Diferenciación odontoblastos

Fisiopatología Pulpar
Profesor: Dr. Juan Carlos Munevar

Presentado por:

Jorge Gruber
Diana Marín

Postgrados Odontología
Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu
Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall
THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July
11, 2008

por
experimentos
DSPP Diferenciacion
Odontoblastos BMP2 Ratones
hipotesis

Hibridación in situ Expresión Mutaciones en Inmuno Histo
forzada NF-Y o quimica.
ADN
de NF-Y Disminucion de Plásmido
Eliminando
fragmentos del BMP-2
promotor EMSA y CHIP
Tiempo real RT-
DSPP
PCR Tiempo real Cultivo y
Ensayo de Análisis cuantitativo tratamiento
tranfeccion Western Blot celular
transitoria

BMP2 NF-Y DSPP
Via de señalización Expresion Diferenciación Odontoblastos

Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan
Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–
19370, July 11, 2008

Interacciones secuenciales Epitelio Dental
Odontogénesis: y recíprocas Ectomesenquima

Células Cresta Neural Craneal
Odontoblastos*
Dentinogénesis Estadios de cito diferenciación
Gradientes temporoespaciales Se originan en el vértice de la
cúspide principal y avanzan hacia la
base del diente

Expresión de genes específicos
de la matriz extracelular dentinal

Matriz orgánica 30%
Colágeno y Proteínas no colágenas NCP
Componentes inorgánicos 70%
Hidroxiapatita Sialoproteína Dentinal DSP Fosfoproteína Dentinal DPP

Modulador de la mineralización
y formación de cristales de
Sialofosfoproteína Dentinal DSP hidroxiapatita
D’Souza R, 1997. Bone Mineral Res.

•Thesleff I. 2003. J. Cell Sci. 116, 1647-1648
• Miletich I and Sharpe P. T. 2003. Hum Mol Genet. 1, R69 – R73

Un patrón especial
Derivado Diferenciación
y temporal que
ODONTOBLASTO CCNC Mesenquimales origina la principal
cúspide a avanza
hacia la base del
diente
Factor de Activan TGF-β1
transcripción Intervienen

heterotrimerico Y Superfamila
NFY TGF-β3 Factor de Factores
crecimiento COMO decrecimiento1-3
Acopla Proteína morfogenica ósea transformanteβ
(BMP)

Síntesis
Secuencia de ADN Promueve
Sialofosfoproteína Matriz orgánica
CCAAT DENTINAL (DSPP) extracelular.

1-3. Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan
19370, July 11, 2008

•Presencia ramificaciones
limitado por la
membrana plasmática •Menor
• Contiene componentes Radio tamaño
cito esquelético Grande •Disminució
• Presentan vesículas n capacidad
CITOPLASMA
secretora
Rudimentario
•Degeneraci
PROCESO
ón celular
ODONTOBLASTICO RER • Muerte
Basofilo celular
Poco gradual
CITOPLASMA
desarrollado
Extenso Asociado a
ribosoma A. GOLGY
RER

Bien desarrollado
supra anuclear
GOLGY Nucleó

BASAL
NÚCLEO

ACTIVO JOVEN MADURO

Goldberg M, Smith AJ, Cell and extracellular matrices of dentin and pulp: a biological basis for
repair and tissue engineering. Crit Rev Oral Biol Med. 2004 : 15;13-27

DSP
ARN P II
Gen DSPP DPP

NH2 COOH

ADN CCAAT
3’
5’

ARNm E I E I E I E I E I E
5’ 3’
DSP DPP Splicing

EXON 1 EXON 2 EXON 3 EXON 4 EXON 5

Eliminación de intrones
5’ 3’

Heterogeneous mutations of human DSPP are associated with dentinogenesis imperfecta type II (DGI-II), type III (DGI-III), and dentin dysplasia type II (DD-
II) (15–19). Biological function of DSPP during tooth development has been confirmed by DSPP knock-out mice.
D’Souza, R. N., Cavender, A., Sunavala, G., Alvarez, J., Ohshima, T., Kulkarni, A. B., and MacDougall, M. (1997) J. Bone Miner. Res. 12,2040–2049

hDSPP EXPRESIÓN
ODONTOBLASTO EXPRESIÓN PREAMELOBLASTO
PERMANENTE TRANSITORIA

DENTINOGENESIS
IMPERFECTA II Función
DG-II DSPP
MUTACIONES MUTACIONES DISPLASIA DENTINAL
HETEROGENEAS 15-19 DD-II Ratones DSPP knock-out
DENTINOGENESIS
IMPERFECTA III ODONTOGENESIS &
DG-III MINERALIZACIÓN
* DENTINOGENESIS
* DIFERENCIACIÓN
ODONTOBLASTOS

15.Xiao, S., Yu, C., Chou, X., Yuan, W., Wang, Y., Bu, L., Fu, G., Qian, M., Yang, J., Shi, Y., Hu, L., Han, B., Wang, Z., Huang, W., Liu,
J., Chen, Z., Zhao, G., and Kong, X. (2001) Nat. Genet. 27, 34520
19- Sreenath, T., Thyagarajan, T., Hall, B., Longenecker, G., D’Souza, R., Hong, S., Wright, J. T., MacDougall, M., Sauk, J., and
Kulkarni, A. B. (2003)J. Biol. Chem. 278, 24874–24880

DIFERENCIACIÓN ODONTOBLASTO
ATLAS DE LA MORFOGÉNESIS DENTAL
¿DIFERENCIACIÓN DEL
ODONTOBLASTO?
REGULADA
FACTORES DE FACTORES DE
CRECIMIENTO TRANSCRIPCIÓN

BMPs
(superfamilia TGF B) BMP2
OSTEOGENESIS 26
DÍA 13 EXPRESIÓN EPITELIO DENTAL
Promueve la DESPUÉS SU EXPRESIÓN CAMBIA A LA PAPILA DENTAL
diferenciación INCREMENTA EN DENTINOGENESIS29
de las células
Stem BMP2 determina el destino de las
BMP2
Mesenquimales células ectomesenquimatosas.
DSPP SE EXPRESA INTENSAMENTE
a osteoblastos
EN ODONTOBLASTOS.

FACTORES DE
TRANSCRIPCIÓN FUNCIONES IMPORTANTES DURANTE
RUNX2/SMAD27 LA ODONTOGENESIS 30
26. Chen, D., Zhao, M., and Mundy, G. R. (2004) Growth Factors 22, 233–241 27. Reddi, A. H. (1997) Cytokine Growth Factor Rev.
8, 11–20 28. Ducy, P., and Karsenty, G. (2000) Kidney Int. 57, 2207–2214 29. Venezian, R., Shenker, B. J., Datar, S., and Leboy, P. S.
(1998) J. Cell Physiol. 174, 331–341 30. De Luca, F. D., Barnes, K. M., Uyeda, J. A., De-Levi, S., Abad, V., Palese, T., Mericq, V., and
Baron. J. (2001) Endocrinology 142, 430–436

UNE PROMUEVE

TGF-β1 O BMP2 Receptor FC
FOSFORILACION ACTIVANDO

COMPUESTO
Dominio regulador N
terminal y Dominio Proteína RAS
cinasa C terminal
RAF

UNE
ESTABILIZADO ACTIVANDO

FOSFORILA FOSFORILA

Serina P
14-3-3
Proteína 14-3-3
Dominio R
N Terminal

19370, July 11, 2008

Separándose del
HIDROLIZA FOSFORILA
MEK
RAS RAF activado

EXPONE
Tirosina 185
DESESTABILIZA

Treonina 183 El labio de MAPc MAP Cinasa

FOSFORILA

MEK

Dimerización al ACTIVA
Factores de
núcleo transcripción
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Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL.
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NF-YA
Complejo NF-Y
COMPONE

SUBUNIDADES NF-YB

NF-YC
En orden de
secuencia
Homologo DE
NF-YB
de ADN H2A Y H2B
NF-YC
Histona

NECESARIO

CCAAT Expresión
UNE de genes
HETERODIMERIZACION como el
NF-YA ¨colágeno¨

283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008

NFY-B y NFY-C

ADN Secuencia de
nucleotidos
3’
5’
Homologa
Histonas H2A y H2B

ADN Secuencia de
nucleotidos Heterodimerizacion
3’
5’

NFY-B NFY-C

NFY-A
CCAAT
3’
5’
Kim, I. S., Sinha, S., de Crombrugghe, B., and Maity, S. N. (1996) Mol. Cell Biol. 16, 4003–4013
Liberati, C., di Silvio, A., Ottolenghi, S., and Mantovani, R. (1999) J. Mol. Biol. 285, 1441–1455
Bhattacharya, A., Deng, J. M., Zhang, Z., Behringer, R., de Crombrugghe, B., and Maity, S. N. (2003) Cancer Res. 63, 8167–8172

Es realizada por los odontoblastos, los cuales
forman tres tipos de dentina fisiológicas.

La dentina primaria y la dentina secundaria no
presentan ningún tipo de diferencia histológica
exceptuando la interface entre ambos tejidos.
La dentina terciaria es sintetizada debido a
respuestas mecánicas, térmicas o traumáticas.

Goldberg M, Smith AJ, Cell and extracellular matrices of dentin and pulp: a biological basis
for repair and tissue engineering. Crit Rev Oral Biol Med. 2004 : 15;13-27

ESTADIOS TEMPRANOS ESTADIOS TARDÍOS DE
DE LA DENTINA LA DENTINA

VÍA DE LA MAPquinasa
( TGF beta) y ( FGF)

colágeno tipo I,
(BMP4) Generar la matriz de la
(DMP1) dentina
(DSPP)
(TGF-BETA1) .

S. Simon, AJ, Simith, P.J, Lumley, A. Berdal, S . Finney , PR . Cooper; ( 2009) Molecular
Characterizacion of young and mature odontoblasts: Bone

DENTINA SECUNDARIA

Expresión de genes colágeno tipo I y
DSPP

Deposición activa de dentina

De expresión de DMP1( fosfoproteína de la matriz de la dentina)
De expresión IBSP ( sialoproteina del hueso)
SPP1 (fosfo proteina secretada 1)

La concentración de fosfatasa alcalina
Amelogina transcriptasa Y influenciar en la deposición
dentinaria

S. Simon, AJ, Simith, P.J, Lumley, A. Berdal, S . Finney , PR . Cooper; ( 2009) Molecular Characterizacion
of young and mature odontoblasts: Bone

Receptor proteína serina /
treonina quinasas

Receptor I –
fosforila II

Activa al factor de
transcripción SMAD

Fosforila y trasloca
al núcleo

Expresión génica

La Célula; Geoffrey M. Cooper y Robert E. Hausman; 4
edición; 2008

Muerte del GENERACIÓN Odontoblasto
odontoblasto secundario

DIFERENCIARAN

• Célula Madre
Células •Fibroblasto
progenitoras • célula sub
odontoblasticas
SECRETAN
• Celula
Mesenquimaticas
indiferenciadas
de la pulpa
Matriz
dentinaria


DENTINA TERCIARIA

Factores de crecimiento

Expresados en procesos de
desmineralización

Familia de TGF- β

TGF-β1 y el TGF -β3,


Diferenciación de células SEÑALIZACIÓN CONTROLA
Vía de
Activador de
odontoblasticas trascripción
proteína ( AP-1)

ESTIMULA FORMADAS

la transcripción Familia de
proteínas
osteocalcina ( JUN-FOS-ATF)
fosfatasa alcalina INTERVIENEN
colágeno

Células pulpares •Diferenciación
forman una línea • Proliferación
de células • transformación
reparadoras

Via de la AP-1

Compuesta

Proteínas

DSPP
Fos Jun ATF

Formar
C-Jun, Jun-B y Jun D

Expresión
genes

ayuda

Homodimeros o Heterodimeros cofactor transcripcional p300
( fosfoproteína nuclear)

Narayanan K, Srinivas R, Peterson MC, Ramachandran A, Hao J, Thimmapaya B,Scherer PE, George A.J Biol Chem.
2004 Oct 22;279(43):44294-302. Epub 2004 Aug 11.

Uniones celula-celula pueden ser :
Uniones GAP son:
 Compuestas por proteínas Conexina 6 de estas forman un conexon
 Especializadas
 Interviene en mineralizacion-citodiferenciacion y respuesta
intracelular
 Contienen vías intracelulares de transferencia de iones y metabolitos
solubles
 Se presenta en la superficie de el odontoblasto
 Unión entre citoplasma- citoplasma

La Célula; Geoffrey M. Cooper y Robert E. Hausman; 4 edición; 2008

Uniones celula-celula pueden ser :
Uniones Desmosomicas

 contiene 2 proteínas ( cadeina especializada)
desmocolina y desmogleína
 Forman placas citoplasmáticas gruesas
 Interactúan con filamentos intermedios
 Se unen a distintas fibras cito esqueléticas

OBJETIVO

DEMOSTRAR SI LA BMP2 REGULA LA
TRANSCRIPCIÓN DEL GEN DSSP Y POR LO
TANTO LA DIFERENCIACIÓN DEL
ODONTOBLASTO

Preparación de animales y tejidos:

Los ratones ICR fueron adquiridos por el Laboratorio Harlan de
Animales S.A. (Indianápolis, IN).

Los tejidos de ratones de diferentes edades fueron recuperados y
preparados para ensayo de hibridación in situ y aislamiento RNA.

Institutional Animal Care Texas
Health Science Center

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Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF
BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008

Cultivo y Tratamiento Celular:
 Luego cultivadas en un medio mínimo esencial sin suero y
estimulados con 100ng/ml de BMP2 humana recombinante
en presencia o ausencia de cicloheximida ( Inhibidor de la
biosíntesis de proteína) (CHX) (10 µg/ml) de 0 a 72 horas

 Los niveles expresivos de la subunidad NF-Y, de la DSP, y de
las proteínas β-actinas ( Controla la expresion de genes
constitutivo) utilizados como control. se analizaron por el
análisis de secado Western.


es un método para la detección de proteínas de una
muestra de un tejido homogeneizado . Implementa gel
electroforesis para separar proteínas desnaturalizadas
de la masa.

Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-
Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE
JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–
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1. La muestra es colocada en la matriz ( gel de
electroforesis)
2. Se tranfiere las bandas de la electroforesis a la
membrana de western blot.
3. Se usan acidos con el fin de precipitar las bandas
4. Se agrega anticuerpos para la inmuno identificasion de
las bandas de interés.

http://www.cultek.com/inf/otros/soluciones/CULTEK-TecnicaWB.pdf

Western Blot
transfección Después
transitoria expresión
MD10- F2 Plásmido NF-Y 72 h
lavadas

transferidas Gel
electroforesis
Trans-Blot lisadas
SDS-PAGE
gel
Detección
proteínas
de
anticuerpos Cabra
de β-actina Antiratón

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ADN plásmido

 construye p1243 ( longitud de los fragmentos) los
fragmentos 5 ' a 3' Bgl II y Hind III, ( enzimas de restricción)
entre nt ( secuencia de nucleótidos) -1.243 y +54 del promotor
del gen DSPP del ratón.

 El P241 a partir de un fragmento 295-BP KpnI y Hind III entre
NT-241 y +54.

 El p791fue igualmente generado a partir de un fragmento de
entre nt-791 y +54 NT contiene XhoI y sitios Hind III.

 El p97 a partir de un fragmento de 151-BP Bam HI y Hind III.
entre NT -97 y + 54, y el p72 a partir de un fragmento de 126-
BP Xba I y Hind III entre -72 y +54.
Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong,
Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–
19370, July 11, 2008

283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008

 Se creo la mutación plásmido, p97mut, este
fue generado por la génesis de mutación
específicamente situada en el ADN p97
que fue construido como molde.

Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL
CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008

Ensayo de transfección transitoria:

 Los plásmidos para le estudio, el plásmido mutante P97 y los
básicos PGL-3( plásmidos de control) fueron transfectados en
las células MD10-F2 utilizando el reactivo Lipofectamina .
( reactivo que ayuda a la trasfeccion)

 Dos días después de la transfección, las células fueron
embebidas en suero durante 12 horas.

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 fueron añadidos 100 ng/ml de BMP2 recombinante
humano durante 12
 Se retira el suero.
 Para inhibir el efecto de la BMP 2 se agregaron dosis
de Noggin (5-20µg/ml) ( inhibidor).
 Apartir de la actividad de la luciferasa ( vector de
plásmido) genera fluorecencia dando los resultados.

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 Primero se separaron los extractos nucleares de la célula MD10-
F2
 Segundo se midió la concentración de proteínas utilizando la
técnica de Bradford la cual debe realizarse rápidamente, esta
utiliza la capacidad de atascamiento entre las proteínas del tinte
Coomasie g-250 el cual tiene un máximo de absorbencia de
595nm.
 Después se empezó a realizar el EMSA el cual es un estudio de
electroforesis en el que a las proteínas a estudiar se les agrega
otra proteína y un anticuerpo aumentando su peso, entonces
cuando esta proteína corra por el gel de agarosa va a tener un
sobre corrimiento (retardo mayor), de esta forma se confirma la
identidad y presencia de la proteína.

“La proteína utilizada fue la [ -32P]ATP y quinasa de
polinucleótido T4 y se purificaron en un 15% en gel de
poliacrilamida. “

Bioquimica, Thoma M Devlin, edición: 4, editorial Reverte- 2004
Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich§, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan Dong, Isabel
Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008

 Las proteinas cubiertas y libres de complejos de ADN
fueron cargadas dentro del Gel de poliacrilamida nativo
en el bufer 1x Tris/ácido bórico/EDTA(TBE)
electroforisadas, secadas, y expuestos a la placa
radiográfica.

 Experimentos de cambios considerables de anticuerpos
fueron realizados con anticuerpos específicos para las
sub unidades NF-YA, NF-YB, y NF-YC.

 Estos anticuerpos se añadieron a los extractos nucleares
10 minutos antes de la adición de la sonda radiactiva.

Shuo Chen, Jelica Gluhak-Heinrich§, Marcos Martinez, Tong Li, Yimin Wu, Hui-Hsiu Chuang, Lei Chen,Juan
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Es un estudio histopatológico que se basa en la utilización de un
anticuerpo específico, previamente marcado mediante un enlace
químico con una enzima que puede transformar un sustrato en
visible.

sin afectar la capacidad del anticuerpo para formar un complejo
con el antígeno, aplicado a una muestra de tejido orgánico

19370, July 11, 2008

INMUNOHISTOQUÍMICA

Cultivadas
MD10-F2 placas de vidrio con BMP2
100 ng/ml
sin

enjuagaron

acetona fría PBS
Fijan
y enfriado por hielo
metanol 10 min.

expresión DSPP
Detección Inmunohistoquímica DSP
cuantitativa fluorescente anticuerpos
NF-Y

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INMUNOHISTOQUÍMICA

Toda la noche 1:100
disolución
Incubación Anticuerpos
4°C primarios

lavado

PBS

agregación
Obtención imágenes
cuantifico
Software microscopio anticuerpos secundarios
MetaMorph
Olympus con Alexa fluo

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Identifica los vínculos entre el ADN y proteínas
monitoreando la regulación de la transcripción de a
través de la modificación de las histonas o interacciones
de unión factor de transcripción al ADN.

Este tiene la capacidad para capturar una imagen instantánea de las
interacciones proteínas específicas al ADN que se presentan en un
sistema y cuantificar las interacciones utilizando el (PCR).

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INMUNOPRECIPITACIÓN DE
CROMATINA (CHIP)
Estabilización

Paso 1 entrecruzamiento:
complejos de proteínas y ADN

celulas

MD10-F2

Con y sin BMP2
En vivo

complejos de penetra entrecruzamiento
Análisis estabilizan proteína con
y de ADN
bloqueando formaldehído al 1%,

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CROMATINA (CHIP)

Paso 2: Lisis Celular AND + Proteína
Extrae
Agrega

Reactivo
NE-PER

Separar

Sensibilidad Núcleo de citoplasma
aumenta

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CROMATINA (CHIP)

analizar Unión proteínas
Paso 3: Corte de Cromatina

cortar

ADN extraído

mecánicamente

Fragmentos de Sonificacion
200-800pb.

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CROMATINA (CHIP)
Paso 4: Aislar Histonas específica modificada
inmunoprecipitación: Factor de transcripción
Co-factor de interés

agregar

Anticuerpos de CHIP-validados

aislar immunoprecipitar

Antígeno +Anticuerpo Lo complejos de otros
anticuerpo de resina componentes
vinculantes G Agarosa. con purificados nucleares

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CROMATINA (CHIP)
Revertir
Paso 5: entrecruzamiento revertido y limpieza de ADN
enlaces

Proteínas + ADN
mediante

calor extenso
por

5 horas a 65°C
Con
tratado
Material 200 mm de NaCl
Proteinaza K recuperado 10mg de ARNasa

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CROMATINA (CHIP)

Paso 6: Amplificación de ADN PCR

1er ciclo 95°C durante 4 minutos

2do ciclo 95°C durante 30segundos

3er ciclo 58°C durante 40segundos

4to ciclo 72°C durante 2 minutos

Se repitió 32 o 36 ciclos.

Chen,Juan Dong, Isabel Gay, and Mary MacDougall THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
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Reacción de la Cadena de Polimerasa en
Transcripción Reversa
(RT-PCR)

Metodo enzimatico de sintesis in vitro de multiples copias en forma de AND
De una secuencia de ARN

Transcriptasa reversa
Denaturalization Mezcla de
Agrega nucleotidos
ARN Sintetiza
Inhibidor de la
ARNasa AND
MgCl2 Complementaro

Observar el gen de donde proviene la proteina
PCR tiempo real

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Primers NF-YA, NF-YB y NF-YA
Amplificar y agrega Desoxirribonucleótidos
Cuantificar ADN Buffer
ADN polimeraza Termo estable
fluoróforo (SYBR Verde)

Termociclador
Fluoresencia
Con sensores de fluorescence
mide

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Calentar y enfriar
TermocicladorABI 7500 Ciclos
Muestras

Ciclo 1 Ciclo 2 Ciclo 3 Ciclo 4

30 seg a
1min a 94°C 7 min a 72°C
58 y 60°C, 1 min a 72°C

Reducir ruidos
Separacion Alineamiento ADN
Presencia
Ac Nucleicos Primers polimeraza
dimeros
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coloco teñido
ADN Gel electroforesis de agarosa Bromuro de etilio
1.5%

mediante
Pelicula se observó
fotografio luz
fotografica SYBR Verde
ultravioleta
calculo

Valores utilizando Mayor +rapida
amplificacion
software SDS2 expresion

Menor + lenta
amplificacion
expresion

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La fosfatasa alcalina es una enzima, una proteína que ayuda a la función celular.
Se encuentra en concentraciones elevadas en las células formadoras de los
huesos y en el hígado, esta se encuentra elevada cuando hay crecimiento óseo
y dentinogénesis.

La actividad de la fosfatasa alcalina cuantitativos (ALP) de las células
lisadas fue realizada utilizando fosfato ρ-nitrofenil como sustrato.

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ANÁLISIS FOSFATASA ALCALINA

Concentración determinó análisis reactivo de método
de la proteína BCA colorimétrico
proteínas (Pierce)
unión

proteína
+
complejo cromóforo-metal

condiciones acídicas

interacciona
determinar
Concentración Residuos proteínas

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La BMP2 estimula la expresión de la DSPP en las células MD10-F2

MD10-F2

Preodontoblastos añadió inducir
BMP2 (100ng/ml) DSPP Misma familia
de ratón

induce expresión sialoproteina ósea
BMP2 (100ng/ml)
genética (BSP)

Otros estudios EN

Ligamentos Las células
periodontales del folículo
dental
VOL. 283, NO. 28, pp. 19359–19370, July 11, 2008

RESULTADOS
qRT-PCR Expresión RNAm de la DSPP

•3.7 en 12 horas
100 ng/ml

•2.7 en 24 horas

•2.4 en 48 horas

•1.7 en 72 horas

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B- actina

ciclofilina Gen
constitutivo

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RESULTADOS
Inmuno fluorescencia cuantitativa

Expresión de proteina DSPP en
el citoplasma
Acumulación de DSPP en el núcleo

El máximo nivel de expresión DSSP
fue a las 24 horas después de la
estimulación de la BMP2
Sin Ac
DSPP
Celulas IGG1 Grupo control
negativo

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RESULTADOS
Identificación de un elemento de respuesta de la
BMP2 en el promotor de gen DSSP en el ratón

Transfección transitoria ADN plásmido,
comparación con y sin BMP2

P1243. 1.6 veces la actividad transcripción



p97 .3,2 veces la actividad transcripción

p72 . resistente a estimulación

estos resultados indican que el elemento
Grupo control : de respuesta de la BMP2 reside entre NT
1 vez -97 y -72 en el promotor de la DSPP del
P: < 0,05* ratón
P: < 0,001 **
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RESULTADOS
Unión de complejos NF-Y al elemento de respuesta
de la BMP2 en el promotor de gen DSSP en el ratón
Sonda EMSA

Identificar los factores de
transcripción
que unen al elemento de respuesta
BMP2 entre NT -97 y -72,

AP-1 (FOS/jun), NF-kB,GATA,
AP-3, NF-Y, el CP2, CCAAT y
C/EBP

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RESULTADOS
El resultado muestra

Complejo proteína + ADN

de 50 y 100
excesos molares

La sonda de tipo salvaje
y
NF-Y compitieron
indicando que si se
CARRILES DE LA SONDA EMSA expresa la NF-y

RESULTADOS
Se confirmo que la secuencia de ADN en el elemento
de respuesta de la BMP2 contiene un sitio de unión NF-Y

superposición de anticuerpos de
sub
Unidades NF-Y.

Extractos nucleares

MD10-F2
luego con

sondas de tipo
salvaje
etiquetadas

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secuencias promotoras de
DSPP de nucleótidos de
ratones se muestran de NT-
100 a-66. Varios posibles
factores de transcripción de
sitios de unión presentes en
este elemento.

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RESULTADOS

Ensayos de CHIP

ADN purificado fue utilizado como molde para
PCR, utilizando cebadores correspondientes a la región de
acompañamiento de la DSSP 5’ del ratón

Cebadores
específicos
Cebadores
específicos

Caja de unión
NF-Y

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RESULTADOS
Producto 181-BP de la PCR se amplificó partiendo de
un fragmento de ADN inmunoprecipitado por anticuerpo NF-YB

Carril 2: muestra un control negativo,

Carril 3: muestra el anticuerpo TFIIB ligado al sitio de unión TFIIB
en la región promotora GAPDH. Control positivo

Carril 4: muestra de ADN de entrada amplificada por primers de
la DSPP del ratón.

Carril 5: muestra los objetivos de DSPP que fueron efectivamente
inmunoprecipitados por el anticuerpo NF-YB

Estos resultados indican que la NF-Y físicamente se une
a la caja invertida del CCAAT en el promotor in vivo de la
DSPP del ratón.
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RESULTADOS
Expresión de la DSPP, la BMP2 y del NF-Y durante desarrollo del
diente

hibridación in situ E15 expresión RNAm de la BMP2
en la papila y no de DSPP

E16 RNAm de l en odontoblastos y
preodontoblastos en la fase folicular

(PN) 1 expresión de DSPP y BMP2
siendo mas abundante BMP2

En PN3 y 2 semanas aun se veían expresiones
De DSPP y BMP2

BMP2 era relevante a la expresión de la DSPP durante las
últimas etapas de la diferenciación y maduración de
odontoblastos
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RESULTADOS
Actividad de la fosfatasa alcalina (ALP)

MD10-F2 BMP2 3 o 6 días
tratadas o no por

Mayor expresión de ALP con BMP2

BMP2 promueve la
diferenciación celular MD10-F2

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RESULTADOS
extraído
RT PCR RNA 2, 10 y 13 semanas PN

midió

expresión de RNAm

sub unidades NF-Y

utilizo

cebadores específicos

Las tres subunidades de NF-Y
se expresaron en las células MD10-F2

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RESULTADOS
La BMP2 regula la expresión del NF-Y en las células MD10-F2

qRT-PCR

•NF-YA mRNA alcanzo su
maximo a 24 H

•NF-YB mRNA alcanzo su
maximo a 12 H

•NF-YC mRNA alcanzo su
maximo a 12 H

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RESULTADOS
El ensayo de Inmuno fluorescencia

NF-YA Núcleo 12 horas y continuó
durante 72 horas
localización celular
NF-YB
de Punto máximo en núcleo a
las 24 horas
subunidad de NF-Y.

NF-YC 24 y las 48 horas y
disminuyo
acumulación nuclear por 72 h

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RESULTADOS
Inhibición del efecto de la BMP2 sobre inhibidor síntesis de proteínas
la expresión NF-Y de la cicloheximida

cicloheximida
con o sin

observó

regulacion expresion

subunidad DSPP por
NF-Y la BMP2

Estos resultados sugieren que la BMP2
es necesaria para la síntesis de la proteína NF-Y Disminución en ambas

12 a 72 horas
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RESULTADOS
El sitio de unión NF-Y es requerido para la actividad promotora del
DSPP mediada por la BMP2

Sonda no interactúa
mutada con NF Y

NO
Sonda interactúa
mutada con NF Y

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RESULTADOS

responde
p97 No estimulación
mutada de BMP2

p97Mutada No responde
estimulación
de BMP2

Control pGL3

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RESULTADOS
Comparación de la DSSPP con y sin bloqueo de
la BMP 2 mediante el noggin

Expresión génica de la
DSPP mediada por la
BMP2 a través de la
señalización NF-Y y el
CCAAT es importante, no
sólo para la unión NF-
Y, sino también para la
expresión de la DSPP
mediada por la BMP2 en
las células
preodontoblastos de
ratón

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BMP2 desempeña un papel
importante en la La señalización de la BMP2
diferenciación dental, así induce a la diferenciación
como en el desarrollo de de células mesenquimales
dientes y en el crecimiento. en odontoblastos

Lindhe, 2009 Iohara, K., Zheng, 2006

En este estudio, hemos identificado
un factor de transcripción del sitio
de unión NF-Y en el promotor
proximal de la DSPP del ratón que
media la estimulación de la BMP2
sobre la expresión DSPP.

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La expresión genética DSP aumenta
DSPP se ha caracterizado como un durante la dentinogenesis y el
marcador unico de la patrón del gen de la DSSP se
diferenciación de odontoblasto encuentra muy restringido a los
D’Souza 1997 tejidos dentales
D’Souza 1997

Se mostro que la BMP2
es relevante para la
expresión genética de la Se mostro que las
Indicando que la BMP2
DSPP y para la BMP2 auto regulan la
promovió la
diferenciación de expresión de la DSPP
diferenciación de
odontoblastos de y de los genes ALP
preodontoblastos.
en las células MD10-
Además la DSPP se
F2
acumula en el núcleo
en respuesta a la
BMP2

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Encontró el dominio DPP de la
DSPP auto reguladora de huesos y Aunque siguen siendo
dientes, a través de los genes desconocidos los mecanismos
relacionados con la integrina / moleculares de la acumulación
vías de señalización Smad y MAPK nuclear de la DSPP en respuesta a
Jadlowiec, 2004 la BMP2

Se ha informado de que la expresión de la BM2 estimuló la BMP y
los genes de osteocalcina y promovió la diferenciación de células
mesenquimales a células osteoblásticas (Runx2/Smad) mediada a
través de la vía de transducción de señales
Ducy. Banerjee, 2001

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MAPK participa también en
respuesta a la BMP2 y regula la
BMP y las expresiones del gen de la Se observo que hay presencia de un
osteocalcina en el folículo dental y papel potencialmente importante en
en las células del ligamento la regulación transcripcional de
periodontal genes DSPP.
Zhao, 2002

Sin embargo, no se ha descartado que otros elementos reguladores
en el promotor de la DSPP del ratón estén expuestos a
responsabilidad de la BMP2

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Utilizando anticuerpos contra tres
EMSA nos indico que el factor de subunidades NF-Y en experimentos
transcripción NF-Y se une a este de anticuerpos ultra cambiantes. se
elemento de respuesta de la BMP2 en el mostró que las NF-Y especialmente
promotor de la DSPP del ratón se unen a CCAAT dentro del
elemento de respuesta de la BMP2

la expresión de cada subunidad
de NF-Y se ha visto en células Los ensayos ChIP in vivo
MD10-F2 y en los tejidos del también demostraron que las
diente del ratón en las diferentes NF-Y es enganchada a CCAAT
etapas de desarrollo de los
dientes

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El NF-Y se compone de tres
El NF-Y es un complejo de subunidades, NF-YA, NF-YB y NF-YC.
proteínas heterotriméricas que Las subunidades A y C se asocian a
se une a la figura CCAAT través de un subdominio que se une el
encontrada en el promotor de ADN y se asemeja a la estructura
muchos genes eucariotas helicoidal α, encontrada en las
Lyons, K. M.,1990 proteínas histonas básicas
Kim, I. S.,1996

La actividad de transactivación del
NF-Y está mediada por la asociación Se indica que el NF-Y es capaz de
de los heterodímeros A/C con la modificar la estructura de la
histona acetiltransferasa P/CAF (47) y cromatina, activando su gen
por la asociación de la subunidad A objetivo de expresión.
con el P300. Faniello, M. C.,1999
Currie, R. A. 1998

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NF-Y ha sido reportado como
una proteína reguladora que demostró que el suero reguló el
responde a varios estímulos enlace del NF-Y a los promotores de
moleculares varios ciclos genéticos celulares en
las células y que activó sus
Caretti, G.,2003 expresiones genéticas
Sjin, R. M.,2002

Nuestro estudio muestra que la BMP2
reguló los genes de expresión del NF-
Y y activó la acumulación nuclear de
las subunidades NF-Y incrementando lo que sugiere que la BMP2 regula
la unión a la cromatina de la CCAAT la síntesis del NF-Y.
en el promotor de la DSPP en las
células MD10-F2 del ratón

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Además de la regulación de la El mecanismo por el cual los factores de
expresión del NF-Y, también crecimiento como la BMP2 median la
observamos que la BMP2 indujo la translocación nuclear del NF-Y sigue
acumulación del NF-Y en el núcleo siendo desconocido.
de las células MD10-F2

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CONCLUSIONES

Se encontró la primera evidencia de que la BMP2 activa la
transcripción de genes DSPP a través de señalización NF-Y, y este
patrón BMP2-NF-Y- DSPP desempeña un papel importante en la
diferenciación de odontoblastos.

La expresión de la DSP es de gran importancia durante la
dentinogenesis por lo cual es muy importante el gen de la DSPP

La DSPP se acumula en el núcleo en respuesta a la
BMP2

CONCLUSIONES

Alteraciones en el gen de DSPP pueden afectar tanto la diferenciación
odontoblastica como la dentinogenesis.

Podemos concluir que la BMP2
es necesaria para la síntesis de la proteína NF-Y

Se confirmo que la secuencia de ADN en el elemento
de respuesta de la BMP2 contiene un sitio de unión NF-Y

Siguen siendo desconocidos Los mecanismos moleculares de la
acumulación nuclear de la DSPP en respuesta a la BMP2 por lo cual se
recomienda hacer investigaciones.

Se sugiere realizar investigaciones que identifiquen los
mecanismos moleculares que regulan la diferenciación de
células dentales, en particular la diferenciación de
odontoblastos.

Se debe investigar para buscar aplicaciones clínicas de cómo utilizar el
BMP2 para estimular la diferenciación de odontoblastos y por ende la
producción de dentina

Deben realizarse investigaciones sobre el El mecanismo por
el cual los factores de crecimiento como la BMP2 median la
translocación nuclear del NF-Y.

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