Khóa luận tốt nghiệp1

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HCM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA
DỊCH CHIẾT TỪ LÁ CÂY SỐNG
ĐỜI (KALANCHOE PINNATA) LÊN
QUÁ TRÌNH TĂNG SINH TẾ BÀO
CÓ NGUỒN GỐC TỪ DA CHUỘT
NHẮT TRẮNG (MUS MUSCULLUS
VAR.ALBINO) SƠ CẤP
Hướng dẫn khoa học
Ths. LẠI ĐÌNH BIÊN
Sinh viên thực hiện
NGÔ QUỐC NGUYÊN
ĐƯỜNG THANH HẠNH NGÂN
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2014

BỘ CÔNG THƯƠNG
TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM TP. HCM
KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC & KỸ THUẬT MÔI TRƯỜNG
KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP
CHUYÊN NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC
KHẢO SÁT SỰ ẢNH HƯỞNG CỦA DỊCH
CHIẾT TỪ LÁ CÂY SỐNG ĐỜI
(KALANCHOE PINNATA) LÊN QUÁ TRÌNH
TĂNG SINH TẾ BÀO CÓ NGUỒN GỐC TỪ
DA CHUỘT NHẮT TRẮNG (MUS
MUSCULLUS VAR.ALBINO) SƠ CẤP
Giảng viên hướng dẫn
Ths. LẠI ĐÌNH BIÊN
NGÔ QUỐC NGUYÊN
Mã số SV: 2008100005
Mã số SV: 2008100084
Lớp: 01ĐHSH1
Tp. Hồ Chí Minh, tháng 7 năm 2014

NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
......................................................................................................................................................
TP. HCM,tháng 6 năm 2014
Ký tên

LỜI CẢM ƠN
Trong suốt quá trình học tập, làm việc và hoàn thành khóa luận này, nhóm chúng
tôi đã nhận được sự hướng dẫn, giúp đỡ quý báu của các thầy cô, các anh chị cùng các
bạn. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, chúng tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân
thành tới:
Thạc sĩ – Lại Đình Biên, người Thầy kính mến đã hết lòng hướng dẫn, giúp đỡ và
tạo mọi điều kiện thuận lợi cho nhóm chúng tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp.
Tập thể các thầy cô giáo trong khoa Công nghệ Sinh học và Kĩ thuật môi trường, đã
trang bị cho chúng tôi những kiến thức và kinh nghiệm quý giá trong quá trình học tập
tại trường và nhiệt tình giúp đỡ chúng tôi thực hiện đề tài này.
Tập thể các bạn sinh viên khóa 01ĐHSH đã luôn giúp đỡ và động viên chúng tôi
mỗi khi chúng tôi gặp khó khăn trong quá trình làm việc.
Mặc dù đã có nhiều cố gắng, nhưng do thời gian có hạn, trình độ, kỹ năng của bản
thân còn nhiều hạn chế nên chắc chắn đề tài khóa luận tốt nghiệp này của chúng tôi
không tránh khỏi những hạn chế, thiếu sót, rất mong được sự đóng góp, chỉ bảo, bổ
sung thêm của thầy cô và các bạn.

LỜI CAM ĐOAN
Chúng tôi cam đoan rằng khóa luận tốt nghiệp này là do chính chúng tôi thực hiện.
Các số liệu thu thập và kết quả phân tích trong báo cáo là trung thực, không sao chép từ
bất cứ đề tài nghiên cứu khoa học nào.
Tháng 6 năm 2014
NGÔ QUỐC NGUYÊN

MỤC LỤC
Trang bìa lót
Nhận xét của giáo viên hướng dẫn
Lời cảm ơn
Lời cam đoan
Mục lục
Danh mục các bảng biểu và sơ đồ
Danh mục các hình ảnh và biểu đồ
PHẦN MỞ ĐẦU 1
Đặt vấn đề..............................................................................................................................2
Mục tiêu nghiên cứu............................................................................................................ 2
PHẦN 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................................... 3
1.1 Đại cương về mô da động vật ...................................................................................... 4
1.1.1 Các loại tế bào của mô da...................................................................................... 4
1.1.2 Cấu trúc mô da .........................................................................................................5
1.2.1 Lịch sử nuôi cấy tế bào...........................................................................................8
1.2.2 Đặc điểm của tế bào động vật – nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào.........9
1.2.3 Các phương pháp tách tế bào từ mô sống...........................................................12
1.2.4 Enzyme sử dụng trong tách tế bào ......................................................................12
1.2.5 Kỹthuật nuôi cấytế bào động vật.......................................................................14
1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào........................................18
1.2.7 Tỉ lệ môi trường với mật độ tế bào đem nuôi, lượng mô đem cấy..................22
1.2.8 Môi trường nuôi cấy..............................................................................................22
1.2.9 Ðánh giá tình trạng tế bào nuôi cấy.....................................................................24
1.3 Đại cương về nguyên bào sợi .....................................................................................24
1.3.1 Nguồn gốc ..............................................................................................................24

1.3.2 Đặc điểm của nguyên bào sợi ..............................................................................25
1.3.3 Chức năng của nguyên bào sợi ............................................................................25
1.3.4 Sơ lược về kinh nghiệm nuôi cấy nguyên bào sợi trên thế giới ......................26
1.3.5 Nguyên bào sợi trong các nghiên cứu và ứng dụng..........................................29
1.4 Sơ lược về cây sống đời (Kalachoe pinata)..............................................................30
1.4.1 Nguồn gốc, phân bố và danh pháp cây sống đời ...............................................30
1.4.2 Đặc điểm hình thái.................................................................................................31
1.4.3 Công dụng của cây sống đời ................................................................................32
1.4.4 Thành phần hóa học trong cây sống đời.............................................................33
PHẦN 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ......................................................................34
2.1 Vật liệu...........................................................................................................................35
2.1.1. Dụng cụ - thiết bị..................................................................................................35
2.1.2 Hóa chât .................................................................................................................35
2.2 Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................36
2.2.1. Phương pháp thu nhận dịch chiết cây sống đời ...............................................36
2.2.2. Phương pháp phân lập và nuôi cấy nguyên bào sợi chuột từ da chuột .........38
2.2.3. Xử lý số liệu .........................................................................................................43
PHẦN 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.............................................................................44
3.1 Thu nhận dịch chiết từ lá cây sống đời .....................................................................45
3.2 Khảo sát khả năng tách tế bào bằng phương pháp trypsin ấm và trypsin lạnh.....45
3.2.1 Trypsin ấm .............................................................................................................46
3.2.2 Trypsin lạnh ...........................................................................................................47
3.3.1 Quá trình tăng sinh và bám của tế bào nguyên bào sợi chuột trong môi trường
D’MEM 5% huyết thanh thỏ..........................................................................................50
3.3.2 Quá trình tăng sinh của tế bào nguyên bào sợi chuột trong môi trường
D’MEM 5% huyết thanh thỏ có bổ sung dịch chiết từ lá cây sống đời....................52
3.4. Khảo sát nồng độ dịch chiết tối ưu khi bổ sung dịch chiết lá cây sống đời vào
môi trường nuôi cấy............................................................................................................54

PHẦN 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ............................................................................58
4.1 Kết luận ........................................................................................................................59
4.2 Kiến nghị ......................................................................................................................59
TÀI LIỆU THAM KHẢO 60
PHỤ LỤC ...............................................................................................................................63

DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU VÀ SƠ ĐỒ
Bảng 1.4.3.1: Công dụng chữa bệnh của cây sống đời.................................................32
Bảng 1.4.4: Thành phần hóa học trong cây sống đời....................................................33
Bảng 2.2.2.4: Thí nghiệm khảo sát nồng độ trypsin và phương pháp phù hợp để tách tế
bào đơn................................................................................................................................40
Bảng 3.2.1.1: Tổng mật độ tế bào đơn khi ủ với trypsin ấm ở các nồng độ khác nhau
............................................................................................................................................46
Bảng 3.2.1.2: Mật độ tế bào đơn sống khi ủ với trypsin ấm ở các nồng độ khác nhau
..............................................................................................................................................46
Bảng 3.2.2.1: Tổng mật độ tế bào đơn khi ủ với trypsin lạnh ở các nồng độ khác nhau
..............................................................................................................................................47
Bảng 3.2.2.2: Mật độ tế bào đơn sống khi ủ với trypsin ấm ở các nồng độ khác nhau
..............................................................................................................................................47
Bảng 3.2.2.3: Xác định phương pháp phù hợp để tách tế bào đơn .............................49
Sơ đồ 1.2.5: Quy trình nuôi cấy sơ cấp...........................................................................16
Sơ đồ 2.2.1: Quy trình thu dịch chiết từ lá cây sống đời..............................................37
Sơ đồ 2.2.2: Quy trình phân lập và nuôi cấy nguyên bào sợi từ da chuột..................43

DANH MỤC HÌNH VÀ BIỂU ĐỒ
Hình 1.1.1: Cấu tạo da ........................................................................................................ 5
Hình 1.1.2.1: Cấu trúc lớp biểu bì ..................................................................................... 6
Hình 1.1.2.2: Mô liên kết trung bì..................................................................................... 7
Hình 1.2.4.1: Cấu trúc không gian của enzyme trypsin................................................13
Hình 1.3.2: Cấu trúc nguyên bào sợi...............................................................................25
Hình 1.4.1: Cây sống đời..................................................................................................31
Hình 2.2.2.4: Buồng đếm hồng cầu loại 25 ô lớn..........................................................41
Hình 3.1: Dịch chiết lá sống đời tươi..............................................................................45
Hình 3.2: Tế bào được nhuộm trypan blue.....................................................................46
Hình 3.3.1.1: Tế bào nuôi ngày thứ nhất ........................................................................50
Hình 3.3.1.2: Tế bào nuôi ngày thứ ba ...........................................................................50
Hình 3.3.1.3: Tế bào nuôi ngày thứ năm ........................................................................51
Hình 3.3.1.4: Tế bào nuôi ngày thứ bảy .........................................................................51
Hình 3.3.1.5: Tế bào nuôi ngày thứ tám .........................................................................52
Hình 3.3.2.1: Tế bào nuôi ngày thứ nhất ........................................................................52
Hình 3.3.2.2: Tế bào nuôi ngày thứ ba ...........................................................................53
Hình 3.3.2.3: Tế bào nuôi ngày thứ tư............................................................................53
Hình 3.3.2.4: Tế bào nuôi ngày thứ năm ........................................................................54
Hình 3.4.1: Tế bào nuôi ở nồng độ dịch chiết 10μl.......................................................55

Đồ thị 3.2.1: Mật độ tế bào đơn sống khi ủ với trypsin ấm ở các nồng độ khác nhau
..............................................................................................................................................47
Đồ thị 3.2.2.1: Mật độ tế bào đơn sống khi ủ với trypsin lạnh ở các nồng độ khác nhau
..............................................................................................................................................48
Đồ thị 3.2.2.2: So sánh mật độ tế bào đơn sống khi ủ với trypsin ấm và trypsin lạnh ở
các nồng độ khác nhau.......................................................................................................49

2
 Đặt vấn đề
Với quan niệm “ nhất dáng nhì da” thì da xếp thứ hai để quan sát và đánh giá vẻ
đẹp của một con người. Hiện nay do kinh tế xã hội phát triển nên nhu cầu thẩm mỹ về
da ngày càng phát triển, đặc biệt nhu cầu thẩm mỹ trong điều trị bỏng. Chính vì những
lý do đó các nhiều nghiên cứu về trị bỏng tức thời và lâu dài bằng cách tạo vật liệu sinh
học trị bỏng hay da nhân tạo để ghép tự thân. Hiện nay, những vật liệu sinh học có bổ
sung hoạt chất tự nhiên để trị bỏng với những ưu điểm như kháng viêm, kháng khuẩn,
tính sinh miễn dịch thấp… trong việc tạo da nhân tạo bằng nuôi cấy tế bào da để ghép
tự thân đang là tiêu chuẩn vàng để tạo vết da đẹp và liền không có vết sẹo. Trên thế
giới, công nghệ này liên tục được nghiên cứu hoàn chỉnh về quy trình công nghệ nuôi
cấy tế bào. Nhiều nước đã đạt những tiến bộ vượt bậc trong điều trị bỏng và tổn thương
mất da, nhiều nạn nhân bỏng sâu và rộng trên 70% diện tích đã được cứu sống cũng
như giảm thiểu các di chứng nặng do mất da để lại.
Tại Việt Nam là một nước rừng nhiệt đới nên có rất nhiều loại cây cỏ và hoạt chất
ứng dụng trong trị bỏng. Hiện nay các nghiên cứu về sử dụng hoạt chất thiên nhiên ứng
dụng trong trị bỏng ngày càng nhiều dựa theo các phương pháp dân gian thì các cây có
ứng dụng trị bỏng giúp trị lành vết thương như dầu mù u, củ nghệ, mỡ trăn cây sống
đời…. Trong các loại cây, thì chỉ có vài cây được khoa học nghiên cứu và khẳng định
tính năng trị bỏng như dầu mù ứng dụng trong việc tạo màng sinh học trong trị bỏng ,
cucurmine trong củ nghệ ứng dụng trong mỹ phẩm có chức năng trị lành vêt thương.
Tuy nhiên, cây sống đời một loại cây cũng được dân gian sử dụng nhiều trong trị bỏng
lại chưa có đề tài và sự nghiên cứu về công dụng trị bỏng của nó chính vì vậy chúng tôi
tiến hành đề tài : “Khảo sát sự ảnh hưởng của dịch chiết từ lá cây sống đời
(Kalanchoe pinnata) lên quá trình tăng sinh tế bào nguyên bào sợi da chuột nhắt
trắng (Mus muscullus var.albino)” .
Mục tiêu nghiên cứu
Khảo sát khả năng tách của tế bào bằng hai phương pháp trypsin ấm và trypsin
lạnh.
Khảo sát khả năng bám và tăng sinh của tế bào sau thời gian nuôi cấy trong môi
trường có bổ sung dịch chiết.

3
Xác định nồng độ dịch chiết tối ưu cho khả năng bám dính của tế bào nguyên bào
sợi chuột trong giai đoạn nuôi sơ cấp.
Từ những yếu tố trên chúng tôi sẽ xây dựng được quy trình phân lập, và nuôi cấy tế
bào nguyên bào sợi da có bổ sung dịch chiết cây sống đời trong môi trường nuôi cấy.
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

4
1.1Đại cương về mô da động vật [3]
Da là mô lát tầng, là một loại mô liên kết biểu bì. Cấu trúc của da có một điểm đặc
biệt là chúng có nhiều lớp tế bào, trong đó các lớp ngoài luôn bị thoái hóa, bong ra và
thay thế bằng các lớp tế bào bên dưới. Nguồn gốc của sự thay mới thường xuyên này là
do một lớp tế bào của da ở vị trí tiếp giáp với mô liên kết có khả năng thường xuyên
tạo tế bào mới. Đây chính là tế bào mầm của cơ thể trưởng thành, có khả năng tạo
thành những dòng tế bào ổn định phục vụ cho nghiên cứu và ứng dụng. Chính vì vậy,
da có tiềm năng lớn trong công nghệ tế bào.
1.1.1 Các loại tế bào của mô da
1.1.1.1 Keratinocyte
Tế bào keratin (keratinocyte) thường thấy ở lớp biểu bì – lớp ngoài cùng của da.
Keratinocyte chiếm đa số trong biểu bì. Các keratinocyte trưởng thành khi nó di
chuyển từ tầng dưới lên để hình thành tầng mới bên trên. Keratinocyte xây dựng một
khung tế bào rất vững chắc nhờ thay đổi sự biểu hiện của các loại vi sợi keratin từ
keratin 5 và 14 thành keratin 1 và 10. Keratinocyte có khả năng sản xuất ra protein có
vỏ keratin như involucrin và loricrin cho việc chuẩn bị hình thành tế bào sừng
(corneocyte). Keratin do keratinocyte tạo ra luôn có xu hướng tích lũy theo hướng lên
trên, do đó các tế bào ở phía trên của lớp biểu bì thường tích lũy nhiều keratin và tạo
thành tầng sừng. Sự tích lũy chất keratin trong các tế bào của lớp biểu bì tạo nên sự
sừng hóa tế bào.
1.1.1.2 Fibroblast (nguyên bào sợi)
Fibroblast là những tế bào có khả năng tạo sợi. Fibroblast thường thấy ở lớp da
chính thức.
1.1.1.3 Melanocyte (hắc tố bào)
Melanocyte là loại tế bào có trong mô biểu bì với mật độ khá ít, thường tập trung ở
tầng sinh sản. Melanocyte tạo màu cho da, lông, tóc nhờ tạo ra các hạt sắc tố melanin
và ngấm vào keratin.
1.1.1.4 Tế bào Langerhans
Tế bào Langerhans là những đại thực bào (macrophage) có hình sao, có vai trò
trong miễn dịch.
1.1.1.5 Tế bào Merkel
Tế bào Merkel là những tế bào ít phân bố trong mô biểu bì, chúng tập trung chủ yếu
ở lớp da chính thức. Tế bào Merkel là loại tế bào thần kinh làm nhiệm vụ thụ quan cảm
giác, có khả năng trả lời các kích thích nhiệt độ, áp suất, xúc giác…

5
1.1.2 Cấu trúc mô da [3]
Da do mô liên kết và biểu mô tạo nên, có cấu tạo nhiều lớp:
Hình 1.1.2 Cấu tạo da
1.1.2.1 Lớp biểu bì
Lớp ngoài cùng của da, gồm nhiều lớp tế bào mô xếp dính chặt với nhau, dày từ
0,07 đến 1,8mm. Lớp biểu bì gồm 5 lớp tế bào: lớp mầm, lớp gai, lớp hạt, lớp bóng và
lớp tế bào sừng.
Lớp mầm (stratum germinatum)
Lớp mầm được tạo thành bởi một hàng tế bào khối vuông và trụ có khả năng phân
chia liên tục, sản sinh ra các tế bào cho lớp biểu bì. Gồm các loại tế bào: tế bào sừng, tế
bào hắc sắc tố, tế bào Langerhans và tế bào Merkel.
Lớp gai (stratum spinosum hoặc filamentosum)
Gồm các tế bào có hình khối đa điện, nhân tròn, nằm trên lớp đáy, có 7 – 15 tầng tế
bào. Những kẽ trống giữa các tế bào này chứa dịch nuôi được tạo ra từ lớp nhú của
trung bì để trao đổi dinh dưỡng với tế bào biểu bì. Các khe trống này bảo đảm cho sự
chuyển hóa, tăng trưởng và biệt hóa của các tế bào sừng. Các đầu tận cùng của dây
thần kinh nhận cảm giác đau cũng nằm rải rác trong các khe này.
Lớp hạt (stratum granulosum)

6
Gồm những tế bào dẹt có nhân chứa các chất sừng trong suốt. Các tế bào này không
chỉ tổng hợp, biến hóa và nối tiếp chéo các protein mới trong quá trình sừng hóa mà
còn làm nhiện vụ tự hủy theo chương trình để biến từ tế bào hạt thành tế bào sừng.
Lớp bóng (stratum lucidum)
Là lớp tế bào trong suốt, được hình thành tạo nên từ lớp đáy, các lớp tế bào già
được đẩy dần ra khỏi môi trường nuôi dưỡng và sự biệt hóa cũng hoàn thành. Lớp
bóng nằm ngay dưới lớp tế bào sừng, có chức năng giữ cho da không bị mất nước và
bảo vệ lớp tế bào phía dưới đối với các tác động cơ học.
Lớp sừng (stratum corneum)
Là lớp ngoài cùng có 15 – 20 tầng tế bào, có hình khối dẹt rộng, hoặc hình đa điện.
Các tế bào này đã mất khả năng sống, hoàn toàn sừng hóa. Chúng dính chặt vào lớp tế
bào trong suốt tạo thành một lớp bảo vệ ngoài cùng của da.
Hình 1.1.2.1 Cấu trúc lớp biểu bì
1.1.2.2 Lớp trung bì (dermis)
Trung bì nằm dưới lớp biểu bì, dày từ 0,7 – 7mm, dày hơn chiều dày của biểu bì từ
15 – 40 lần. Trung bì là một lớp xơ rất chắc, được tạo nên từ các chất nền (chất gian
bào), các tế bào liên kết, bó sợi liên kết, sợi đàn hồi, các tuyến ống, cơ dựng nang lông,
mạch máu và dây thần kinh. Nguyên bào sợi được coi là tế bào chủ của trung bì, chúng
sản sinh ra chất keo mạng lưới (reticular collagen), các sợi đàn hồi và các chất nền của
trung bì. Trung bì gồm hai lớp: lớp nhú và lớp lưới.
Lớp nhú

7
Là một lớp tế bào mỏng, nằm sát ngay dưới màng nền và lớp tế bào mầm của lớp
đáy hình thành nhiều gai nhú gồ lên hình làn sóng. Lớp nhú có các sợi tơ tạo keo, sợi
tơ đàn hồi, chất keo đặc giữa các sợi tơ và các tế bào liên kết, bạch cầu, tế bào
Langerhans… Lớp nhú là nơi trao đổi các yếu tố tăng trưởng, cytokine và các chất cơ
bản của trung bì gắn kết với các tế bào biểu bì qua thụ cảm xuyên màng.
Lớp lưới (reticular dermis)
Có chiều dày 4 – 5mm, có ít tế bào và mạch hơn lớp nhú. Lớp lưới chứa các bó sợi
liên kết gồm các sợi tạo keo, sợi đàn hồi, các sợi bắt màu bạc. Lớp lưới chia làm hai
vùng: vùng trên (nông) có nhiều tế bào liên kết, nguyên bào sợi, tế bào viêm, các bó
keo, các sợi chun dãn xếp theo hướng ngang và vùng dưới (sâu).
Chức năng của lớp lưới là làm nền cho da bền chắc.
Hình 1.1.2.2 Mô liên kết trung bì
1.1.2.3 Lớp hạ bì (hypodermis, subcutis)
Là một lớp mô liên kết – mỡ, dày 0,25mm đến vài cm. Hạ bì gồm 3 lớp: lớp mỡ,
lớp chân nông và lớp tế bào dưới da.
- Lớp mỡ: các bó xơ dày to hình nón quây thành những khoang chứa các tế bào
mỡ. Chúng góp phần tạo hình, dự trữ năng lượng và cách nhiệt.
- Lớp chân nông: có chỗ dày tới 1mm.
- Lớp tế bào dưới da: là mô liên kết lỏng lẻo, làm cho da dễ dàng di động trên cơ,
gân, xương. Các tổ chức tế bào lỏng lẻo này có khả năng thấm nước và các chất
hòa tan của dịch.

8
1.2 Sơ lược về nuôi cấy tế bào
1.2.1 Lịch sử nuôi cấy tế bào [7, 10, 21]
Năm 1883, người ta có thể duy trì được các tế bào phôi gà trong dung dịch nước
muối.
Năm 1709, Harrison đã tách tế bào thần kinh ếch và nuôi trong môi trường bạch
huyết. Sau vài tuần nuôi cấy, ông thấy có sự xuất hiện và tăng trưởng những tế bào này
trên mẫu cấy.
Năm 1910, Roux tiếp tục nghiên cứu trên những tế bào ung thư ở gà.
Năm 1913, Carrel và công sự đã làm nhiều thí nghiệm chứng minh được tế bào
động vật hoàn toàn có thể sống được một khoảng thời gian dài trong điều kiện in vitro,
nếu thường xuyên cung cấp các chất dinh dưỡng vô trùng cần thiết. Đến năm 1923, ông
thiết kế ra hộp chuyên sử dụng để nuôi cấy mô động vật trong điều kiện vô trùng gọi là
hộp Carrel.
Năm 1948, Earle đã tiến hành phân lập các tế bào và nuôi cấy chúng trong điều
kiện môi trường đặc biệt.
Năm 1952, Grey đã tách và nuôi thành công tế bào ung thư cổ tử cung người
(HeLa). Đây là một trong những dòng tế bào tốt nhất được tạo ra đầu tiên trên thế giới
từ khối u cổ tử cung của một phụ nữ 31 tuổi tên Henrietta Lacks.
Năm 1954, Levi – Moutalcini đã nghiên cứu sự ảnh hưởng của các chất điều hòa
tăng trưởng lên khả năng phát triển của tế bào trong nuôi cấy in vitro.
Năm 1955, Eagle và năm 1965, Ham đã tìm được môi trường và quy trình nuôi cấy
thích hợp cho nhiều loại mô khác nhau của người và động vật.
Năm 1961, I.A.Macpherson và M.G.P. Stoker tạo được dòng nguyên bào sợi thận
chuột đồng con (BHK-21). Dòng tế bào được sử dụng rộng rãi là dòng 13 từ thận của 5
con chuột một ngày tuổi chưa xác định giới tính, những chú chuột đồng này thuộc loài
Mesocriteus auratus. Công việc nuôi cấy tiến hành liên tục trong 84 ngày và dòng 13
được phân lập từ tế bào đơn.
Năm 1962, George Todaro và Howard Green đã tạo được dòng nguyên bào sợi phôi
chuột (3T3) từ mô phôi của chuột Mus. musculus. Dòng tế bào này được ứng dụng
trong nghiên cứu các protein cơ bản của sợi myelin.
Năm 1964, J. Ponten và E. Saksela đã tạo ra dòng tế bào ung thư xương người (U-2
OS), có nguồn gốc từ dòng 2T được phân lập từ mô xương của một bé gái 15 tuổi bị
bệnh về xương.

9
Năm 1966, J.P. Jacobs tạo ra dòng nguyên bào sợi phổi bào thai người (MRC-5) từ
khối u mô phổi thai nhi 14 tuần tuổi. Dòng tế bào này được sử dụng trong việc phát
triển vaccine, trong chuyển nhiễm tế bào chủ để nghiên cứu virus và kiểm tra cytotoxic
in vitro.
Năm 1972, D.J. Giard và cộng sự đã tạo được dòng tế bào ung thư biểu mô phổi
người (A-549) từ khối u của biểu mô phổi ở một nam giới người Caucasian 58 tuổi.
Dòng tế bào này được dùng để nghiên cứu về những bệnh có liên quan đến hệ hô hấp.
Từ năm 1970 – 1980, sản xuất được kháng thể lai đơn dòng.
Từ năm 1987 – 1995, kỹ thuật tái tổ hợp DNA đã tạo ra nhiều loại sản phẩm sinh
học từ các tế bào biến đổi di truyền.
Sự phát triển của nuôi cấy mô như là một kĩ thuật tinh vi hiện đại nhờ vào sự cần
thiết của hai nhánh chính nghiên cứu về y học: tạo vaccine kháng virus và nghiên cứu
về ung thư. Sự tiêu chuẩn hóa các điều kiện và các dòng tế bào để sản xuất và thí
nghiệm virus rõ ràng đã thúc đẩy sự phát triển của kỹ thuật nuôi cấy mô hiện đại, cụ
thể là tạo ra một lượng lớn tế bào phù hợp cho các phân tích sinh hóa. Cùng với sự phát
triển của những kỹ thuật khác đã tạo nên những sản phẩm môi trường và huyết thanh
đáng tin cậy được thương mại hóa, và kiểm soát tốt hơn về ngoại nhiễm với các kháng
sinh và thiết bị làm sạch không khí, làm nuôi cấy mô có thể được quan tâm rộng rãi.
1.2.2 Đặc điểm của tế bào động vật – nguồn nguyên liệu cho nuôi cấy tế bào
1.2.2.1 Sự điều hòa trao đổi chất [11]
Quá trình trao đổi chất của cơ thể được tập trung chủ yếu ở trong từng tế bào. Sự
chuyển hóa vật chất chủ yếu xảy ra trong tế bào và có tính quyết định đến sự tồn tại
của cơ thể sống.
Ở vi sinh vật, quá trình trao đổi chất là quá trình xảy ra giữa tế bào và môi trường
sống. Do đó, ngoài các yếu tố ảnh hưởng từ bên ngoài (nhiệt độ, pH, nồng độ các chất
dinh dưỡng, các chất độc…), tế bào còn phụ thuộc rất nhiều vào các hoạt động của
enzyme.
Ở tế bào thực vật, ngoài tác động của enzyme, quá trình trao đổi chất còn chịu tác
động rất mạnh bởi hệ dịch bao quanh tế bào.
Ở tế bào động vật, ngoài tác động của enzyme, hệ dịch quanh tế bào như ở thực vật,
chúng còn bị tác động rất mạnh của hệ thần kinh. Hệ thần kinh thu nhận những phản xạ
phong phú từ bên ngoài và bên trong tế bào, điều khiển một cách hài hòa toàn bộ quá
trình trao đổi chất ở tế bào. Sự rối loạn quá trình trao đổi chất ở tế bào có liên quan rất

10
chặt chẽ với sự điều khiển từ hệ thần kinh. Do đó, việc điều khiển trao đổi chất của tế
bào động vật trong cơ thể sống trở nên hết sức phức tạp.
Tuy nhiên, việc điều khiển dinh dưỡng tế bào trong nuôi cấy in vitro khác quá trình
dinh dưỡng tế bào trong cơ thể. Khi nuôi cấy tế bào in vitro, các quá trình trao đổi chất
của tế bào hoàn toàn tuân theo các đặc điểm của một tế bào độc lập, không tuân theo
quy luật của mô và của cơ thể đa bào. Việc nuôi cấy tế bào động vật được thực hiện
trên cơ sở điều khiển quá trình tổng hợp enzyme và các hoạt động của enzyme, đây
cũng là hai yếu tố quyết định khả năng phát triển của tế bào, khả năng tạo ra những sản
phẩm trao đổi chất của tế bào, cũng như khả năng phân chia tế bào.
Trong quá trình phát triển của tế bào, có hai vấn đề ảnh hưởng quyết định đến kết
quả:
- Bản chất tự nhiên của tế bào, hay nói cách khác là nguồn gốc của tế bào.
- Những yếu tố môi trường quyết định đặc trưng riêng biệt của tế bào.
Sự hiểu biết nguồn gốc của tế bào giúp ta định hướng sản phẩm cuối, còn sự hiểu
biết về đặc trưng riêng biệt giúp ta điều chỉnh (hay điều khiển) để tính trạng đó được
biểu hiện ra trong quá trình nuôi cấy.
Trong nuôi cấy tế bào in vitro có những yếu tố hoàn toàn khác với sự phát triển của
chính tế bào đó trong cơ thể. Mọi yếu tố tác động lên tế bào nuôi cấy in vitro là những
tác động trực tiếp. Còn khi phát triển trong cơ thể, các tế bào này không chỉ chịu tác
động trực tiếp mà còn chịu những tác động gián tiếp. Do đó, mọi tác động của môi
trường đến tế bào nuôi in vitro xảy ra rất nhanh và mãnh liệt, cần tạo ra sự hài hòa
trong mọi tác động đến sự trao đổi chất của tế bào được nuôi cấy.
1.2.2.2 Tính chất cơ học yếu [8]
Ở tế bào vi sinh vật, tế bào được bao bọc bởi thành tế bào – được cấu tạo từ những
hợp chất hữu cơ khá bền, khó bị phân hủy khi tế bào còn đang phát triển. Ở tế bào thực
vật, thành tế bào còn được cấu tạo bởi hợp chất lignocellulose hay pectinocellulose, các
hợp chất này tạo ra tính chất cơ học, hóa học, vật lý khó bị phân hủy hơn rất nhiều so
với cấu trúc thành tế bào của vi sinh vật.
Tế bào động vật hoàn toàn không có thành tế bào, mà chúng chỉ được bao bọc bởi
một màng tế bào – thành phần duy nhất ngăn cách giữa tế bào với các tế bào khác
trong mô. Mặt khác, kích thước tế bào động vật thường rất lớn, trung bình khoảng 10
μm, lại không có vách nên tế bào động vật có tính chất cơ học yếu. Do đó, khi nuôi cấy
cần nhẹ nhàng, tránh sự phá vỡ tế bào (Phan Kim Ngọc, 2002).

11
1.2.2.3 Khả năng phân chia và tốc độ tăng trưởng rất chậm [7]
Do đặc điểm di truyền, các tế bào vi khuẩn thường phân chia với tốc độ rất nhanh,
khoảng 20-50 phút. Ở động vật và thực vật, một chu kỳ tế bào thường kéo dài 20-70
giờ (Nguyễn Đức Lượng và Lê Thị Thủy Tiên, 2002). Nếu trong một điều kiện nào đó,
một loại tế bào trong cơ thể đa bào lại tăng số lượng một cách bất thường, cơ thể sẽ
chuyển sang trạng thái bệnh lý.
1.2.2.4 Cần giá đỡ trong quá trình phát triển, nhân đôi [8]
Trừ tế bào máu và một số giai đoạn của tế bào sinh dục, hầu hết các mô và tế bào
động vật cần bám vào giá đỡ để có thể sống và phân chia. Tế bào sẽ ngừng phân chia
khi đã hình thành một lớp đơn liên tục trên bề mặt của dụng cụ nuôi. Tuy vậy, một số
dòng tế bào như tế bào ung thư hoặc dòng tế bào liên tục từ mô bình thường (sau khi
được thuần hóa) có thể sinh trưởng và phân chia trong trạng thái lơ lửng, không cần
bám vào giá đỡ.
1.2.2.5 Chịu ảnh hưởng rất mạnh bởi sản phẩm trao đổi chất của chúng [11]
Đây là cơ chế kiềm hãm ngược bởi sản phẩm cuối (negative feed – back). Bất kỳ tế
bào sinh vật nào cũng biểu hiện cơ chế này, điểm khác biệt của tế bào động vật là ở chỗ
quá trình tổng hợp sản phẩm thừa ít xảy ra và thường thì các sản phẩm trao đổi chất
thoát ra khỏi tế bào rất chậm.
1.2.2.6 Khả năng tiếp nhận gene lạ [11]
Xét về cấu trúc tế bào, tế bào động vật được xem như một loại tế bào trần tự nhiên.
Chúng được bao bọc chỉ bởi một lớp màng, do đó, trong trường hợp chúng tồn tại ở
trạng thái tự do, chúng có khả năng nhận dòng thông tin di truyền lạ (từ virus…) hoặc
khi cho những tế bào động vật có thông tin di truyền khác nhau ở gần nhau, sẽ xảy ra
hiện tượng trao đổi vật chất di truyền tạo ra các tế bào lai.
1.2.2.7 Khả năng bảo quản trong điều kiện nhân tạo [11]
Khác với tế bào vi sinh vật và tế bào thực vật, tế bào động vật cần phải được bảo
quản trong những điều kiện hết sức đặc biệt mới có thể giữ được những đặc tính riêng
của nó.
Bằng cách sử dụng Nitrogen lỏng (-1960C), tế bào động vật vẫn duy trì được đặc
tính của chúng trong thời gian rất dài. Phương pháp này được áp dụng nhiều ở các ngân
hàng giống động vật trên thế giới.
Khi sử dụng, tế bào động vật được tiến hành giải đông và được hoạt hóa để phục
hồi khả năng tăng trưởng và phân chia như trước khi đem bảo quản.

12
Ngoài ra, tế bào động vật rất kém thích nghi với điều kiện môi trường, rất nhạy cảm
với kim loại. Trong quá trình phát triển trong môi trường nhân tạo, chúng rất cần huyết
thanh, hormone.
1.2.3 Các phương pháp tách tế bào từ mô sống [3, 20 ]
Các tế bào trong mô sống thường gắn kết chặt chẽ với nhau nên không thể nuôi cấy
trong môi trường nhân tạo. Chính vì vậy cần phải tách rời các tế bào tạo thành dịch tế
bào trước khi chuyển sang nuôi cấy. Có hai phương pháp để tách tế bào từ mô sống:
- Phương pháp cơ học: Sử dụng để tách các mô có liên kết giữa các tế bào tương
đối lỏng lẻo như mô tủy xương, các mô mềm như mô não. Nguyên tắc để tách tế
bào bằng phương pháp cơ học là dùng lực cơ học đẩy mô qua các rây kín loại có
đường kính lỗ tương ứng với kích thước tế bào cần tách. Phương pháp cơ học có
ưu điểm là không tốn kém, dễ thực hiện tuy nhiên chỉ thích hợp với một số loại
mô.
- Phương pháp enzyme: Các liên kết giữa các tế bào mô sống của động vật đều có
bản chất protein. Phương pháp tách tế bào bằng enzyme sử dụng các protease để
phân cắt protein của các liên kết này từ đó tách rời các tế bào.
1.2.4 Enzyme sử dụng trong tách tế bào [3]
Về nguyên lý, tất cả các enzyme thủy phân protein đều có thể tham gia tách tế bào.
Một số protease như dipase I và II, pronase, papain… đã được sử dụng trong tách tế
bào. Ưu điểm của các enzyme này là chúng có nguồn gốc không phải từ động vật và có
thể sử dụng chúng với sự hiện diện của huyết thanh. Nhưng chúng lại không bị bất hoạt
bởi huyết thanh, dẫn đến phải loại bỏ chúng thông qua việc rửa tế bào sau khi tách –
quá trình này có thể làm tổn thương tế bào.
Trypsin là enzyme có thể khắc phục được các nhược điểm kể trên do sau khi sử
dụng nó có thể bị bất hoạt dễ dàng bằng huyết thanh. Phương pháp trypsin hóa được
Litwin (1971) tiêu chuẩn hóa trong sự tách tế bào và nuôi cấy fibroblast lưỡng bội ở
người.
1.2.4.1 Cấu trúc của enzyme trypsin
Trypsin là một serine protease gồm một chuỗi polypeptide gồm 249 acid amin,
trọng lượng phân tử khoảng 22 680 – 23 400 Dalton. Serine protease thuộc họ enzyme
proteolyse, sử dụng cơ chế phản ứng xúc tác nucleophile (ưa hạt nhân), với gốc serine
như là nucleophile phản ứng.

13
Hình 1.2.4.1 Cấu trúc không gian của enzyme trypsin
Các thành viên của họ này được biết đến nhiều nhất là ba enzyme trypsin,
chymotrypsin và elastase. Chúng tạo thành một nhóm thực hiện nhiệm vụ tiêu hóa
trong cơ thể động vật.
Môi trường thích hợp cho hoạt động của trypsin là môi trường acid yếu, có pH từ
6,9; tối ưu ở 8,9. Hoạt tính của trypsin bị kiềm hãm bằng huyết thanh thai bò hoặc di –
isopropyl fluoro phosphate (DFP). Canxi được xem như chất bảo vệ cho trypsin, hoạt
tính xúc tác của trypsin giảm 50% khi thiếu Ca2+.
1.2.4.2 Cơ chế tác động của trypsin trong quá trình tách tế bào
Vị trí tác động của enzyme trên phân tử protein
Trypsin, chymotrypsin và elastase đều là các endopeptidase, cắt chuỗi protein tại
các nối peptide bên trong mạch.
Mỗi enzyme có vị trí cắt ưa thích tại mạch nối kề cận với kiểu gốc amino acid đặc
trưng. Trypsin cắt nối peptide ngay tại các nhóm carbonyl của gốc amino acid base
(lysine hay arginine)
Tác động của enzyme tách tế bào lên tế bào nuôi cấy
Trypsin không tách tế bào từ bề mặt nhưng dẫn đến sự cuộn tròn tế bào. Nó khởi
đầu hoạt động trên khung tế bào cũng như trên các thành phần bề mặt của phức màng
tế bào – khung tế bào.
Các nghiên cứu của Bailey và cộng sự (1980) cho thấy trypsin làm phân tán các sợi
căng nhằm thay đổi hình dạng tế bào. Khi tế bào co lại, màng tế bào trở nên bị nhúm
lại với nhiều lỗ rỗng và vi sợi. Quá trình này dần dần làm tế bào cuộn tròn. Trong quá
trình cuộn tròn, vị trí và sự hợp nhất của các vị trí dính được duy trì. Bề mặt chất nền
được bao phủ bởi các chất còn lại của các sợi co lại và các cấu trúc giống như tấm nhỏ.

14
Các tế bào được làm tròn này được gắn kết rất lỏng lẻo và cuối cùng có thể dễ dàng
tách ra bằng các biện pháp cơ học.
Tuy nhiên sự kéo dài xử lí trypsin sẽ tạo tổn thương cho tế bào. Ngoài tổn thương
bề mặt, trypsin còn tạo sự tổn thương bên trong chẳng hạn như sự thủy phân
polyribosome. Các nghiên cứu của Hodges và cộng sự (1973) trên tế bào Hela và tế
bào thận CBM17 ở chuột cho thấy trypsin đánh dấu có thể tìm thấy bên trong tế bào
chất, nhân và hạch nhân của tế bào nuôi cấy. Để giảm tiềm năng gây tổn thương tế bào
của trypsin, McKeehan (1977) đã nghiên cứu và đề ra biện pháp giảm nhiệt độ trong
quá trình trypsin hóa. Nói chung, trypsin được sử dụng ở khoảng nồng độ từ 0,01% -
0,5%. Thường nồng độ sử dụng là 0,25% trong thời gian là 5 – 15 phút.
Quá trình trypsin hóa cũng chịu ảnh hưởng của pH, pH thuận lợi cho hoạt động của
trypsin trong quá trình tách tế bào ở khoảng 7,4 – 8,0.
Tế bào bị tổn thương do quá trình trypsin hóa có thể phục hồi sau khi bất hoạt
trypsin. Tuy nhiên, khi sử dụng môi trường không huyết thanh việc bất hoạt trypsin có
thể được thực hiện bằng việc sử dụng chất ức chế trypsin hoặc rửa tế bào nhiều lần.
1.2.5 Kỹ thuật nuôi cấytế bào động vật [17]
Phương pháp chính trong nuôi cấy tế bào động vật có vú để sản xuất các sản phẩm
sinh - dược là dựa trên cơ sở nuôi cấy dịch huyền phù trong hệ lên men. Từ lâu, hệ lên
men đã được sử dụng trong nuôi cấy vi khuẩn và nấm men. Đầu tiên, sự lên men là
thuật ngữ dùng cho sản xuất cồn. Sau đó, các nhà vi sinh vật học ứng dụng các nguyên
tắc trên để tách chiết các vitamin, các acid hữu cơ và các kháng sinh… Kết quả dẫn
đến sự phát triển nhanh chóng các phương pháp và các hệ thống lên men khác nhau.
Các nguyên lý tương tự sau đó được ứng dụng cho nuôi cấy sinh khối tế bào động
vật và thực vật. Tuy nhiên, nuôi cấy các tế bào động vật và thực vật khó khăn hơn
nhiều so với vi sinh vật, cái chính là do quá trình trao đổi chất trong các loại tế bào này
diễn ra chậm, điều này cũng phản ánh tốc độ sinh trưởng chậm của tế bào. Các tế bào
động vật có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp hơn so với vi khuẩn và nấm men, chúng
không có thành tế bào như vi khuẩn vì thế rất dễ biến dạng và vỡ. Do đó, các hệ thống
khuấy và sục khí được thiết kế khác với nuôi cấy vi khuẩn. Mặc dù có một số điểm
không thuận lợi, nhưng hệ thống lên men đã được sử dụng để nuôi cấy tế bào động vật
ít nhất cũng vài chục năm trước đây. Các dòng tế bào khác nhau như BHK-21, LS, các
tế bào Namalwa… đã được sinh trưởng trong hệ lên men theo phương thức nuôi cấy
chìm ngập trong môi trường để sản xuất các viral vaccine và các sản phẩm khác.

15
Đặc điểm dễ biến dạng và dễ vỡ của tế bào động vật đã được khắc phục bằng cách
đưa vào các cánh khuấy có dạng hình mái chèo. Việc cung cấp khí trực tiếp có thể tạo
ra bọt khí dễ làm vỡ tế bào, vì thế cần cung cấp khí bằng cách khuếch tán thông qua
ống silicone. Môi trường chứa nhiều protein huyết thanh có khả năng gây ra hiện tượng
tạo bọt nên cần khuấy chậm và nhẹ. Đối với nuôi cấy mật độ cao, cần cung cấp thêm
oxygen. Phương pháp dùng ống silicone để sục khí có nhiều ưu điểm do không tạo ra
bọt khí và tốc độ truyền oxygen là thỏa đáng.
Như vậy, các hệ lên men vi sinh vật được cải tiến thích hợp có thể dùng để nuôi cấy
sinh khối các tế bào động vật sinh trưởng trong dịch huyền phù. Nếu muốn nuôi cấy
một dòng tế bào dính bám thì nên dùng một hệ thống chất mang như là microcarrier.
Các dòng tế bào động vật có vú thường được sử dụng trong nuôi cấy là CHO4,
NS05, BHK6, HEK-2937 và tế bào võng mạc của người.
Người ta có thể sử dụng tế bào tự do (bạch cầu, limpho,…) hoặc tế bào của mô để
nuôi cấy. Mô được phẫu thuật trong môi trường vô trùng, cắt thành mảnh nhỏ và được
xử lý bằng enzyme kết hợp với kỹ thuật nghiền mô để tách thành tế bào riêng biệt ở
dạng huyền phù. Trong môi trường nuôi cấy, các tế bào tự do thường ở dạng huyền
phù, còn tế bào mô thường bám vào đáy bình thành lớp. Người ta sử dụng buồng đếm
hoặc máy đếm tự động để tính toán số lượng tế bào theo từng giai đoạn phát triển.
Người ta có thể thực hiện các mẻ cấy liên tục bằng cách trích một phần mẻ cấy
trước để cấy chuyền vào môi trường mới, nếu là mẻ bám thì phải sử dụng enzyme để
tách riêng tế bào và phải làm rất nhanh trong vòng 15 phút vì enzyme có thể gây hại
cho tế bào.
Nuôi cấy sơ cấp
Nuôi cấy sơ cấp là quá trình nuôi cấy tế bào trực tiếp từ mô trước lần cấy chuyền
đầu tiên (subculture).
Trong nuôi cấy sơ cấp, các tế bào ban đầu thường là một hỗn hợp các dòng tế bào
khác nhau, hoặc chứa một kiểu tế bào trội nhất, trong đó có những tế bào quan tâm và
những tế bào khác (được gọi là tế bào nhiễm). Có thể loại bỏ các tế bào nhiễm bằng cơ
học hay enzyme khi tách mô hay bằng cách duy trì các điều kiện chọn lọc dương tính
cho sự sống sót của một kiểu tế bào quan tâm cần thu nhận.
Qui trình nuôi cấy sơ cấp gồm:
- Bước 1: Thu nhận mô (tươi hoặc đông lạnh) có chứa tế bào sống.
- Bước 2: Phẫu tích và (hoặc) tách rời tế bào, xác định nồng độ.
- Bước 3: Nuôi cấy tế bào.

16
Sơ đồ 1.2.5 Quy trình nuôi cấy sơ cấp
Thu nhận mẫu mô
Cắt nhỏ
(Chọn lọc mẫu mô quan tâm, cắt bỏ phần mô chết)
Cắt nhỏ
(Mảnh nhỏ để nuôi)
Tách TB bằng cơ học
(nghiền, ép)
Tách TB bằng enzyme
(ủ,…)
Nuôi mẫu mô sơ cấp
Thu nhận tế bào
mới
Nuôi mảnh mô
thứ cấp
Trypsin lạnh Trypsin ấm Collagenase
Li tâm
Nuôi sơ cấp
Cấy chuyền
Dòng tế bào
Tái huyền phù

17
Thu nhận mẫu và xử lí sơ bộ
Các mẫu thu nhận có thể bao gồm bất kỳ mô nào của cơ thể, trước khi lấy phải làm
sạch mô tại vị trí lấy, đưa mô vào bảo quản trong dung dịch DPBS, nhanh chóng
chuyển về phòng thí nghiệm.
Xử lí mẫu sơ bộ bao gồm rửa nhiều lần bằng dung dịch PBS có bổ sung kháng sinh,
kháng nấm, sau đó cắt bỏ các phần mô chết, phần thừa,… mẫu mô cần được cắt nhỏ
thành từng mảnh 2-3 mm2
Tách rời các tế bào
Có thể sử dụng nhiều phương pháp khác nhau như:
- Tách tế bào bằng cơ học: nghiền, ép
- Tách tế bào bằng cách ủ với enzyme trypsin hay collagenase
- Tách tế bào bằng phương pháp li tâm theo gradient tỷ trọng
- Tách tế bào bằng phương pháp dựa vào marker bề mặt.
Kết quả của giai đoạn này thu được dịch tách tế bào.
Nuôi cấy
- Dùng pipetman hút vào bốn eppendorf, mỗi cái 1 ml dịch tách tế bào.
- Li tâm 1000 vòng/ph trong 10 phút, loại bỏ dịch nổi.
- Cho vào mỗi eppendorf 1 ml môi trường nuôi, huyền phù tế bào bằng vortex.
- Hút dịch huyền phù tế bào ở bốn eppendorf cho vào một bình nuôi cấy (bình
Roux) và bổ sung 1ml môi trường.
- Ủ ở 37,50C trong tủ nuôi, sau 24h thay môi trường mới và tiếp tục ủ.
Sau lần nuôi cấy sơ cấp sẽ thu được các tế bào sơ cấp. Đối với trường hợp lượng
mẫu mô quá ít, người ta nuôi cấy nguyên mảnh mô để thu nhận tế bào sơ cấp.
Đời sống tế bào động vật trong nuôi cấy
Tế bào mô động vật, đặc biệt là động vật có vú có đặc điểm là khi nuôi cấy, dù là
cấy chuyền chỉ qua được 50 thế hệ, sau đó chúng thoái hóa và chết. Số thế hệ tế bào
tùy thuộc vào độ biệt hóa của mô mà ta lấy tế bào. Đối với tế bào gốc thì khả năng sinh
trưởng sẽ dài hơn so với tế bào biệt hóa, tế bào gốc phôi có khả năng sinh trưởng dài
hơn tế bào gốc cơ thể trưởng thành. Tuy vậy, người ta đã tạo ra được các dòng tế bào
“bất tử” tức là tế bào có khả năng sinh trưởng liên tục trong môi trường cấy chuyền. Đó
chính là các tế bào ung thư của cơ thể hoặc là dạng tế bào được làm chuyển dạng “ung
thư hóa” với những biến đổi di truyền. Sự chuyển dạng thường được thực hiện nhờ tác
nhân gây đột biến, nhờ virut, nhờ gen ung thư,… Ngày nay, người ta đã nuôi cấy và cất

18
giữ nhiều dòng tế bào “bất tử” nhân tạo như các dòng tế bào chuột, chuột Hamster TQ,
khỉ,… hoặc lấy từ cơ thể từ các mô ung thư tế bào Hela (tế bào ung thư cổ tử cung) hay
tế bào Namalwa (tế bào ung thư limphoma của một phụ nữ có tên là Namalwa).
Sự sinh trưởng của tế bào động vật trong nuôi cấy.
Sự sinh trưởng của tế bào động vật in vitro thường trải qua 3 pha:
- Pha chậm (Lag phase) là giai đoạn khi tế bào được đưa vào môi trường nuôi
cấy cho đến khi tế bào bắt đầu phát triển. Thời gian này dài hay ngắn tùy
thuộc vào trạng thái biệt hóa của mô được trích tế bào.
- Pha tiến triển (exponential phase) là giai đoạn tế bào phân chia liên tục, tăng
nhanh số lượng tế bào trong khoảng thời gian từ 15 – 25 giờ với số lượng tế
bào đạt 1-2 x 106/cm3, là nồng độ chuẩn cho nuôi cấy theo mẻ.
- Pha dừng (Stationary phase) là giai đoạn sau pha tiến triển, trong đó số
lượng tế bào không thay đổi, tức là khi môi trường dinh dưỡng nghèo dần và
bắt đầu tích lũy các sản phẩm trao đổi chất độc hại. Bắt đầu xuất hiện tự hoại
tế bào thể hiện ở chỗ nhân bị đứt chẻ và trên bề mặt tế bào tạo thành các
mảnh khối có thể quan sát được dưới kính hiển vi. Muốn cho tế bào tiếp tục
sinh trưởng cần thực hiện các mẻ cấy chuyền với môi trường mới.
1.2.6 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình nuôi cấy tế bào [19, 15]
1.2.6.1 Môi trường và các yếu tố bổ sung
Ảnh hưởng của môi trường bên ngoài lên quá trình nuôi cấy tế bào biểu hiện qua 4
con đường:
1. Tính tự nhiên của giá thể rất có ý nghĩa trong quá trình nuôi cấy, nơi tế bào
sẽ gắn bám và tăng trưởng. Giá thể phù hợp thì tế bào tăng trưởng mạnh –
điều này tạo ra tính đồng nhất trong tăng trưởng, có thể nuôi cấy lớp đơn trên
nhiều giá thể khác nhau như: trên đĩa plastic, giá thể bán rắn (trong một loại
gel, collagen, ager hoặc trong dung dịch nuôi cấy dịch treo).
2. Sự cấu thành của các yếu tố lý hóa và sinh lý của môi trường.
3. Sự thiết lập về giai đoạn pha khí.
4. Ảnh hưởng của nhiệt độ ủ.
Việc nuôi những tế bào từ những mảnh mô có thể được cấy chuyền và tăng sinh in
vitro dẫn đến việc thử nghiệm tạo ra nhiều môi trường hơn để duy trì sự tăng trưởng
của dòng tế bào liên tục và thay thế môi trường tự nhiên như: dịch chiết phôi, dịch thủy
phân protein, lympho…

19
Sự tiếp cận để phát triển một môi trường mới bắt đầu với một môi trường giàu chất
dinh dưỡng như: Ham’s F12 hoặc môi trường 199 được bổ sung với nồng độ cao của
huyết thanh (20%) và dần dần thử nghiệm giảm bớt huyết thanh bởi sự thay đổi nồng
độ của các thành phần tồn tại trong môi trường và thêm vào các yếu tố mới.
1.2.6.2 Yếu tố bề mặt của chai nuôi – giá thể
Phần lớn tế bào động vật có xương sống có khả năng tăng trưởng thành từng lớp
đơn trên bề mặt nhân tạo trong điều kiện nuôi in vitro. Từ những cố gắng sớm nhất,
thủy tinh đã được sử dụng như là giá thể, khởi đầu do đặc tính quang học của nó,
nhưng do tế bào cần dàn trải, gắn bám lên trên một bề mặt giá thể thích hợp cho sự
tăng trưởng nên để khắc phục tình trạng này người ta đã dùng nhựa plastic do chúng có
đặc tính quang học tốt và bề mặt tăng trưởng bằng phẳng, tạo ra được các đơn vị tăng
trưởng tế bào và sự tái tạo trong nuôi cấy.
Hiện nay, đa số người ta thích dùng polystyrene. Ngoài ra còn có các loại giá thể
bán thấm, các loại vi giá thể và các giá thể nhân tạo khác. Sự lựa chọn giá thể được
quyết định dựa vào:
- Khả năng sinh sản của tế bào.
- Sự tăng của tế bào trong dịch treo hoặc tạo lớp đơn.
- Việc nuôi nên để thông khí hay bịt kín.
- Mẫu chuẩn và mẫu thí nghiệm được thực hiện hay không.
- Giá cả hợp lí.
1.2.6.3 Yếu tố vật lý
Áp suất thẩm thấu
Hầu hết tế bào được nuôi có một giới hạn chịu đựng khá rộng về áp suất thẩm thấu.
Trong thực tế, áp suất thẩm thấu giữa 260 mOsm/kg và 320 mOsm/kg thường được
chấp nhận cho hầu hết những tế bào, nhưng nên có một sự chọn lựa và nên giữ ở mức
sai số ±10 mOsm/kg.
Nhiệt độ
Nhiệt độ ảnh hưởng trực tiếp lên sự tăng trưởng của tế bào vì nó làm ảnh hưởng đến
pH do sự thay đổi về ion và pKa của dung dịch đệm. pH nên được điều chỉnh thấp hơn
0,2 đơn vị ở nhiệt độ phòng hơn là ở 36,50C.
Nhiệt độ tối ưu cho tế bào nuôi phụ thuộc vào:
- Nhiệt độ cơ thể của động vật nơi tế bào được thu nhận.
- Tùy thuộc vào các vùng khác nhau về nhiệt độ cơ thể (như da và tinh hoàn
có nhiệt độ thấp hơn các vùng khác trong cơ thể).

20
Tất cả yếu tố an toàn theo sau trong điều kiện nuôi cấy:
- Nhiệt độ được quan tâm đối với người và dòng tế bào động vật máu nóng tốt
nhất là 36,50C. Gần với nhiệt độ cơ thể nhưng thấp hơn để đảm bảo an toàn,
nhiệt độ quá cao ảnh hưởng nghiêm trọng hơn nhiệt độ thấp.
- Tế bào nuôi có thể dừng tăng trưởng dựa vào điều khiển nhiệt độ, có thể tồn
tại một vài ngày ở 40C và có thể bị đông lạnh, ngừng hoạt động sinh lý ở
nhiệt độ lạnh sâu -1960C, nhưng không thể tồn tại ở nhiệt độ 20C trong điều
kiện bình thường khoảng một vài tiếng và chết khá nhanh ở nhiệt độ 400C và
cao hơn.
Tính nhớt
Tính nhớt của môi trường bị ảnh hưởng bởi các thành phần của huyết thanh và
trong một số trường hợp, ảnh hưởng một ít lên sự tăng trưởng tế bào. Tính nhớt trở nên
đặc biệt quan trọng khi mà nuôi dịch treo được lắc hoặc khi dịch nuôi cấy được khuấy
hoặc khi tế bào được tách ra sau khi bị trypsin hóa.
Áp lực sức căng bề mặt và sự tạo bọt
Áp lực sức căng bề mặt được sử dụng để kiểm soát sự bám dính của mảnh mô được
cấy nguyên phát với giá thể. Trong nuôi cấy dịch treo với 5% CO2 trong không khí thì
bọt được tạo ra trong môi trường chứa huyết thanh. Sự thêm vào của một Silicone
kháng bọt (Dow chemical) hoặc Plunoric F68 (Wyandotte) giúp cải thiện điều này bởi
làm giảm áp lực sức căng bề mặt.
Ảnh hưởng của sự tạo bọt đến sự biến tính protein và nguy cơ của việc nhiễm gia
tăng vẫn chưa được xác định rõ ràng, nếu sự tạo bọt gia tăng đến cổ của lọ nuôi, tốt
nhất là nên tránh.
Yếu tố hóa học
- Oxygen: Phần quan trọng trong cấu tạo của pha khí là O2 và CO2. Áp lực O2 phù
hợp với hầu hết các loại tế bào nuôi, cơ quan, đặc biệt là gia đoạn muộn của
phôi, cá thể mới sinh hoặc trưởng thành đều cần đến 95% O2 trong pha khí.
Chiều sâu của môi trường có ảnh hưởng đến tỉ lệ khuếch tán oxy hòa tan của tế
bào, thích hợp nhất nên giữ độ sâu của môi trường trong khoảng 2 – 5mm.
- Dioxide carbon (CO2): CO2 có nhiều vai trò quan trọng như: ảnh hưởng đến
nồng độ CO2 hòa tan, pH và nồng độ HCO3
-. Rất khó để xác định chính xác áp
lực CO2 không khí để kiểm soát nồng độ CO2 hòa tan.
Đây là một phản ứng thuận nghịch diễn ra:
𝐻2 𝑂 + 𝐶𝑂2 ↔ 𝐻2 𝐶 𝑂3 ↔ 𝐻+
+ 𝐻𝐶 𝑂3
−
(1)

21
Kết quả của việc gia tăng CO2 không khí là làm giảm pH. Vì thế, hiệu quả của
việc gia tăng áp lực CO2 được trung hòa bởi sự gia tăng nồng độ bicarbonate:
𝑁𝑎𝐻𝐶 𝑂3 ↔ 𝑁𝑎+
+ 𝐻𝐶𝑂3
−
(2)
Sự gia tăng HCO3
- làm cân bằng (1) cho đến khi có sự cân bằng pH ở 7.4:
𝑁𝑎𝑂𝐻 + 𝐻2 𝐶𝑂3 ↔ 𝑁𝑎𝐻𝐶 𝑂3 + 𝐻2 𝑂 ↔ 𝑁𝑎+
+ 𝐻𝐶 𝑂3
−
+ 𝐻2 𝑂 (3)
Tóm lại, nuôi tế bào ở nồng độ thấp trong chai mở cần ủ trong CO2 không khí
nơi mà nó được cân bằng với sodium bicarbonate trong môi trường. Ở tại nồng
độ tế bào rất thấp cần thêm CO2 vào pha khí của bình khí kín đối với hầu hết
việc nuôi. Khi nồng độ tế bào cao, không cần thiết để thêm CO2 vào pha khí
trong chai kín và cũng không cần đối với chai mở.
- pH: Hầu hết các dòng tế bào đều tăng trưởng tốt ở pH 7.4. Mặc dù điều kiện
thuận lợi về pH đối với sự phát triển của tế bào sẽ thay đổi liên quan đến các
kiểu tế bào khác nhau. Phenol red thường được sử dụng như là một chất chỉ thị.
- Dung dịch đệm: Môi trường nuôi phải được đệm bởi hai lý do:
+ Đĩa, chai thường xuyên được mở ra, nơi tạo điều kiện cho CO2 xâm nhập và
làm gia tăng pH.
+ Sự sản sinh quá nhiều CO2 và acid lactic trong dòng tế bào bị biến đổi ở mật
độ tế bào cao, khi đó pH sẽ giảm xuống. Một loại dung dịch đệm phải được sử
dụng để kết hợp chặt chẽ trong moi trường để giữ pH không thay đổi nhưng
trong phản ứng (1), sản phẩm CO2 ngoại sinh có lẽ cần cho vài dòng tế bào, đặc
biệt ở nồng độ tế bào thấp, việc ngăn chặn tổng lượng CO2 hòa tan mất đi là cần
thiết nếu không sẽ khiến Bicarbonate trong môi trường bị thất thoát.
Dung dịch đệm Bicarbonate được sử dụng thường xuyên hơn các dung dịch đệm
khác do chúng có khả năng đệm ở mức thấp hơn pH sinh lý, tạo ra ít độc tố, giá
thành thấp và giá trị kinh tế cho việc nuôi cấy tế bào.
Môi trường tủ nuôi
Cần hạn chế mở cửa tủ cấy nhất là trong trường hợp phòng vô trùng thí nghiệm
không đạt chuẩn yêu cầu.
Tránh chồng các đĩa, chai tủ cấy, dễ ngã đổ môi trường lên nắp trong miệng chai
cấy, nếu không có thể làm tăng nguy cơ gây nhiễm và gây nhiễm cả môi trường bên
trong tủ cấy. Tránh sự rung lắc, dao động tủ cấy làm ảnh hưởng đến kết quả thí
nghiệm.
Nhiệt độ tủ cấy nên ổn định không đổi trong khoảng 36,5 ± 0,50C.

22
1.2.7 Tỉ lệ môi trường với mật độ tế bào đem nuôi, lượng mô đem cấy [19]
Đối với cách tách tế bào bằng trypsin, người ta thường sử dụng: 5ml môi trường/
chai cấy loại 25cm2 và mật độ tế bào từ 106 – 107 tế bào/ml.
- Với môi trường giàu dinh dưỡng có bổ sung sẵn chất bổ trợ như
AMNIOMAXTM – C100 20% FBS thì thường sử dụng 1ml ứng với 1 ngày sau
thay, 5ml ứng với 5 ngày thay.
- Với môi trường nghèo dinh dưỡng như: DMEM 20% AHS, EMEM 20% AHS
thì thường sử dụng 5ml tương ứng với 2 ngày sau thay.
Đối với cách tách bằng cơ học, nuôi cấy nguyên phát, người ta thường sử dụng cách
thay và liều lượng thay môi trường như sau:
+ 1ml môi trường/ chai cấy (1 ngày thay) ứng với chai cấy loại 25cm2.
1.2.8 Môi trường nuôi cấy [8]
1.2.8.1 Môi trường
Thành phần môi trường nuôi cấy tế bào động vật phức tạp hơn rất nhiều so với môi
trường nuôi cấy vi sinh vật và tế bào thực vật. Trong các công trình đầu tiên về nuôi
cấy tế bào động vật người ta thường dùng hỗn hợp dung dịch muối sinh lý, huyết thanh
và chiết phẩm phôi gà làm môi trường nuôi cấy. Do thành phần huyết thanh và chiết
phẩm phôi gà rất phức tạp, khó ổn định nên người ta dần quan tâm đến việc nghiên cứu
chế tạo các môi trường tổng hợp để có thể chủ động bảo quản, sử dụng, điều chỉnh
thành phần môi trường và ổn định môi trường trong những lần nuôi cấy khác nhau.
Hiện nay, trừ những dòng tế bào đã thiết lập được thuần hóa với môi trường tổng
hợp hoàn toàn, đa số các dòng tế bào được nuôi cấy trong môi trường tổng hợp có bổ
sung 5 – 10% huyết thanh (có dòng tế bào cần bổ sung 20% huyết thanh). Thông
thường huyết thanh bê được sử dụng phổ biến hơn cả, nhưng có một số loại tế bào cần
phải sử dụng huyết thanh bào thai bò (Fetal bovine serum: FBS).
1.2.8.2 Một vài loại môi trường thông thường được sử dụng trong nuôi cấy tế bào
và mô động vật [8]
Môi trường BM (Basal Medium): đây là môi trường cơ bản do H. Eagle thiết lập,
khi dùng phải bổ sung 5 – 10% huyết thanh và amino acid, vitamin với chủng loại và
số lượng tùy loại tế bào. Thường sử dụng nuôi cấy tế bào HeLa, tế bào L.

23
Môi trường E’MEM (Eagle Minimun Essential Medium): còn gọi là môi trường tối
thiểu, do H. Eagle thiết lập. Đây là môi trường BM có chứa nồng độ cao hơn các amino
acid và vitamin, cũng cần bổ sung 5 – 10% huyết thanh khi nuôi cấy tế bào.
Môi trường D’MEM (Dulbecco – Modifiled Eagle Medium) là môi trường E’MEM
do Dulbecco cải tiến với thành phần một số amino acid cao gấp 2 lần và một số vitamin
cao gấp 4 lần so với môi trường khác để nuôi được nhiều loại tế bào hơn.
Môi trường F10, F12: do R.G. Ham thiết lập dùng cho nguyên bào sợi, trong môi
trường này huyết thanh được thay bằng 20µg/ml albumin huyết thanh hoặc bằng 3.10-7
M acid linoleic.
Môi trường Iscove: do N.N. Iscove thiết lập trên cơ sở tiếp tục cải biến môi trường
D’MEM.
Môi trường 5A: do T.A. Mc. Coy thiết lập, thường được dùng cho tế bào bệnh bạch
huyết.
Môi trường RPMI – 1640: được G.E. Moore thiết lập tại viện nghiên cứu Roswell
Part Memorial Institute, được dùng để nuôi cấy tế bào và mô bạch huyết.
Môi trường 199: do R.C. Parker thiết lập dùng để nuôi cấy tế bào mô cơ phôi gà
trong sản xuất vaccine phòng bệnh bại liệt.
Trong hầu hết các loại môi trường nuôi cấy tế bào động vật đều có mặt huyết thanh
vì nó có những vai trò quan trọng như sau:
+ Cung cấp chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào như các amino acid thiết yếu,
tiền chất của nucleic acid, các nguyên tố vi lượng…
+ Cung cấp các nhân tố tăng trưởng, kích thích cho tế bào tăng trưởng và phân
chia.
+ Kích thích sự phục hồi các tổn thương của tế bào khi cấy chuyền và các
protein trong huyết thanh làm bất hoạt trypsin tránh các enzyme gây tổn thương tế
bào.
+ Cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng.
+ Cải thiện tính dính của tế bào lên bề mặt bình nuôi cấy nhờ các yếu tố làm
tăng độ dính của tế bào lên giá đỡ.
+ Chống oxy hóa: huyết thanh có tính kháng oxy hóa mạnh và ức chế độc tính
của oxy.
Huyết thanh rất cần cho việc nuôi cấy tế bào động vật, tuy nhiên huyết thanh làm
tăng giá thành nuôi cấy lên rất nhiều (chiếm 90% giá thành của môi trường nuôi cấy).
Ngoài ra huyết thanh còn dễ bị nhiễm virus, mycoplasma và khó ổn định chất lượng

24
của những lô môi trường khác nhau cũng như còn chứa những thành phần gây ức chế
sự phân bào của một số tế bào đặc biệt (do đó cần chọn loại huyết thanh phù hợp
không chứ yếu tố ức chế đối với dòng tế bào nuôi cấy). Vì các lý do đó mà nhiều nhà
nghiên cứu đã xây dựng môi trường nuôi cấy tế bào động vật không dùng huyết thanh
hay dùng với lượng thấp.
Có 2 phương pháp điều chế môi trường không có huyết thanh là phương pháp của
G. Sato và phương pháp của R.G. Ham. Cả 2 phương pháp này đều thay huyết thanh
bằng những yếu tố khác như: kích thích tố, nhân tố tăng trưởng, protein vận chuyển,
nhân tố kết dính và kéo dài, các chất dinh dưỡng, khoáng…
1.2.9 Ðánh giá tình trạng tế bào nuôi cấy [11]
Ước lượng trạng thái sức khỏe nói chung hay sự “happy” của tế bào nuôi cấy
thường dựa trên 4 đặc điểm: hình thái, tỷ lệ phát triển, năng suất che phủ và biểu hiện
chức năng đặc biệt.
- Dựa vào hình thái học (hình dạng tế bào) là dễ xác định nhất nhưng thường ít
được sử dụng nhất. Tuy đặc điểm này được theo dõi thường xuyên khi nuôi cấy
nhưng rất khó đưa ra kết luận dựa vào những quan sát này. Ngoài ra, đặc điểm
này không thể hiện một số lượng hay đo lường chính xác nào. Phương pháp này
thỉnh thoảng sai khi quan sát tế bào bằng kính hiển vi và vi trường quan sát xấu
hay có biểu hiện bất thường. Khi nghi ngờ, có thể nhuộm những tế bào đó với
crystal violet hoặc các chất nhuộm mô khác để xác định vấn đề bất thường.
- Đếm tế bào để ước lượng số lượng tế bào, cho phép xác định tỷ lệ phát triển – tỷ
lệ này nhạy cảm với những thay đổi cơ bản của điều kiện nuôi cấy. Dựa vào đó
để thiết lập các thí nghiệm xác định điều kiện (môi trường, chất nền, huyết
thanh…) tốt hơn cho tế bào.
- Năng suất che phủ là phương pháp kiểm tra dựa trên số lượng nhỏ tế bào (từ 20
– 200) bám trên bình nuôi cấy và số lượng các cụm tế bào đặc trưng được xác
định. Phần trăm các cụm tế bào đặc trưng biểu hiện cho khả năng tồn tại, trong
khi kích thước cụm tế bào đặc trưng cho tỷ lệ phát triển. Phương pháp này
tương tự phương pháp phân tích tỷ lệ phát triển, nhưng nhạy cảm hơn với sự
khác biệt nhỏ của điều kiện nuôi cấy.
- Đặc điểm cuối cùng là sự biểu hiện chức năng đặc biệt: thường khó quan sát và
đo lường nhất, được xác định bằng các xét nghiệm hóa sinh và miễn dịch.
1.3Đại cương về nguyên bào sợi
1.3.1 Nguồn gốc [2, 13, 14]

25
Nguyên bào sợi có nguồn gốc từ trung mô, tồn tại hai dạng là nguyên bào sợi
(fibroblast) và tế bào sợi (fibrocyte).
Tế bào sợi: khi chúng ở trạng thái nghỉ thì nhân có màu đậm, ít bào tương, có kích
thước nhỏ hơn so với nguyên bào sợi.
Nguyên bào sợi: chúng sẽ ở trạng thái hoạt động trong suốt quá trình làm lành vết
thương. Nguyên bào sợi có thể tồn tại 6 – 7 tháng trong quá trình nghiên cứu in vitro.
Vòng đời tăng trưởng của các dòng nguyên bào sợi phụ thuộc vào các cơ quan khác
nhau trên cơ thể.
1.3.2 Đặc điểm của nguyên bào sợi [2, 13]
Hình dạng của tế bào có thể bị thay đổi do những yếu tố vật lý (bề mặt) nơi mà
chúng gắn bám. Dưới kính hiển vi điện tử, nguyên bào sợi là những tế bào non, ít biệt
hóa. Nguyên bào sợi thường có dạng hình thoi, ít nhánh và ngắn, kích thước không quá
20 – 25µm, nhân bầu dục hoặc hình cầu có một hoặc vài hạt nhân. Nhân của nguyên
bào sợi cô đặc được kéo dài ra. Bào tương của base hạt, lưới nội bào, ti thể phát triển.
Nguyên bào sợi có khả năng phân chia mạnh, tế bào có thể di động yếu nhờ siêu sợi
actin và myosin ở ngoại vi bào tương. Tế bào có những nhánh là chân giả dạng sợi.
Hình 1.3.2 Cấu trúc nguyên bào sợi
1.3.3 Chức năng của nguyên bào sợi [6, 13, 15]
Hình dáng cấu trúc vật lý của tế bào đem lại những chức năng đặc biệt đối với việc
tổng hợp và tiết ra các đại phân tử, đảm nhận nhiều chức năng quan trọng trong cơ thể
như:

26
- Tổng hợp các chất như phân tử collagen, proteoglycans, glycoprotein và sợi
elastin bằng quá trình ngoại tiết để tạo sợi liên kết, tổng hợp
glycosaminoglycan, tổng hợp một phần glycoprotein.
- Tham gia vào quá trình tái tạo.
- Tạo tế bào sợi trưởng thành, tế bào mỡ, tế bào sụn, tế bào xương.
- Khả năng thực bào của nguyên bào sợi rất thấp.
Tầm quan trọng của nguyên bào sợi chưa thể đánh giá hết được. Chúng hiện diện
ngay trong trạng thái phát triển bình thường, và ngay cả lúc hàn gắn và sửa chữa vết
thương. Ngày ngày, chúng tham gia hoạt động sinh lý của các mô và các cơ quan trong
cơ thẻ. Nguyên bào sợi đảm nhiệm nhiều chức năng. Nó có thể khử biệt hóa để trở về
trạng thái ở giai đoạn sớm trong tiến trình phát triển và sau đó lặp lại sự biệt hóa đó (tái
biệt hóa) để tạo ra một số loại tế bào khác.
1.3.4 Sơ lược về kinh nghiệm nuôi cấy nguyên bào sợi trên thế giới [19]
Ngoài môi trường dinh dưỡng cơ bản, nhu cầu chính yếu của tế bào dạng nguyên
bào sợi cũng như nguyên bào sợi là cần giá bám để mọc lan ra, những tế bào này có
tính linh động yếu và tính độc lập khi mật độ tế bào còn thấp. Để hiện diện được, nó
cũng như những tế bào biểu mô cần có sự cảm ứng trực tiếp giữa tế bào với tế bào mới
sống sót và phát triển được tối ưu để tạo thành cụm tế bào.
Ba nhóm protein chuyển biến màng chính yếu được thể hiện liên quan đến tính cảm
ứng giữa tế bào với tế bào, giữa tế bào với giá thể:
+ Phân tử cảm ứng gắn bám giữa tế bào với tế bào là: CAMs (độc lập với Ca2+) và
Cadherins (phụ thuộc vào Ca2+) – nó thể hiện tương tác cơ bản giữa các tế bào đồng
loại. Tính tự cảm ứng như: những phân tử giống nhau thì mọc đối xứng tương tác lẫn
nhau. Điều này được phát hiện bởi: Edelman, 1986, 1988; bởi Roseman và Gallatin,
1991.
+ Mối tương tác giữa tế bào và giá thể trong môi trường nuôi cấy được thể hiện qua
đoạn dính gắn (integrins) của tế bào, thụ thể của tế bào gắn bám với những phân tử
chất nền như là: fibronectin, laminin, collagen, những sợi này sẽ liên kết với các tế bào
tạo ra đường nối rõ ràng đặc hiệu, thường chứa đựng trong những sợi này gồm có:
RGD (arginine, glycine, aspartic acid). Điều này được phát hiện bởi: Yamada, 1991.
Mỗi đoạn đính (integrins) gồm có: tiểu đơn vị 𝛼 và tiểu đơn vị 𝛽. Cả hai sợi này đều có
tính đa dạng cao, được sinh ra nhiều đáng kể, tạo ra sự đa dạng giữa các đoạn dính gắn
(integrins).

27
+ Nhóm thứ ba của phân tử gắn bám tế bào là: sự chuyển biến những proteoglycans
màng, cũng như dựa trên sự tương tác giữa các thành tố chất nền với nhau, như là:
tương tác với những proteoglycans khác hoặc collagen nhưng không gắn kết đặc hiệu
với sợi RGD.
Có một số sự kiện chuyển biến proteoglycans màng có chức năng hoạt động như là:
cơ quan cảm thụ nhân tố tăng trưởng với ái lực yếu. Điều này được phát hiện bởi:
Klagsbrun và Baird, 1991.
Sự kiện không kết tụ của mô có nghĩa là: thể hiện một sự gắn bám thành lớp đơn
trong nuôi cấy. Do trong quá trình tăng sinh có sự hiện diện của protease tiêu hủy một
số chất nền ngoại bào, thậm chí có lẽ làm suy thoái sự chuyển biến protein màng, mà
protein màng đó sẽ cảm ứng với chất nền ngoại bào. Khi đó, nó sẽ cho phép các tế bào
tách biệt thành mỗi cái riêng rẽ.
Những tế bào ngoại bì và nội bì thường đề kháng với sự không kết tụ hơn, có nghĩa
là: chúng có khuynh hướng mọc chồng chéo lên nhau, tạo ra dạng tế bào phức hợp
hoặc chèn lấp lẫn nhau thành đám.
Trong khi những tế bào trung bì thì phụ thuộc vào sự tương tác với chất nền hơn là
sự liên kết gian bào. Vì lý do đó nên dễ dàng mọc tách riêng biệt ra thành lớp đơn.
Chính vì lí do này mà tế bào phải tái tổng hợp protein chất nền trước khi chúng gắn
bán, hoặc là phải được cung cấp một giá thể có chất nền được lót bọc sợi liên kết.
Trong nuôi cấy sơ cấp, quan sát những tế bào lớp đơn, Hence đã lập ra sự liên hệ
giữa tỉ lệ mật độ và sự chuyển đổi của tế bào, liên quan đến cách sử dụng chất nền để
bám.
Trong nuôi cấy lớp đơn, nếu tế bào còn môi trường sử dụng và giá thể để bám thì
chúng sẽ không khép kín sự tiếp xúc với những tế bào khác. Khi môi trường và không
gian nuôi cấy đã hết, nếu để lâu hơn vài giờ thì những bước chọn lọc khuynh hướng
phát triển khác nhau sẽ xảy ra:
+ Những tế bào mà nó nhạy cảm với giới hạn, mật độ phát triển thì sẽ ngừng phân
chia.
+ Những tế bào nào bị chuyển dạng thì sẽ không cảm nhận được giới hạn mật độ
phát triển. Chúng sẽ có khuynh hướng phát triển vượt bậc, phát triển quá giới hạn.
+ Khi giữ mật độ tế bào ở mức thấp, bằng cách tạo ra sự cấy chuyền thường xuyên
sẽ giúp ích cho việc giữ ổn định kiểu hình bình thường của tế bào trong môi trường
nuôi cấy, như là trường hợp nuôi nguyên bào sợi chuột nếu cấy chuyền thường xuyên
sẽ giúp không rơi vào trạng thái dễ dàng chuyển dạng. Khi mà mật độ tế bào ở mức độ

28
quá cao thì tại thời điểm đó, ở nơi đó, sự chuyển dạng tự phát sẽ làm cho tế bào có
khuynh hướng phát triển quá giới hạn.
Một vài diễn biến chức năng chuyên biệt được hiểu rõ ràng trong nuôi cấy sơ cấp,
đặc điểm này thể hiện khi nuôi cấy trở nên nhập dòng (các dòng tế bào khác nhau hòa
hợp cùng phát triển trên cùng môi trường nuôi cấy). Ở giai đoạn này, nuôi cấy sẽ thể
hiện trạng thái khép kín dày đặc nhất và vẫn còn tình trạng đa dạng về thể loại tế bào.
Sau lần đầu tiên cấy chuyền, nuôi cấy nguyên phát trở nên - được biết gần như là
một dòng tế bào và có lẽ sẽ được nhân lên sau vài lần cấy chuyền nữa. Sau mỗi lần cấy
chuyền thành công, thành phần của quần thể sẽ có khả năng tăng sinh mạnh mẽ hơn,
hầu như nhanh hơn và tăng dần đến một mức độ tối ưu nào đó và rồi không tăng sinh
nữa; hoặc các tế bào tăng sinh chậm chạp lại, trong trường hợp này mật độ tế bào sẽ bị
loãng ra và thưa đi. Điều này là sự kiện nổi bật nhất sau lần đầu tiên cấy chuyền. Ở
những vùng khác nhau sẽ cho khả năng tăng sinh khác nhau. Và xu hướng là: những tế
bào bị tổn thương bởi trypsin sẽ có khuynh hướng chuyển dạng tế bào.
Mặc dù vậy, một sự chọn lọc dòng về kiểu hình và kiểu gen tiếp tục được thực hiện
trong môi trường nuôi. Bởi lẽ, sau lần cấy chuyền thứ ba, chỉ các loại tế bào điển hình
có khả năng chịu đựng cao thì mới tăng sinh nhanh chóng và mạnh mẽ. Trong trường
hợp có sự hiện diện của huyết thanh mà không có điều kiện chọn lọc chuyên biệt thì
những dòng tế bào trung mô được dẫn xuất từ mô liên kết như nguyên bào sợi và
những nhân tố thuộc mạch máu thường phát triển mạnh mẽ, tăng lên quá mức trong
môi trường nuôi cấy. Từ những nghiên cứu này đã đưa ra một số dòng tế bào rất hữu
dụng:
+ W138: Nguyên bào sợi từ phổi phôi người.
+ BHK21: Nguyên bào sợi chuột đồng con.
Phần lớn các dòng tế bào có thể nhân lên không làm thay đổi hiện trạng của tế bào,
do có sự giới hạn số lượng thế hệ tế bào. Bên cạnh đó, chúng có thể chết hoặc nhân lên
thành dòng tế bào liên tục. Khả năng một dòng nào đó phát triển thành dòng tế bào liên
tục có thể phản ánh khả năng biến đổi di truyền của nó. Qua đó cho phép ta chọn lọc
dòng tế bào theo trình tự cấy chuyền nối tiếp nhau.
Nguyên bào sợi người duy trì số lượng thể bội chỉnh áp đảo, đánh giá thông qua
tuổi đời nuôi cấy của chúng và không bao giờ cho ra dòng tế bào liên tục. Trong khi
đó, nguyên bào sợi của chuột và những tế bào nuôi cấy từ những mô bướu của người
và những động vật khác thì thường cho ra thể bội không chỉnh; song song đó, cho ra
dòng tế bào liên tục trong nuôi cấy với tần số hoàn toàn cao. Sự biến đổi trong nuôi cấy

29
và cho ra dòng tế bào liên tục phổ biến gọi là: “sự chuyển dạng trong nuôi cấy thí
nghiệm (in vitro transformation)”. Có nhiều loại tế bào không cho ra dòng tế bào liên
tục. Trong số những loại tế bào này có nguyên bào sợi người; là loại tế bào duy trì thể
bội chỉnh trong suốt tuổi đời thế hệ (khoảng 50 thế hệ).
1.3.5 Nguyên bào sợi trong các nghiên cứu và ứng dụng
1.3.5.1 Điều trị vết thương [14, 23]
Nguyên bào sợi là thành phần của mảnh ghép tự thân trong điều trị tổn thương, rút
ngắn thời gian lành hóa. Mảnh ghép tự thân gồm hai lớp tế bào, tế bào keratin và
nguyên bào sợi, cả hai đều được phân bố và tăng sinh trên hai chất nền khác nhau, chủ
yếu từ acid hyaluronic.
Một trong những chức năng sửa chữa vết thương nổi bật của nguyên bào sợi được
ứng dụng nhiều chính là khả năng sửa chữa vết rách đơn giản ở da. Việc sửa chữa mô
hoặc hàn gắn vết thương xảy ra theo hai cách thức chính: sự tái sinh và sự xơ hóa.
Tái sinh là sự thay thế mô bị phá hủy bằng những loại tế bào tương tự hoặc giống
như những tế bào trước đó.
Ở những nơi mà sự xơ hóa xảy ra, nó sẽ bọc lấy vị trí cần sửa chữa bằng mô liên
kết có sợi, đó chính là sự hình thành mô sẹo. Trước khi những sự kiện này xảy ra thì
còn phụ thuộc vào:
(1) Loại mô bị hư hại.
(2) Độ nghiêm trọng của sự tổn thương (tùy loại vết thương).
Vết rạch thì mô sẽ hàn gắn vết thương dễ dàng hơn là mô bị rách. Mô tổn thương sẽ
thiết lập thành dãy bằng phẳng trong vùng bị tổn thương, khi đó vùng bị tổn thương sẽ
trở thành vùng vận động. Bề mặt ngoại bì bắt đầu tái sinh bằng cách mọc lan xuyên
qua bên dưới mô hạt. vừa sát khít bên dưới sẹo và tách rời ngay sau đó. Kết quả cuối
cùng là tái sinh đầy bề mặt ngoại bì mà ở đó mô sẹo được lót ở bên dưới.
1.3.5.2 Sản xuất sản phẩm và vật liệu sinh học [6]
Thu nhận collagen
Ở Nhật, người ta đã thu hồi sinh khối collagen từ nguyên bào sợi người. Collagen
này có ưu điểm là không gây dị ứng. Nguyên bào sợi được nuôi cấy trên vật liệu đặc
biệt để sản xuất sinh khối, chất nền là giàn giáo để nguyên bào sợi bám và phát triển
trong cấu trúc không gian ba chiều.
Sản xuất interferon và vaccine

30
Thử nghiệm dùng nguyên bào sợi để sản xuất interferon: mục đích của việc này là
để phân lập và nắm được đặc tính của dòng tế bào lưỡng bội mới, thích hợp cho việc
sản xuất interferon với số lượng lớn.
Thu nhận chất nền ngoại bào (ECM)
Thu nhận chất nền ngoại bào từ nguyên bào sợi được ứng dụng trong kĩ thuật nuôi
cấy tế bào trên màng thấm. Màng bổ sung chất nền ngoại bào để cải tiến hệ thống nuôi
cấy in vitro bằng cách cung cấp cho tế bào các thành phần vi môi trường.
Tạo lớp tế bào nền (feeder) trong nuôi cấy tế bào gốc
Nguyên bào sợi sản xuất một loạt các yếu tố cần thiết và thành phần chất nền ngoại
bào cần cho sự sinh trưởng và tăng sinh của các loại tế bào khác nhau.
Tạo da nhân tạo
Nguyên bào sợi là tế bào trung mô có tính năng liên lạc với hầu hết vật liệu trong
cơ thể. Nguyên bào sợi của động vật có vú được sử dụng trong nghiên cứu này. Sự
bám dính, tương tác của các tế bào có tính tương hợp và an toàn sinh học cao. Chúng
được ứng dụng làm vật liệu sinh học, không gây phản ứng phụ hay nguy hiểm nào đối
với bệnh nhân.
1.4 Sơ lược về cây sống đời (Kalachoe pinata)
1.4.1 Nguồn gốc, phân bố và danh pháp cây sống đời
Cây sống đời hay cây thuốc bỏng danh pháp có 2 loài là Kalanchoe pinnata, và
syn. Bryophyllum calycinum, Bryophyllum pinnatum, là loài cây bản địa của
Madagascar. Cây sống đời có khả năng sinh sản sinh dưỡng bằng lá rất tốt, đây cũng là
đặc điểm chung của nhóm Bryophyllum thuộc chi Kalanchoe. Cây sống đời được nhiều
người dân nước ta trồng làm kiểng vì có hoa màu sắc đẹp, dễ trồng, vừa dùng làm
thuốc chữa bệnh cho gia đình. Cây được trồng và mọc tự nhiên tại nhiều vùng thuộc
Châu Á, Thái Bình Dương và Caribe. Cây có rất nhiều công dụng tuy nhiên nổi bật
nhất là khả năng chữa lành vết thương của cây. Cây sống đời thuộc:

31
Phân loại khoa học
Giới (regnum) Plantae
Bộ (ordo) Saxifragales
Họ (familia) Crassulaceae
Chi (genus) Kalanchoe
Đoạn (section) Bryophyllum
Loài (species) K. pinnata
Hình 1.4.1 Cây sống đời
1.4.2 Đặc điểm hình thái [24]
Cây sống đời là loài thảo mộc thân nhẵn, cao từ 0,3 – 1,2m.
- Thân cây: tròn, nhẵn, mọng nước, có đốm tía.
- Lá: mọc đôi, chéo chữ thập, các lá ở tầng thấp thường có kích thước từ 6 –
12cm, những lá ở tầng cao có kích thước từ 3 – 5 cm. Lá hình trứng hoặc
hình elip, mọc đơn hoặc gồm 3 – 4 lá chét dầy; mép lá khía răng cưa tròn.
Đặc biệt cây sống đời còn có khả năng tạo cây non từ kẽ lá của các khía của
mép lá.

32
- Hoa: Hoa màu đỏ hay vàng cam, rủ xuống trên một cán dài ở ngọn thân hay
ở lá bên cạnh.
- Quả: được bao bọc bởi búp hoa phía ngoài.
- Hạt: nhỏ, trơn nhẵn, thuôn dài hoặc có hình elip.
1.4.3 Công dụng của cây sống đời
1.4.3.1 Công dụng của cây sống đời trên thế giới [24]
Bảng 1.4.3.1 Công dụng chữa bệnh của cây sống đời
Công dụng dân gian trên thế giới
Brazil
chữa áp- xe, viêm họng, viêm khớp, mụn nhọt, viêm phế quản,
chữa bỏng, vết chai, vết côn trùng đốt, các vấn đề về đường
ruột, ngứa, sỏi thận, rối loạn bạch huyết, căng thẳng, nhiễm
trùng đường hô hấp, đau răng, bệnh lao, ung thư, viêm loét,
suy tiết niệu và đóng vai trò như một thuốc an thần.
Ecuador vết bầm tím, gãy xương
Guatemala nhức mỏi, tiêu chảy, đau, vấn đề về da
Ấn Độ
mụn nhọt, vết bầm tím, bệnh tả, bệnh tiểu đường, tiêu chảy,
kiết lỵ, đầy hơi, đau đầu, sỏi thận, côn trùng cắn, ghẻ, lở loét,
suy tiết niệu, làm lành vết thương.
Mexico
nhiễm trùng mắt, đau đầu, viêm nhiễm, rối loạn kinh nguyệt,
mụn nhọt, làm lành vết thương.
Nicaragua
đau nhức, bỏng, cảm lạnh, ho, sốt, nhức đầu, nhiễm trùng
đường hô hấp.
Nam Mỹ hen suyễn, cảm lạnh, đau tai, đau đầu, loét, các khối u.
Mỹ thủy đậu, sốt, đau bụng.
Việt Nam kháng khuẩn và kháng viêm.
Các vùng khác
viêm khớp, hen suyễn, vết bầm tím, bỏng, táo bón, tiểu đường,
đau tai, đau đầu, suy dinh dưỡng, đau nửa đầu, viêm thận, tê
liệt, viêm đường hô hấp, bệnh thấp khớp, bong gân, sưng, loét,
ói ra máu, chữa lành vết thương.
1.4.3.2 Giới thiệu một số bài thuốc dùng lá cây sống đời ở nước ta
- Mất ngủ: Chiều và tối ăn mỗi lần 8 lá sống đời, giấc ngủ sẽ đến sớm.

33
- Viêm xoang mũi: Giã nát 2 lá sống đời, lấy nước thấm vào bông, nút hố mũi
bên viêm. Ngày làm 4-5 lần. Nếu viêm cả 2 bên thì sáng nút một bên chiều
nút một bên.
- Trĩ nội: Mỗi ngày dùng 10 lá sống đời (sáng 4 lá, chiều 4 lá, tối 2 lá) nhai
nuốt bớt nước, bã bỏ vào gạc vải, đắp lên hậu môn. Trước khi đắp thuốc phải
làm vệ sinh hậu môn bằng nước pha muối. Sau 20-45 ngày sẽ khỏi.
- Kiết lỵ (viêm đại tràng): Mỗi ngày ăn 20 lá sống đời (sáng 8 lá, chiều 8 lá,
tối 4 lá). Trẻ 5-10 tuổi dùng liều bằng nửa người lớn. Ăn 5 ngày là khỏi.
1.4.4 Thành phần hóa học trong cây sống đời [24, 25, 26, 27]
Bảng 1.4.4 Các hợp chất hữu cơ trong cây sống đời
Lá cây
 P-coumaric acid, Ferulic acid, Syringic acid, Caffeic acid, citric
acid, isocitric acid, malic acid, P-hydroxybenzoic acid.
 Flavnoids như quercetin, kaem pferol.
 Quercetin-3-diarabinoside, Kaempferol-3-glucoside, Quercetin-3-
L-rhamnosido-L-arabino furanoside.
 η-hentricontane, η-tritriacontane.
 Sitosterol
 Hai dẫn xuất phenanthrene tương đồng: 2 (9-decenyl)
phenanthrene (I) và 2 (undecenyl) phenanthrene (II).
 Năm dẫn xuất Bufadienolide: Bryophyllin B, Bryophyllol,
Bryophollone, Bryophollenone, Bryophynol.
Đỉnh ngọn
 18 oleanane α
 ψ-taraxasterol
 Alpha và β-amyrins và các acetate của chúng.
 24 epiclerosterol [24 (R) stigmasta-5, 2-dien-3 β-oi]; 24 (R) 5 α-
stigmasta-7, 25-dien-3 β-oi; 5 α-stigmast-24-en-3 β-oi; 25-methyl-
5-α stigmast-24-en-3 β-oi và 25-methyl-5α-ergost-24 (28)-en-3 β –
oi.
 Axit glutamic, methionine, phenylalanine và tryrosine.

34
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP

Khóa luận tốt nghiệp1

Recommandé

Recommandé

Contenu connexe

Tendances

Tendances (20)

En vedette

En vedette (11)

Similaire à Khóa luận tốt nghiệp1

Similaire à Khóa luận tốt nghiệp1 (20)

Dernier

Dernier (20)

Khóa luận tốt nghiệp1