Este documento describe diferentes microorganismos indicadores que se pueden usar para evaluar la calidad microbiológica de los alimentos. Explica que los microorganismos marcadores son organismos cuya presencia indica posible contaminación por patógenos. Luego discute varios microorganismos comúnmente usados como indicadores, incluyendo aerobios mesófilos, coliformes totales, coliformes fecales y Escherichia coli. Finalmente, brinda detalles sobre métodos de análisis para detectar estos microorganismos indicadores.
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Microorganismos marcadores en alimentos
1. 06/12/2011
Análisis microbiológico de alimentos
Microorganismos marcadores En realidad…
• La mayoría de los
alimentos
contienen
microorganismos.
• No es posible el
análisis de todos
los patógenos y de
María Marcela Martínez Miranda
Magister en Microbiología
todos los
Departamento de Ingeniería alterantes.
Universidad de Caldas Marcela Martínez M.Sc.
¿Porqué buscar
Microorganismos marcadores
microorganismos marcadores?
1. La detección de • Son organismos (o
patógenos puede ser muy grupos) que advierten:
complicada, muy lenta y/o
muy costosa. – manejo inadecuado
2. La investigación de – presencia de
patógenos en alimentos microorganismos
no facilita un enfoque patógenos
preventivo.
• Su detección en el
3. Calidad microbiológica en
términos de laboratorio es más
microorganismos sencilla, rápida y/o
marcadores. económica.
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
Características de un buen índice de
Microorganismos marcadores contaminación en alimentos
• Microorganismos cuya presencia 1. Origen específico
en cantidades o niveles por
encima de ciertos límites
Índices numéricos indica la posible 2. Técnicas de laboratorio
presencia de patógenos fiables y rápidas
ecológicamente relacionados.
3. Resistencia a
condiciones ambientales
• Microorganismos cuya presencia y al procesado tanto o
en cantidades determinadas
indica un tratamiento o más que los patógenos a
Indicadores procesado de inocuidad los cuales representa.
inadecuado.
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
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2. 06/12/2011
Un tratamiento de
La presencia posible de Los principales microorganismos
patógenos entéricos, es decir,
inocuidad una función de índice para
microorganismos de indicadores en alimentos son:
insuficiente importancia para la salud
cumpliendo de ese pública, como por ejemplo las
modo una función
shigelas, que se pudieran
haber originado en la zona
• Indicadores de condiciones de manejo o de eficiencia de
de indicador donde fueron tratados los
camarones. proceso:
– Aerobios Mesófilos
– Psicrófilos y psicrotróficos
– Termófilos o termodúricos
– Mohos y levaduras
Un microorganismo marcador dado – Coliformes totales
puede funcionar a la vez como índice y
como indicador. • Indicadores de contaminación fecal:
Por ejemplo, la presencia de cantidades
importantes de E. coli en los camarones – Coliformes fecales
precocinados congelados indica:
– E. coli
– Enterococos
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
– Anaerobios sulfito-reductores
Otros microorganismos Métodos de análisis microbiológico
indicadores • Método: cualitativo
– PRESENCIA / AUSENCIA en
• Estafilococos coagulasa positiva 25 g o mL de muestra.
(Staphylococcus aureus) • Salmonella sp.
• Vibrio cholerae
• Recuento de Anaerobios Mesófilos • Listeria monocytogenes
• Método: cuantitativo
• Recuento de Anaerobios Esporulados – Tubos múltiples: NMP/g o mL
de muestra
• Recuento de Virus entéricos – Recuento en placa: ufc/g o mL
a. Por incorporación
b. Por superficie
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
Recuento de aerobios mesófilos
Indicadores de condiciones de
(RAM)
manejo o de eficiencia de proceso
Se desarrollan en presencia de aire
Aerobios a temperaturas medias (25-40°C).
mesófilos Dan lugar a la formación de colonias
visibles después de 72 horas a 3Oº
Psicrófilos y C (ó 48 horas a 37ºC) sobre un agar
termófilos de recuento, incubado en
condiciones de aerobiosis.
Mohos y Indican:
levaduras la calidad sanitaria de un
alimento.
Coliformes
las condiciones de manipulación.
totales
las condiciones higiénicas de la
Marcela Martínez M.Sc.
materia prima. Marcela Martínez M.Sc.
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3. 06/12/2011
Aplicación del RAM El RAM NO es útil para:
Alimentos fermentados.
Col acida, queso y otros
Alimentos derivados lácteos.
frescos,
Alimentos esterilizados
refrigerados y (Recuento Microscópico
congelados. Directo).
Alimentos deshidratados y
Materias primas e congelados (Recuento
insumos. Microscópico Directo).
Alimentos refrigerados
Alimentos listos (Recuento de
para consumir. psicrotróficas).
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
Existen dos métodos clásicos para
el recuento de aerobios mesófilos RAM por el método de siembra a
profundidad
Profundidad 10 -1 (48 h) 10 -2 A (48 h) 10 -2 B (48 h) 10 -3 A (48 h) 10 -3 B (48 h)
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
Un RAM elevado indica: Un RAM elevado puede significar:
1. Excesiva contaminación
En alimentos estables
de la materia prima.
– Materias primas muy contaminadas. 2. Deficiente manipulación
– Tratamiento no satisfactorio. durante el proceso de
elaboración.
En alimentos perecederos
3. La posibilidad de que
– Materias primas muy contaminadas. existan patógenos, pues
éstos son mesófilos.
– Tratamiento no satisfactorio.
4. La inmediata alteración
– Almacenamiento en condiciones de del producto.
temperatura inadecuadas.
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4. 06/12/2011
Psicrotróficos Psicrotróficos
• Por definición son Incluye bacilos y cocos; formadores de esporas; gram
organismos que producen positivos y gram negativos; aeróbos; anaerobios y
crecimiento visible a 7o C anaerobios facultativos.
1o C dentro de 7 a 10 – Aeromonas
días, independiente de su
– Bacillus
temperatura de crecimiento
óptima. – Clostridium
– Lactobacillus
• Los organismos
mayormente asociados con – Escherichia
alimentos refrigerados y – Listeria
que causan daño son
– Serratia, ect.
psicrotróficos y no
psicrofílicos – Hongos y levaduras
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
Psicrotróficos
Psicotróficos patógenos Métodos de detección
Patógenos
• Cultivo durante 10 días
– Aeromonas hydrophila
a 7oC para siembra en
– Bacillus cereus (algunas profundidad.
cepas)
– Clostridium botulinum type E, • Cultivo durante 7-8
ByF días a 7o C para
siembra en superficie
– Listeria monocytogenes
– Vibrio cholerae • Cultivo durante16 hr a
17O C seguido de 3
– Yersinia enterocolítica
días a 7oC
– Escherichia coli (algunas
cepas)
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
Termodúricos Termodúricos
Organismos que Género Alimento asociado
Actinomycetes Leche
pueden tolerar calor y
Alcaligenes Leche
por consiguiente
Arthrobacter Leche
tienen la capacidad
Bacillus Leche/huevos
de sobrevivir
Clostridium Leche
pausterización. Son Coryneform Huevos
capaces de sobrevivir Lactobacillus Leche/carne/jugos
el calentamiento de Microbacterium Leche
un alimento a Micrococcus Leche/huevos
temperaturas de 60 a Pseudomonas Huevos
80OC. Streptococcus/ Leche/carne/huevo
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
Enterococcus
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5. 06/12/2011
Coliformes
Bacilos Gram negativos
No esporulados
Aerobios o anaerobios
facultativos
Fermentan la lactosa a 35⁰C
con producción de ácido y
gas
Viven en el ambiente y en
animales de sangra caliente
Los coliformes totales
incluyen los fecales
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
Son algunas especies que
pertenecen a los géneros:
Género Fuente
Heces (humanas y
Escherichia
animales)
Klebsiella Heces, ambiente
Enterobacter Heces, ambiente
Citrobacter Ambiente
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
Coliformes como indicadores de Aplicación del uso de Coliformes
contaminación fecal como indicadores
• Se encuentran en el intestino del hombre y de 1. Detección de prácticas sanitarias deficientes en el
animales, pero también en otros ambientes manejo y en la fabricación de los alimentos.
como: suelo, plantas, cáscara de huevo, etc.
2. Evaluación de la calidad microbiológica de un
• Son útiles como indicadores de contaminación producto.
fecal por: 3. Evaluación de la eficiencia de prácticas sanitarias
– Su frecuencia en heces e higiénicas en el equipo.
– Su fácil detección en el laboratorio 4. Calidad sanitaria del hielo y los distintos tipos de
– Sus características semejantes a algunos miembros agua utilizados en las diferentes áreas del
patógenos de la familia Enterobacteriaceae procesamiento de alimentos.
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
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6. 06/12/2011
Pruebas de determinación de Pruebas para detección y
Coliformes recuento de Coliformes
1. Investigación y recuento en 1. Prueba presuntiva
medio líquido
• Se usa el Caldo
– Caldo Lauril Triptosa (CLT).
lactosado biliado verde – Caldo Mc. Conkey.
brillante (Brilliant Green
Bile Lactose: BGBL) – Caldo lactosado bilis verde brillante.
2. Investigación y recuento en 2. Prueba confirmativa:
medio sólido
• Se utiliza el medio – Medio EC.
selectivo agar biliado – Medio bilis lactosa (BLVB)
rojo-violeta (Violet Red
Bile Agar: VRBA)
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
Investigación y recuento en
Coliformes fecales (CF)
medio sólido
Origen intestinal
Coliformes totales
en placas de agar Pertenecen a la familia
Enterobacteriaceae
bilis rojo violeta,
incubadas por 24 h Bacilos Gram negativos,
a 35 ºC anaerobios facultativos, no
esporulados.
UFC/g (o/mL) de
Fermentadores de lactosa a
muestra. 44.5 °C con producción de gas.
Principalmente Escherichia coli
(90%)
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
Determinación de CF Escherichia coli (coliformes
termotolerantes)
• Capacidad para producir
indol a partir de triptófano
• Producción de la enzima β-
glucuronidasa.
• Es el índice de
contaminación fecal más
adecuado.
• Hay grandes cantidades de
Escherichia coli en las
Su determinación se hace a partir de la segunda etapa heces humanas y
(confirmativa) del método de NMP, cultivando en caldo animales.
lactosado con incubación a 44.5 °C.
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
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7. 06/12/2011
Determinación de E. coli Recuento de Enterobacterias
• Familia
• Métodos basados en: Enterobacteriaceae
– Producción de ácido y gas a partir
de la lactosa.
• Lactosa + y lactosa -
– Producción de la enzima β- • Se usan como grupo
glucuronidasa. indicador en lugar del
grupo de coliformes
• Los procedimientos incluyen: totales.
– Filtración con una membrana que • Son de origen fecal y
después se incuba en medios
selectivos a 44–45 °C.
no fecal.
– «número más probable»
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
Razones por las cuales se utilizan las enterobacterias Qué indica niveles altos de Enterobacteiras en
como indicadoras en lugar de los coliformes alimentos procesados?
1. Los coliformes son un • Tratamiento inadecuado y/o
grupo mal definido contaminación posterior al
taxonómicamente. tratamiento; más
frecuentemente a partir de
2. Los coliformes solo materias primas, equipos
tienen en cuenta las sucios o manejo no
higiénico
enterobacterias
lactosa positiva. • Multiplicación microbiana
que pudiera haber permitido
3. Las Enterobacterias el crecimiento de toda la
son mas resistentes serie de microorganismos
que los coliformes. patógenos y toxigénicos.
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
Estreptococos fecales
Métodos para el recuento de
Enterobacterias
Enterococcus
• Se encuentran en las heces
• Método de de los humanos y animales
de sangre caliente.
recuento
• Animales de producción:
– Recuento en vaca, cerdo, oveja, caballo,
placa gallina y pato.
– Recuento en • Son importantes en
medio líquido Confirmación con situaciones donde se sabe
prueba de oxidasa que hay contaminación
• Método de VRBG Agar
fecal y no se detectan
ausencia coliformes.
presencia
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
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8. 06/12/2011
Uso de Enterococcus como
indicadores en alimentos
Especies de Enterococcus
• Aunque se encuentran
Grupo Especies Hábitat
en cantidades menores
que E. coli, son mas Enterococcus faecalis
están normalmente
resistentes. Grupo 1 Enterococcus faecium presentes en las heces de
humanos y animales
• Se consideran Enterococcus durans
indicadores en alimentos Streptococcus bovis
procesados, como Streptococcus equinus no se encuentran
lácteos y cárnicos, en Grupo 2 comúnmente en las heces
Enterococcus avium humanas
los cuales E. coli no
puede sobrevivir.
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
Recuento de esporas de Clostridium
Clostridium sulfito reductores sulfito reductores
Se pesan 10g o ml y se homogenizan Se realizan diluciones seriadas en
• Bacterias Grampositivas, con 90ml de peptona 0.1% 9ml peptona 0.1%
esporuladas, anerobias,
reductoras de sulfitos.
• Se utilizan como
indicadores de
contaminación fecal
antigua.
• Clostridium perfringens es
de origen fecal y también se
encuentra ampliamente
distribuida en la naturaleza.
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
Choque térmico para formación de
esporas Siembra en fondo en agar SPS
Se ponen los tubos con las diluciones a sembrar en agua hirviendo por 10 Se siembra 1ml en fondo de la dilución
minutos para hacer luego el choque térmico y activar las esporas. que ha sido sometida a choque térmico
Marcela Martínez M.Sc. y se agrega el medio SPS caliente. M.Sc.
Marcela Martínez
Para finalizar el choque térmico, se ponen los tubos de diluciones en hielo.
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9. 06/12/2011
Incubación en anaerobiosis Mohos y levaduras
Se llevan a incubar las cajas en cámara Unicelulares hongos filamentosos
de anaerobiosis por 72 horas a 37 C,
con sobre generador de anaerobiosis e
indicador atmosférico.
• Crecen más lentamente que las bacterias en los alimentos no ácidos que
conservan humedad.
• Las levaduras crecen mas rápidamente que los mohos, pero con frecuencia
junto a ellos.
• Mohos son aerobios estrictos.
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
• Levaduras crecen en aerobiosis o en anaerobiosis (fermentación).
Mohos y levaduras en alimentos Recuento de mohos y levaduras
Importantes en alimentos • Se desarrollan en
ácidos y en los de baja condiciones de aerobiosis.
actividad de agua:
• A temperaturas que varían
– Frutas frescas entre 20 y 30⁰C.
– Jugos
– Vegetales • Crecen más lentamente
que las bacterias.
– Quesos
– Cereales • Los medios de cultivo
– Alimentos salazonados deben favorecer su
desarrollo pero no el de las
– Encurtidos
bacterias.
– Alimentos congelados y
deshidratados Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
Medios de cultivo para mohos Recuento de mohos y levaduras
Se tiene en cuenta el rango de 10 UFC – 100 UFC
Agar de Sabouraud
Se reportan indistintamente mohos y levaduras
Agar papa dextrosa
Agar extracto de malta
Agar Czapek-Dox
Agar Micosel o micobiótico
BHI + antibióticos
BHI
Marcela Martínez M.Sc. Marcela Martínez M.Sc.
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10. 06/12/2011
“La misión de la vida es descubrir la vocación y luego
entregarse a ella con todo el corazón”
Marcela Martínez M.Sc.
Buda
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Notes de l'éditeur
La presencia de microorganismos en los alimentos no significa necesariamente un peligro para el consumidor o una calidad inferior de estos productos. En realidad, si se exceptúa el reducido número de productos esterilizados, cada bocado de alimento contiene levaduras inocuas, mohos, bacterias y otros microorganismos. La mayor parte de los alimentos se convierten en potencialmente peligrosos para el consumidor sólo después de que han sido violados los principios de higiene, limpieza y desinfección. Si los alimentos han estado sometidos a condiciones que pudieran haber permitido la llegada a los mismos y/o la multiplicación de agentes infecciosos o toxigénicos, pueden constituirse en vehículo de transmisión de enfermedades., tales como la salmonelosis o la intoxicación estafilocócica. La puesta en evidencia de estos riesgos se basa en el examen de muestras de alimentos para en busca de los propios agentes causales o de indicadores de una contaminación no admisible con lo que se busca determinar la calidad de los mismos.
La calidad microbiológica de los alimentos es fundamental porque influye en su conservación y vida de anaquel y, sobre todo, porque los microorganismos presentes en ellos, pueden ser causantes de enfermedades transmitidas por alimentos ó ETA’s (en inglés se denominan “foodborne illness” ó FBI).
La detección en el laboratorio de los microorganismos patógenos puede ser muy complicada, muy lenta y/o muy costosa para determinaciones rutinarias. Además, es concluyente cuando se encuentra un microorganismo patógeno pero puede haber casos en que no se detecte por razones circunstanciales como el clima o la cantidad de individuos infectados que están contaminando, a pesar de que el manejo del alimento implique el riesgo de que el patógeno aparezca en cualquier momento. En todo caso, la investigación de microorganismos patógenos en alimentos no facilita un enfoque preventivo.
Los indicadores son organismos (o grupos) que advierten oportunamente de un manejo inadecuado o contaminación que incrementan el riesgo de presencia de microorganismos patógenos en alimentos. Además de que su detección en el laboratorio es más sencilla, rápida y/o económica, los microorganismos indicadores permiten un enfoque de prevención de riesgos, puesto que advierten manejo inadecuado y/o contaminación.
Conocer las fuentes de contaminación del alimento que se analiza. Valorar las normas de higiene utilizadas en la elaboración y manipulación de los alimentos. Detectar la posible presencia de flora patógena que suponga un riesgo para la salud del consumidor. Establecer en qué momento se producen fenómenos de alteración en los distintos alimentos, con el fin de delimitar su periodo de conservación.
Criterios Microbiológicos Un criterio microbiológico para alimentos define la aceptabilidad de un proceso, producto o lote de alimentos basándose en la ausencia o presencia o el número de microorganismos y/o la investigación de sus toxinas por unidad de masa, volumen o área. Un criterio microbiológico, según se detalla en “Principios para el Diseño y la Aplicación de Criterios Microbiológicos Para Alimentos” - Codex Alimentarius Commission, consiste en: - señalar el alimento al que se aplicará el criterio, - elección de microorganismos y/o sus toxinas/ metabolitos a identificar y la razón de la elección para el producto, - un plan de muestreo indicando el número de muestras a tomar, el tamaño de la misma y las características de la unidad analítica, - los métodos para su detección y/o cuantificación, - los límites microbiológicos considerados apropiados para el alimento en el punto indicado de la cadena alimentaria, - el número de unidades analíticas donde se debe verificar el cumplimiento de dichos límites.
La selección de indicadores en un alimento depende fundamentalmente de los riesgos implicados y de lo que se requiera saber para liberar, controlar o mejorar el alimento, manteniendo el enfoque preventivo.
En este grupo se incluyen todas las bacterias capaces de desarrollarse a 30 - 37°C en las condiciones establecidas. Refleja la calidad sanitaria de un alimento, las condiciones de manipulación, las condiciones higiénicas de la materia prima.
Se lleva a cabo a partir de diluciones decimales de la muestra, que se inoculan en placas vertidas de agar triptona glucosa extracto o agar cuenta estándar. Las placas se incuban en condiciones de aerobiosis, a 35 °C durante 24 a 48 horas. Es importante aplicar las reglas para el recuento, de la NOM-092-SSA1- 1994. Bienes y Servicios. Método para la cuenta de Bacterias Aerobias en Placa.
Los mohos y las levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente, por lo que son frecuentes en la microbiota habitual de muchos alimentos; se dispersan fácilmente por el aire y el polvo. Ciertas especies de mohos y levaduras son útiles en la elaboración de algunos alimentos, sin embargo también pueden ser causantes de la descomposición. .
Debido a su crecimiento lento y a su baja competitividad, los hongos y levaduras se manifiestan en los alimentos donde las condiciones no favorecen el crecimiento bacteriano, por ejemplo: pH ácido, baja humedad, alto contenido en sales o carbohidratos, baja temperatura de almacenamiento, presencia de antibióticos u otros antibacterianos. Las levaduras y los mohos crecen mas lentamente que las bacterias en los alimentos no ácidos que conservan humedad y por ello pocas veces determinan problemas en tales alimentos. Sin embargo, en los alimentos ácidos y en los de baja actividad de agua, crecen con mayor rapidez que las bacterias, determinando por ello importantes pérdidas por la alteración de frutas frescas y jugos, vegetales, quesos, productos cerealícolas, alimentos salazonados y encurtidos, así como en los alimentos congelados y en los deshidratados, cuyo almacenamiento se realiza en condiciones inadecuadas. Además, existe el peligro potencial de producción de micotoxinas por parte de los mohos.
Como grupo indicador son útiles para evidenciar grado general de contaminación en alimentos con estas características o cuando los mesófilos aerobios no son útiles, como en alimentos fermentados. También son indicadores del riesgo de desarrollo de hongos toxigénicos en alimentos como frutos secos, especias, cereales y otros granos, y sus derivados. Para estudiar los mohos se usan los mismos métodos generales de cultivo que para las bacterias. Casi todos, se desarrollan en condiciones de aerobiosis en los medios de cultivos bacteriológicos usuales, a temperaturas que varían entre 20 y 30 ºC. La mayor parte lo hacen mas lentamente que las bacterias, y así, cuando llegan a coexistir, el desarrollo de estas sobrepasa con creces el de los mohos. Si se quiere aislar los mohos, resulta muy práctico usar un medio de cultivo que favorezca su desarrollo pero que no sea óptimo para las bacterias. Medios ácidos ( ph 5,6) con concentraciones relativamente elevadas de azúcar con tolerados bien por los mohos pero inhiben muchas bacterias.
Un medio natural de amplio uso para el cultivo de los hongos es una infusión de maíz al que se le adiciona agar y glucosa. Otro medio de cultivo para los mohos y levaduras contiene infusión de papa con agar y glucosa. Muchas fórmulas de los medios de cultivos para los mohos y levaduras contienen peptona, algún carbohidrato y agar; en cambio , los medios para los hongos patógenos necesitan ser enriquecidos con otras sustancias. Uno de los medios de cultivos mas conocido y antiguo para cultivar hongos Sabouraud, y contiene maltosa y peptona con sus ingredientes principales, pero fue modificado y ahora en Estados Unidos se usa uno que solo contiene glucosa. Este medio se utiliza mucho para aislar mohos y ciertas levaduras; además es muy útil para el crecimiento de hongos patógenos a partir del cuerpo y exudados. Su acción selectiva parcial se debe a su alta concentración de azúcar y bajo pH.
El recuento se lleva a cabo a partir de diluciones decimales de la muestra, que se inoculan en placas vertidas de papa dextrosa agar (PDA) y agar extracto de malta (AEM) acidificados con ácido tartárico, para favorecer a los hongos y levaduras e inhibir bacterias (NOM-111-SSA1-1994. Bienes y Servicios . Método para la cuenta de mohos y levaduras en alimentos). En algunos casos, se utilizan antibióticos para hacer más selectivo el medio de cultivo.
La definición generalmente aceptada para el término “coliformes” describe a estos microorganismos como bacilos Gram negativos, no esporulados, aerobios o anaerobios facultativos que fermentan la lactosa con producción de ácido y gas, aunque algunos pueden ser fermentadores tardíos o no fermentadores, como Citrobacter y Serratia , respectivamente. La mayoría de los coliformes pueden encontrarse en la flora normal del tracto digestivo del hombre o animales, por lo cual son expulsados especialmente en las heces, por ejemplo Escherichia coli . Por esta razón, su presencia constante en la materia fecal, los coliformes son el grupo más ampliamente utilizado en la microbiología de alimentos como indicador de prácticas higiénicas inadecuadas. Como los coliformes también pueden vivir en otros ambientes, se distingue entre coliformes totales y coliformes fecales. Esta práctica se refiere a coliformes totales.
Incluye los géneros: Escherichia, Enterobacter, Klebsiella y Citrobacter. Durante mucho tiempo se consideraron evidencia de contaminación fecal, pero se ha demostrado que muchos de ellos pueden vivir e incluso crecer en el suelo, el agua y otros ambientes. Actualmente se consideran un excelente indicador de la eficiencia de los procesos de sanitización y desinfección, así como de calidad sanitaria en agua, vegetales y diversos productos procesados.
Ser un habitante normal de la flora intestinal de individuos sanos. Estar presente, de forma exclusiva, en las heces de animales homeotérmicos. Estar presente cuando los microorganismos patógenos intestinales lo están. Presentarse en número elevado, facilitando su aislamiento e identificación. Debe ser incapaz de reproducirse fuera del intestino de los animales homeotérmicos. Su tiempo de supervivencia debe ser igual o un poco superior al de las bacterias patógenas, su resistencia a los factores ambientales debe ser igual o superior al de los patógenos de origen fecal. Debe ser fácil de aislar y cuantificar. No debe ser patógeno.
Detección de prácticas sanitarias deficientes en el manejo y en la fabricación de los alimentos. Evaluación de la calidad microbiológica de un producto, aunque su presencia no necesariamente implica un riesgo sanitario, cuando los coliformes son de origen no-fecal. Evaluación de la eficiencia de prácticas sanitarias e higiénicas en el equipo. Calidad sanitaria del hielo y los distintos tipos de agua utilizados en las diferentes áreas del procesamiento de alimentos.
Su determinación se basa generalmente en la capacidad de fermentar lactosa. Se pueden utilizar los métodos del número más probable (NMP ó MPN por sus siglas en inglés) que es un método estadístico en tres etapas y permite el hallazgo de cantidades muy bajas de coliformes. También se pueden detectar por cuenta en placa utilizando agar bilis-rojo violeta (ABRV ó RVBA por sus siglas en inglés) en el cual las colonias fermentadoras de lactosa causan el vire del indicador; pueden detectarse por filtración en membrana ( Millipore ) e incubación en medios adecuados, por métodos rápidos como Petrifilm y reacciones cromogénicas o fluorogénicas.
No todos los coliformes son de origen fecal, por lo que se hizo necesario desarrollar pruebas para diferenciarlos a efectos de emplearlos como indicadores de contaminación. Se distinguen, por lo tanto, los coliformes totales —que comprende la totalidad del grupo— y los coliformes fecales —aquellos de origen intestinal—. Dentro del grupo coliforme, los de origen fecal son capaces de fermentar la lactosa también a 44.5 °C; se consideran el indicador más adecuado de contaminación con heces de animales y humanos, por ejemplo en pescados y mariscos, carnes, leche, alimentos RTE, entre otros. La determinación se hace a partir de la segunda etapa (confirmativa) del método de NMP, cultivando en caldo lactosado con incubación a 44.5 °C. Este análisis permite descartar a Enterobacter , puesto que ésta no crece a esa temperatura. Si se aplica este criterio crecerán en el medio de cultivo principalmente Escherichia coli (90%) y algunas bacterias de los géneros Klebsiella y Citrobacter . La prueba de coliformes fecales positiva indica un 90% de probabilidad de que el coliforme aislado sea E. coli .
No todos los coliformes son de origen fecal, por lo que se hizo necesario desarrollar pruebas para diferenciarlos a efectos de emplearlos como indicadores de contaminación. Se distinguen, por lo tanto, los coliformes totales —que comprende la totalidad del grupo— y los coliformes fecales —aquellos de origen intestinal—. Dentro del grupo coliforme, los de origen fecal son capaces de fermentar la lactosa también a 44.5 °C; se consideran el indicador más adecuado de contaminación con heces de animales y humanos, por ejemplo en pescados y mariscos, carnes, leche, alimentos RTE, entre otros. La determinación se hace a partir de la segunda etapa (confirmativa) del método de NMP, cultivando en caldo lactosado con incubación a 44.5 °C. Este análisis permite descartar a Enterobacter , puesto que ésta no crece a esa temperatura. Si se aplica este criterio crecerán en el medio de cultivo principalmente Escherichia coli (90%) y algunas bacterias de los géneros Klebsiella y Citrobacter . La prueba de coliformes fecales positiva indica un 90% de probabilidad de que el coliforme aislado sea E. coli .
Los Estreptococos fecales, actualizados taxonómicamente como Enterococcus incluyen un número de especies que se encuentran en las heces de los humanos y animales de sangre caliente. Esto es muy importante, ya que la contaminación fecal causada por animales puede involucrar riesgos sanitarios, por lo que hay que tener en cuenta los microorganismos más abundantes frecuentes en las heces de los animales, sobre todo en los de producción; vaca, cerdo, oveja, caballo, gallina y pato. En todos ellos se encuentran coliformes y Estreptococos fecales, aunque son más abundantes los estreptococos fecales. Los Estreptococos fecales no se multiplican en el medio ambiente, o si esto ocurre es solamente en raras ocasiones, son más persistentes en ambientes acuáticos y en suelos contaminados que E. coli. Son importantes en situaciones donde se sabe que hay contaminación fecal y no se detectan coliformes, como ocurre cuando las descargas son intermitentes o más antiguas, de modo que mueren los coliformes fecales y E. coli, y permanecen los estreptococos. Aunque se encuentran en cantidades menores por un orden de magnitud, en comparación con E. coli, tienen algunas ventajas como su mayor supervivencia. Se consideran indicadores en alimentos procesados, como lácteos y cárnicos, en los cuales E. coli puede no sobrevivir .
Las especies de Enterococcus que están presentes en las heces y que se encuentran en aguas contaminadas pueden ser divididas en dos grupos: en el primer grupo se encuentran Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium y Enterococcus durans, estos organismos están normalmente presentes en las heces de humanos y animales, el segundo grupo incluye Streptococcus bovis, Streptococcus equinus y Enterococcus avium, estos organismos no se encuentran comúnmente en las heces humanas. La identificación de la especie puede ser un mejor indicativo de la fuente de contaminación (27).
Los Clostridium sulfito reductores, por ser productores de esporas, tienen una mayor resistencia a las condiciones ambientales y a la desinfección por lo que se utilizan como indicadores de contaminación fecal antigua (29). El número de Clostridium en agua es mucho menor que el de Coliformes y Streptococcus, por esto no sustituyen a los anteriores, no obstante en aguas carentes de coliformes y Streptococcus informan sobre la posibilidad de contaminaciones no recientes. Clostridium perfringens es de origen fecal y no es patógeno en el intestino de los animales homeotérmicos. No es exclusivamente fecal se encuentra en suelos y guas contaminadas. Por ser una bacteria esporulada tolera elevadas temperaturas y desecación, pH extremos, falta de nutrientes, entre otras condiciones adversas. Cuando está presente en el agua potabilizada y desinfectada indica fallos en el tratamiento o en la desinfección. Su presencia en aguas cloradas se asocia con deficiencias en la filtración. Debido a su alta resistencia las esporas pueden indicar, de forma indirecta, la presencia de quistes de protozoarios .
Se pesan 10g o ml y se homogenizan con 90ml de peptona 0.1% Se realizan diluciones seriadas en 9ml peptona 0.1%
Se ponen los tubos con las diluciones a sembrar en agua hirviendo por 10 minutos para hacer luego el choque térmico y activar las esporas. Para finalizar el choque térmico, se ponen los tubos de diluciones en hielo.
Se siembra 1ml en fondo de la dilución que ha sido sometida a choque térmico y se agrega el medio SPS caliente.
Por ultimo, se llevan a incubar las cajas en cámara de anaerobiosis por 72 horas a 37°C, con sobre generador de anaerobiosis e indicador atmosférico.