metodos de estudio de la biologia molecular, clase del doctor nelson fuentes, depto biomedico de la universidad de antofagasta.Transcripciónn no autorizada para su difusión masiva. al descargar estoestásssiendo cómplice. ijijji Nicolas Mora -All rights are reserved 2013-

1. Métodos de estudio de la
biología molecular
Introducción
De acuerdo a lo que nos hemos dado cuenta hemos visto con diferentes
profes todo el desarrollo con una serie de temas relacionados con biología
celular, constitución química, moléculas inorgánicas y orgánicas haciendo
estructuras de mayor nivel y aparecen las partes de la célula , membrana ,
citoplasma, citoesqueleto, y con otros profesores vieron aspectos relacionados
con el citoplasma membranoso núcleo y cromosomas y en las ultimas clases la
diferenciación y procesos de meiosis y especificación de las células para
cumplir su función específica en los seres vivos. Con eso más o menos esta
completo respecto a célula. Pero esto es también molecular, asique daremos
nociones (no es un curso de biología molecular) como funciona y trabaja con
sus principales aspectos, con este tan importante boom de la biología
molecular, metodologías para obtener la información necesaria, y en la
próxima clase para ácidos nucleídos y proteínas involucradas directamente en
biología molecular. Finalizando con la aplicación de estas técnicas a los
diferentes seres vivos que constituyen la biotecnología y terapia génica. Solo
saber que existen y como funciona.

2. METODOS DE BIOLOGIA
MOLECULAR
Como les decía, la biología molecular se entretiene estudiando moléculas,
especialmente 2, proteínas y ácidos nucleídos, por ende las metodologías
están dirigidas a estudiar estas 2 moléculas, una de estas 2 metodologías
importantes son las que tienen que ver con la separación con las diferentes
moléculas de un organismo, ya que en un organismo hay miles de proteínas
aquí se separan y se estudian en forma única para reconocer y manipular sus
características en forma específica, que es la ELECTROFORESIS eso es una
cámara típica, es vertical, porque la muestra corre de arriba hacia abajo, hay
otras que son horizontales, esto separa diferentes moléculas sea proteína o
acido nucleído, se hace por medio de un gel, que es una estructura que
físicamente está entre solido y liquido, lo disolvemos y según su concentración
es duro o blando, dependiendo del tipo de sustancia que tenemos que
separar, si son muy grandes el gel tiene que ser lo más blando posible con
espacio grandes entre sus moléculas para que las otras moléculas puedan
pasar. Si son chicas el gel tiene que ser más concentrado, entonces el gel
depende de la concentración para ver que separar.

3. Electroforesis trabaja con electricidad,
cátodo y ánodo, con diferencia de
potencial eléctrico por electrodo
circula corriente por el buffer, por ahí
pasan los iones de ahí los electrones
pasan por el gel y de ahí al otro buffer
llegando al ánodo haciendo el
recorrido, con esa circulación las
partículas del gel empiezan a
movilizarse según peso. Si son positivas
se van al polo negativo, y si son
negativas van al ánodo. Hay que
hacer algo para que todas las
muestras sean negativas, “WELLS” pocillos para poner la muestra (la rafa lo
pregunto *o*)
Para que todas las moléculas sean negativas se tratan con una sustancia que
las carga negativamente, SDS se pega a las moléculas de proteína y todas las
proteínas están cargadas negativamente, y así corren al polo positivo.
Una vez que el gel ha corrido y las moléculas de acuerdo al tamaño se
posicionan, las mas chicas corren mas y pasan por los orificios y las más
grandes solo pasan por los orificios grandes y así se quedan más atrás y se
demoran más tiempo.
Una vez que se
separan las moléculas
hay que moverlas del
gel porque ya el
proceso siguiente es
manipular esas bandas
que se generaron y
manipular un gen es
difícil es quebradizo y
resbaladizo, lo más
probable es que se
caiga, para que evitar
eso se hace otro
proceso en el cual se
traspasa desde el gel
hacia un papel de
nitrocelulosa. Este papel tiene la capacidad de absorber acido nucleído y
proteínas, entonces si lo colocamos pegado al papel de nitrocelulosa y
hacemos circular agua, es algo simple y barato, de manera que el buffer pasa
por el gel y lleve las moléculas al papel de nitrocelulosa, arriba de ese hay
papel absorberte normal

4. Otro método que es más simple y rápido es un método eléctrico, se pone todo
en un sistema eléctrico y así las moléculas del gel se van al papel.
De esa manera se obtiene que todo quede en el papel de nitrocelulosa y el
gel queda sin nada, ese papel es mucho mas manipulable, tiene las bandas
de las moléculas igual que el gel igual eso se puede trabajar para reconocer
que tipo de moléculas son las diferentes bandas que se generaron. Si busco
algo especifico lo podemos hacer con anticuerpos, si queremos saber la
insulina ponemos en la bolsa el anticuerpo anti insulina y luego se reconocerá
la banda marcada, una es por anticuerpos
Lo interesante y general del procedimiento es que podemos tener en forma
separada moléculas especificas esa es su capacidad, de un conjunto de una
célula o tejido en forma única limpia y separada una de otra
Así podemos hacer varias cosas podemos diluir, cortamos y diluimos la proteína
en un buffer o bien cortamos el papel de micro celulosa y lo diluimos en tubo
de ensayo y ahí está la proteína o acido núcleos que se necesita.
Northen blot reconoce la presencia de ácidos ribonucleicos ARN los marca
con acido desoxirribonucleico, se pone un gel papel y se marca, esa
marcación se hace con radio actividad, una molécula de ADN con
radioactividad reacciona con el papel. Reaccionara solo moléculas parecidas
que tengas bases complementarias esas bases complementarias se unirán en
el papel y verán la radioactividad del papel. Esa banda son los ácidos
nucleídos que andamos buscando. Se buscan con acido desoxirribonucleico
mas por ejemplo carbono 14 , algo radioactivo,
Se verá solo que
esta marcado.
Se prepara la
secuencia y
se maca con
carbono 14,
entonces esa

5. molécula estará marcada radioactivamente y esa reacción con la molécula
se le pone al papel y se marcara solo la que tenga la secuencia
complementaria, y así la molécula se pegara, si no la tiene simplemente no se
pega no hay complementariedad, y ahí aparecerá la banda. Porque esa está
marcada,.
Otra tecnología utilizada de separación es la CROMATOCRAFIA se usan
sistemas simples, en que simplemente es una probeta, que se pone una
sustancia que es un polvo blanco y sobre el una mezcla de sustancias, esa
mezcla tiene diferentes compuestos y algunos de esos compuestos tendras
afinidad mayor o menor con la sustancia que hay en la columna, las que no
tengan ninguna afinidad pasaran rápidamente, eso pasa rápidamente y sale
primero, lo que sea de mayor tamaño o mas afinidad se demorara mas y
saldrá en segundo lugar, y si hay otra más grande o mas afín saldrá en tercer o
cuarto dependiendo el numero de moléculas de la mezcla. Lo principal es
colocar la mezcla
ahí arriba y se
separa,
La idea es tener
compuestos
distintos de un
volumen mas o
menos grandes.
Unos 100ml. Pero a
veces la muestra
son unos pocos
micro litros o 1 o 2
ml. De ahí se usan
otros métodos.,
Cromatografía en papel, en esas manchas se ponen las mezclas de diferentes
compuestos unos mas grandes o pequeños con mas o menos carga y se
ponen en forma coloreada, marcando en colores, se ponen las gotas en un
trozo de papel con un solvente que puede ser alcohol o acetona
dependiendo que queremos separar, cuando ponemos papel en el liquido el
liquido sube por capilaridad llegando a las manchas arrastrándolas los mas
pesados se quedan atrás y los livianos suben y al final hay como un arcoíris
pasando los conjuntos de moléculas y tenerlos individualmente, se corta el
papel y se tendrá esa molécula específicamente.

6. Lo otro es la cromatografía de columna, es
una técnica bastante desarrollada , hay
diferentes tipos de cromatografía, la parte
básica es una columna de vidrio o de lo que
sea, pero el principio es el mismo, ocurre que
en la columna de vidrio se coloca una matriz
es una sustancia generalmente solida
partículas muy pequeñas en polvo y gránulos
dependiendo del tipo de matriz porque hay
una que separa sustancias eléctricamente
que separan por tamaño que separan que no
están cargadas eléctricamente etc.
Consiste en que la muestra que es una mezcla de varias moléculas se colocan
en la superficie de la matriz y se hace pasar a través de ella generalmente de
un solvente. Esta mezcla pasa a través de la matriz y las diferentes moléculas
tienen diferente afinidad por la matriz, abran unas que se retrasan o que van
más rápido. Y al final se van separando de manera que la roja sale primero
luego la verde y luego la negra se queda pegada al sistema de esa manera
recogeremos las sustancias prácticamente puras, porque es muy difícil que
existan 2 moléculas iguales.
El sistema puede ser de intercambio iónico
es decir que la matriz en la columna está
cargada positivamente, aquellas que no
tienen carga pasan sin fijarse, las que tienen
carga positiva se repelen y pasan
positivamente y las negativas se pegan, esas se
quedan adheridas a la matriz, entonces solo
quedaran las moléculas rojas , se agrega un
buffer y se sueltan.
También puede ser que
la columna tenga
partículas en la matriz
con partículas con
espacios de manera que las
moléculas pasan por esos
espacios y eso muestra que las
que pasan por ahí se
demoraran mas entonces es
una separación por tamaño,
cromatografía de filtración en
gel
Y por último la de afinidad es cuando está marcada
por anticuerpo, la separación acá es especifica solo se
pega el antígeno, lo único que se pegara ahí es la
insulina. Luego con el buffer se obtiene la insulina en un
tubo.

7. Otro procedimiento bastante utilizada ahora es el sistema MICROARRAYS o
micro ordenadores, esa tecnología es un sistema que utiliza básicamente unas
tarjetitas con weas pequeñas donde se ponen las mezclas, en volúmenes no
más de 5 o 10microlitros, y en esos orificios se hacen reacciones, compuestos
necesarios para que reacciones y den algún color
Luego en la tarjeta se verán diferentes colores , en cada uno de los orificios se
coloca en la parte de abajo un trozo de ADN o ARN , eso se llaman oligos
porque son moléculas chicas de 8 y 20 bases no mas, entonces esos oligos
tienen la característica de que se les coloca una secuencia de bases que es la
que nosotros queremos reconocer , si queremos reconocer si hay o no un ADN
modificado como la de la muestra del ratón ,o si hay un ADN que tiene que
ver con cáncer, entonces se sabe la secuencia, y si queremos saber la
presencia o ausencia ponemos la secuencia mas característica, sacamos ese
ADN y lo marcamos con radioactividad o fluorescencia debería traer la
secuencia complementaria, es decir en el oligo esta la complementaria y se
pegan por lo tanto ese ADN queda pegado en el fondo del orificio si no la
tiene no se pega y cuando se lava se sale,. Y no abran marcas y si se pega
abra marcas y el color rojo en los orificios es la marca en el ADN.
En ese tipo de tecnología se pueden hacer para hacer muchas cosas, el
microarray a dado mucha información respecto a composición de ácidos
nucleícos de diferentes componentes en los seres vivos.

8. Otra tecnología es la FISH
“Florence in situ hybridization”
Estudio de cromosomas si hay
una secuencia especifica en
un cromosoma específico. Hay
que obtener células para sacar
el cromosoma, ese cromosoma
con dna tiene secuencias de
nucleótidos, si queremos
reconocer alguna secuencia
especifica hacemos un oligo
especifico pero
complementario. Con esa secuencia marcada con fluorescencia se hace la
reacción con esa molécula con el cromosoma, y la región en donde esta esa
secuencia se marca, viendo la fluorescencia en el cromosoma y esa
secuencia esta, se observa el cromosoma completo o regiones chicas, como
enzimas, donde reaccionara el oligo? En aquella región que tendrá la
secuencia complementaria. También pueden marcarse sin buscar un gen
específico, esperamos encontrar para cualquier gen 2 cromosomas y si hay 3
hay porque hay problemas (trisomia)
Una de las herramientas claves que ha tenido
la responsabilidad del desarrollo de la biología
molecular, son las enzimas de restricción, son
unas proteínas que están en las bacterias,
estas son enzimas, de restricción. Porque
cortan las moléculas de ADN en ciertas
regiones especificas, las bacterias las usan
para romper las proteínas que ingresan los
virus, cuando los virus la infecta la bacteria
hace la proteína y así corta la proteína del
virus, así sacaron las proteínas de las bacterias
y vieron la especificidad, cortan secuencias
especificas, una proteína no la corta la
pepsina en el estomago, no la corta en
cualquier lugar sino que elige en una
secuencia de aminoácidos especifico.

9. EcoR1 corta entre G y A de esa manera podemos elegir la enzima para cortar
donde queramos, que se puede hacer?
Uno de los tantos uso de las enzimas de restricción es el de insertar trozos de
dna complementario en el plásmido que es un ADN extra celular de la
bacteria, se abre el plásmido con la secuencia pegajosa libre, por ende si
querernos ponerle otro trozo de ADN echo o sacado de otra célula , como la
insulina 150 nucleótidos, y en los extremos le ponemos la secuencia
complementaria que corto ecor1 y con ligasa se pegan y se les une al
plásmido y queda con DNA recombinante que es la mezcla del dna de
plásmido con el dna extraño. Que no es la de la bacteria,
Pero el sistema es universal, entonces cuando coloquemos el plásmido en la
bacteria lo reconocerá como propio y hará insulina.
Una vez que se ha producido el dna recombinante se pone en el interior de la
bacteria esta la reconoce como si fuera propio y empieza a dividirse y a
producir la proteína que el trozo de ADN le permite hacer.

10. Otra tecnología importante es el uso de genes reporteros, ustedes saben
que las proteínas son 30.000 en mamíferos, si hay 5 coloreados son mucho,
hemoglobina es de color rojo y se seguimos buscando es difícil buscar
proteínas con color. Entonces en nuestras preparaciones será difícil saber si hay
o no hay proteína porque no se ve nada, como la albumina con agua no se
ve nada, entonces hay que hacer una reacción específica para colorearla.
Entonces el gen reportero tiene como finalidad permitir la identificación la
identidad de determinados genes para ver si están o no están presentes, estos
son secuencias que pueden generar proteínas coloreadas, se colocan en
forma siguiente al gen que queremos estudiar., que ocurrirá? Que el gen que
tiene para proteína X le ponemos después el gen reportero que son chicos
producirá una proteína coloreada ya que la proteína x no tiene color. Pero
siempre irán juntas, en cualquier experimento la proteína estará en la cantidad
y lugar que esta la proteína reportera, entonces si esta gen reportero esta la
proteína, solo interesa que diga si está o no y en qué cantidad.
Un gen reportero muy utilizado es la proteína fluorescente verde. Que se
extrajo de una medusa que es chica como 50-60 entonces es un gen pequeño
de 100 y algo bases. Que produce una proteína de color verde fluorescente,
entonces si lo ponemos al lado de uno que estamos estudiando veremos
cómo reacciona, se agregan secuencias hasta que coincidan. Es una
molécula que nos permite ubicar lo que queremos con mucha facilidad

11. Otra tecnología importantísima es el PCR
Fue creada por kary mullis gano el nobel con 20mil dólares, y vendió la patente
por 300.000.000 . aweonao.
Es importante porque permite hacer dna a partir de una muestra muy
pequeña, lo hace por 3 cosa: desnaturacion, annealing de primers y luego la
extensión.
Básicamente esa técnica fue posible porque ese científico estudio una
polimerasa, que trabaja a temperatura muy altas sobre 90ºC, eso dice que las
bacterias tienen moléculas que trabajan a esa temperatura ese fue el
descubrimiento el tomo las enzimas y las utilizo en ese procedimiento porque la
desnaturacion del dna tiene que ser a 94ªc que es donde se separan los
enlaces de hidrogeno y quedan las 2 cadenas complementarias separadas,
luego la otra es a 54ªc donde trabaja la polimerasa, y luego es a 72ºC todas
las reacciones son bastante altas,
Cualquier polimerasa se desnaturaria entonces tiene que ser esa polimerasa
especifica. Puede partir teóricamente de una molécula de dna.

12. Separar en el paso 1, luego en el annealing se ponen los primer que son los
trozos de dna que queremos reproducir
El primer es lo mismo que en el caso de los mircroarrays que son entre 8 y eo
nucleótidos con secuencia específica para saber si hay o no, tendremos el
dna de una célula x ,tenemos que replicar un trozo determinado de ese dna,
Se pone una secuencia de la región en un lado y luego en la cadena
complementaria. Así se acota el trozo. Porque cuando coloquemos el primer
será la secuencia complementaria de eso. Se pegara justo ahí, porque ahí
está su secuencia complementaria.
¿Y donde se pega el otro primer?
Ocurrirá que empieza a formarse la molécula ahí en cada extremo de las
hebras, y en la tercera etapa en la extensión lo que continua haciendo la
polimerasa es seguir poniendo los nucleótidos después del primer, hasta que
encuentre la otra y cuando se encuentran las 2 se termina la síntesis. Con eso
lo que estamos haciendo es seleccionar el trozo de dna que se quiere
reproducir.
Eso se realiza
muchas
veces 1 a 2 a
4 a 8 y así
2^35 en 140
minutos
2horas 20
minutos hay
esa cantidad
de copias
que es lo que
ocurre

13. La secuenciación es saber el orden de los nucleótidos en la secuencia de
ADN.
La secuenciación es muy importante para saber que enzimas utilizar.
El año 2000 se secuencio casi en 98% el genoma del ser humano, para eso se
necesitaba esa técnica, cada vez se ha ido mejorando, secuencia el dna
preparar el gel que toma un día, tomaba 2 días para la secuencia, ahora la
secuenciación es muy tecnológica en donde simplemente se pone el dna en
la maquina y esta hace todo. Se basa el procedimiento en que es muy similar
de PCR, hay igual 3 etapas
Se desnatura se corta a 94ºc y se separan las 2 cadenas
Luego un annealing con primer para hacer el trozo de ADN que nos
interesa, no nos interesa todo el ADN solo partes especificas
En la tercera etapa (extencion) está la diferencia, con el PCR se pone
ddntp`s solo nucleótidos mientras que en la secuenciación se usa una mezcla
de nucletipos con dntp`s que significa?Una secuencia de nucleótidos de dna
que es lo que se observa ahí, unidos por el oxigeno entre fosfato y azúcar, esa
es dexosi porque es dexoxi
ribosa, porque el carbono
no tiene el oxigeno se le
saco por eso es dexosi ,
entonces ese es el
nucleótido que se agrega
para la secuenciación
para el PCR , que tiene un
oh que no tiene el oxigeno
porque es deoxi
nucleótido para PCR. Pero
en la secuenciación se
agrega el deoxinucleotido y el dideoxinucleotido no tiene ninguno de los dos
oxígenos. Porque es importante el deoxi = porque la unión es importante al
oxígeno por eso tiene que tener el oh y si no lo tiene no se une y no hay
reacción y cuando no lo tendrá? Cuando nosotros usemos la molécula de
didexoxi. Cuando tenemos los deoxis hay reacción y entra otro tro tro pero si
entra un dideoxi ahí se para la reacción porque no encontrara el oxigeno y se
detiene la reacción. El dideoxi puede entrar en cualquier parte porque es al
azar .al principio al medio o al final de la reacción. Significa que se van
generando trozos de dna de diferente tamaño dependiendo en donde
ingrese el dideoxi que terminan en un nucleótido determinado. Porque se
ponen nucleótidos marcados diferente. Al final tendremos una mezcla de
trozos de diferente tamaño de los ácidos nucleícos unos muy chicos y unos
muy grandes. Y se les hace una
electroforesis, ósea que pasan por el
gel que se van separando de acuerdo
a su tamaño que se separan según
tamaño. El sistema actual que es
automático hace una cosa así igual.
Se ponen los nucleótidos en el gel y en
el computador se obtiene la
información, si sabemos el color del
nucleótidos etc. se sabe la secuencia
ddTTP ddGTP etc.