PHƯƠNG THỨC VẬN TẢI ĐƯỜNG SẮT TRONG VẬN TẢI
Bài giảng Sinh học phân tử - TS Võ MInh Trí
1. TRƯỜNG ðẠI HỌC KHOAHỌC TỰ NHIÊN
GV. TS.VoõMinh Trí
ðẠI HỌC QUỐC GIATP. HỒ CHÍ MINH
SINH HỌC PHÂN TỬ
(MOLECULAR BIOLOGY)
1
CBGD: GV.TS.VoõMinh Trí
2. NỘI DUNG
GV. TS.VoõMinh Trí
1. Giới thiệu
2. Cấu trúc và sự nhân bản của vật liệu di truyền
3. Biểu hiện gene
4. ðiều hòa biểu hiện gene
5. Dụng cụ, thiết bị dùng trong sinh học phân tử
6. Enzyme dùng trong sinh học phân tử
7. Một số phương pháp trong sinh học phân tử
2
3. GIỚI THIỆU GV. TS.VoõMinh Trí
3
Sinh học phân tử là gì?
Môn học tìm hiểu những hiện tượng sinh học ở
mức ñộ phân tử: ñịnh nghĩa này khó phân
biệt sinh học phân tử với sinh hóa (biochemistry).
Môn học nghiên cứu cấu trúc và chức năng của
gen ở mức ñộ phân tử.
Trong lịch sử, sinh học phân tử phát triển từ môn
di truyền học và sinh hóa học.
ðiểm bắt ñầu của sinh học phân tử từ nhữngthí
nghiệm di truyền của Mendel từ giữa thế kỷ 19.
Di truyền tính trạng
Sinh học phân tử ra ñời vào 1944 khi thành phần
hóa học của gen ñược khám phá.
5. 5
GV. TS.VoõMinh Trí
CẤU TRÚC VÀ SỰ NHÂN BẢN CỦA VẬTLIỆU
DI TRUYỀN
Phát hiện và vị trí của DNA trong tếbào
DNA là vật liệu di truyền
Thành phần và cấu trúc DNA
Cơ chế sao chép
Cơ chế sửa sai và bảo vệ DNA
6. 6
GV. TS.VoõMinh Trí
PHÁT HIỆN VÀ VỊ TRÍ CỦA DNA TRONG TẾBÀO
1896 Friedrich Meischer ñã phân lập DNAtừ
tinh trùng cá và mủ từ vết thương.
Vì phân lập từ vùng nhân (nuclei), F. Meischer
ñặt tên cho thành phần hóa học mới này là nuclein
Tên ñược ñổi thành nucleic acid, sau ñó
là deoxyribonucleic acid (DNA)
1914 Robert Feulgen phát hiện DNAnhuộm
màu với thuốc nhuộm fuchsin
9. 9
GV. TS.VoõMinh Trí
DNA LÀ VẬT LIỆU DI TRUYỀN
Thí nghiệm chứng minh hiện tượng biến nạp
ở vi khuẩn của Griffith (1928)
Thí nghiệm chứng minh nhân tố gây biến
nạp là DNA của Avery, Loeod, và Carty
(1944)
Thí nghiệm xác ñịnh vật liệu do phage bơm
vào vi khuẩn là DNA của Hershey và Chase (1952)
10. HIỆN TƯỢNG BIẾN NẠP Ở VI KHUẨN (GrG
ifV
f.
iT
tS
h.V
)oõMinhTrí
Streptococcus pneumoniae:
phế cầu khuẩn gây viêm phổi
Chủng ñộc (S, smooth):
khuẩn lạc trơn, gây chết chuột
Chủng lành (R, rough):
khuẩn lạc thô, không gây
chết chuột
10
11. ðun diệt chủng ñộc,tiêm
vào chuột: chuột sống.
HIỆN TƯỢNG BIẾN NẠP Ở VI KHUẨN (GriG
fV
f.
itT
hS.
)VoõMinhTrí
11
ðun diệt chủng ñộc, trộn
với chủng lành, tiêm vào
chuột: chuột chết.
Kết luận: tế bào chết chủng
ñộc ñã truyền tính gây bệnh
cho chủng lành.
Biến nạp (transformation):
Griffith: hiện tượng truyền tính
gây bệnh từ vi khuẩn ñộc sang
vi khuẩn lành.
Sinh học phân tử hiện ñại: sự
tiếp nhận DNA trần bởi tế
bào nhận.
12. HIỆN TƯỢNG BIẾN NẠP Ở VI KHUẨN (GriG
fV
f.
itT
hS.
)VoõMinhTrí
12
13. NHÂN TỐ GÂY BIẾN NẠP LÀ DNA (Avery, LoeodG
,V.
CTS
a.
rVo
tõ
yM
)inhTrí
13
14. NHÂN TỐ GÂY BIẾN NẠP LÀ DNA(Avery, LoG
eV
o.
dTS
,.V
Coõ
aM
rin
th
yTr
)í
14
Huyền phù chủng ñộc ñã bị ñun chết ñược trộn
với các enzyme khác nhau trước khi trộn với chủng
lành và tiêm vào chuột:
Xử lý với protease (thủy phân protein): chuột chết.
Xử lý với ribonuclease (thủy phân RNA): chuột chết.
Xử lý với endonuclease
(thủy phân DNA):
chuột sống.
Trộn DNA từ chủng ñộc
chết với chủng lành, tiêm
vào chuột: chuột chết.
Kết luận: DNA là vật
liệu di truyền ở hiện tượng biến nạp
15. GV. TS.VoõMinh Trí
VẬT LIỆU DO PHAGE BƠM VÀO VI KHUẨN LÀ DNA (Hershey, Chase)
15
Sự xâm nhập và nhân bản
bacteriophage ở vi khuẩn
Nuôi cấy bacteriophage
16. SỰ XÂM NHẬP VÀ NHÂN BẢN BACTERIOPHAGEG
ỞV.T
VS.
IVo
KõM
Hinh
UTr
Ẩí
N
Bacteriophage (phage,
thực khuẩn thể): vi rút
của vi khuẩn
16
Phage T2:
Vỏ protein bên ngoài
DNA bên trong
Phage T2 xâm nhiễm vi
khuẩn E. coli
Gắn lên bề mặt vi khuẩn
Chuyển vật chất vào vi khuẩn
Làm tan vi khuẩn và phóng
thích các phage mới
Protein hay DNAñược
chuyển vào E. coli?
17. SỰ XÂM NHẬP VÀ NHÂN BẢN BACTERIOPHAGEG
ỞV.T
VS.
IVo
KõM
Hinh
UTr
Ẩí
N
17
19. GV. TS.VoõMinh Trí
THÍ NGHIỆM CỦA HERSHEY VÀ CHASE (1952)
ðánh dấu protein của phage bằng 35S bằng cách
nhiễm phage lên E. coli ñược nuôi trong môi trường
có chứa chất dinh dưỡng 35S
Phage ñược sinh ra có protein mang 35S
19
20. GV. TS.VoõMinh Trí
THÍ NGHIỆM CỦA HERSHEY VÀ CHASE (1952)
ðánh dấu DNA của phage bằng 32P bằng cách
nhiễm phage lên E. coli ñược nuôi trong môi trường
có chứa chất dinh dưỡng 32P
Phage ñược sinh ra có DNA mang32P
20
21. 21
GV. TS.VoõMinh Trí
THÍ NGHIỆM CỦA HERSHEY VÀ CHASE (1952)
Nhiễm phage ñã ñánh dấu 35S và 32P lên E. colinuôi
trong môi trường không chứa ñồng vị phóng xạ
Tách phần gắn của phage lên bề mặt E. coli
bằng cách lắc mạnh
Ly tâm ñể làm lắng E. coli ở ñáy ống ly tâm
Thu E. coli ở cặn lắng (cặn ly tâm, precipitant) ñáy
ống ly tâm và thu dịch không lắng (dịch nổi,
supernatant) chứa phage
22. 22
GV. TS.VoõMinh Trí
THÍ NGHIỆM CỦA HERSHEY VÀ CHASE (1952)
Xác ñịnh hàm lượng ñồng vị phóng xạ 35S và 32P
ở phần cặn (chứa E. coli) và phần dịch nổi
(chứa phage):
Tế bào E. coli (phần cặn) chứa 70% tổng 32P
Dịch nổi chứa phage chiếm 80% tổng 35S
Kết luận:
DNA của phage ñược chuyển vào trong tế bào E. coli,
cho phép nhân bản tạo nhiều phage mới trong E. coli
Vật chất di truyền của phage là DNA
24. GV. TS.VoõMinh Trí
THÀNH PHẦN VÀ CẤU TRÚC DNA
Thành phần hóa học và ñặc ñiểm DNA sợiñơn
Mô hình cấu trúc DNA mạch ñôiWatson-Crick
ðặc tính ñối songsong
Các cấu hình DNA
Cấu trúc bậc cao của DNA ở tếbào
tiền nhân (prokaryote)
Cấu trúc bậc cao của DNA ở tếbào
nhân thật (eukaryote)
24
25. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA ðƠN PHÂN TRONG DNAVÀ RNA
GV. TS.VoõMinh Trí
25
26. THÀNH PHẦN HÓA HỌC CỦA ðƠN PHÂN TRONG DNAVÀ RNA
GV. TS.VoõMinh Trí
26
33. GV. TS.VoõMinh Trí
SỰ TẠO THÀNH PHÂN TỬ POLY-(RIBO)NUCLEOTIDE BẰNG LIÊN KẾT PHOSPHODIESTER
33
34. GV. TS.VoõMinh Trí
SỰ SẮP XẾP BASE, RIBOSE VÀ PHOSPHATE TRONGMẠCH
NUCLEICACID
Khung: mạch ribose và liên kết phosphodiester
ðầu chứa gốc phosphate tựdo:
ñầu 5’ phosphate (ñầu5’)
ðầu chứa gốc hydroxyl tựdo:
ñầu 3’ hydroxyl (ñầu3’)
Các base gắn vuông gốc với mặt phẳng ñường ribose
Mạch nucleic acid có tính ñịnh hướng
34
35. LIÊN KẾT HYDROGEN GIỮA CÁC CẶP BASE PURINE-PYRIMIDINE
TRONG NUCLEIC ACID MẠCH KÉP
GV. TS.VoõMinh Trí
35
36. TÍNH ðỐI SONG SONG CỦA HAI MẠCH TRONG PHÂN TỬ DNA
GV. TS.VoõMinh Trí
36
37. MÔ HÌNH DNA KÉP CỦA WATSON-CRICK(1953)
GV. TS.VoõMinh Trí
37
38. GV. TS.VoõMinh Trí
CÁC CẤU HÌNH CỦA DNA TRONG TẾBÀO
DNA tồn tại ở nhiềucấu
hình khác nhau:
Bán kính phân tử (r)
Khoảng cách giữa 2
nucleotide (h)
Các cặp nucleotide/vòng
xoắn (n)
Dạng B: trong ñiều kiện
sinh lý bình thường
Các dạng khác (A, C,…, Z):
các ñiều kiện môi trường,
nội môi trường khác nhau
38
39. CÁC THÔNG SỐ ðẶC TRƯNG CỦA DNA DẠNG A, B, Z
GV. TS.VoõMinh Trí
39
42. CẤU TRÚC BẬC CAO CỦA
DNA Ở PROKARYOTE
GV. TS.VoõMinh Trí
42
43. CẤU TRÚC BẬC CAO CỦA DNA Ở PROKARYOTE
GV. TS.VoõMinh Trí
43
44. CẤU TRÚC BẬC CAO CỦA DNA Ở EUKARYOTE
GV. TS.VoõMinh Trí
44
45. CẤU TRÚC BẬC CAO CỦA DNA Ở EUKARYOTE
GV. TS.VoõMinh Trí
45
46. 46
CƠ CHẾ SAO CHÉP DNA
GV. TS.VoõMinh Trí
Sao chép theo khuôn, bán bảo tồn
Cơ chế phân tử của sự sao chép
So sánh sao chép ở prokaryote và eukaryote
47. CÁC MÔ HÌNH SAO CHÉP DNA
GV. TS.VoõMinh Trí
Sao chép (sao mã, replication)
47
48. THÍ NGHIỆM CỦA MESELSON-STAHL (1958)
GV. TS.VoõMinh Trí
48
49. THÍ NGHIỆM CỦA MESELSON-STAHL (1958)
GV. TS.VoõMinh Trí
49
50. THÍ NGHIỆM CỦA MESELSON-STAHL (1958)
GV. TS.VoõMinh Trí
15N-15N 15N-15N 15N-15N
15N-14N
14N-14N
50
51. SAO CHÉP THEO KHUÔN, BÁN BẢO TG
ỒV.T
NS.VoõMinh
Trí
51
52. 52
CƠ CHẾ PHÂN TỬ CỦA SỰ SAO CHÉP DNA
GV. TS.VoõMinh Trí
ðiều kiện của phản ứng tổng hợp DNA (saochép):
Cần khuôn mạch ñơn
Xúc tác bởi DNApolymerase
Cần ñoạn mồi (primer): ñoạn RNA ngắn bổ sung
với khuôn
Cơ chất: dATP, dCTP, dTTP, dGTP (dNTP)
Mạch mới ñược tổng hợp bằng cách kéo dài mồi theo
chiều 5’ -> 3’: ñầu 5’-phosphate của nucleotide mớisẽ
gắn vào ñầu 3’-OH của ñường ribose trong oligonucleotide
Các nucleotide ñược nối với nhau bằng liên kết
phosphodiester giữa 5’-P và 3’-OH
57. 57
GV. TS.VoõMinh Trí
BA BƯỚC TRONG QUÁ TRÌNH SAO CHÉP (SAOMÃ)
Khởi sự (Initiation): hình thành phức hợp sao chép
(replisome) ở trình tự khởi sự sao chép ori, hình
thành khuôn mạch ñơn, hình thành chẻ ba sao chép
(replication fork), tạo primer
Tổng hợp (kéo dài, Elongation): kéo dài primer, tổng
hợp sợi DNA theokhuôn
Kết thúc (Termination): giải thể phức hợp replisome,
kết thúc sao mã
58. GV. TS.VoõMinh Trí
CÁC PROTEIN CẦN CHO QUÁ TRÌNH SAO CHÉP (SAO MÃ)
58
DnaA: nhận diện, gắn vào ori, cảm ứng tách mạch,
cảm ứng gắn DnaB, DnaC
DnaB: tạo phức hợp với DnaC
DnaC: giúp gắn DnaB vào khuôn
DnaG: primase
SSB: gắn và ổn ñịnh DNA mạchñơn
DNA gyrase: giải xoắn DNA
DNA polymerase III: kéo dài primer, tạo mạch
DNAmới, có hoạt tính 3’=> 5’exonuclease ñể loại
bỏ nucleotide sai
DNA polymerase I: thủy phân mồi RNA vàthay
bằng DNA
DNA ligase: nối các ñoạnOkazaki
63. GV. TS.VoõMinh Trí
TỒNG HỢP LIÊN TỤC Ở MẠCH TRƯỚC VÀ KHÔNG
LIÊN TỤC Ở MẠCH SAU
63
Mạch trước: tổng hợp
liên tục, hướng ñi vào
ngã ba sao chép
Mạch sau: tổng hợp
không liên tục theo
từng ñoạn Okazaki
(1000-2000bp), theo
hướng ñi ra khỏi ngã
ba sao chép
Tốc ñộ sao chép ở
E. coli 5 x 104 nu/phút
71. GV. TS.VoõMinh Trí
SAO CHÉP Ở EUKARYOTE
Sao chép phức tạp
và chậm hơn so với
prokaryote
(3000nu/phút)
Nhiều ñiểm xuất
phát sao chép
(replicon) trên
1 nhiễm sắc thể
Cơ chế kiểm soát
sự sao chép lặp
lại trên 1 ori
71
73. GV. TS.VoõMinh Trí
CƠ CHẾ SỬA SAI VÀ BẢO VỆDNA
Các dạng ñột biến trên DNA
Sửa sai trong sao chép
Sửa sai các ñột biến
Các hệ thống bảo vệ DNA
73
74. 74
GV. TS.VoõMinh Trí
CÁC DẠNG ðỘT BIẾN TRÊNDNA
ðột biến do sai sót trong saochép
ðứt mạch do cơhọc
Thủy phân liên kết N-glycoside làm mất base
Methyl hóa trên base dẫn ñến bắt cặp sai
Mất nhóm amine dẫn ñến bắt cặp sai
Chuyển dạng enol-keto, amino-imino dẫn ñến
bắt cặp sai
Tạo dimer thymine trên cùng một mạch do tia UV
75. GV. TS.VoõMinh Trí
THỦY PHÂN LIÊN KẾT N-GLYCOSIDE LÀM MẤTBASE
Xảy ra với tỷ lệ cao ñối với purine so với pyrimidine
1/105 purine/ngày/tế bào người trong ñiều kiện
bình thường
75
79. 79
GV. TS.VoõMinh Trí
HỆ THỐNG SỬASAI DNAðẢM BẢO TÍNH ỔN ðỊNH CỦA
VẬT LIỆU DI TRUYỀN DNAQUACÁC THẾ HỆ
Tần số sai sót của sao chép in vitro: 10-5
Tần số sai sót của sao chép in vivo: 10-9
Hệ thống sửa sai DNA:
Sửa sai trong sao chép: DNA polymerase III,
DNA polymerase I
Sửa sai do ñột biến
85. 85
GV. TS.VoõMinh Trí
HỆ THỐNG BẢO VỆ DNA
Hệ thống sửa sai
Hệ thống SOS
Hệ thống giới hạn-biến ñổi
86. HỆ THỐNG SOS (SOS REGULATORY SYGV
S.T
TS.
EVo
MõMin
)h
Trí
86
87. GV. TS.VoõMinh Trí
HỆ THỐNG GIỚI HẠN – BIẾN ðỔI
87
(RESTRICTION – MODIFICATION SYSTEM
Giúp vi khuẩn phân biệt DNA chính mình vớiDNA
ngoại lai (phage) và thủy phân DNA ngoạilai
ðặc ñiểm:
Nhận diện một trình tự nucleotide chuyên biệt (trình tự
nhận biết) có tính ñối ngẫu (palindrome, trình tự 5’ => 3’
của hai sợi ñồng nhất)
Có hoạt tính methyl hóa một nucleotide trên trình tự nhận
biết: hoạt tính methylase
Có hoạt tính cắt liên kết phosphodiester tại trình tự nhận
biết, hoặc một vị trí nhất ñịnh so với trình tự nhận biết:
hoạt tính endonuclease
Hoạt tính endonuclease chỉ có ñối với trình tự nhận biết
không bị methyl hóa
88. GV. TS.VoõMinh Trí
HỆ THỐNG GIỚI HẠN – BIẾN ðỔI
(RESTRICTION – MODIFICATION SYSTEM
88
89. 89
GV. TS.VoõMinh Trí
BIỂU HIỆN GEN: PHƯƠNG THỨC SỬ DỤNG
THÔNG TIN DI TRUYỀN TRONG TẾ BÀO
Học thuyết trung tâm
DNA và mã di truyền
Phiên mã ở prokaryote
Phiên mã ở eukaryote
ðặc ñiểm, chức năng các sản phẩm phiên mã(RNA)
Dịch mã
Biến ñổi sau dịch mã
90. 90
GV. TS.VoõMinh Trí
HỌC THUYẾT TRUNG TÂM
Gen và tính trạng
Nguyên tắc truyền thông tin di truyền trong tế bào
và qua các thế hệ
Các bước trong quá trình biểu hiện của gen
91. SAI HỎNG CỦA GEN DẪN ðẾN CÁC SAI HỎNGGV.
ST
IS.
NVo
HõMin
HhT
Órí
A
Bệnh niệu
alkaptonuria
(Garrod, 1908): ñột
biến lặn liên quan ñến
homogentisic acid
oxidase
Các bệnh di truyền ñột
biến lặn khác trong chu
trình phenylalanine
91
92. GV. TS.VoõMinh Trí
1 GEN – 1 ENZYME
Beadle, Tatum (1941): thí nghiệm trên mốc vàng
Neurospora crassa
Tạo các chủng mốc ñột biến khuyết dưỡng (mất
khả năng tự tổng hợp một nhu cầu dinh dưỡng,
ví dụ 1 acid amin
Xác ñịnh mỗi chủng ñột biến liên quan ñến 1 gen:
giả thuyết “1 gen-1 enzyme”
Mở rộng khái niệm:
1 gen - 1 protein
1 gen - 1 polypeptide
1 gen - 1 ñại phân tử sinh học
92
93. NGUYÊN TẮC TRUYỀN THÔNG TIN DI TGV
R.T
US.V
YoõM
Ềin
Nh
Trí
TRONG TẾ BÀO VÀ QUA CÁC THẾ HỆ
Truyền thông tin
giữa 2 thế hệ
Truyền thông tin
trong tế bào
93
Functional protein
94. Ý NGHĨA VÀ ðẶC ðIỂM CỦA CÁC BƯGV
Ớ.TS
C.VoõMinh
Trí
94
TRUYỀN THÔNG TIN
Phiên mã (transcription):
Chọn lựa phần thông tin di truyền cần sử dụng từ bộ gen
Chuyển thông tin di truyền từ DNA thành RNA
Kích thước RNA nhỏ 1/1000 lần so với DNA
RNA kém bền do có C2’-OH, chỉ tồn tại trong một thời
gian nhất ñịnh trong tế bào
Phương thức mã hóa thông tin không thay ñổi
Bản chất hóa học và kiểu kiên kết hầu như không thay ñổi
95. Ý NGHĨA VÀ ðẶC ðIỂM CỦA CÁC BƯGV
Ớ.TS
C.VoõMinh
Trí
95
TRUYỀN THÔNG TIN
Dịch mã (translation):
Thông tin di truyền ñược dịch thành trình tự các amino
acid có bản chất hóa học và kiểu liên kết khác
Các sản phẩm phiên mã ñược dịch mã ở mức ñộ khác nhau
Sản phẩm dịch mã có cấu trúc và chức năng ña dạng
Protein không bền vững và bị phân hủy sau một thời
gian nhất ñịnh
Biến ñổi sau dịch mã (post-translational
modification)
Giúp kiểm soát ở mức ñộ cao hơn sự biểu hiện của gen
Thực hiện bằng những biến ñổi cộng hóa trị và
không cộng hóa trị
96. CHỨC NĂNG ðA DẠNG CỦAPROTEGV
I.T
NS.VoõMinh Trí
96
97. DÒNG THÔNG TIN Ở TẾ BÀO PROKARYOTE VÀ EGV
U.T
KS.
AVo
RõM
Yinh
OTr
Tí
E
Prokaryote: DNA=>RNA=>protein=>functional protein
Eukaryote: DNA=>pre-mRNA=>RNA=>protein=>functional protein
97
99. GV. TS.VoõMinh TríPHIÊN MÃ Ở PROKARYOTE
Là phản ứng sinh tổng hợp
RNA trong tế bào từ DNA
khuôn.
ðiều kiện của phiên mã in vivo:
RNA polymerase có hoạt tính
(tạo liên kết phosphodiester
giữa các rNTP dựa theo khuôn
DNA mạch ñơn)
99
Có ñủ rNTP (rATP, rGTP,
rCTP, rUTP)
Gen ñược mở
Sự phiên mã ñược thực hiện
theo từng ñơn vị phiên mã
Sự tổng hợp RNAluôn
theo chiều 5’ =>3’.
100. ðƠN VỊ PHIÊN MÃ Ở PROKARYOTEGV.TS.VoõMinh Trí
ðơn vị phiênmã:
Promoter: trình DNA nơi RNA polymerase gắn vào
Trình tự mang mã: gồm trình tự các bộ ba mã hóa
(codon) bắt ñầu bằng ATG và kết thúc bằng bộ ba kết thúc
Terminator: trình tự mã hóa cấu trúc kết thúc phiên mã
RNA polymerase gắn với promoter thôngqua
nhân tố sigma
100
101. 101
PROMOTER VÀ SỰ NHẬN DIỆN BỞI SIGGVM.TS.AVoõMinh Trí
Promoter: vùng chứa trình tự bảo tồn ở các nucleotide -10
(TATAAT) và -35 (TTGACA) so với ñiểm bắt ñầu +1.
Nhân tố sigma nhận diện và gắn với promoter tại
vùng -10 và -35.
Sigma gắn với promoter
ở cả hai mạch, mạch xuôi
5’ => 3’chứa trình tự
bảo tồn ñược nhận diện
là mạch mang mã,
mạch ñối diện là mạch
khuôn dùng ñể tổng
hợp RNA.
Trình tự ribonucleotide
của RNA tương tự với
trình tự nucleotide
của mạch mang mã.
102. CÁC SỰ KIỆN TRONG KHỞI SỰ PHIÊN MGVÃ.TS.VoõMinh
Trí
102
103. BA BƯỚC TRONG SỰ PHIÊN MÃ: KÉGOV.TDS.VÀoõMIinhTrí
103
104. BA BƯỚC TRONG SỰ PHIÊN MÃ: KẾTGVT.TSH.VÚoõMCinhTrí
104
105. BA BƯỚC TRONG SỰ PHIÊN MÃ: KẾTGVT.TSH.VÚoõMCinhTrí
105
108. GV. TS.VoõMinh Trí
SO SÁNH PHIÊN MÃ Ở PROKARYOTE VÀ EUKARYOTE
Prokaryote:
Một loại RNA polymerase tổng hợp tất cả các loại RNA
108
mRNA thường chứa nhiều ORF (nhiều gene, polycistron)
Eukaryote:
Vùng mang mã di truyền của gene (exon) bị gián ñoạn
bởi các ñoạn không mang mã (intron)
mRNA ñược tổng hợp qua hai bước: tiền mRNA
(pre mRNA) và mRNA trưởng thành (mature mRNA)
Pre mRNA có chứa chóp 7-methyl-guanosine ở ñầu 5’và
chứa ñuôi polyA (100-200 adenine) ở ñầu 3’
Pre mRNA ñược chế biến (splicing) ñể loại bỏ intron và
nối các exon lại trước khi ñi vào tế bào chất
mRNA trưởng thành trong tế bào chất chứa thông tin
liên tục
109. GV. TS.VoõMinh Trí
SO SÁNH PHIÊN MÃ Ở PROKARYOTE VÀ EUKARYOTE
Eukaryote:
mRNA chỉ chứa 1 ORF
(một gen, monocistron)
RNA polymerase I và III:
tổng hợp rRNA, tRNA và các
RNA nhỏ khác
109
RNA polymerase II: tổng hợp
mRNA
112. CÁC VÙNG CHỨC NĂNG VÀ ðỘ BỀN CỦAGmV.TRS.NVoAõMinhTrí
Các vùng chức năng:
5’-UTR (untranslated region): vùng 5’ không dịchmã
Vùng dịch mã: một hay nhiều khung dịch
mã (ORF, open reading frame)
3’-UTR: vùng 3’ không dịchmã
Terminator: cấu trúc kết thúc
ðộ bềnmRNA:
Phụ thuộc vào cấu trúc bậc cao ở ñầu 5’và 3’, mũ 5’và ñuôi polyA
mRNA của prokaryote có cấu trúc ñơn giản, thờigian
bán phân ngắn (phút)
mRNA của eukaryote có thời gian bán phân dài (30 phút – 24giờ)
Vùng 5’không
dịch mã
112
Vùng dịch mã, ORF Vùng 3’không
dịch mã
113. ðƠN VỊ PHIÊN MÃ CỦA OPERON RNA ỞPROGKV.ATSR.VYoõOMinThETrí
113
117. SỰ GẮN CHUYÊN BIỆT AMINO ACID LÊN tRNATƯGV
Ờ.T
NS.
GVoõM
Ứin
Nh
GTrí
Liên kết ester hình thành giữa 3’-OH của tRNA
và –COOH của amino acid tương ứng nhờ sự xúc
tác của aminoacyl-tRNA synthetase tương ứng
117
118. MÔ HÌNH PHÂN TỬ MINH HỌA TÍNH CHUYÊN BG
IV
Ệ.T
TS.V
Goõ
IM
Ữin
AhTrí
ENZYME, AMINO ACID VÀtRNA
118
119. GV. TS.VoõMinh Trí
DỊCH MÃ
119
Là quá trình sinh tổng hợp protein trong tế bào
trên khuôn mRNA và ribosome.
ðiều kiện của dịch mã in vivo:
Có ñủ amino acid và aminoacyl-tRNA (tRNAgắn
amino acid)
Có ñủ các nhân tố dịch mã
Ribosome hoạt ñộng và mRNA
Sự dịch mã ñược thực hiện theo từng ñơn vị là ORF
Sự dịch mã luôn theo chiều 5’ => 3’ của mRNA,
ñầu 5’ tương ứng với -NH2 (ñầu N), ñầu 3’ tương
ứng với -COOH (ñầu C) của polypeptide
121. GV. TS.VoõMinh Trí
BA BƯỚC TRONG DỊCH MÃ: KHỞI SỰ
121
Gồm các sự kiện lắp ghép có trực tự
của mRNA, các tiểu phần ribosome,
tRNA-fMet tại codon khởi sự trước
khi hình thành một liên kết peptide
Ribosome hoàn chỉnh có ba vị trí:
A: nơi tiếp nhận tRNA gắn amino acid
P: nơi tiếp nhận tRNA-fMet và
nơi chứa tRNA-peptide
E: vị trí thoát của tRNA
ðược kiểm soát bởi các nhân tốkhởi
sự dịch mã IF (Initiation factor)
122. TƯƠNG TÁC GIỮA 16S rRNA VÀ TRÌNH TGV
Ự.TS.
SVo
HõM
Iin
NhT
Erí
- DALGARNO Ở ðẦU 5’CỦA mRNA
122
123. BA BƯỚC TRONG DỊCH MÃ: KÉOG
DV.
ÀTS.
IVoõMinhTrí
Các nhân tố kéo dài dịch mã EF (elongation factor)
giúp ñưa tRNA mang amino acid vào vị trí A và
cảm ứng sự xúc tác hình thành liên kết peptide
123
124. BA BƯỚC TRONG DỊCH MÃ: KÉOG
DV.
ÀTS.
IVoõMinhTrí
Ribosome di chuyển 1 bộ ba
theo chiều 5’ => 3’của mRNA
Vị trí của các tRNAtrên
ribosome thay ñổi
Năng lượng ñược
cung cấp từ sự thủy
phân GTP
124
125. BA BƯỚC TRONG DỊCH MÃ: KÉOG
DV.
ÀTS.
IVoõMinhTrí
125
126. HÌNH THÀNH LIÊN KẾT PEPTIDE VÀ SGV
Ự.TS
D.Vo
ỊõM
Cin
Hh
Trí
CHUYỂN CỦA RIBOSOME TRONG DỊCH MÃ
126
127. 127
BA BƯỚC TRONG DỊCH MÃ: KẾT TG
HV.T
ÚS.
CVoõMinhTrí
Vị trí A củaribosome
gặp codon kết thúc
Nhân tố kết thúc
dịch mã RF
(releasing factor)
gắn vào
Thủy phân liên kết
ester giữa peptide
và tRNA
Hai tiểu phần
ribosome tách ly
và rời khuôn
mRNA
128. BIẾN ðỔI SAU DỊCH MÃ (POST-TRANSLATIONALMODG
IV
F.T
IS
C.V
Ao
TõM
Ii
Onh
NTr
)í
Biến ñổi cộng hóa trị: gắn thêm ñường, phosphate,
methyl…
Biến ñổi không cộng hóa trị:
Gắn với một hợp chất phân tử lượng nhỏ (tác nhân biến cấu)
Gắn với một protein khác
Tương tác với chaperon phân tử
128
129. ðột biếnñiểm:
ðỘT BIẾN (MUTATION) LÀM THAY ðỔI KIỂU GENE VGÀV.KTSI.ỂVUoõMHinÌhNTrHí
Thêm hoặc mất một nu: làm lệch khung dịch mã
Thay thế nu này bằng nu khác: ñột biến lệch nghĩa
(mis-sense), ñột biến trung tính (neutral) hay lặn (silent),
ñột biến mất nghĩa (non-sense)
Hồi biến (reverse mutation): ñột biến ñiểm trở lại nu ban ñầu
ðột biến mất ñoạn, thêm ñoạn, ñảo ñoạn, chuyểnvị:
làm bất hoạt gen và mất khung dịch mã
Tần số ñột biến tự nhiên:
ðột biến trong sao chép: 10-4-10-8/thế hệ
ðột biến mất nghĩa: 10-6-10-8/thế hệ
Chuyển vị gene: 10-4/thế hệ
Tác nhân gây ñột biến: tia xạ, hóa chất, sinh học…129
131. ðỘT BIẾN (MUTATION) LÀM THAY ðỔI KIỂU GENE VÀG
KV.
IT
ỂS.
UVo
HõM
Ìin
Nh
HTrí
131
132. GV. TS.VoõMinh Trí
ðIỀU HÒA SỰ BIỂU HIỆN CỦAGENE
VÀ SỰ PHÁT TRIỂN
132
Hiện tượng ñiều hòa biểu hiện của gene
ðặc ñiểm cơ bản của sự ñiều hòa biểu hiệncủa
gene ở prokaryote và eukaryote
Các mức ñiều hòa sự biểu hiện của gene
Kiểm soát dương và kiểm soát âm ở prokaryote
Cấu trúc protein ñiều hòa
ðặc ñiểm kiểm soát phiên mã của gene ởeukaryote
ðiều hòa biểu hiện của gene trong biệt hóavà
phát triển
133. 133
HIỆN TƯỢNG ðIỀU HÒA SỰ BIỂU HIỆN CGV
Ủ.TS
A.Vo
Gõ
M
Einh
NTrí
E
ðáp ứng thích nghi của tế bào, cá thể về hìnhthái,
sinh lý, sinh hóa… ñối với sự thay ñổi của
môi trường
Sự biểu hiện nối tiếp, có chương trình của các
gene ở vi sinh vật
Sự biệt hóa thành nhiều tế bào có chức năng khác
nhau trong cơ thể ña bào bậc cao
134. ðẶC ðIỂM BIỂU HIỆN CỦA GENE ỞPROG
KV.
ATS.
RVo
YõMi
OnhT
Trí
E
Sự biểu hiện
của gene ñáp
ứng theo thay
ñổi của môi
trường
Hầu như không
có biệt hóa
134
135. ðẶC ðIỂM BIỂU HIỆN CỦA GENE ỞEUKGV
A.T
RS.V
Yoõ
M
Oinh
TT
Erí
Phương thức ñiều hòa phức tạp hơn và có sự biệt hóa
135
136. 136
CÁC MỨC ðIỀU HÒA SỰ BIỂU HIỆN CỦGV
A.TS
G.Vo
Eõ
M
Ninh
ETrí
Mức DNA:
Thay ñổi cấu trúc bậc cao
ðột biến, sắp xếp lại DNA
Mức phiên mã: tăng cường hay ức chế phiên
mã tạo mRNA
Mức dịch mã:
Tính ổn ñịnh và cấu trúc mRNA
Hiệu quả tổng hợp protein
Mức sau dịch mã:
Hình thành cấu hình tự nhiên
Chức năng và hoạt tính protein
137. GV. TS.VoõMinh Trí
ðIỀU HÒA SỰ BIỂU HIỆN CỦA GENE MÃHÓA
ENZYME Ở MỨC PHIÊN MÃ, DỊCH MÃ VÀ
SAU DỊCH MÃ
137
138. ðIỀU HÒA SỰ TỔNG HỢP ENZYMEVÀGV.
HTS
O.Vo
ẠõMi
TnhTrí
TÍNH ENZYME
138
140. 140
ðIỀU HÒA PHIÊN MÃ Ở PROKARYOTEGV:.TKS.VIoỂõMMinh
Trí SOÁT ÂM (NEGATIVE CONTROL)
Liên quan tới repressor và operator
Khi repressor gắn vào operator => không tạo mRNA
Repressor ñược ñiều hòa sau dịch mã => trạng thái
có hoạt tính và không có hoạt tính:
Repressor ñược hoạt hóa bởi Effector và gắn vào
operator: sự biểu hiện của trp operon bị ức chế (repression)
bởi tryptophane
Repressor bị bất hoạt không gắn vào operator: sự biểu hiện
của lac operon ñược cảm ứng (induction) bằng lactose
141. XÚC TÁC SỰ THỦY PHÂN
LACTOSE BỞI
-GALACTOSIDASE
141
142. KIỂM SOÁT ÂM SỰ BIỂU HIỆN CỦA OPERON LGV
A.T
CS.
TVo
OõM
Sin
Eh
Trí
142
143. KIỂM SOÁT ÂM SỰ BIỂU HIỆN CỦA OPERON TRG
YV.
PTS
T. V
Ooõ
PMi
Hnh
ATr
Ní
E
143
144. 144
GV. TS.VoõMinh Trí
ðIỀU HÒA PHIÊN MÃ: KIỂM SOÁTDƯƠNG
(POSITIVE CONTROL)
Liên quan tới activator và activator-binding site
(hoặc enhancer)
Activator gắn vào enhancer => tăng cường
tạo mRNA
Activator ñược ñiều hòa sau dịch mã: trạng thái
có hoạt tính và không có hoạt tính
Activator ñược hoạt hóa bởi effector (cAMP)
ñể gắn vào activator-binding site: trường hợp
lac operon, mal operon
146. ðIỀU HÒA KIỂM SOÁT DƯƠNG Ở lacOG
PV.
ETS.
RVo
OõMi
Nnh
Trí
146
147. ðIỀU HÒA KIỂM SOÁT DƯƠNG Ở malOGV
P.T
ES.
RVoõ
OMin
Nh
Trí
147
148. VAI TRÒ CỦA ACTIVATOR TRONG KIỂM SOÁTGV
D.TS
Ư.V
ƠoõM
Nin
Gh
Trí
148
149. GV. TS.VoõMinh Trí
TƯƠNG TÁC GIỮA PROTEIN VÀ NUCLEIC ACID
Tương tác không chuyên biệt: histone-DNA
Tương tác chuyên biệt: protein là dimer, mỗi
monomer gắn vào một trình tự xác ñịnh trên một
sợi DNA
ðặc ñiểm của trình tự gắn protein: lặp lạiñảo
ngược (trên một mạch)
149
151. 151
GV. TS.VoõMinh Trí
ðẶC ðIỂM CẤU TRÚC CỦA DNA-BINDINGPROTEIN
Cấu trúc bậc 2 (xoắn -helix), phần ổn ñịnh cấu
hình và phần chứa trình tự nhận diện (nơi gắn)
Xoắn-gập-xoắn (Helix-turn-helix motif)
Ngón tay gắn kẽm (zinc finger)
Dây kéo leucine (leucine zipper)
153. 153
GV. TS.VoõMinh Trí
ðẶC ðIỂM ðIỀU HÒA PHIÊN MÃ Ở EUKARYOTE
Phương thức ñiều hòa phức tạp hơn
Promoter bao gồm: TATAbox và UPE (upstream
element)
Hầu hết các gene ñược ñiều hòa bởi ñồng thời nhiều
trình tự ñiều hòa
ðiều hóa theo cơ chế kiểm soát dương bởi activator
và các enhancer nằm cách xa về phía thượng lưu
hoặc hạ lưu của promoter
ðiều hòa theo cơ chế kiểm soát âm bởirepressor
và trình tự ñiều hòa (repressor-binding site)
157. 157
GV. TS.VoõMinh Trí
ðIỀU HÒA SỰ BIỂU HIỆN CỦA GENE TRONGQUÁ
TRÌNH BIỆT HÓA VÀ PHÁTTRIỂN
Các tế bào khác nhau ở cơ thể ña bào ñều có lượng
DNA như nhau và có khả năng bắt cặp bổ sung
với nhau
Các tế bào biệt hóa khác nhau có hàm lượng, chủng
loại mRNA và protein khác nhau
Các gene ñược biểu hiện theo chương trình thời gian
Phiên mã là cơ chế chủ yếu của sự ñiều hòa biểu
hiện của gene trong biệt hóa và phát triển
158. 158
MỘT SỐ ENZYME CƠ BẢN DÙNG TRG
OV.
NTS
G.VoõMinhTrí
SINH HỌC PHÂN TỬ
DNApolymerase:
Taq polymerase
Pfu polymerase
Enzyme cắt hạn chế:
Enzyme cắt ñầu dính
Enzyme cắt ñầu bằng
Enzyme nối DNA:
T4 DNAligase
159. GV. TS.VoõMinh Trí
Taq polymerase
DNA polymerase chịu nhiệt, nhiệt ñộ hoạtñộng
thích hợp ở 70-80oC
Chiết tách từ vi khuẩn Thermus aquaticus sống ở
suối nước nóng
Tốc ñộ tổng hợp chuỗi oligonucleotide khoảng
1000-1500nu/phút
ðược sử dụng ñể tổng hợp ñoạn DNA invitro
Taq polymerase sẽ gắn các dNTP vào ñầu 3’OH
của nucleotide nằm trong oligonucleotide dựa theo
mạch khuôn
159
160. GV. TS.VoõMinh Trí
Taq polymerase
160
Taq polymerase sẽ gắn thêm một nucleotide adenine
(A), làm cho mạch mới tổng hợp sẽ dư một Aso
với mạch khuôn (75% sản phẩm PCR)
ðộ chính xác không cao (10-4errors/bp)
Phản ứng ñược xúc tác bởi Taq polymerase phải có
ñầy ñủ các thành phần sau:
Mạch DNA ñơn làm khuôn
Mồi-là một ñoạn oligonucleotide ngắn (5-150 nu) phải
bổ sung với mạch DNAkhuôn
dNTP: dTTP, dATP, dGTP và dCTP
Dung dịch ñệm chứa phần muối và pH thích hợp
ñể duy trì hoạt tính của Taq polymerase
162. 162
GV. TS.VoõMinh Trí
Pfu polymerase
Là DNA polymerase chịu nhiệt, nhiệt ñộ hoạtñộng
thích hợp ở 70-80oC
Chiết tách từ vi khuẩn cổ Pyrococcus furiosus sốngở
suối nước nóng (nhiệt ñộ thích hợp 100oC )
Tốc ñộ tổng hợp chuỗi oligonucleotide khoảng
500-1000nu/phút
ðược sử dụng ñể tổng hợp ñoạn DNA invitro
Pfu polymerase sẽ gắn các dNTP vào ñầu 3’OH
của nucleotide nằm trong oligonucleotide dựa theo
mạch khuôn
163. 163
GV. TS.VoõMinh Trí
Pfu polymerase
Pfu polymerase không gắn nucleotide vào ñầu 3’OH
ðộ chính xác cao (10-6 errors/bp)
Phản ứng ñược xúc tác bởi Pfu polymerase phải có
ñầy ñủ các thành phần sau (cũng tương tự
Taq polymerase):
Mạch DNA ñơn làm khuôn
Mồi-là một ñoạn oligonucleotide ngắn (5-150 nu) phải
bổ sung với mạch DNAkhuôn
dNTP: dTTP, dATP, dGTP và dCTP
Dung dịch ñệm chứa phần muối và pH thích hợp
ñể duy trì hoạt tính của Pfu polymerase
165. GV. TS.VoõMinh Trí
Enzyme cắt hạn chế
Là enzyme của vi khuẩn dùng ñể cắt DNAcủa
bacteriophage (phage) xâm nhiễm vi khuẩn,
nhờ ñó bảo vệ vi khuẩn khỏi bị phage tiêu diệt
Thủy phân liên kết phosphodiester trên sợi
DNA tại vị trí chuyên biệt sẽ giải phóng sợi
DNA có ñầu 5’P và 3’OH
Có nhiều loại enzyme cắt hạn chế
Sau khi cắt sản phẩm DNAcó
thể ñầu dính hay ñầu bằng
Tên gọi của enzyme cắt hạn chế ñược gọi theo tên
viết tắt của loài vi sinh vật ñầu tiên có enzyme cắt
giới hạn ñó
165
167. 167
GV. TS.VoõMinh Trí
Tên gọi của enzyme cắt hạn chế
HindIII: Haemophilus influenzae serotype d
EcoRI: Escherichia coli RY13
BglII: Bacillus globigii
168. GV. TS.VoõMinh Trí
Vị trí cắt của enzyme cắt hạn chế
Trình tự ñối ngẫu: ñối xứng qua một trục
Cắt ñầu dính:
5’-G-3’OH
3’-CTTAA-5’P
5’P-AATTC-3’
3’OH-G-5’
5’-A-3’OH
3’-TTCGA-5’P
5’P-AGCTT-3’
3’OH-A-5’
168
169. GV. TS.VoõMinh Trí
Vị trí cắt của enzyme cắt hạn chế
Cắt ñầu bằng:
169
5’-CCC-3’OH
3’-GGG-5’P
5’P-GGG-3’
3’OH-CCC-5’
5’-AGG-3’OH
3’-TCC-5’P
5’P-CCT-3’
3’OH-GGA-5’
170. 170
GV. TS.VoõMinh Trí
T4 DNAligase
ðược tìm thấy và chiết tách từ bacteriophageT4
Xúc tác sự hình thành phosphodiester giữa 3’OH
của chuỗi DNA này với ñầu 5’P của một chuỗi
DNAkhác
T4 DNA ligase có thể nối DNAsợi ñôi hoặc DNA
sợi ñơn/RNA ñể tạo thành một phântử
Trong trường hợp DNA sợi ñôi, các ñoạnDNA
ñã xử lý với enzyme cắt hạn chế thì T4 DNAligase
chỉ có thể nối các ñoạn DNA cắt cùng loạienzyme
172. Phân tử DNA 1 ñã xử lý vớiEcoRI
5’-ATATATACCGGAG-3’OH
3’-TATATATGGCCTCTTAA-5’P
GV. TS.VoõMinh Trí
Phân tử DNA 2 ñã xử lý vớiEcoRI
5’P-AATTCTTCCACCCCCGGAAGCTTGGGAAAT-3’
3’OH-GAAGGTGGGGGCCTTCGAACCCTTTA-5’
T4 DNAligase
5’P3’OH
3’OH5’P
5’-ATATATACCGGAGAATTCTTCCACCCCCGGAAGCTTGGGAAAT-3’
- - - - - -
3’-TATATATGGCCTCTTAAGAAGGTGGGGGCCTTCGAACCCTTTA-5’
Liên kết hydro ñược tạo thành giữa
các base nitơ bắt cặp bổ sung
5’-ATATATACCGGAGAATTCTTCCACCCCCGGAAGCTTGGGAAAT-3’
- - - - - -
3’-TATATATGGCCTCTTAAGAAGGTGGGGGCCTTCGAACCCTTTA-5’
T4 DNA ligase sẽ xúc táchình
thành liên kết phosphodiester
ở cả hai mạch tạo thành 1 phân tử DNA
172
173. MỘT SỐ DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠG
NV.T
GS.V
PoõM
Hin
Áh
Tr
Pí
DÙNG TRONG SINH HỌC PHÂN TỬ
Pipetman, eppendorf
Máy ly tâm, phương pháp ly tâm
ðiện di và phát hiện nucleic acid
Nhân bản DNA bằng phản ứngPCR
Xác ñịnh nồng ñộ và ñộ sạch mẫu nucleic acid
Biến tính DNA
Lai DNA
Giải trình tự DNA
Tách chiết DNA bộ gene và plasmid
Thu nhận ñoạn DNA, gene
173
176. GV. TS.VoõMinh Trí
Phương pháp ly tâm
Phân tách các thành phần rắn trong huyền phù dựa vào
trong lượng phân tử dưới tác dụng của lực ly tâm
F = mω2r
RCF = (1.119 x 10-5)(rpm)2(r)
176
177. GV. TS.VoõMinh Trí
ðiện di DNA
Phân tách các ñoạn DNA
có kích thước phân tử
khác nhau dưới tác dụng
của ñiện trường
Mẫu di chuyển từ cực âm
sang cực dương
Bộ nguồn: cung cấp
dòng ñiện
Bồn ñiện di: nơi chứa dung dịch ñiện di, giá thể ñiện di
(agarose gel), nơi xảy ra quá trình di chuyển của
các ñoạn DNA
177
178. GV. TS.VoõMinh Trí
ðiện di DNA
Cách tiến hành:
Chuẩn bị giá thể ñiện di (agarose gel): ñun chảy agarose
gel, chờ nguội, ñổ vào khuôn ñã gắn lược tạo giếng, chờ
agarose gel ñông
Tháo lược ra khỏi agarose gel, lắp vào bồn ñiện di,
thêm dung dịch diện di vượt qua mặt gel
178
179. GV. TS.VoõMinh Trí
ðiện di DNA
Cách tiến hành:
Chuẩn bị mẫu ñiện di: mẫu DNA
ñược trộn với dung dịch nạp mẫu
Chứa glycerol hoặc succrose: ngăn
không cho mẫu DNA thoát ra khỏi giếng
Chứa phẩm màu: nhận biết mẫu ñiện di
ñã di chuyển tới ñâu trong giá thể ñiện di
Mỗi mẫu DNA ñược nạp ở mỗi
179
giếng khác nhau
Giếng ñầu tiên ñược nạp với
thang DNA
Chứa các ñoạn DNA ñã biết
trước kích thước
ðậy nắp bồn ñiện di, bật nguồn ñể cung cấp dòng ñiện,
quan sát sự di chuyển của vạch màu, tắt nguồn khi vạch
màu di chuyển tới một vị trí thích hợp
180. GV. TS.VoõMinh Trí
ðiện di DNA
1.0 kb
Cách tiến hành:
Ngâm gel vào dung dịch chứa ethidium bromide
Ethidium bromide có ái lực mạnh với nucleic acid và xen giữa hai
base nitơ, phát sáng khi kích thích bằng tia UV, vì vậy trên gel
agarose nơi có DNA thì ethidium bromide sẽ gắn vào vàphát
ra vạch sáng
Xem kết quả trên hộp ñèn UV, chụp hình
1 2 3 4 5
1176 bp
0.5 kb
2148 bp
3.5 kb
3.0 kb
2.5 kb
180
181. 181
Xác ñịnh nồng ñộ và ñộ sạch mẫu nucleG
iV
c.TS
a.V
co
iõM
dinhTrí
Xác ñịnh nồng ñộ của dung dịch nucleic acid:
Dựa vào sự hấp thu của nucleic acid ở bước sóng 260nm
ðối với dung dịch DNA mạch ñôi: 1 ñơn vịOD260nm
tương ứng 50µg/ml
ðối với dung dịch DNA mạch ñơn hoặc RNA: 1 ñơnvị
OD260nm tương ứng 40µg/ml
Xác ñịnh ñộ sạch của mẫu nucleic acid:
Dựa vào tỷ lệ OD260nm/OD280nm
OD260nm/OD280nm = 1,8 – 2 => mẫu nucleic acid sạch
protein
182. Xác ñịnh nồng ñộ và ñộ sạch mẫu nucleG
iV
c.TS
a.V
co
iõM
dinhTrí
182
183. GV. TS.VoõMinh Trí
Nhân bản DNA bằng phản ứngPCR
PCR (Polymerase Chain Reaction): là phản ứng nhân bản
in vitro DNA dưới xúc tác của DNA polymerase chịu nhiệt
Gồm 3 bước:
Biến tính DNA: phản ứng PCR
ñược nâng nhiệt ñộ tới khoảng
95oC ñể hai mạch của phân tử
DNA tách rời nhau ra. Hai
mạch này ñược sử dụng làm
khuôn
Bắt cặp: Phản ứng PCR
ñược hạ nhiệt ñộ xuống
trong khoảng 50-65oC ñể
mạch khuôn và mồi bắt cặp
với nhau. Nhiệt ñộ bắt cặp
tùy thuộc vào ñặc tính của
mồi
183
184. GV. TS.VoõMinh Trí
Nhân bản DNA bằng phản ứngPCR
Kéo dài: Phản ứng PCR
ñược nâng lên nhiệt ñộ thích
hợp
cho DNA polymerase chịu nhiệt
hoạt ñộng khoảng 72oC ñể kéo
dài mồi theo chiều 5’=> 3’bằng
cách thêm nucleotide vào ñầu
3’OH và dựa vào mạch bổ sung
Ba bước này tạo thành một
chu kỳ trong phản ứng PCR.
Mỗi phản ứng PCR thường
lặp lại khoảng 30 – 35 chu kỳ
Khuếch ñại số lượng bản sao ñoạn DNA lên 106 lần
184
185. GV. TS.VoõMinh Trí
Biến tính DNA
Liên kết hydrogen giữa hai mạch
bổ sung có thể bị cắt ñứt khi xử lý
với tác nhân hóa học-vật lý, giúp
hai mạch tách rời nhau
Tm: nhiệt ñộ cần thiết ñể mạch
ñôi của phân tử DNA tách thành
mạch ñơn
Hai mạch DNA ñã tách có thể
tái bắt cặp bổ sung ñể trở về
dạng ban ñầu (phân tử DNA
mạch ñôi) khi dung dịch ñược
hạ nhiệt ñộ từ từ
185
186. GV. TS.VoõMinh Trí
Lai DNA (DNAhybridization)
Phương pháp lai Southern
Giúp phát hiện trình tự
chuyên biệt trên một
ñoạn DNA
Dựa vào sự bắt cặp bổ
sung giữa trình tự cần xác
ñịnh và mẫu dò (probe)
Probe: oligonucleotide
với trình tự ñã biết và
ñược ñánh dấu bằng ñồng
vị phóng xa, chất phát
huỳnh quang, một chất
có khả năng tạo màu
186
188. GV. TS.VoõMinh Trí
188
Giải trình tự DNA
Dùng phương pháp
Sanger với
dideoxyribonucleotide
(ddNTP) ñánh dấu
Trình tự DNA ñược
ñọc dựa trên tổng hợp
các sợi bổ sung bằng
DNA polymerase bị
gián ñoạn bởi một
ddNTP nhất ñịnh ñược
ñánh dấu
Tách các ñoạn DNA
bằng ñiện di trên
polyacrylamide gel
ðọc trìnhtự
190. GV. TS.VoõMinh Trí
Thu nhận DNA bộ gene và plasmid
Tách chiết DNA bộ gene, plasmid từ tế bào
Phân tích bằng ñiện di
Kiểm tra ñộ sạch, nồng ñộ
190