Ma. Alejandra Bueno y Ma. Fernanda Gómez

1. Expresión de MyD88 en el Foliculo Dental de ratas:Implicaciones para la osteoclastogénesis y la erupción dental Ma. Alejandra Bueno Ma. Fernanda Gómez

2. Aislamiento y cultivo de células del FD In vivo Gen MyD88 Días de estudio 1, 3, 5, 7, 9, 11 Postnatales Ratas FD 6 Aislamiento Cultivo celular Cultivados después triptinización en (MEM) FD de 5 a 6 días de edad 10% suero de becerro 1mM de Piruvato de Sodio 1% de Penicilina/Estreptomicina 0,2% de Fungizona

3. Aislamiento del ARN Determinar pureza de ARN usando Remover contaminación con ADN Absorbancia de 260nm

4. Análisis de Microselección del ADN Selección del ADN Determinar la expresión del MyD88 in vivo Etiquetado con biotina 16-UTp Generar ARN complementario Kit TrueLabeling-AMP 2.o ARN del FD Hibridado a quimioquina de rata Oligo receptor de ADN Hibridización a 60º por 18 horas Buffer de bloqueo por 40 min Incubada con estreptavitina y fosfatasa alcalina por 10 min Visualizado por incubación de sustrato quimio- luminescente 113 genes Control interno 20 min después Se obtuvo imagen Lavado 4 veces por 5 min. Radio gen MyD88 Analizado con software Gen GAPDH

5. Transcripción reserva en tiempo real- PCR Incubación 10 min a 70°c Transcriptasa reversa A 37°c por 1 hora Cebadores: MyD88 5’- ACCGCATCGAGGAGGACTG-3’ 5’ CTGTGG-GACACTGCTCTCCA-3’ NFKβ1 5’ -GCTTACGGTGGGATTGCATT-3’ 5’ –TTATGGTGCCATGGGTGATG-3’ MCP-1 5’-CACGCTTCTGGGC-CTGTT-3’ 5’-TGAGACAGCACGTGGATGCT-3’ RANKL 5’-TCCCA-TCGGGTTCCCATAA-3’ 5’-GGCCCAGCCTCGATCAT-3’ RT-PCR MCP-1 MyD88 NFKβ-1 RANKL Expresión Células FD Presentado con SYBR Green MasterMix

6. Transfección in vitro de células del FD con ARN de interferencia El ARN de interferencia pequeño de sustrato Dicer (siADN) Integrated DNA Technologies Pone en blanco el ARNm del MyD88 en nucleótidos 420-444 1 día después de la tranfección Combinados e incubados por 25 min - 1mM de piruvato de Na - 10% suero de becerro Opti MEM I medio de Suero reducido

7. Cultivo incubado a 37° C con 5% de CO2 por 24, 48 y 72 horas Células colectadas para determinar expresión de genes RT-PCR en tiempo real

8. Inmuno-tinción Se retiró Peroxidasa Endógena Controles: Ag 1rio reemplazado con IgG de cabra Ag 2rio IgGanticabra Bloqueadas a temperatura ambiente por 1 hora Ag 1rio. MyD88 antihumano policlonal de cabra Seguido de contratincion con hematoxilina TBS 2% suero de conejo

9. Inmuno-tinción

10. Tratamiento con IL-1 alfa Expresión de NFKβ1 MCP-1 RANKL Por 1-2 horas

11. Análisis estadístico SAS Valor p < o = 0,05 Gen cronológica ANOVA Otros experimentos Valor p < o = a 0,05 T-test pareado

12. Resultados Gen MyD88 MyD88 – IL-1 alfa > Día 3 Expresión 1.7, 1.4, 1.9 veces mas alto que los días 1, 5 y 7 Expresión máxima de MyD88 a 6 horas de tto. con IL-1 Proteína MyD88 Inmuno-teñidos MCP-1 NFKβ1 MyD88 Expresión en FD, hueso alveolar y ameloblastos Reducida a 48-72 horas Reducida de 24-72 horas No tinción en controles

13. Resultados IL-1 Mejora espresión NFKβ1 MCP-1 RANKL MyD88 Actividad quimiotáctica de Cmde células de FD Mejoramiento mediante IL-1alfa Requerido para actividad quimiotáctica mediante IL-1 alfa Contribuye a osteoclastogénesis

14. Factor de Diferenciación de Osteoprotegerina y Osteoclastos en la Erupción Dental

15. Materiales y Métodos

16. Materiales y Métodos Folículo Dental y órganos del esmalte microdiseccionados Remoción de suero en MEM Tripsinización Cultivadas células del 5to pasaje -0.2% grasa libre de ácido - Factor de crecimiento reducido de suero de albúmina bovino Cultivados en PTHrP o CSF-1 5 min, 30 min, 1hr, 3hrs, 12 hrs, 24hrs y 48 hrs 6 folículos de cualquier edad para realizar análisis de OPG Se repitió experimento 3 veces 1, 10, 25, 50, 100 ng/mL de PTHrP Controles incubados en MEM libre de suero Para examinar efectos dependientes de las dosis

18. 1 min a 60°C

19. 2 min de extensión a 72°CAmplificación del ADN

20. Visualizado con tinción Electroforesis Productos de PCR ID ImageAnalysis Software in a Kodak Digital ScienceElectrophoresisDocumentation and AnalysisSystem Perfiles de PCR semicuantitativos y determinar intensidad de las bandas Evaluación de densitometría de la data Normalizada a β- actina

21. Inmunolocalización de ODF Localizazción de ODF Anticuerpo policlonal de cabra- antiratón Diluido en 20 µg/mL en PBS Se siguió protocolo del sistema de tinción.

22. Resultados OPG IN VITRO Inhibida PTHrP OPG IN VIVO RATA: Día 3 postnatal Tiempo- 30 min. RT - PCR RATON: Día 5 postnatal MCP-1 / IL-1 CSF-1 inhibe OPG No inhiben expresión de OPG Después de 12 horas