1. GENERALASPECTS OF
CHROMATOGRAPHY
1.1 General concepts of analytical chromatography
1.2 The chromatogram
1.3 Gaussian-shaped elution peaks
1.4 The plate theory
1.5 Nernst partition coefficient ( K )
1.6 Column efficiency
1.7 Retention parameters
1.8 Separation (or selectivity) factor between two Solutes
1.9 Resolution factor between two peaks
1.10 The rate theory of chromatography
1.11 Optimization of a chromatographic analysis
1.12 Classification of chromatographic techniques

2. NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ SẮC KÝ
• Sắc ký là một phương pháp tách dựa trên tính chất vật
lý hay hóa lý của các cấu tử trong hổn hợp ở thể khí
hay lỏng. Tiến trình xãy ra như trong quá trình chưng
cất, trích ly gián đoạn.
• Tiến trình sắc ký có thể mô tả như sau :
+ Một pha đứng yên được cấu tạo có thể là một cột
rỗng, một tờ giấy, một bản mặt v.v..được làm đầy một
loại rắn hay lỏng phù hợp gọi là pha tĩnh
+ Trên một đầu pha tĩnh cho vào một lượng mẫu nhỏ
có chứa các thành phần ra khỏi nhau

3. + Pha động là những dung môi được đưa lên liên tục sau khi
cho mẫu vào, pha động sẽ di chuyển trong cột do trọng lực và
đem các cấu tử khác nhau trong mẫu theo chúng. Quá trình
này gọi là sự rửa giải. Nếu các thành phần này di chuyển với
những tốc độ khác nhau thì chúng sẽ tách ra khỏi nhau và có
thể thu hồi cùng với pha động.
NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ SẮC KÝ

4. • Đây là phương pháp được sử dụng đầu tiên vào đầu thế
kỷ 20 đo nhà thực vật Michaël Tswett
• Quá trình xãy ra trên cột có thể áp dụng để tách và làm
sạch trong tiến trình xử lý mẫu (chuẩn bị cột sắc ký)
• Quá trình xãy ra đã hình thành kỹ thuật phân tích sắc ký
bằng cách đo thời gian di chuyển của các hợp chất khác
nhau, nghĩa là có thể định danh chúng mà không cần thu
nhận và phân tích. Quá trình định danh một hợp chất cần
thiết phải có chất chuẩn của nó.
NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ SẮC KÝ

5. • Kỹ thuật sắc ký nhanh chóng phát triển, cùng với sự hổ trợ
của các ngành khoa học khác như toán học, vật lý, tin học
v.v..và nó có thể tách ở những thành phần ở mức vi lượng.
• Biểu đồ nhận được từ quá trình chạy sắc ký gọi là sắc ký
đồ. Sắc đồ ký đồ mô tả trình tự quá trình rửa giải các thành
phần khác nhau khi ra hỏi cột
• Detector là thiết bị nhận biết các cấu tử khi ra khỏi mẫu,
nó cho biết thời điểm các cấu tử ra khỏi cột và cường độ
tương tác các cấu tử với detector. Thông tin này giúp cho
việc định danh và định lượng các cấu tử trong mẫu ban
đầu.
• Như quá trình sắc ký xãy ra hai giai đoạn.
NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ SẮC KÝ

6. Việc định danh một hợp chất chỉ dựa vào thời gian lưu là chưa
hợp lý. Thường người ta kết hợp với một vài phương pháp khác
như Mass spectrometer hay Infrared Spectrometer. Những thiết
bị này sẽ cho những thông tin độc lập từ đó có thể so sánh và
kết luận.
NHỮNG KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ SẮC KÝ

7. GAUSSIAN-SHAPED ELUTION PEAKS
• Sắc ký đồ rửa giải của một peak có dạng giống với biểu đồ
phân bố Gaussian
• Trong đó µ tương ứng với thời gian lưu của peak rửa giải, σ là
độ lệch chuẩn của peak (σ2 là phương sai).
• y là tín hiệu nhận được từ detector nó giống như hàm theo thời
gian x
• Trong trường hợp lý tưởng hàm phân bố có thể mô tả theo
phương trình:
Đặt: Suy ra:

8. • Phương trình trên có đồ thị là một đường cong đối xứng ( x=0
khi y= 3.999), đồ thị đi qua hai điểm uốn tại x= +1 và -1,
tương ứng với giá trị y đạt được là 0,242 ( chiều cao tương
ứng là 60.6% so với giá trị cực đại. Độ rộng của peak tại điểm
uốn là 2σ (σ =1).
• Trong sắc ký đồ w1/2 là ký hiệu cho độ rộng tại ½ chiều cao
peak (w = 2,35σ). Độ rộng của peak tính tại nền và được đo ở
chiều cao đạt được là 13,5% so với chiều cao cực đại là w= 4 σ
GAUSSIAN-SHAPED ELUTION PEAKS

9. THE PLATE THEORY
• Gần một nữa thế kỷ các thuyết lần lượt ra đời để giãi thích sự
di chuyển và phân tách của các cấu tử trong cột.
• Craig’s theoretical plate model được xem là thuyết giãi thích
quá trình di chuyển và phân tách các cấu tử chất tan trong cột
là hợp lý nhất.
• Mặc dù quá trình xãy ra trong cột là một quá trình xãy ra liên
tục nhưng theo mô hình của Craig, ông cho rằng đó là những
bước tiếp nối riêng biệt. Trong sắc ký lỏng – rắn các tiến trình
cơ bản này là sự tuần hoàn của sự hấp phụ và giãi hấp phụ.
Các bước này tái lập lại tuần hoàn theo sự di chuyển của các
cấu tử trong cột.
• Mỗi bước tương ứng với một trạng thái cân bằng mới gọi là
đĩa lý thuyết

10. • Các đĩa này sắp xếp dọc theo chiều dài cột. Mỗi một chất khi
di chuyển trong cột sẽ có số lần tái tổ hợp khác nhau( hấp phụ
/ giãi hấp phụ) nên số đĩa khác nhau.
• Nêu gọi chiều cao tương đương của một đĩa lý thuyết là H
(Height equivalent to a theoretical plate)
• Ta có :
THE PLATE THEORY

11. + Nếu tính lượng chất trên đĩa thứ J tại thời điểm I ta có: Tổng
lượng chất tan mT là tổng số lượng chất tan được pha động di
chuyển tới từ đĩa thứ (j-1) nằm cân bằng tại thời điểm (i-1) và
lượng chất tan thực sự có sẵn ở đĩa thứ j tại thời điển (i-1)
THE PLATE THEORY

12. Lý thuyết có một lỗi nghiêm trọng ở chỗ nó không tính đến
phân tán trong cột do sự khuếch tán của các hợp chất
THE PLATE THEORY

13. Nerst partition coefficient(K)
• Thông số hóa lý cơ bản của quá trình sắc ký là hằng số cân
bằng K, gọi là hệ số phân bố, được tính bằng tỷ số nồng độ của
chất tan nằn giữa hai pha
• Hệ số K có thể rất lớn, như 1000 nếu như pha động là khí hoặc
nhỏ khi pha động là lỏng
• Mỗi một hợp chất thường phân bố trong vùng không gian
trong cột, và có nồng độ khác nhau ở những vùng khác nhau
( CM và CS khác nhau) nhưng tỷ số của chúng không đổi

14. COLUMN EFFICIENCY
• Hiệu quả cột (số đĩa lý thuyết) N: Số cân bằng xãy ra trong cột
khi cấu tử đi qua suốt bề mặt cột.
• Độ phân tán σ được tính theo phương sai σ2 , giá trị này tăng
với khoảng cách phân tán. Khi khoảng cách phân tán tiến đến
chiều dài L của cột
Ta có :

15. • Theo trên ta có :
• Suy ra:
• Hay:
COLUMN EFFICIENCY

16. SỐ ĐĨA HIỆU QUẢ THỰC TẾ
• Để đánh giá đúng thực chất hiệu quả cột đối với sự tách một
cấu tử, thông số thời gian lưu tR được thay thế bằng thời gian
lưu thực tế t’
R
• Lúc này ta có :
• Nếu tính ở độ rộng w1/2:
Hay

17. CÁC THÔNG SỐ LƯU GIỮ
 Thời gian lưu tR (Retention time)
 Thể tích của pha động trong cột (thể tích chết)
 Thể tích của pha tĩnh
 Hệ số phân bố
 Thể tích phân giãi VR
 Hệ số dung lượng k' (Capacity factor)

18. THỜI GIAN LƯU
(Retention time)
tR = tO . (1 + k')
• Bản chất của pha tĩnh
• Bản chất, thành phần,tốc độ của pha động
• Cấu tạo và bản chất phân tử của chất tan
• Một số yếu tố khác

19. THỂ TÍCH CỦA PHA ĐỘNG VÀ PHA TĨNH
TRONG CỘT
VS = VC - VM

20. THỂ TÍCH PHÂN GIÃI VR

21. HỆ SỐ PHÂN BỐ
K = Cs /Cm
Phụ thuộc vào:
 Bản chất các pha
 Chất tan
 Nhiệt độ

22. HỆ SỐ DUNG LƯỢNG k
(Capacity factor)
k = mS / mM = K.VS / VM
Khối lượng chất tan bị lưu giữ trong pha tỉnh và pha động tỷ lệ với
thời gian hay số mol của chúng nên có thể viết:
Vì thời gian lưu thực tế t’
R chính là tS nên có thể viết

23. .
• Từ đây có thể viết:
HỆ SỐ DUNG LƯỢNG k
(Capacity factor)

24. HỆ SỐ DUNG LƯỢNG k
(Capacity factor)

25. HỆ SỐ CHỌN LỌC GIỮA HAI CẤU TỬ
• Hệ số chọn lọc α cho phép so sánh hai peak liền kề trong một
sắc ký đồ, xem chúng thể tách ra khỏi nhau không.
• Hệ số chọn lọc α là được đánh giá là tỷ số giữa hệ số dung
lượng cột của hai peak
Hay

26. HỆ SỐ PHÂN GIÃI GIỮA HAI PEAK
• Hệ số phân giãi R giữa hai cấu tử trong cột cho phép đánh
giá hai cấu tử này có thể tách ra khỏi nhau không (hệ số α
cũng giúp cho chúng ta đánh giá trên mức độ này)
• Hệ số R được đánh giá là theo biểu thức sau:

27. • Giá trị đo R phản ảnh mức độ phân giãi giữa hai peak
HỆ SỐ PHÂN GIÃI GIỮA HAI PEAK

28. • Ảnh hưởng của chiều dài cột đến độ phân giãi
HỆ SỐ PHÂN GIÃI GIỮA HAI PEAK

29. • Phương trình liên hệ giữa độ phân giãi R với hệ số lưu k, hệ số
chọn lọc α và hiệu quả cột được biểu thị như sau:
HỆ SỐ PHÂN GIÃI GIỮA HAI PEAK

30. PHƯƠNG TRÌNH VAN DEEMTER
• Phương trình Van deemter (1956) mô tả sự ảnh hưởng của tốc
độ dòng pha động đến hiệu quả tách.
• Ba hệ số A,B,C liên quan khác nhau tùy thuộc vào bản chất
của cột và điều kiện thực nghiệm.
• Trong đó A là hệ số khuyếch tán xoáy, B là hệ số khuyếch tán
dọc theo cột, C là hệ số truyền khối.
• Nếu H có đơn vị là cm thì A là cm, B là cm2/s, C là s

31. + Phương trình cho thấy sự tồn tại của tốc độ dòng pha động mà tại đó
hiệu quả cột là lớn nhất.
+ Hiệu quả cột giảm khi tốc độ dòng pha động tăng.
+ Hiệu quả cột đạt cao nhất khi H nhỏ nhất ứng với
PHƯƠNG TRÌNH VAN DEEMTER

32. TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH SẮC KÝ
• Mục đích của quá trình tối ưu hóa là có được sự tách hoàn
toàn các chất cần phân tích trong thời gian ngắn nhất khi
đi qua cột.
• Để có được tối ưu quá trình sắc ký người ta phải sử dụng
những nguồn sẵn về thiết bị, phần mềm dể mô phỏng được
những kết quả thu được từ sự thay đổi các thông số vật lý
khác.
• Quá trình tối ưu hóa đồng nghĩa với việc chọn lựa: Cột, chiều
dài cột, đường kính cột, thành phần pha tĩnh trong cột, tốc độ
dòng và thành phần pha động. Tất cả những yếu tố này lại
tương tác với nhau. Ví dụ độ phân giãi R và thời gian chu kỳ
sắc ký tỷ lệ nghịch với nhau.

33. TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH SẮC KÝ

34. Năm hệ số K, N, k, α và R ảnh hưởng chủ yếu khi xem xét tối ưu
hóa quá trình sắc ký
TỐI ƯU HÓA QUÁ TRÌNH SẮC KÝ

35. PHÂN LOẠI CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ
• Sắc ký lỏng (LC)
• Sắc ký khí (GC)
• Sắc ký dòng siêu chảy (SFC)

36. LC (Liquid chromatography)
• Trong LC thành phần pha động là lỏng, là loại sắc ký
được biết đến đầu tiên.
• Tùy thuộc vào cơ chế lưu giữa chúng mà có những loại
sắc ký sau: Sắc ký lỏng- rắn, sắc ký ion, sắc ký rây phân
tử, sắc ký lỏng- lỏng, sắc ký lỏng pha liên kết
PHÂN LOẠI CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ

37. Sắc ký lỏng-rắn : còn gọi là sắc ký hấp phụ. Pha tĩnh trong
trường hợp này là chất rắn trơ đối với các chất cần phân tích.
Hệ số hóa lý cho quá trình là hệ số hấp phụ. Ngày nay đã có
những pha tĩnh được thiết lập đa dạng hơn để đáp ứng hiệu
quả tách.
Sắc ký trao đổi ion: Trong kỹ thuật này pha động là những
dung dịch đệm, còn pha tĩnh là rắn có cấu tạo bề mặt gắn
những nhóm trao đổi ion. Quá trình tách theo kiểu này được
đặc trưng bởi hệ số phân bố ion
PHÂN LOẠI CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ

38. Sắc ký rây phân tử ( Size exclusion chromatography): Pha
tĩnh trong kỹ thuật này là những vật liệu trên đó có những lổ
xốp. Kích thước lổ là yếu tố đặc trưng cho quá trình tách.
Các phân tử có kích thước phù hợp với kích thước lổ sẽ
được lưu giữ trong cột lâu hơn. Tùy thuộc vào bản chất pha
động là dung dịch hay dung môi hửu cơ mà ta có sắc ký lọc
gel (gel filtration) và sắc ký thẩm thấu gel (gel permeation).
Trong kỹ thuật này hệ số phân bộ được gọi là hệ số phân
tán( diffusion coefficient)
PHÂN LOẠI CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ

39. • Sắc ký lỏng- lỏng: Pha tĩnh là lỏng được phủ lên vật liệu
trơ hay xốp (giống như chất mang). Quá trình tách các
chất dựa trên sự phân bố chất tan giữa hai hai pha tĩnh và
động (đều là pha lỏng), nên hệ số đặc trưng cho quá trình
là hệ số phân bố. Kỹ thuật hiện nay ít được dùng vì pha
tĩnh dễ bị hòa tan, người ta gọi là hiện tượng chảy máu
cột (bleeding)
PHÂN LOẠI CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ

40. Sắc ký lỏng – pha liên kết
• Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên
kết (bonded phase chromatography).
• Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha
liên kết có nhiều ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lỏng vì một số
nguyên nhân sau:
– Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lỏng dễ bị hòa tan bởi pha
động nên dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và
gây nhiễm đối với hợp chất phân tích.
– Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lỏng dễ tan trong pha động nên
người ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient
dung môi
PHÂN LOẠI CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ

41. • Sắc ký khí (GC)
Pha động trong trường hợp này là các khí mang như
N2,H2,He. Tùy vào bản chất của pha tĩnh mà người ta
phân loại sắc ký khí làm 2 loại
- Sắc ký khí - lỏng ( GLC)
- Sắc ký khí- rắn (GSC)
PHÂN LOẠI CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ

42. Sắc ký khí - lỏng (GLC):
- Pha tĩnh là lỏng được phủ lên bề mặt rắn của một chất
mang bằng sự hấp thụ bề mặt hay liên kết với bề mặt bên
trong chất mang của cột.
- Mẫu phải được hóa hơi và được khi mang đưa đi qua cột
- Kỹ thuật này được Martin và Synge đưa ra vào 1941 để
thay thế pha động là lỏng, điều này dẫn đến làm tăng khả
năng tách các hợp chất từ trong mẫu ban đầu. Hệ số phân bố
K là đặt trưng cho quá trình tách
PHÂN LOẠI CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ

43. • Sắc khí khí-rắn (GSC)
- Trong sắc khí loại này pha tĩnh ở dạng rắn xốp như than
hoạt tính, silicagel, bột nhôm. Pha động là khí.
- Sắc ký loại này ảnh hưởng tới những cấu tử trong hổn
hợp có nhiệt sôi thấp. Hệ số hấp phụ là đặt trưng cho quá
trình
PHÂN LOẠI CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ

44. • Sắc ký dòng siêu chảy(SFC- supercritical fluid
chromatography)
- Pha động ở đây ở trạng thái dòng siêu chảy của nó như
Cacbondioxyt ở khoảng 500C và 150 atm.
- Pha tĩnh lúc này có thể ở cả hai trạng thái lỏng – rắn.
- Kỹ thuật này kết hợp với các loại sắc ký lỏng – lỏng hay
lỏng khí để tăng hiệu quả tách
PHÂN LOẠI CÁC KỸ THUẬT SẮC KÝ