Simplified flow cytometric immunophenotyping panel for multiple myeloma, CD56/CD19/CD138(CD38)/CD 45, to differentiate neoplastic myeloma cells from reactive plasma cells

1. Jurnal Hematologi I
Simplified flow cytometric
immunophenotyping panel
for multiple myeloma, CD56/CD19/
CD138(CD38)/CD 45,
to differentiate neoplastic myeloma cells
from reactive plasma cells
Tae-­‐dong
Jeong,Chan-­‐Jeong
Park,
Hyoeun
Shim,
Seongsoo
Jang,
et
al
Korean
Journal
of
hematology
2012;47:260-­‐266
Verna B / Paulus B. N
Senin,16 September 2013
1

2. Pendahuluan
Mieloma multipel ( MM ) : neoplasma klonal sel B -->
hasil akumulasi dari sel plasma neoplastik di sumsum
tulang ( BM )
Mayoritas kasus MM memproduksi protein monoklonal :
paraprotein abnormal
Diagnosis MM = adanya sel plasma neoplastik di BM ,
terdeteksinya protein monoklonal di darah atau urine.
2

3. ....Pendahuluan
Mayoritas sel plasma pada penderita MM:
- sel mieloma neoplastik,
- sel plasma normal atau reaktif : % sedikit
--> dimana bertanggung jawab untuk menjaga
fungsi sistem imun.
Flowsitometri ( FCM) : dasar dari imunofenotipe, telah
menjadi alat diagnostik utama untuk membedakan sel
plasma neoplastik dengan sel plasma reaktif secara
laboratoris
3

4. ....Pendahuluan
Penelitian sebelumnya : Antigen pada sel plasma
diekspresikan secara bervariasi --> CD19, CD20,
CD27, CD33, CD38, CD45, CD56,CD117 dan CD
138
Profil immunophenotypic : sel plasma neoplastik
dan sel plasma reaktif berbeda
4

5. ....Pendahuluan
Sel plasma
reaktif
Sel plasma
neoplastik
Forward / Side Scatter (FSC/
SCC) rendah ;
CD 19 +/CD 56-
CD 38: ekspresi tinggi
FSC/SCC tinggi ;
CD 19 - / CD 56 +
CD 38: ekspresi relatif rendah
5

6. ....Pendahuluan
• The European Myeloma Network (EMN)
merekomendasikan penggunaan antigen yang
paling berguna untuk mendeteksi plasma sel
aberrant di MM
• Rekomendasi terdiri dari 3 klasifikasi :
1. “ essential “ : CD19 dan CD 56
2. “ recommended “ : CD117, CD20, CD28, CD27
3. “suggested “ : CD 81 dan CD 200
diagnosis dan monitoring
6

7. Tujuan
PeneliGan
• Mengevaluasi panel yang disederhanakan
dari CD 56 / CD19/ CD138( CD38 ) /
CD45 untuk menganalisis mieloma
multiple.
7

8. Bahan
dan
Metode
• Jumlah sampel : 70 penderita
- 62 penderita yang baru terdiagnosis MM
( blm diterapi )
- 8 penderita telah dilakukan analisis BM, sebagai
pemantauan terapi MM.
• April 2010 – Juli 2011
• Diagnosis MM berdasarkan klasifikasi WHO
• Penelitian ini disetujui oleh Asan medical center dan
semua penderita dilakukan informed concent sebelum
pengambilan spesimen BM
8

9. 9
FCM
immunophenotyping
• FCM
immunophenotyping secara multiparameter
menggunakan antibodi monoklonal terhadap
CD56, CD19, CD138 (CD38), dan CD45.
Cuci dgn
Phosphate –
Buffered Saline
( PBS )
Aspirat BM +
EDTA
Resuspensi dalam
PBS + 1 % serum
bovin albumin
WBC 1-2 x 10 6/mL

10. 10
....
FCM immunophenotyping
10
μl
Anti CD 138
dikonjugasi dgn PerCP
Anti CD 19
dikonjugasi dgn PE
Anti CD 56
dikonjugasi dgn FITC
100 µl BM yg
telah dicuci,
vortek 3 dtk
Anti CD 38
dikonjugasi dgn PerCP
Anti CD 45
dikonjugasi dgn APC
Inkubasi selama
25 menit , suhu
kamar, di ruang
gelap
+ Lysis Solution,
vortek segera 10
menit, inkubasi 10
menit, di ruang
gelap
Cuci dgn PBS, sel
difiksasi dgn +
500 µl PBS
formaldehyde 1%

11. ....
FCM immunophenotyping
• Didapatkan
50.000
sel
berinG
dan
analisis
dengan
menggunakan
FACS
Canto
II
flowsitometri
(BD
Bioscience,
San
Jose,
CA,
USA)
• Sel
plasma
awalnya
diidenGfikasi
CD138
dan
side
sca4er,
kemudian
sel
di
gated
dgn
CD138
+
dan
dianalisis
untuk
CD56,
CD19,
dan
CD45
11

12. Fig 1.Typical laboratory protocol for distinguishing neoplastic plasma cells
(CD56+or-/CD19-/CD138+/CD45-) from reactive plasma cells (CD56-/
CD19+/CD138+/CD45+) in patients with multiple myeloma.
12

13. ....
FCM immunophenotyping
• Kasus
CD
138
-­‐,
BM
dilabel
kembali
dengan
panel
CD
56/CD
19
/
CD38/
CD
45.
• Sel
plasma
di
ga6ng
menggunakan
CD
38
dan
side
sca4er.
• Sel
CD
38
+
dengan
low
side
sca4er
dilakukan
ga6ng
ulang
untuk
hasil
ekspresi
CD
45
negaGf
atau
intermediate
13

14. 14
Fig.2 Flow cytometric immunophenotyping of 2 cases (A and B) with CD138-negative
neoplastic plasma cells.Plasma cell were gated with CD38+ and low side scatter,
followed by selectionof CD 45-dim(A) and CD45-negative(B)cells. In both cases ( A and
B), neoplastic plasma cell showed CD 19- and CD 56+ expression( A,dim and B,
intermediate )

15. 15
• Definisi :
- CD 138 : deteksi sel neoplastik dan reaktif
- Sel plasma neoplastik : CD 138+ / CD56 - atau + / CD
19 - / CD 45 - Sel plasma reaktif : CD 138 +/ CD 56 - / CD 19 + / CD
45+
• Komponen monoklonal serum ( Komponen M )
- Konfirmasi protein monoklonal --> elektroforesis
protein
- Persentase dari protein monoklonal diukur dgn
densitometer
- Konsentrasi absolut dari protein monoklonal dihitung
dgn total konsentrasi protein serum

16. Analisis
staGsGk
• Data kontinu : mean ± SD dan dibandingkan dengan
tes Mann-Whitney U .
• Data kategori : tes Fischer’s exact
• Analisis korelasi : identifikasi kuatnya hubungan
antara komponen monoklonal dan fraksi sel plasma
neoplastik atau proporsi sel berinti dari BM seperti yg
telah ditentukan oleh flowsitometri.
• Semua analisis : SPSS 18.0 , P< 0.05 = signifikan
16

17. Hasil
17
Table 1. Patient Demographics

18. Table 2. Comparison of overall positive expression rates for
CD56, CD19, CD138, and CD45 in neoplastic myeloma cells
between the untreated and treated patients.
18

19. 19
Table 3. Clinical and laboratory characteristics of
2 cases with CD138-negative neoplastic plasma cells
according to FCM immunophenotyping.

20. Table 4. Comparison of the proportion of neoplastic
plasma cells between the untreated and treated
patients.
20

21. Fig 3. Comparison of the monoclonal immunoglobulin component
(M-component) and the tumor burden of neoplastic plasma cells
(PCs) in bone marrow (BM) aspirates according to flow cytometry
(FCM).
21
(A) A weak positive correlation (r=0.15) was noted between the fraction of neoplastic PCs according to FCM and the M-component,
but this was not statistical significant (P=0.245). (B) The proportion of neoplastic PCs in BM aspirates, i.e., fraction of neoplastic
PCs according to FCM×percentage of PCs among the total number of nucleated cells in the BM aspirates according to differential
cell count, showed a statistically significant positive correlation with the M-component (r=0.26, P=0.045).

22. Diskusi
• Sel plasma neoplastik sebelumnya telah diidentifikasi
sesuai dengan CD38 + + / CD45- atau ekspresi dim.
• CD 38 :
- petanda non-spesifik untuk sel plasma --> memiliki
distribusi yang luas , ditampilkan pada permukaan sel
hematopoietik dan nonhematopoietik.
- sebagian besar ekspresi pada sel limfosit B dan
limfosit T.
• Penelitian sebelumnya: mieloma mengekspresikan CD
45 +
22

23. ...Diskusi
• CD138 :
ü identifikasi awal sel plasma --> hanya sel plasma yg
mengekspresikannya.
ü petanda untuk identifikasi dan isolasi populasi analisis
FCM.
ü Gating CD138 --> identifikasi populasi sel myeloma
lebih homogen daripada gating CD38.
ü digunakan untuk analisis FCM pada kedua kelompok
pasien krn tdk ada perbedaan signifikan secara
imunofenotipe sel myeloma.
23

24. 24
...Diskusi
• Akan tetapi, ada komponen sel plasma yang tidak
mengekspresikan CD 138
• Penelitian ini :
- 68 penderita ( 97.1% ) = CD 138 +
- 2 penderita ( 2.9 % ) = CD 138 - , namun CD38 +
untuk kelompok ini.
ü Tak ada perbedaan profil immunophenotypic
(CD 56+/CD19-/CD45+) antara gating menggunakan
CD 138 dgn CD38 + .

25. ...Diskusi
• EMN : CD 138 saja tidak adekuat sebagai petanda
untuk peng gating primer sel plasma.
• Deteksi simultan kedua CD 138 dan CD 38 digunakan
sebagai rekomendasi --> meningkatkan presisi dan
mengurangi variasi antara pengamat
• Penelitian ini gagal mendeteksi subpopulasi sel
plasma neoplastik dengan gating CD 138 saja
( ekspresi dim sampai negatif ) .
25

26. 26
...Diskusi
• Untuk mendeteksi sel mieloma dgn ekspresi CD 138
dim sampai negatif dapat dianalisis scr terpisah dari
sel dgn CD 138 – dgn dasar ekspresi CD 38.
• Pengating awal menggunakan CD138 diikuti oleh
CD38 :
- hanya untuk sampel ekspresi CD 138 dim
sampai
negatif --> alur kerja yang disederhanakan
untuk
karakterisasi MM

27. 27
...Diskusi
CD 38+/CD56+/CD19
Sel NK
gating ulang sel dgn ekspresi
CD 45 dim sampai negatif -->
eksklusi sel NK

28. ...Diskusi
• Semua kasus MM :
- Antigen tunggal tidak dapat digunakan.
- CD 138 terekspresikan tinggi --> tidak dapat
membedakan sel plasma neoplastik dgn sel plasma
reaktif
- CD 56 terekspresikan terutama sel plasma neoplastik
walaupun tidak di semua kasus
- CD 45 - /CD 45+ terdapat pada populasi sel plasma
neoplastik
- CD 19 --> reaktif sel plasma ; pd sel plasma neoplastik
ekspresi hanya negatif sampai dim
28

29. 29
...Diskusi
• Mahmoud
et
al
:
Penegakkan
ekspresi
CD19
pada
sel
mieloma
manusia
akibat
dari
hambatan
pertumbuhan
dan
mengurangi
tumorigenisitas
.
• PeneliGan
ini
:
-­‐ CD19
Gdak
diekspresikan
dalam
sel
plasma
neoplasGk
-­‐-­‐>
jumlah
penderita
yg
terbatas
-­‐ hilangnya
ekspresi
CD19
dalam
MM
mewakili
sel
myeloma
neoplasGk.
-­‐
CD19
penanda
paling
berguna
untuk
membedakan
sel
plasma
neoplasGk
dari
sel
plasma
reakGf.

30. 30
...Diskusi
• Peran
CD
45
pada
MM
masih
kontroversial
-­‐-­‐>
adanya
ekspresi
yg
berbeda-­‐beda.
• MGUS
=
distribusi
sama
pada
CD
45+
dan
CD
45-­‐
• Persentase
sel
plasma
yg
mengekspresikan
CD
45
pd
penderita
MM
baru
atau
relap
-­‐-­‐>
ekspresi
nya
lbh
rendah
daripada
MGUS
atau
Smoldering
myeloma.
• PeneliGan
ini
:
>>
sel
plasma
neoplasGk
mempunyai
pola
ekspresi
CD
56
-­‐/+
dan
CD
19
-­‐
,
dimana
intensitas
CD
45
bervariasi.
(
negaGf
sampai
bright)

31. 31
...Diskusi
• Sampai
saat
ini,
Gdak
ada
kesimpulan
yang
pasG
bisa
ditarik
mengenai
CD45
ekspresi
pada
pasien
MM,
meskipun
>>
peneliGan
setuju
bahwa
fenoGpe
CD45
-­‐
mewakili
populasi
sel
plasma
neoplasGk.
• CD
45
:
-­‐ Pola
ekspresinya
bervariasi
-­‐ Mempunyai
keterbatasan
-­‐ Dikaitkan
dgn
hasil
klinis
yg
buruk
-­‐ Berguna
untuk
analisis
sel
plasma
dgn
FCM

32. 32
...Diskusi
• Restriksi
sitoplasmik
imunoglobulin
rantai
ringan
terjadi
akibat
proliferasi
sel
plasma
neoplasGk
• Pengukuran
sitoplasmik
imunoglobulin
rantai
ringan
dgn
FCM
dapat
menunjukkan
pola
restriksi
-­‐-­‐>
diagnosis
MM.
• M e t o d e
F C M
u n t u k
d e t e k s i
s i t o p l a s m i k
i m u n o g l o b u l i n
r a n t a i
r i n g a n
m e m p u n y a i
keterbatasan

33. ...Diskusi
• Metode
lain
untuk
mengukur
sitoplasmik
rantai
ringan
:
-­‐immunohistochemical
staining,
-­‐immunofixa6on
electrophoresis,
-­‐serum
free
light
chain
assay.
• PeneliGan
ini
:
dilakukan
immunohistochemical
staining
pd
spesimen
BM
untuk
rantai
ringan
kappa
dan
lambda
(data
Gdak
ditampilkan)
untuk
lebih
mendukung
idenGfikasi
sel
plasma
neoplasGk.
33

34. 34
Simpulan
• Panel
ImunofenoGpe
FCM
:
CD56/CD19/CD138
(CD38)
/
CD45,
berguna
untuk
membedakan
sel-­‐sel
myeloma
neoplasGk
dari
sel
plasma
reakGf
pada
saat
diagnosis
dan
selama
pemantauan
penderita
MM
• CD19
merupakan
anGgen
yang
paling
penGng
untuk
mengidenGfikasi
sel
myeloma
neoplasGk
pada
penderita
MM

35. Terimakasih
35

36. •
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
CD
19.ppt
CD138.ppt
CD56_natural
killer
cell.ppt
Consensus
internaGonal
myeloma
(2).ppt
cyyoplasmic
imunoglobulin.ppt
enforced
cd
19.ppt
EssenGal
monoclonal
gammopathy(
MGUS).ppt
flowsitometri
imunophenotyphing.ppt
imunohistokimia.ppt
MM.ppt
phenotypic
plasma
cell
1.ppt
ReacGve
VS
neoplasGc
plasma
cell.ppt
ImmunofixaGon.pptx
Serum-­‐free
light-­‐chain
measurement.pptx
CD45
expression
by
bone
marrow
plasma
cells
in.pptx
-­‐PRINSIP
PEMERIKSAAN
FLOWCYTOMETRY
PADA
IMUNOPHENOTYPING.ppt
36

37. 37

38. Atypical plasma cell infiltrate with both Russell (cytoplasmic) and
Dutcher (nuclear) bodies.
38

39. 39