Este documento presenta una guía de trabajo práctico sobre la regulación de la actividad enzimática por factores como el pH, la temperatura y la concentración de sustrato. Explica los objetivos y procedimientos experimentales para evaluar cómo estos factores afectan la actividad de una enzima específica mediante métodos colorimétricos.

1. Fundación H. A. Barceló-Facultad de Medicina
Guía de Trabajos Prácticos: Enzimas: regulación por pH, temperatura y concentración de sustratos
FUNDACIÓN BARCELO
INSTITUTO UNIVERSITARIO DE CIENCIAS DE LA SALUD
FACULTAD DE MEDICINA
BIOQUÍMICA, INMUNOLOGÍA Y NUTRICION NORMAL
3° AÑO
GUÍA DE TRABAJOS PRÁCTICOS
ENZIMAS: REGULACIÓN POR pH, TEMPERATURA Y
CONCENTRACIÓN DE SUSTRATOS
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Guía de Trabajos Prácticos: Enzimas: regulación por pH, temperatura y concentración de sustratos
ENZIMAS
Aspectos generales: Las enzimas son en su mayoría proteínas que catalizan reacciones químicas
en los seres vivos. Las enzimas son catalizadores biológicos, sustancias que sin consumirse en
una reacción, aumentan notablemente su velocidad.
No hacen factibles las reacciones imposibles, sino que solamente aceleran aquellas reacciones
que se producen espontáneamente. Las enzimas hacen posible la existencia de seres vivos, ya
que permiten que se produzcan aquellas reacciones químicas que, sin catalizador, requerirían
de tiempos y condiciones de presión, temperatura y pH incompatibles con la vida.
Prácticamente todas las reacciones quimicas que tienen lugar en los seres vivos están
catalizadas por enzimas. Las enzimas son catalizadores específicos: cada enzima cataliza un solo
tipo de reacción, y casi siempre actúan sobre un único sustrato o sobre un grupo muy reducido
de ellos.
El sustrato se une a una región concreta de la enzima, llamada centro activo. El centro activo
comprende un sitio de unión formado por los aminoácidos que están en contacto directo con el
sustrato y un sitio catalítico formado por los aminoácidos directamente implicados en el
mecanismo de la reacción. Una vez formados los productos, la enzima puede comenzar un
nuevo ciclo de reacción.
Propiedades de las enzimas: Las propiedades de las enzimas se encuentran íntimamente
relacionadas con su estructura. Dada la alta complejidad estructural que presentan es que
pueden llevar a cabo procesos catalíticos complejos. Por consiguiente cualquier modificación en
la estructura nativa de la misma suele ir asociado a cambios en la actividad catalítica. Los
factores que influyen de manera más directa sobre la actividad de una enzima son:
• Cambios de pH
• Cambios de Temperatura
• Presencia de Cofactores
• La concentración de sustrato y producto
• La fuerza iónica de la solución
Efecto del pH sobre la actividad enzimática: las enzimas poseen grupos químicos ionizables
(carboxilos –COOH, aminos –NH2, tiol –SH, imidazol, etc.) en las cadenas laterales de sus
aminoácidos. Según el pH del medio, estos grupos pueden tener carga eléctrica positiva,
negativa o neutra. Como la conformación de las proteínas depende, en parte, de sus cargas
eléctricas, habrá un pH en el cual la conformación será la más adecuada para la actividad
catalítica. Éste es el llamado pH óptimo.
La mayoría de las enzimas son muy sensibles a los cambios de pH. Desviaciones de pocas
décimas por encima o por debajo del pH óptimo pueden afectar drásticamente su actividad. Así,
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la pepsina gástrica tiene un pH óptimo de 2, la ureasa tiene un pH óptimo de 7 y la arginasa
tiene un pH óptimo de 10.
Efecto de la temperatura sobre la actividad enzimática: en general, los aumentos de
temperatura aceleran las reacciones químicas: por cada 10°C de incremento, la velocidad de
reacción se duplica. Las reacciones catalizadas por enzimas siguen esta ley general. Sin
embargo, debido a su estructura biológica, a partir de cierta temperatura, se empiezan a
desnaturalizar por el calor. La temperatura a la cual la actividad catalítica es máxima se llama
temperatura óptima. Por encima de esta temperatura el aumento de la velocidad de la reacción
debido a la temperatura es contrarrestado por la pérdida de actividad catalítica debida a la
desnaturalización térmica, y la actividad enzimática decrece rápidamente hasta anularse.
Efecto de las concentraciones de sustrato sobre la actividad enzimática: La velocidad de una
reacción enzimática depende de la concentración del sustrato mientras la enzima no se
encuentre saturada.
TRABAJO PRÁCTICO
OBJETIVOS
• Determinar la variación de la actividad de una enzima frente a variaciones en el pH del
medio de reacción.
• Determinar la variación de la actividad de una enzima ante cambios de temperatura en
la reacción química.
• Observar el incremento de la actividad enzimática frente a concentraciones crecientes
de sustrato.
La determinación de la actividad de una enzima se realiza por métodos colorimétricos que
requieren de la utilización del ESPECTROFOTOMETRO, que permite medir la cantidad de luz
absorbida de una sustancia, preferentemente coloreada. La determinación de la concentración
se realiza al pasar un fino haz de luz a través de la solución. La porción de luz que pasa a través
de la solución colorida es la trasmitancia porcentual, la luz que no pasa es absorbida por la
solución y es medida como unidades de absorvancia. Las soluciones concentradas dejan pasar
menos luz que las diluidas. Así podemos decir que cuanto mayor es la concentración de una
solución mayor es su absorvancia y menor su trasmitancia. Tanto la absorvancia como la
trasmitancia pueden ser leídas en los espectrofotómetros.
El fundamento del método colorimétrico consiste en realizar una reacción que nos de cómo
producto un compuesto coloreado, el cual va a ser valorado a través de la absorvancia que
presente la solución.
ENZIMA
SUSTRATO PRODUCTO (coloreado)
El espectrofotómetro tiene la capacidad de medir la cantidad de luz que absorbe el producto
coloreado en base a la siguiente relación:
ABSORBANCIA = a × l × c
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Donde a: es una constante propia de la sustancia coloreada, l: es el diámetro del tubo que
contiene la sustancia coloreada, c: es la concentración
La absorbancia es directamente proporcional a la concentración de una solución dentro de un
rango, a altas concentraciones se pierde la relación lineal. A mayor concentración de producto
mayor concentración de sustrato reacción en presencia de la enzima.
ACTIVIDADES DE LABORATORIO
Para el desarrollo de los objetivos del TP se utilizará un sistema constituido por una enzima que
cataliza la transformación de un sustrato en un producto coloreado.
Efecto del pH:
Reactivos y materiales
• Buffer de reacción pH cercano a 7 (A)
• Buffer de reacción pH ácido (B)
• Buffer de reacción pH alcalino (C)
• Sustrato
• Enzima
• Baño termostatizado a 37 °C
Procedimiento experimental
En tres tubos de ensayo se colocarán respectivamente:
Tubo 1: pH óptimo Tubo 2: pH ácido Tubo 3: pH alcalino
Buffer A 1 ml
Buffer B 1 ml
Buffer C 1 ml
Enzima ….. µl ……µl …..µl
Sustrato (1 g/l) 10 µl 10 µl 10 µl
Incubar los tres tubos en baño de agua a 37°C, durante 10 minutos
Observar el color obtenido en cada tubo, leer la absorbancia a 505 nm frente a blanco de
reactivo y relacionar con la actividad enzimática
Efecto de la temperatura:
Reactivos y materiales
• Buffer de reacción pH cercano a 7 (A)
• Sustrato
• Enzima
• Baño termostatizado a 37 °C
• Hielo
• Agua hirviendo
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Procedimiento experimental
En tres tubos de ensayo se colocará respectivamente:
Tubo 1: 0°C Tubo 2: 37°C Tubo 3: 100°C
Buffer A 1 ml 1 ml 1 ml
Enzima …..µl …..µl …..µl
Sustrato (1 g/l) 10 µl 10 µl 10 µl
Incubar 10 min en baño de Incubar 10 min a Incubar 10 min a
hielo (0 °C) 37°C 100°C
Observar el color obtenido en cada tubo, leer la absorbancia a 505 nm frente a blanco de
reactivo y relacionar con la actividad enzimática
Efecto de la concentración de sustrato:
Reactivos y materiales
• Buffer de reacción pH cercano a 7 (A)
• Sustrato
• Enzima
• Baño termostatizado a 37 °C
Procedimiento experimental
En dos tubos de ensayo se colocará respectivamente:
Tubo 1 Tubo 2
Buffer A 1 ml 1 ml
Sustrato (1 g/l) 10 µl 30 µl
Enzima ….µl ….µl
Incubar los tubos en baño de agua a 37°C, durante 10 minutos
Observar el color obtenido en cada tubo, leer la absorbancia a 505 nm frente a blanco de
reactivo y relacionar con la actividad enzimática
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CUESTIONARIO:
1- Grafique los resultados obtenidos en las experiencias de actividad enzimática en función de la
variación del pH y temperatura. Compare con los gráficos teóricos. ¿Qué conclusiones obtiene?
2- Teniendo en cuenta la experiencia de efecto de la concentración de sustrato sobre la
actividad enzimática, discuta:
a) ¿En que tubo se observa mayor cantidad de producto y por qué?
b) ¿Dónde se observa mayor actividad enzimática y de que dependió la misma?
c) En este sistema el aumento de actividad enzimática, ¿dependió de la cantidad de enzima?
3- El sabor dulce del maíz recién cosechado es debido a la gran cantidad de azúcar de los granos.
Varios días después de la cosecha el maíz no es tan dulce debido a que el 50% del azúcar libre se
convierte en almidón durante el primer día posterior a la cosecha. Para mantener el sabor dulce
del maíz recién cosechado se sumergen las espigas en agua hirviendo durante unos minutos,
enfriándolo después con agua fría. El maíz procesado de este modo mantiene su dulzor
perfectamente. Utilizando lo estudiado sobre enzimas, trate de explicar esta situación.
4-¿Cómo se valora a través de un método colorimétrico la aparición de producto de una
reacción enzimática y qué relación tiene con la actividad enzimática?
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