1. Universidad de Oriente
Núcleo Bolívar
Escuela de Ciencias de la Salud “Francisco Batisttini”
Dpto. de Ciencias Fisiológicas: Bioquímica
Profesora Zulay Castillo Pérez
2. Enzimas
Proteínas con actividad catalítica de los seres vivos.
Unidades del Metabolismo
Regulan la velocidad de las reacciones químicas espontáneas
(ΔG-).
No promueven reacciones no-espontáneas (Δ G +).
Incrementan la velocidad de reacción 103 a 1012 veces sin
afectar el sentido de la reacción.
No forman parte del producto de la reacción.
3. Enzimas
Catalizador de origen biológico y naturaleza proteica, de
alto peso molecular y conformación tridimensional
característica, acelera la reacción al disminuir la energía
de activación.
Estructura
Contiene un centro activo, generalmente situado en un entorno
apolar. La actividad catalítica requiere que dicho centro adopte
una conformación determinada, mantenida por el resto de la
molécula proteica.
4. No hacen factibles las reacciones imposibles
Son sustancias que, sin consumirse en una
reacción, aumentan notablemente su velocidad.
Ello hace posible que en condiciones fisiológicas tengan
lugar reacciones que sin catalizador requerirían
condiciones extremas de presión, temperatura o pH.
Prácticamente todas las reacciones químicas que tienen
lugar en los seres vivos están catalizadas por enzimas.
* En su mayoría son proteínas, hay ARN con capacidad catalítica (ribozimas)
5. Propiedades generales
Aumentan la velocidad de reacción
◊ De 106 a 1012 veces vs sin enzima.
◊ Aún más rápido que los catalizadores químicos.
Condiciones de reacción
◊ Temperatura 25-40 o C (algunas hasta 75 o C)
◊ pH neutro (5-9), la mayoría 6.5 – 7.5
◊ Presión atmosférica normal
Capacidad de regulación
◊ Por concentración de sustrato
◊ Por concentración de enzima
◊ Por inhibidores competitivos (semejantes al sustrato)
◊ Por inhibidores no competitivos (modificación covalente de la
enzima)
◊ Por regulación alostérica
Alta especificidad de reacción
◊ Interacción estereoespecífica con el sustrato
◊ No hay productos colaterales.
6. Enzimas simples y conjugadas
Las enzimas simples están constituidas por
proteína sin requerir de la unión de otra molécula o
grupo químico para realizar su actividad catalítica.
Las enzimas conjugadas poseen en su estructura
una parte no protéica esencial para su
funcionamiento que según su naturaleza puede
llamarse cofactor o coenzima.
7. Apoenzima: fracción protéica
Cofactor: grupo que se une a la fracción protéica para
permitir el correcto funcionamiento de la enzima.
Holoenzima: fracción protéica + cofactor o coenzima
8. Cofactores
Átomo, ion o molécula que participa en el proceso catalítico sin
ser enzima ni sustrato.
Los cofactores participan de dos maneras distintas:
A través de una fijación muy fuerte a la proteína y salen sin ser
modificados del ciclo catalítico.
Como un segundo substrato; salen modificados del sitio
catalítico y por lo general requieren otra enzima para volver al
estado original.
9. Cofactores
En función de su naturaleza los cofactores se denominan:
Grupos prostéticos: se trata de iones o moléculas
inorgánicas.
Coenzima: es una molécula orgánica. Aquí se puede
señalar, que muchas vitaminas funcionan como coenzimas;
y realmente las deficiencias producidas por la falta de
vitaminas responde más bien a que no se origina la
coenzima, para una determinada enzima.
11. Coenzimas de naturaleza no
vitamínica
Hemo Hemoenzimas , citocromos
Complejos Fe-S Ferredoxinas
Quinonas Transporte electrónico mitocondrial y
fotosintético
Glutatión Redox, transporte de aminoácidos
ATP Transferencia de fosfato y/o energía
UTP Transferencia de grupos glucosídicos
Carnitina Transportador de grupos acilo
12. Sitio Activo
Región de la enzima donde se une la molécula de sustrato
de forma específica, suele ser un bolsillo o una hendidura
que se forma entre las cadenas laterales de los aminoácidos.
Estas cadenas:
• Facilitan la unión del sustrato (especificidad de sustrato)
• Intervienen en la catálisis (centro catalítico)
13. Sitio Activo. Características
1. Supone una porción relativamente
pequeña del volumen total de la
enzima
2. Es una entidad tridimensional
3. Se unen a los sustratos por fuerzas
relativamente débiles
4. Son hoyos o hendiduras de las que
suele quedar excluida el agua, salvo
que sea un componente de la
reacción
5. La especificidad del enlace depende
de la disposición de los átomos
del centro activo
14. Sitio Catalítico
Lugar de la enzima en el que ocurre la catálisis y
puede incluir también:
• Coenzimas
• Cofactores
Puede coincidir o no con el centro activo
15. Mecanismo de unión del sustrato
al sitio activo
PUENTES DE H
INTERACCIONES IÓNICAS
ENLACES COVALENTES
16. Modelos de interacción del
sustrato y el sitio activo
En 1894, Emil Fischer propuso la hipótesis de la
llave-cerradura
Sitio
activo
17. Modelos de interacción del
sustrato y el sitio activo
En 1958, Koshland propuso el modelo del ajuste inducido
Sitio
activo
Conformación del estado de
transición
18. Especificidad de la unión
enzima-sustrato
Estereoespecificidad
Centros activos asimétricos: sólo L-aminoácidos
Capacidad de distinguir entre estereoisómeros
Especificidad geométrica
Grupos químicos que interactúan con el sitio activo
Más limitante que la estereoespecificidad
Enzimás digestivas: más “preferencia” que “especificidad”
19. Nomenclatura enzimática.
Nombres particulares
Antiguamente, los enzimas recibían nombres
particulares, asignados por su descubridor.
Ejemplo:
amilasa (hidroliza el almidón)
Glc + ATP Glc-6P + ADP
Al ir aumentando el número de enzimas conocidos, se hizo
necesaria una nomenclatura sistemática que informara
sobre la acción específica de cada enzima y los sustratos
sobre los que actuaba.
20. Nomenclatura enzimática.
Nombres sistemáticos
Consta actualmente de 3 partes:
el sustrato preferente
el tipo de reacción realizado
terminación "asa"
ejemplo: la glucoquinasa
ATP-glucosa-fosfo-transferasa
Glc + ATP Glc-6P + ADP
21. Nomenclatura enzimática.
Comisión de enzimas
El nombre es identificado por un código numérico:
Encabezado por las letras EC (enzyme
commission), seguidas de cuatro números separados por
puntos:
el primer número indica a cual de las seis clases
pertenece la enzima,
el segundo se refiere a distintas subclases dentro de
cada grupo,
el tercero y el cuarto se refieren a los grupos químicos
específicos que intervienen en la reacción.
22. Nomenclatura enzimática.
Comisión de enzimas
Ej.: ATP:glucosa fosfotransferasa (glucoquinasa)
Glc + ATP Glc-6P + ADP
EC 2.7.1.2.
2: transferasa
7: fosfotransferasa
1: el aceptor es un grupo OH
2: es un OH de la D-glucosa el que acepta el grupo
fosfato.
29. Clase 6-Ligasas
Catalizan la unión de dos sustratos con hidrólisis
simultánea de un nucleótido trifosfato (ATP, GTP, etc.)
A + B + XTP ⇄ A-B + XDP + Pi
30. Mecanismo de acción enzimática
Perfil energético de una Perfil energético de una
reacción espontánea reacción catalizada
La acción de los catalizadores consiste en disminuir la Energía
de activación.
Las enzimas son catalizadores especialmente eficaces, ya que
disminuyen la energía de activación, aún más que los
catalizadores inorgánicos.
31. Mecanismo de acción enzimática
Por ejemplo, la descomposición del agua oxigenada (H2O2)
puede ocurrir:
sin catalizador Ea= 18 Kcal/mol
con un catalizador inorgánico (platino) Ea= 12 Kcal/mol
con una enzima específico (catalasa) Ea= 6 Kcal/mol
Así, se puede calcular que el platino acelera la reacción
20.000 veces, mientras que la catalasa la acelera 370.000
veces.
32. Mecanismo de acción enzimática
Para que una reacción química tenga lugar, las moléculas de los reactantes
deben chocar con una energía y una orientación adecuadas.
La enzima :
aumenta la concentración efectiva de los sustratos (aumenta la
probabilidad de choque)
permite que los reactantes (sustratos) se unan a su centro activo con
una orientación óptima para que la reacción se produzca y
modifica las propiedades químicas del sustrato unido a su centro
activo, debilitando los enlaces existentes y facilitando la formación
de otros nuevos
33. Cinética enzimática
Estudio cuantitativo de la catálisis enzimática que
proporciona información sobre las velocidades de
reacción, afinidad de las enzimas por su sustrato,
mecanismos de reacción y los inhibidores
Aplicación:
- Mejor comprensión de las rutas metabólicas
- Diseño de tratamientos más adecuados
Velocidad de una reacción bioquímica: Cambio de la
concentración de un reactante o un producto por unidad
de tiempo
34. Variables que influyen en la velocidad de una
reacción enzimática
1. Concentración de sustrato
2. Concentración de enzima
3. pH
4. Temperatura
5. Efectores (Activadores e Inhibidores)
35. La velocidad inicial Vo de la reacción A → P , donde A= Sustrato y P=
Producto, es:
- Δ[A] Δ[P] Donde
Vo= =
Δt Δt [A]= concentración de sustrato
[P]= concentración del producto
T= tiempo
Es proporcional a la frecuencia con que las moléculas reactantes
forman el producto, la velocidad de reacción es
Vo= K [A]x Donde
Vo= velocidad
K= constante de velocidad
(temp, pH, fuerza iónica)
X= orden de reacción
36. Orden de una reacción enzimática
Orden de Reacción: Suma de los componentes de los
términos de concentración en la expresión de
velocidad
Reacción de Primer Orden:
La velocidad es
proporcional a la
concentración de sustrato
Reacción de Orden Cero:
Independientemente
de la concentración de
sustrato, la velocidad es
constante
37. Cinética Michaelis-Menten
Modelo propuesto por Leonor Michaelis y Maud
Menten en 1913 Donde:
K1= constante de velocidad de
la formación de ES
k1 k2 K-1= constante de velocidad
E+S ES E+P de la disociación de ES
K-1 K2= constante de velocidad de
la formación y liberación del
producto del lugar catalítico
Hipótesis del Estado Estacionario: establece que [ES]
se mantiene casi constante durante gran parte de la
reacción
K1 [E][S]=K-1 [ES] + K2 [ES]
38. Cinética Michaelis-Menten
Inducen una nueva constante: Km (Constante de Michaelis)
K-1 + K2
Km=
K1
Ecuación de Michaelis-Menten:
Donde
Vmax s Vmax= velocidad máxima
v Km= constante de Michaelis
Km s [S]= concentración del
sustrato
39. Efecto de la [S]
Representa la Ecuación de
Michaelis-Menten
Km (Constante de Michaelis): mide la
concentración del sustrato a la que la
enzima tiene la mitad de la velocidad
máxima (Vmáx/2)
Vmáx: Se alcanza cuando todos los centros
catalíticos de la enzima se encuentran
ocupados por sustrato
Km y Vmax se determina midiendo las velocidades iniciales de reacción a varias [S]
40. Cinética Michaelis-Menten.
Limitantes
No todas las enzimas cumplen las condiciones
(Enzimas alostéricas)
Difícilmente aplicable a reacciones con dos
sustratos
No se puede determinar con exactitud Vmax
ni Km (Hipérbola rectangular, nunca llega a
Vmax)
41. Unidades de actividad
enzimática
Unidades Internacionales (UI): Cantidad de
enzima necesaria para producir 1 μmol de
producto/minuto
Nueva Unidad: Katal
Cantidad de enzima que transforma 1 mol de
sustrato/segundo (6 x 107 UI)
Grado de Pureza: Actividad Específica. Número
de UI en 1 mg de proteína
42. Ecuación de Lineweaver-Burk
Consiste en representar la recíproca de la ecuación de Michaelis-
Menten
1 KM 1 1
v0 V max S V max
Donde:
y = 1/Vo
x = 1/[S]
m = Km/Vmáx
Resultado: línea recta
b = 1/Vmáx
Pendiente: Km/Vmax
Corte en ordenada: 1/Vmax
Corte en Abscisa (extrapolado): -1/Km
44. Inhibición enzimática
Inhibidores: moléculas que reducen la actividad de
una enzima (fármacos, antibióticos, conservantes
alimentarios, venenos)
- Importante para regular las rutas metabólicas
- Tratamiento clínico
Tipos de Inhibición Enzimatica:
Isostérica: Reversible (competitiva, acompetitiva y no
competitiva) e Irreversible
Alostérica
45. Inhibición Competitiva
Representación de dobles recíprocos de una
actividad enzimática sin inhibir frente a un
inhibidor competitivo
Representación de MM de una
actividad enzimática sin inhibir frente
a un inhibidor competitivo
47. Inhibición no competitiva
Representación de MM de una
actividad enzimática sin inhibir frente
a un inhibidor no competitivo
Representación de dobles recíprocos
de una actividad enzimática sin
inhibir frente a un inhibidor no
competitivo
48. Inhibidores
Los inhibidores irreversibles reaccionan con un grupo químico de
la enzima, modificándola covalentemente, su acción no se
describe por una constante de equilibrio Ki, sino por una
constante de velocidad ki:
E+I E’
A diferencia de la inhibición reversible, el efecto de los inhibidores
irreversibles depende del tiempo de actuación del inhibidor.
Los inhibidores irreversibles son, por lo general, altamente
tóxicos.
Algunos tipos de inhibidores irreversibles
1. Reactivos de grupos -SH
2. Organofosfóricos
3. Ligandos de metales
4. Metales pesados
49. Sustratos suicidas:
(Inhibidores activados enzimáticamente)
1 2 3
E+I EI EI* E’ + I*
1. El inhibidor se unen al centro activo de la enzima, de manera específica, igual
que el substrato o un inhibidor competitivo convencional
2. La acción catalítica de la enzima convierte al inhibidor I en una especie
altamente reactiva I*
3. I* modifica covalentemente a la enzima, inactivándola de forma definitiva al
igual que un inhibidor irreversible.
Tienen por tanto:
(a) la especificidad del inhibidor competitivo y
(b) la potencia de los inhibidores irreversibles
50. Ejemplo: Sistema de la b-lactamasa bacteriana
La utilización masiva de antibióticos b-lactámicos
(penicilinas, sus derivados semisintéticos y Penicilina (activa)
cefalosporinas) ha conducido a la aparición de
S
resistencias a los mismos. R CO NH CH3
N CH3
O
Los microorganismos resistentes a estos COO-
antibióticos lo son por producir una enzima, la b-
lactamasa, que inactiva a los antibióticos b-
lactámicos. -Lactamasa
S
R CO NH CH3
O C HN CH3
O-
COO-
Ác.peniciloico (inactivo)
52. Enzimas Alostéricas
Características:
También llamadas regulables, la actividad de la enzima se
afecta por moléculas efectores que se unen en otros lugares;
sitios alostéricos o regulables
Catalizan pasos reguladores claves de las rutas bioquímicas
La regulación puede ser:
- Activación alostérica: enzima aumenta afinidad por el
sustrato (disminuye su Km), así como su velocidad de catalisis
- Inhibición alosterica: efectores negativos.
53. Enzimas Alostéricas
Vo
Características:
Cinéticamente no sigue el
comportamiento catalítico de
MM
- Gráfica: curva sigmoidea o
hiperbólica
La presencia de una sigmoide
implica la existencia de
cooperatividad en la fijación [S]
del substrato
54. Enzimas Alostéricas
La cooperatividad (positiva) consiste en que la fijación de una
molécula de substrato favorece la fijación del siguiente, y así hasta
ocuparse toda la molécula
s + s s + s s + s s
1 2 s 3 s s
En términos de Km veríamos que Km1 > Km2 > Km3
Existe también cooperatividad negativa, cuando la fijación de
una molécula de substrato dificulta la fijación del siguiente.
55. Modelos que tratan de explicar la cinética de las
enzimas alostéricas
1. Monad, Wyman y Chanqeux (MWC)
Forma R s s s s s s s
s s s
Forma T i i i
i i i i i i i
2. Kosland, Nemethy y Filmes (KNF)
3. Eigen (Eig)
56. Los efectores alostéricos operan sobre
el grado de cooperatividad del sistema:
Inhibidores y activadores
alostéricos
Los inhibidores alostéricos aumentan el 1.0
Y
grado de cooperatividad Activador
0.8
Los activadores alostéricos disminuyen el 0.6 Sin Inhibición
grado de cooperatividad; a
concentraciones elevadas de activador, la 0.4
cinética pasa a ser michaeliana, y deja de Inhibidor
ser sigmoide. 0.2
s
0.0
0 2 4 6 8 10 12
58. Inhibición Alostérica
Centro Centro Centro
Centro
activo alostérico activo
alostérico
s i s
En ausencia de inhibidor, el sustrato Cuando el inhibidor ocupa el centro
se fija normalmente al centro activo alostérico, tiene lugar un cambio
conformacional en el centro activo que
impide la fijación del sustrato
59. Cinética de reacciones multiustrato
La mayoría de las enzimas catalizan reacciones
con dos o más sustratos
Varios mecanismos posibles
- Orden de unión de los sustratos
- Orden de liberación de los productos
Determinación más compleja que en las enzimas
monosustrato
- Para cada sustrato hay Km, Kcat y Vmax
60. Mecanismos principales de reacciones
multiustrato
Mecanismo secuencial
o de desplazamiento
simple:
Secuencial Ordenado
adición de todos los
sustratos para poder
obtener los productos
Secuencial Aleatorio
61. Mecanismos principales de reacciones
multiustrato
Mecanismo de doble desplazamiento o ping
pong:
no se han unidos todos los sustratos cuando ya hay
salida de productos
62. Catálisis: Proceso en el que aumenta la velocidad a
la que una reacción se aproxima al equilibrio
Catálisis Covalente
- Grupo reactivo que se une transitoriamente mediante enlace covalente
Catálisis Ácido-Base
- Molécula diferente de H2O acepta o cede protón
Catálisis por Iones Metálicos
- Varias funciones, dependiendo de la reacción
Catálisis por Aproximación
Catálisis por unión del Estado de Transición
63. Quimotripsina: Dos Mecanismos Catalíticos
Quimotripsina: proteasa que rompe enlaces peptídicos
adyacentes a los aminoácidos aromáticos
Catálisis Covalente
- Unión irreversible con el diisopropilfluorofosfato (DFP)
- Actividad de residuo clave, Ser 195
Catálisis Ácido-Base
- Otros dos elementos de “triada catalítica”
- Asp 102 e His 57
64. Catálisis por Iones Metálicos
Aprox. 30% de las enzimas usan iones metálicos:
- Metaloenzimas unidas fuertemente a metales de transición:
Fe2+, Fe3+, Cu2+, Zn2+, Mn2+ o Co3+
- Metaloenzimas unidad débilmente a metales en solución:
Na+, K+, Mg2+ o Ca2+
Mecanismos:
- Enlace con el sustrato para permitir su adecuada orientación
- Participación del metal en mecanismos de oxidorreducción
- Estabilizador de la reacción al atraer cargas negativas del sustrato
65. Catálisis por Proximidad y Orientación
Observada en reacciones con varios sustratos
- Reactantes se encuentran en relación espacial
óptima
Proximidad: acercamiento simple de las moléculas
- Aumentos de velocidad de hasta 5x
Orientación: acercamiento de los grupos
66. Catálisis por unión del Estado de
Transición
Uno de los mecanismos más importantes
- Enzima tiene mayor afinidad por el estado
de transición que por los sustratos o
productos
Conjuntamente con los demás, es responsable
de los grandes aumentos de velocidad
67. Regulación de la actividad enzimática
Las rutas bioquímicas están organizadas en reacciones químicas catalizadas
por enzimas, donde la regulación se hace más compleja
Razones de la regulación:
- Mantenimiento de un estado ordenado
- Conservación de la energía
- Respuestas a las variaciones ambientales
Se realiza:
- Regulación de la concentración enzimática
- Regulación de la actividad intrínseca de la enzima
1. Regulación alostérica
2. Regulación por modificación covalente
68. Regulación alostérica
Procesos a nivel celular; regulación de ajuste fino de la actividad
enzimática, a través de efectos de retroalimentación (negativa
o positiva)
Regulación por modificación covalente
Procesos a nivel supracelular (orgánico); regulación a gran escala
de actividades enzimáticas, a través de modificación covalente
de enzimas, provocadas por señales (transducción de señales)
69. Regulación alostérica
Retroalimentación Negativa en Vías Metabólicas
Síntesis de Isoleucina
Thr a-cetobutirato Ile
Treonina
desaminasa
El producto final de la ruta, Isoleucina, inhibe a la primera
enzima de la misma, Treonina desaminasa
70. Regulación por modificación covalente
Suele haber fenómenos de modificación covalente de enzimas en la
respuesta celular a señales químicas:
1. Neurotransmisores
2. Hormonas
3. Factores de crecimiento
4. Estímulos morfogenéticos y de diferenciación
5. Muerte celular programada (apoptosis)
6. Estímulos antigénicos
7. Luz y otros agentes físico-químicos
71. Regulación por modificación covalente
Defosforilación: Protein fosfatasas Fosforilación: Protein kinasas
R CH R CH
R CH R CH ATP ADP
H2O Pi N H N H
N H N H
O C O C O
O C O O C
Ser H C CH2OH Ser HC CH2O P O-
Ser HC CH2O P O- Ser H C CH2OH
H N O- H N
H N H N O-
C O C O
C O C O
R' C H R' CH R' CH R' C H
N H N H N H N H
Sobre residuos previamente fosforilados: Ser-
P, Thr-P, Tyr-P Sobre residuos de Ser, Thr y Tyr
Adenilación. ADP-ribosilación. Actúa NAD+ como
Sistema de la Glutamina sintetasa donador del grupo ADP-ribosa
H2N
Tyr R CH
R CH
H2N
N H N N
N H O N N
O C O
O C OH OH O O
HC CH2 O P O CH2 N N
O HC NH N CH2 O P O P O CH2 N N
C H O
H N O- H N O -
O-
C O C O NH2
+
R' C H R' CH
OH OH OH OH
N H N H
72. Isoenzimas
Son variantes de una misma enzima. Formas físicamente
distintas de una enzima pero que catalizan una misma
reacción
Enzimas multiméricas con varios tipos de subunidades
- LDH: cuatro cadenas, tipos M y H
- 5 isoenzimas diferentes
- Preferencia por reacciones diferentes
Permite ajustes sutiles en función catalítica, una enzima
simple puede tener isoenzimas, ej: anhidrasa carbónica
73. Niveles enzimáticos como índices de
enfermedad
Enzimas Funcionales: Actúan normalmente en
las reacciones del metabolismo
Enzimas No Funcionales: Aumentan sus niveles
cuando hay daño tisular o orgánico
74. Niveles enzimáticos como índices de
enfermedad
Enzima no Funcional Daño ocasionado
a-amilasa Daño pancreático
Obstrucción biliar,
Fosfatasa Alcalina
cáncer de huesos
Fosfataa Ácida Cáncer de Próstata
Creatinfosfoquinasa (CKmb), Lactato
Infarto al
Deshidrogenasa (LDH-H4), a-
miocardio
hidroxibutirato DH
Trasaminasa Glutámica Oxaloacético
Evalúa infarto
(TGO)
Trasaminasa Glutámica Pirúvica
Evalúa la Hepatitis
(TGP)
