偽時系列解析(pseudo-temporal ordering analysis)の研究動向についての資料

1. Single-cell pseudo-temporal ordering
近年の技術動向
報告：鈴木良平

2. 参考文献 (括弧内はソフトウェア/アルゴリズム名)
1. Trapnell, Cole, et al. "The dynamics and regulators of cell fate decisions are revealed by
pseudotemporal ordering of single cells." Nat. biotechnol. 32.4 (2014): 381-386. (Monocle 1)
2. Marco, Eugenio, et al. "Bifurcation analysis of single-cell gene expression data reveals
epigenetic landscape." PNAS 111.52 (2014): E5643-E5650. (SCUBA)
3. Setty, Manu, et al. "Wishbone identifies bifurcating developmental trajectories from
single-cell data." Nat. biotechnol. 34.6 (2016): 637. (Wishbone)
4. Haghverdi, Laleh, et al. "Diffusion pseudotime robustly reconstructs lineage branching."
Nat. methods (2016): 041384. (DPT)
5. Qiu, Xiaojie, et al. "Reversed graph embedding resolves complex single-cell trajectories."
Nat. methods (2017). (Monocle 2, RGE)

3. Single-cell biology
組織中の細胞ごとの表現型の
違いを捉える実験・分析手法．
IHC, FACSなどlow-throughput
↔ オミックス（バルク分析）
目的となる知見
• 組織内の遺伝型多様性, 変異
• 同種細胞間の表現型多様性
• 異種細胞の組織内空間分布
(Navin et al., 2011: breast cancer CNV)
• 細胞種同士の分化関係
Junker, Jan Philipp, and Alexander van Oudenaarden. "Every cell is special: genome-wide
studies add a new dimension to single-cell biology." Cell 157.1 (2014): 8-11.
→ High-throughput＋single-cellへ

4. Single-cell transcriptome
Single-cell real-time PCR
• Guo et al., 2010: マウス胚500細胞48遺伝子の発現量測定
→ PCAを用いて3胚葉への早期分化マーカーを特定
• 同時に計測できるのは数十遺伝子程度が限界
scRNA-seq
• 細胞ごとにゲノムワイドなトランスクリプトームを計測する
• 逆転写時に各細胞でユニークなバーコード配列を結合，シーケンス後にどの細胞
由来のリードか区別 (Hashimshony et al., 2012; Islam et al., 2011)
※single-cell mass-cytometry (プロテオーム)
• 様々なタンパク質に重金属修飾抗体を結合, ToF質量分析で同時定量

5. scRNA-seqの技術発展
Svensson, Valentine, Roser Vento-Tormo, and Sarah A. Teichmann. "Exponential
scaling of single-cell RNA-seq in the last decade.", arXiv:1704.01379 [q-bio.GN]
実験あたりシーケンス細胞数
• 2011年ごろ〜100個程度
• 2017年現在100万個が視野に
※数百〜数万細胞での実験が典型的
バーコード手法の進化
• STRT-seq (Islam et al., 2011)
細胞ごとにチューブに分離
• Drop-seq (Macosko et al., 2015)
ユニークプライマー入り液滴に細胞分離
• Combinatorial index (Cao et al., 2017)
バーコード配列のin situ逆転写を繰り返す

6. Tissue homeostasis and development
組織内には様々な分化段階の細胞が恒常的な割合で共存している
→「ある時点に組織に含まれる細胞集団には、
ひとつひとつの細胞が辿る各瞬間の状態に
対応した姿の細胞が含まれている」(仮定)
cf. エルゴード性 (ergodicity）
≡アンサンブル(集団)平均と時間平均が等しい
一時点での組織のsingle cell解析により、
組織内の細胞分化ダイナミクスが分かる！
リンパ系，造血系など

7. Pseudo-temporal ordering (PT, 偽時系列解析)
入力
• single-cell methodで得られたデータ (e.g., scRNA-seq, mass cytometry, Hi-C)
出力
• 各細胞の時間的順序 (または代表的な時系列)
• 分岐(bifurcation)パターンとその位置の特定
入力例：高次元発現プロファイル
細胞
細胞
低次元空間にマッピング
(手法による)

8. PTの基本的なアイデア
仮定
• 分化に伴い表現型は連続的に変化する
→ 時間的に近い細胞は高次元空間内で近接
• 組織中には分化経路上のあらゆる段階の細胞が
まんべんなく存在している
アプローチ
• 細胞の高次元空間中での分布を調べる
• 列をなしていれば、それが時系列変化
• 枝分かれがあれば、それが分岐的分化
Furusawa, Chikara, and Kunihiko Kaneko. "A dynamical-systems
view of stem cell biology." Science 338.6104 (2012): 215-217.

9. 近年のPT研究の発展
2011〜2013年ごろ
• 各種single-cell技術が登場 (real-time PCR, scRNA-seq, mass cytometry)
2014年 (pseudo-temporal analysis黎明)
• Wanderlust, Monocle, SCUBA
→ 複数時刻でサンプリングしたデータが主な対象．単純な次元削減＋グラフ解析
2016年
• Wishbone, TSCAN, DPT
→ ~万クラスの細胞数＋ゲノムワイドデータへの対応
2017年
• RGE (Monocle 2)

10. PTアルゴリズムの比較軸
入力データの複雑さ
• 数十次元 (mass cytometry向け) 〜 超高次元 (genome wide)
次元削減・データ表現の方法
• 高次元データからどうやって低次元構造を抽出するか (PCA, ICA, diffusion mapなど)
分岐検出
• 非対応, 2分岐のみ, 多分岐対応
生物学的事前知識・教師データの利用
• マーカー遺伝子, 分岐数などの情報
他、真の複数時刻測定に対して分岐解析を行う機能を持つもの(SCUBA)など

11. 主なPT手法 (2014年以降のpublication)
https://github.com/agitter/single-cell-pseudotime
Monocle / Monocle 2 (Census) / Wanderlust / Cycler / Wishbone / SCUBA / DPT /
Oscope / Diffusion maps / destiny / DeLorean / Waterfall / Embeddr / GP-LVM /
pseudogp / GP-LVM / SLICER / TSCAN / SCOUP / Topslam / Ouija / Slingshot /
Gpfates / SCIMITAR / WaveCrest / LEAP / CellTree / Bayesian hierarchical mixture
of factor analysers (MFA) / Mpath / SCORPIUS / SCODE / switchde / MAGIC /
PHATE / SOMSC / TASIC / FORKS / UNCURL / reCAT / PhenoPath / Branched
Gaussian processes / Branch-recombinant Gaussian Processes / MATCHER /
SoptSC / Di-SNE / Population Balance Analysis / Scanpy / etc.
得意とする細胞数や遺伝子数，生物学的プロセスが違う（あと、論文書きやすいのではないだろうか…）

12. Monocle [Trapnell et al., 2014]
特徴 ベンチマーク標準．広く使われている
戦略 次元削減(独立成分分析)＋スパイン検出 (最小全域木)
評価 ヒト筋芽細胞の分化を複数時刻でscRNA-seq
→ 既知マーカー再現＋新転写因子提案
長所 多遺伝子データセットに適用可能
短所 数百細胞程度までしか安定動作しない
分岐数はマニュアル指定
https://bioconductor.org/packages/release/bioc/html/monocle.html

13. Monocle - 独立成分分析 (FastICA)
PCAに似た目的の処理
正規分布(ガウス性)を仮定しない
• 混合モデル
• 分離モデル
Wを最適化してuの独立性を最大化
※独立性≡KLダイバージェンス
観測データ
分離信号
FastICA: xを白色化して|W|=1の直交行列に限定
https://www.slideshare.net/sfchaos/numpy-scipy-9039097

14. Monocle - スパイン検出
最小全域木 (MST)
• 全細胞を含む最小のネットワーク
• 一番長く取れる経路＝スパイン
順序付け＆分岐検出 (PQ-tree)
• スパインに沿って順序付け
• スパイン上の同じ細胞から伸びた
枝どうしは順不同
• 上の制約を満たしつつ
全距離最小の全順序を
偽時系列として出力
• 分岐は指定回数だけ
スパインの次に長い経路を取る

15. SCUBA [Marco et al., 2014]
特徴 実時系列single-cellデータの分岐階層分析が主機能．
戦略 次元削減(t-SNE)＋主経路検出 (principal curve analysis)
評価 B細胞分化のmass cytometry (2万細胞)
→ 偽時系列のCD群増減が既知の振る舞いと一致
長所 シンプルな実装, 多細胞データへの対応
短所 分岐検出は不完全
https://github.com/gcyuan/SCUBA

16. SCUBA – principal curve
Hastie, Trevor, and Werner Stuetzle. "Principal curves." Journal of the
American Statistical Association 84.406 (1989): 502-516.
離散的なデータについては折れ線を作る．
各頂点 xi について、
• V = {xiの近傍のデータ点 yj} として
• xi = E[yj ∈ V]
を満たすような折れ線がprincipal curve．
実際は反復的最適化で計算する．

17. Wishbone [Setty et al., 2016]
特徴 二又分岐に特化，mass cytometryが主なターゲット
戦略 次元削減 (diffusion map) + 最短路ベース経路 (kNN-graph)
評価 マウス胸腺 CD4+/CD8+分化 (23万細胞, 表面マーカmass cytometry)
→ DN,DP,SPの分化経路を多CDで正しく再現
長所 高精度な分岐判定
短所 高次元データには対応しない
scRNA-seqではマーカー選択が必須
http://www.c2b2.columbia.edu/danapeerlab/html/wishbone.html

18. Wishbone – diffusion maps
Coifman, Ronald R., and Stéphane Lafon. "Diffusion maps." Applied
and computational harmonic analysis 21.1 (2006): 5-30.
要素の類似性にもとづく高次元
データの次元削減手法
1. 集合をグラフ表現
2. ランダムウォークで類似性計算
3. 類似性(遷移)行列を対角化
4. 固有値が大きい固有ベクトルが
粗視化空間を張る

19. Wishbone – kNN-graphによる分岐判定
• 低次元空間内でkNNを結んだネット
ワークを作る
• ランダムに選ばれた複数の細胞それぞ
れ(waypoints)から他の各細胞までの
最短距離を計算
• global trajectoryは近隣のwaypointに
重みを付けてコンセンサスを取る
• Aを開始点, BとCをwaypointとして
d(A,B) < d(A,C)とする
• もしA,B,Cが同じ経路上にあれば
d(A,B) + d(B,C) ≈ d(A, C)

20. DPT [Haghverdi et al., 2016]
特徴 次元圧縮を行わない，密度分析による準安定状態検出
戦略 遷移確率行列をプロファイルに用いる＋シンプルな分岐検出
評価 マウス造血系qPCR (赤血球/内皮分化), ES細胞scRNA-seq
→ 既知の発現パターンを再現
長所 ロバストネス
スケーラビリティ(?)
短所 複雑な分岐パターンには対応しない(?)
diffusion parameterの非自明な調整が必要

21. DPT - アルゴリズム
• 距離行列の構成はWishboneと類似
• 開始細胞からの距離で見た順序と，最遠隔細胞からの距離で見た順序を比較
• もし分岐がなければ常に逆相関する
• 分岐地点では二つの順序が正の相関を示す

22. RGE (Monocle 2) [Qiu et al., 2017]
特徴 反復的戦略，高次元空間内でのprincipal graph (木構造) 生成
戦略 低次元空間での経路予測と高次元空間でのデータ操作を反復
評価 筋芽細胞ゲノムワイドscRNA-seq
→ 分化経路依存の887遺伝子を特定
長所 分岐モデルなど事前知識が不要
短所 ?

23. Reversed graph embedding

24. 今後の課題
• 10万〜細胞×ゲノムワイド入力に対応するスケーラビリティ
• 少数遺伝子変化へのセンシティビティ (cocktail party)
• 細胞分布の偏りに対する頑強性
• 階層的な分岐構造の自動検出
• cell cycleなど分化と無関係なダイナミクスの自動検出
• などなど…