Peynirde H.alvei ve laktik asit bakterilerinin shigatoksin üreten E.Coli üzerindeki etkisi

1. Süt ürünlerinden izole edilen bakteri suşlarıyla Shigatoksin üreten
Escherichia coli’nin kontrolü

3. İçerik
 Giriş
 Escherichia coli
 STEC (Shigatoksin üreten E.Coli)
 Çalışmanın amacı
 Materyal ve Yöntem
 Bulgular ve Tartışma
 Sonuç

4. Giriş
 Hastalık Kontrol ve Korunma Merkezleri (CDC)’nin Shigatoksin üreten
Escherichia coli ile ilgili yayınladığı en son raporda Birleşik Devletler’de her
yıl;
 265 binden fazla hastalık,
 3600 tane hastaneye kaldırılma,
 30 tane ölüm meydana gelmiştir.
 Hassas insanlar için 10 bakteri hastalık etmeni olarak yeterli olabiliyor. Bu
yüzden gıdalarda bulunması hiç istenmiyor.

5. GİRİŞ
 E. COLİ
 Enterobacteriaceae
 Gram-negatif
 Çubuk şeklinde
 Spor oluşturmayan
 Katalaz pozitif
 Oksidaz negatif
 Fakültatif anaerob
 Koliform
Çoğu E. coli zararsızdır, insanların sindirim sistemi için önemli mikroorganizmalardır. Zararsız türleri sindirim
sisteminin normal florasında mevcuttur. Vitamin K2’nin üretiminde görev alır ve patojen mikroorganizmaların
çoğalmasını engeller. Fekal-oral yol ile insanlara bulaşır ve hastalığa sebep olur.

6. GİRİŞ
 Bazı E. coli suşları lethal toksik üretme potansiyeline sahiptir.
E. coli (O157: H7), O104:H4, O121, O26 (O26:11), O103, O111, O145 and
O104:H21
Serolojik ve virülans özelliklerine göre enterik patojenler 6 sınıfa ayrılır:
Shigatoksin üreten E. coli (STEC)
Enteropatojenik E. coli (EPEC)
Enterotoksijenik E. coli (ETEC)
Enteroinvazif E. coli (EIEC)
Enteroagregatif E. coli (EAEC)
Düffüz adrean E. coli (DAEC)

7. GİRİŞ
 STEC (EHEC, VTEC)
STEC, shigatoksin üreten patojenik E. colilerdir. Damarlarda hasar, hemorajik kolit
(kalın bağısak iltihabı, kanlı diare), trombositopeni, bir böbrek rahatsızlığı olan
hemolitik üremik sendroma neden olur. Çocuklarda akut böbrek yetmezliğine sebep
verir.
 Trombositopeni
Trombositopeni veya trombopeni kandaki trombosit sayısının azlığına verilen isimdir. Genel
olarak sağlıklı bir insanın trombosit sayımı 150.000 - 350.000/ mm3arasında değişir. Trombosit
sayısının 150.000/mm3'den az olması trombositopeni olarak tanımlanır.
Trombositler, kanama sırasında pıhtılaşma oluşturarak kanamayı engeller. Trombositlerin az
olması durumunda vücudumuzun kan pıhtısı oluşturma yeteneği olmayacak ve bu nedenle
kanama kontrol altına alınamayacaktır. Bu durum herhangi bir yere çarpmadan ya da biri
vurmadan da oluşabilecek morarma, ağız veya burundan kan gelmesi ya da nokta şeklinde
küçük kırmızı döküntülere (peteşi) neden olabilir.

8. GİRİŞ
 HUS (Hemolitik Üremik Sendrom)
EHEC’e bağlı HÜS en sık okul öncesi dönemde (1-5 yaş) görülür. Yetişkinlerde ve 6
aydan küçük olanlarda nadirdir. Çocuklarda HÜS’ün en sık görülen nedenleri
verositotoksin (Shiga benzeri toksin) üreten ve ishale yol açan bakteriyel
enfeksiyonlardır. Çoğu bakteri, konak organizmanın bağışıklık siteminin işleyişini
bozan virülans faktörleri üretir. İntimin adı verilen bir protein EHEC’in en önemli
virulans faktörüdür. İntimin ile EHEC enterosite bağlanır ve hücreleri yıkıma
uğratır. En önemlileri VT-1 ve VT-2 olan çeşitli ekzotoksinler üretirler. VT-2’nin
farklı alt grupları vardır ve HÜS daha çok VT-2, VT-2c ve VTd üreten serotipler
tarafından ortaya çıkarılmaktadır. Hemorajik kolit ve HÜS’e sebep olan
serotiplerin VT-2’nin alt gruplarını, intimin ve hemolizini daha fazla ürettiği
görülmüştür.

9. GİRİŞ
 İlk olarak 1982 yılında patojen olarak tanımlanan E. coli O157 suşu dışındaki
shigatoksin üreten diğer suşlar (non-O157) fazla bilinmez. Bunların sebep
olduğu hastalıklar E. coli O157 suşuyla kıyaslandığında daha hafiftir. Ancak
bazı suşların E. coli O26 gibi E. coli O157 ile aynı toksinleri üretebildiği,
benzer hastalıklara sebep verebildiği görülmüştür. Hemorajik kolit ve
hemolitik üremik sendrom gibi ciddi rahatsızlıklar dahi bu
mikroorganizmaların ürettiği toksinlerden kaynaklanabilmektedir.
 (2011, Almanya, O104:H4 serotipine bağlı 3594 vaka, 852 HÜS, 51 ölüm)
 Ama bugünlerde Amerika’da non-0157 STEClerin daha fazla hastalığa sebep
olduğu tahmin edilmektedir. O26, O45, O103, O111, O121, O145 en çok
görülen non-O157 suşlarıdır.

10. GİRİŞ
 E. coli O157:H7
İlk kez 1982 yılında böbrek yetmezliği hastalığının sebebi araştırılırken tanısı
yapılmıştır. Bir fast-food zincirinin hamburgerlerinin tüketimiyle
ilişkilendirilmiştir. E.Coli’nin bu serotipinin Shigatoksin başta olmak üzere
ürettiği çeşitli virülans faktörler insanlarda hastalıklara yol açtığı görülür.
Shigatoksin farklı varyantlara sahiptirler. Stx1, Stx2, St2c gibi. Endotel ve
diğer hücrelerde protein sentezini inhibe eder. Endotel hücre yüzeyi yani kan
damarlarının iç yüzeyi E. coli O157:H7’ye çok hassastır. Sitotoksijenik etki
gösterir. (Hücrenin çalımasını durduran, azaltan, parçalayan).

11. GİRİŞ
 E. coli O26:H11
Non-O157 STECler içinde HUS ve kanlı diyareye sebep olabilecek en önemli
serotip O26:H11dir. STEC O26: H11 çok dinamiktir. Hızlı bir şekilde stx-taşıyan
fazlarını kaybedip kazanabiliyorlar, bu da onların bulundukları ortama adapte
olmasını kolaylaştırırken dünyaya yayılmış olmasını da açıklar. Yakın zamana
kadar izole edilen O26:H11in sadece Shiga-toksin 1 (Shigatoksin 1A altürü) ve
Shigatoksin 1A’ya ile ilişkili çok az da Stx 2A alttürünü barındırdığı düşünülüyordu.
1990ların ortalarında Avrupa’da yeni bir STEC O26:H11 kopyası (clone)nın
Shigatoksin Stx 2A taşıdığı görülmüştür. Daha sonra Güney Amerika ve Birleşik
Devletler de bu kopyasına rastlanılmıştır. Bu toksin daha ciddi rahatsızlıklara
sebep verebilmektedir. Bu yeni kopya için hastalık edici potansiyeli yüksek
denilebilir. HUS ile de ilişkilendirilmektedir.

12. GİRİŞ
 İnsanlara bulaşma yolları:
 kontamine gıda (et, süt vs.) ve suyun tüketimi,
 hasta hayvanlara temas,
 hayvan dışkısı nedeniyle kontamine olmuş çevre,
 Hasta insanlarla temas,
 Kontamine su ile yıkanmış taze ürünler,
 Hayvansal üretimin olduğu yerlerde hattaki pis suyun akışı,
 Üretim alanlarındaki toz ve böcekler…
 Ayrıca hayvanlar kümeste ve sürülerde birbirine bulaştırabilir.

13. GİRİŞ
 Çalışmanın amacı
Shigatoksin üreten E. coli (STEC O26:H11 ve O157:H7) suşlarının süte inoküle
edilen inhibe edici bakteri türlerinin varlığında gelişiminin değerlendirilmesini
amaçlamaktadır.

14. MATERYAL VE YÖNTEM
 Model peynir kesmiğinde bakteri suşlarının inhibisyon gücünün izlenmesi
41 adet Listeria, STEC, S. aureus üzerinde inhibe edici özelliği olan suşlar Fransa
Ulusal Tarım Araştırmaları Merkezi’ne bağlı Peynir Araştırmaları Merkezi’nden ve
VetAgro Sup Enstitüsü’nden temin ediliyor.
Örneklerin ekim ve sayımı M17 Agar, Man Rogosa Sharpe (MRS), Brain Heart
Infusion (BHI)’da yapılıyor. Gece boyunca 4oC’de tutulduktan sonra inoküle
ediliyorlar.
Süt ve peynirlerden izole edilmiş O26:H11 (21765 ve F43368 suşları) ve O57:H7
(FCH6 suşu) STEC serotipleri VetAgro Sup Enstitüsü’nden temin ediliyor. 24 saat
tamponlanmış peptonlu suda bekletildikten sonra inoküle ediliyor.

15. MATERYAL VE YÖNTEM
 STEC suşlarının H2O2’e karşı duyarlılıkları
O26:H11 21765 ve F43368, O157: H7 FCH6 suşları 108 kob/ml 0.25, 0.50, 0.75,
1.00, 1.50 ve 2.00 mM H2O2 içeren BHI besiyerine ekiliyor. Daha sonra Violet Red
Bile Glucose agar besiyerinde 42oC’de 24 saat boyunca bırakılıyor ve 24 saati
sonunda sayım yapılıyor.
 Bakteri suşlarının H2O2 üretmesi
Bakteriler 107 kob/ml olarak BHI besiyerine inoküle ediliyor, 30oC de 24 saat
boyunca inkübe ediliyor. 200 rpm’de 3 saat boyunca çalkalanıyor. Daha sonra 100
µl kültür 12500 rpm’de 2 dakika santrifüj ediliyor. Prussian blue agardaki
kuyucuklara yerleştiriliyorlar, burada etrafına doğru yayılan bir mavi çeber
oluşturuyorlar. 100 µl steril sudaki farklı konsantrasyonlardaki pozitif kontrolleri
hazırlanıyor. Pozitif kontrollerle kıyaslanarak H2O2 konsantrasyonu tahmin
ediliyor.

16. MATERYAL VE YÖNTEM
 Sütte pH ve redoks potansiyel ölçümü
Sterilize süt tozundan elde edilen süt 106 kob/ml 41 bakteri suşuyla inoküle
edildikten sonra pH ve redoks potansiyelindeki değişimler CINAC sistemi sürekli
olarak kaydediliyor.
 Model peynir kesmiğinin üretilmesi
Kontrol model peynirimiz 50 ml pastörize sütü 33oC de inkübasyonu ve
Streptococcus thermophilus (106 kob/ml) ve STEC suşlarının (102 kob/ml)
ilavesiyle elde edilir. Her inhibe edici bakteri türü 106 kob/ml oranında ilave
edilir. Süt 20 µl buzağı reneti kullanılarak pıhtılaştırılır. (35 dk, 33oC). Daha sonra
20 dk, 33oC’de14000 rpm hızında santrifuj yapılır. Üstünde kalan sıvı kısım
uzaklaştırılır ve çökelek olan kısım 24 saat inkübe edilir. Burada sıcaklık kontrollü
batch reaktörlerle pişirilmemiş preslenmiş peynir üretimindeki sıcaklık değişimi
taklit edilir. (33oC den 24oC ye 24 saat içinde düşürülüyor).

17. MATERYAL VE YÖNTEM
 Pastörize ve çiğ sütten üretilen pişirilmemiş preslenmiş
peynirlerin(uncooked pressed cheese) hazırlanması
500 g pişirilmemiş preslenmiş peynirler 5 l çiğ ve pastörize sütten yapılmıştır.
Kontroller için süt sadece 106 kob/ml S. thermophilus ve 102 kob/ml STEC suşu
inoküle edilmiştir. Örnek numuneler için bakteri türleri de 106 kob /ml olacak
şekilde eklenmiştir. (tek veya beraber). Pıhtılaşmadan 24 saat sonra 9oC’de, %70
bağıl nemde 4 saat boyunca kurumaya bırakılıyor, sonrasında 9oC’de steril
paslanmaz çelik dolaplarda 8-28 gün arası olgunlaştırılıyor. 8. ve 18.günlerde
peynirler %20’lik steril tuzlu su çözeltisiyle yıkanıyorlar.

18. MATERYAL VE YÖNTEM
 Koruyucu etkinlik testleri için Saint-Nectaire tipi peynirlerin
hazırlanması
Saint-Nectaire tip peynirler 40 l çiğ süt kullanarak üretilmiştir. Süt
ENILVden(Ulusal Et ve Süt Endüstrisi Okulu, Eğitim Merkezi), starter kültür
Danisco’dan temin edilmiştir. Starter kültür %0.6 oranında kullanılmıştır.
MY800, St. Thermophilus, Lactobacillus delbrueckii spp. bulgaricus
içermektedir. Ayrıca Penicilium commune küf kültürü 2.5 ml/ 200 l ilave
edilmiştir. (Laboratoire Interprofessonnel de Production- LIP, France). Çiğ süt
102 kob/ml STEC O26: H11, 0.05 kob/ml O157: H7 suşlarıyla inoküle edilmiştir.
Bazı örneklerde Lactobacillus plantarum (FH3), Lactococcus lactis (D5.3), ve
H. Alvei (B16) kombine olarak ilave edilmiştir. Paslanmaz çelik dolaplarda
9oC’de, %96 bağıl nemde 28 gün boyunca olgunlaştırılmıştır.

19. MATERYAL VE YÖNTEM
 Duyusal analiz için Saint- Nectaire tipi peynirlerin hazırlanması
240 l süt 6ya bölünmüştür. 40 litresi sadece MY800 ve ticari küf kültürüyle inoküle
edilmiş, diğer 5 gruba H. Alvei (B16) tekbaşına veya inhibe edici diğer suşlarla
birlikte kullanılmalıdır.
(1) H. alvei (B16) + Lc. lactis (N718)
(2) H.alvei (B16) + Lc. lactis (D5.3)
(3) H.alvei (B16) + Lb. plantarum (FH3) + Lc. lactis (D5.3)
(4) H.alvei (B16) + M. caseolyticus (RP8)

20. MATERYAL VE YÖNTEM
 Analizler
 Mikrobiyal Analizler
Pastörize edilmiş örneklerden sütten 0, 2, 3, 6 saat sonra, model peynir
kesmiğinden 24 ve 48 saat sonra, pişmemiş preslenmiş peynirlerden 6, 24, 48 saat
ve 8 gün sonra örnekler alınıp VRBG (Violet Red Bile Glucose Agar) besiyerinde
42oCde inkübe ediliyor ve daha sonra sayım yapılıyor.
Çiğ sütten 0, 2, 3, 6, 24, 48 saat sonra, ayrıca 8., 18., ve 28. günlerde örnek
alınıp Chrome ID coli besiyerinde 42oCde inkübe edildikten sonra sayım yapılıyor.
İnhibisyon gücü olarak kontroldeki STEC sayısının log10 tabanındaki değerinden,
örnekteki STEC sayısının log 10 tabanındaki değerini çıkarıyoruz. St. Nectaire tip
peynirlerde temel bazımikroorganizma gruplarının gelişimi incelenirken peynirin
üç farklı bölgesinden 10 g numune alınıyor. Seçilmiş besi yerlerine inoküle edilen
bu mikroorganizmaların 1. 8., 18. ve 28. gün sonunda sayımı yapılıyor.

21. MATERYAL VE YÖNTEM
 Mezofilik bakteriler- PCAL
 Enteroccoccus- SB (Super Broth)
 Gram (+), Katalaz (+) bakteriler- CRBM (Cheese Ripening Bacteria Medium)
 Mayalar- OGA (Oxytetracycline Glucose Agar)
 Toplam mezofilik bakteri- PCAI
 Pseudomonas- CFC (Cephalothin-Sodium Fusidate-Cetrimide)

22. MATERYAL VE YÖNTEM
 Fizikokimyasal analizler
Peynirin üç farklı bölgesinde pH’a bakılıyor. 926 VTV pH-meter, Ingold electrode
406 MX cihazı kullanılmaktadır. Üç sonucun ortalaması alınmaktadır.

23. MATERYAL VE YÖNTEM
 Duyusal Analizler
 32 gün sonunda Saint- Nectaire tipi peynirler duyusal olarak
değerlenddiriliyor. 13 eğitimli panelist tarafından 0-10 arası belirlenen
kriterlere göre değerlendirme yapılıyor. 20 adet parameter analizde yer
almaktadır.
 Lezzet- ekşimiş, acılaşmış, meyvemsi, süt ürünü tadı, krema/süt
 Koku-mayhoş, acı(sivri), meyvemsi, tereyağı, krema/süt
 Tat- acı, ekşi, tuzlu, ekşimtrak
 Yapı- ağızda sertlik, ağızda erimesi, granuler, hollerin bulunması
21oC’de panelistlere soruluyor, bütün peynir türleri ayrı tabaklarda rasgele olarak
panelistlere sunuluyor.

24. MATERYAL VE YÖNTEM
 İstatiksel analizler
Statistica Software yazılımında yer alan spearman test kullanılmıştır. Model
peynir kesmiğinde inhibisyon gücü ile 6 saat sonraki pH ve 24 saat sonraki sütteki
pH ve redoks potansiyel arasında bir korelasyon bulunmaya çalışılmış fakat tespit
edilememiş. Duyusal analizlerin istatistiğinde Principal Componet Analysis (PCA)
kullanıldı. Önemli bir fark oluşmadığı görüldü.

25. BULGULAR VE TARTIŞMA
 Model peynir kesmiğinde STEC’e karşı bakterilerin inhibisyon gücü
 41 bakteri suşunun STEC’e karşı inhibisyon gücü, BHI besiyerinde H2O2 üretimi,
sütün redoks potansiyeline ve pH’ına etkisi, ayrıca model peynir kesmiğinin
pH’ına etkisi ölçülmeye çalışılmıştır.
 Leuconostoc pseudomesenteroides M7, H. Alvei B16, Carnobacterium mobile
CR18 ve M. Caseolyticus RP8 en etkili suşlar olmuşlardır. (2.5<IP<2.8)
 Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium
 (2.2<IP<2.5)
 Lc. Lactis’in 5 farklı suşu, Lb. Plantarum, Lb. Farciminis, Lb. Casei, Lb.
curvatus düşük inhibe edici özelliğe sahiptir.
 (IP<1.0)

27. BULGULAR VE TARTIŞMA
 Pastörize veya çiğ sütten üretilen pişirilmemiş preslenmiş
peynirlerde STEC’e karşı bakterilerin inhibisyon gücü
 Sadece tek bir suşun kullanımı
 IP>1.4 olan en etkili suşlar pastörize sütten üretilen pişirilmemiş preslenmiş
peynirlerde denenmiştir. 6 log kob/ml olarak inoküle edilmişler 24 saat sonunda
8.5-9.0 log kob/ml’e ulaşmıştır. En etkili 6 suş şöyledir:
 H. alvei: Üç E.Coli suşunda da benzer etkiye sahiptir.
 Lc. lactis cremoris N718 ve Ln. pseudomesenteroides M7, Lc. Lactis D5.3 ve 1147:
E. coli O26:H11 21765’i diğerlerine göre daha iyi inhibe eder.
 Diğer bakteri suşları kontrol peynir kesmiği ile kıyaslandığında pastörize
pişirilmemiş preslenmiş peynir türlerinde daha az aktiftirler.
 H. alvei, Ln. pseydomesenteroides, Lc. lactis cremoris çiğ sütte daha az etkili
olmuşlardır.

29. BULGULAR VE TARTIŞMA
 Suşların birlikte kullanımı
H. alvei 11 tane farklı suşla beraber inhibisyon için kullanılmıştır. STEC O26:H11
üzerine etkisi incelenmiştir. H. alvei’nin M. caseolyticus, Lc. lactis, Lb.
plantarum ve Lb. lactis ile kombinasyonları H. alvei’nin tek başına
kullanılmasından etkili olmuştur. E. coli O26:H11 (21765) suşuna karşı
kombinasyonların etkileri artmıştır.

31. BULGULAR VE TARTIŞMA
 İnhibe edici türlerin bir arada kullanıldığı Saint- Nectaire tipi
peynirlerde STEC gelişimi
 İnhibe edici gücü en fazla olan kombinasyon
H. alvei B16 + Lb. plantarum FH3 + Lc. lactis D5.3
Bu kombinasyon 3 log kob/g’a kadar azalmayı sağlamıştır.
Ayıca sonucu tabloda gösterilmeyen bir analizde STEC suşları 0.05 kob/ml olarak
eklendiğinde 24 saatin sonunda 2 log kob/g’a yükseliyor. 8 günün sonunda
O157:H7 FCH6 1 log kob/g’ın altına düşerken kontrol grubunda bu sayı 3 log
kob/g’dır.

35. BULGULAR VE TARTIŞMA
 Diğer bazı mikrobiyal grupların 102 kob/ml sayısınca Saint-Necteira tip
peynirlere inoküle edilmesine karşı inhibe edici mikrobiyal suşların
kullanılması sonucu aşağıdaki veriler elde edilmiştir:
 Enterokoklar ve mezofilik bakterilerin sayısında kontrol grubuyla arasında
belirgin bir fark görülmemiştir.

36. BULGULAR VE TARTIŞMA
 Gram pozitif, katalaz pozitif bakterilerde, pseudomonaslarda, dextran üreten
leuconostoclarda inhibe edici etkisi gözlemlenmiştir.
 Redoks potansiyelde azalma olup aerobik bakteriler için istenmeyen koşulların
oluşması sağlanmış olabilir.

37. BULGULAR VE TARTIŞMA
 İnhibe edici türlerin bir arada kullanıldığı Saint- Nectaire tipi
peynirlerde duyusal özellikler
 H. alvei B16 + M. caseolyticus RP8 – keskin koku
 H. alvei B16 + Lb. plantarum F163 + Lc. lactis D5.3 – ekşimsi koku, acı veya
ekşi tat
 H. alvei B16 – tuzlu, tereyağ kokulu, granular yapı
 H.alvei B16 + Lc. lactis D5.3 veya N718- meyvemsi, tereyağımsı koku,
peynirde boşluklu yapı, ağızda yapışkansı yapı
 Toplam skorları göz önüne alındığında ve skorların arasındaki farka dikkat
edildiğinde önemli bir kusurun olmadığı Principal Component Analysis
yöntemiyle tespit edilmiştir. Ancak oluşan küçük farklar inoküle edilen
mikroorganizmaların metabolizması veya mikrobiyal populasyona etkisinden
kaynaklanabilir.

38. SONUÇ
 LAB’nin STEC’e karşı inhibe edici özelliği tür ve suşlara bağlıdır.
 Antogonistik kültürler peynirlerde E. coli O26: H11 ve E. coli O157:H7’i
kontrol etmek için kullanılabilir.
 Mikroorganizmların faaliyetleri duyusal özelliklere zarar vermemiştir.
 Kullanılan türler genel olarak GRAS statüsündedir.
 Seçilen inhibe edici türler peynirlerde kolayca gelişebilmektedir.
 İleride peynir matrisinde görülen inhibisyonda pH ve redoks potansiyelin etkisi
araştırılmalıdır.