1. UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA
FACULTAD DE INGENIERÍA
E.A.P. INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL
Método de Observación de los
Microorganismos
Técnica de Observación en
Seco
CURSO:
Laboratorio de Microbiología.
DOCENTE:
Blgo. Mblgo. Carlos Azañero Díaz
GRUPO:
“C”
ALUMNA:
Aburto Rodríguez Ruddy
2012

2. TÉCNICA EN SECO 2
I.
OBJETIVO:
Realizar un frotis bacteriano, su fijación y posterior coloración.
Realizar y diferenciar los tipos de coloraciones: simples, compuestas o
diferencial (Gram) y especial.
Observar y diferenciar la morfología individual y de agrupación
bacteriana.
Utilizar y familiarizarse con el correcto empleo del aceite de inmersión
en observaciones al máximo aumento.
II.
FUNDAMENTO TEÓRICO:
MÉTODO DE OBSERVACIÓN DE LOS MICROORGANISMOS
TÉCNICA EN SECO
Coloración simple:
Un colorante; proporciona contraste para observar mejor un organismo
completo
Se tiñe con un colorante básico (azul de metileno, cristal violeta, o fucsina
básica) durante unos 5 minutos. Aclarar brevemente con agua. Se tiñen
casi todas las bacterias; la mayoría de los tejidos no se tiñen.
Coloración compuesta:
Las tinciones diferenciales son aquellas tinciones que se usan para
diferenciar de manera más explícita los microorganismos. Estas tinciones
utilizan los colorantes diferenciales, que se componen de más de una
sustancia tintórea. En algunas técnicas de coloración, las tinciones
diferenciales más importantes que se emplean en bacteriología son las de
Gram y la tinción ácido-resistente. Ambas tinciones se utilizan para
obtener información acerca de la composición de las capas de la pared
celular de las células bacterianas.
ColoraciónGram:
Las células Gram positivas permanecen tenidas, pero las negativas
pierden el colorante. Se tiñe con safranina (contraste). El color violeta de
las Gram positivas se vuelve más oscuro y las Gram negativas se tiñen de
rosa.
MICROBIOLOGÍA

3. TÉCNICA EN SECO 3
Dos o más colorantes; distingue entre bacterias Gram positivas y Gram
negativas
Coloración de esporas:
Tiñe selectivamente las endosporas.
Se cubre la preparación con verde de malaquita y se calienta a emisión
de vapores durante 60 segundos. Se lava con agua durante 30 segundos
y se tiñe con safranina. Las endosporas retienen el color verde; el resto de
la célula toma el color rosa.
Coloración de capsulas:
Revela la presencia de cápsulas .
Se utiliza tinta china o nigrosina para teñir una preparación en fresco del
espécimen. Las partículas de colorante no pueden penetrar en la cápsula,
que se observa como una región clara alrededor de la célula.
III.
MATERIALES Y MÉTODOS:
Para latécnica de observación en seco empleamos los siguientes materiales:
Material biológico:
Suspensionesbacterianas de Bacillus sp, Escherichia coli, staphylococcus
spp.
Cultivo puro bacteriano de Enterobactersp y Klepsianasp.
Láminas montadas de morfología individual y de agrupación, y de
estructura bacterianas.
Alimentos:
Mechero de alcohol
Asa bacteriológica
Pipeta serológica o pipeta Pasteur
Laminas portaobjetos y laminillas cubreobjetos
Microscopio compuesto de luz convencional
Colorantes
MICROBIOLOGÍA

4. TÉCNICA EN SECO 4
IV.
RESULTADOS:
1. Coloración simple:
Muestra:
Preparado :
Coloración:
Aumento : 100x
Descripción:
Bacillussubtilis
Montaje seco
simple
se puede observar
que la muestra se ha teñido color
violeta. Estructurado por cadenas por
filamentos largos; coloreado con azul
de metileno.
Filamentos
largos
2. Coloración compuesta:
Muestra:
Preparado :
Coloración:
Aumento : 100x
Descripción:
Bacillussubtilis
Muestra:
Preparado :
Coloración:
Aumento : 100x
Descripción:
Bacillussp
Montaje seco
compuesta
se puede observar
que la muestra se ha teñido color rojo.
Estructurado
por
cadenas
por
filamentos largos y cadenas de cocos.
Coloreado con tinción de Gram.
Formación
de cadenas
3. Coloración de esporas:
Esporas
Montaje seco
compuesta
se puede observar
que las células vegetativas se tiñen de
rojo y las esporas color terqueza.
Estructurado
por
cadenas
por
filamentos largos. Coloreado con verde
de malaquita.
MICROBIOLOGÍA

5. TÉCNICA EN SECO 5
Bacillussubtilis
Clasificación científica
Reino:
Bacteria
Filo:
Firmicutes
Clase:
Bacilli
Orden:
Bacillales
Familia:
Bacillaceae
Género:
Bacillus
Especie:
B. subtilis
4. Coloración de capsula:
Muestra:
Preparado :
Coloración:
Aumento : 100x
Descripción:
Klepsiellasp
Montaje seco
compuesta
se puede observar
que las células vegetativas se tiñen de
marrón y las cápsulas no se colorean.
Teñido con rojo Congo.
Agrupación
de cápsulas
Klebsiellasp
Clasificación científica
Dominio:
Bacteria
Filo:
Proteobacteria
Clase:
Gammaproteobacteria
Orden:
Enterobacteriales
Familia:
Enterobacteriaceae
Género:
Klebsiellasp
MICROBIOLOGÍA

6. TÉCNICA EN SECO 6
5. Muestras puras:
Bacillussp:
Muestra:
Preparado :
Coloración:
Aumento : 100x
Descripción:
Bacillussubtilis
Montaje seco
simple
Agrupación
formado por cadenas de color azul.
Muestra pura.
Cadenas de
Bacillus
Escherichiacoli:
Muestra:
Preparado :
Coloración:
Aumento : 100x
Descripción:
Escherichiacoli
Montaje seco
compuesta
se puede observar
que la muestra se ha teñido color rojo.
Estructurado por cocos rojos.Muestra
pura.
Agrupación
de E.coli
Escherichiacoli
Clasificación científica
Reino:
Bacteria
Filo:
Proteobacteria
Clase:
Gammaproteobacteria
Orden:
Enterobacteriales
Familia:
Enterobacteriaceae
Género:
Escherichia
Especie:
E. coli
MICROBIOLOGÍA

7. TÉCNICA EN SECO 7
Staphylococcus:
Muestra:
Preparado :
Coloración:
Aumento : 100x
Descripción:
Staphylococcus
Montaje seco
compuesta
agrupación decocos
en forma de manchas color violeta.
Muestra pura.
Agrupación de
Staphylococcus
Staphylococcusaureus
Clasificación científica
Reino:
Bacteria
Filo:
Firmicutes
Clase:
Bacilli
Orden:
Bacillales
Familia:
Staphylococcaceae
Género:
Staphylococcus
Especie:
S. aureus
Esporas:
Muestra:
Preparado :
Coloración:
Aumento : 100x
Descripción:
Bacillussp
Montaje seco
compuesta
esporas
color
terqueza. Estructurado por cadenas
por filamentos largos. Muestra pura.
Esporas
turquesas
MICROBIOLOGÍA

8. TÉCNICA EN SECO 8
Capsulas:
Muestra:
Preparado :
Coloración:
Aumento : 100x
Descripción:
Enterococcussp
Montaje seco
compuesta
se puede observar
que las cápsulas tienen estructura
brillante.
Capsulas
Enterococcus
Clasificación científica
Dominio:
Bacteria
Filo:
Firmicutes
Clase:
Bacilli
Orden:
Lactobacillales
Familia:
Enterococcaceae
Género:
Enterococcus
MICROBIOLOGÍA

9. TÉCNICA EN SECO 9
V.
CONCLUSIÓN:
En la coloración simple se utiliza un solo colorante, por lo que todas las
estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta china, Azul
Metileno de Loeffler).
En la coloración compuesta se utilizan varios colorantes combinados. Las
estructuras celulares se diferencian en función de los diferentes colorantes
que fijan de acuerdo con su propia constitución química.Los ejemplos
clásicos sería la tinción de GRAM o la de Ziehl-Neelsen. BGN y levaduras
en una tinción GRAM.
Las bacterias Gram-positivas (azul, violeta)y Gram-negativas (rojo)
tiñen de forma distinta debido a las diferencias constitutivas en la
estructura de sus paredes celulares.
Finalmente podemos mencionar que a pesar que la bacteria es una
estructura muy pequeña, por medio de la tinción con verde de
malaquita, el cual requirió del calor para la penetración; se pudo
observar la estructura interna de la célula bacteriana, particularmente
las esporas. En este experimento se utilizó una tinción simple debido a
que la misma permite que se coloree toda la célula excepto la espora
que se observa de un tamaño bien aceptable
Están descritos varios métodos para teñir esporas. Quizás el más utilizado
sea el de Wirtz-Conklin o tinción con verde malaquita. Este colorante se
une fuertemente a las esporas gracias a la utilización de calor como
mordiente. La fase de decoloración en este caso se realiza con agua
abundante. Las formas vegetativas pierden el color verde y se tiñen con
el colorante de contraste (fucsina o safranina).
La tinción de cápsula se denomina tinción negativa porque tiñe el fondo
de la preparación y no el microorganismo. Desde el punto de vista
formal no es una tinción propiamente dicha, porque no fija los
microorganismos.
MICROBIOLOGÍA

10. TÉCNICA EN SECO 10
VI.
CUESTIONARIO:
1. ¿Cuál es el propósito de fijar frotis o extensión con calor?
Se denomina frotis a la extensión que se realiza sobre un portaobjetos de
una muestra o cultivo con objeto de separar lo más posible los
microorganismos, ya que si aparecen agrupados en la preparación es
muy difícil obtener una imagen clara y nítida.
2. ¿Cuáles son las características que tiene que tener un frotis
bacteriano que esté bien echo?
Este frotis debe ser posteriormente fijado al vidrio del portaobjetos
para poder aplicar los métodos habituales de tinción que permiten
la observación al microscopio de las bacterias sin que la muestra sea
arrastrada en los sucesivos lavados. La fijación de una extensión
bacteriana hace que las bacterias queden inactivadas y adheridas al
vidrio alterando lo menos posible la morfología y bacteriana y las
posibles agrupaciones de células que pudiera haber.
3. ¿Cuál es la característica que tiene la técnica de Gram en la
identificación de bacterias?
Se trata de una tinción diferencial que distingue entre bacterias con
pared gruesa (gram positivas) y bacterias con pared fina y membrana
externa (gram negativas). La mayoría de las bacterias presentan una de
estas dos morfologías generales.
4. Escriba el nombre de 3 bacterias Gram-positivas y 3 de Gramnegativas.
Gram-positivas:
Bacillus anthracis (produce la enfermedad del carbunco)
Clostridium botulinum (produce botox)
Clostridium tetani(produce tetanos)
Gram-negativas:
Neisseriagonorrhoeae, (produce la gonorrea)
MICROBIOLOGÍA

11. TÉCNICA EN SECO 11
Serratiamarcescens (causa de infecciones nosocomiales y urinarias.)
Rhizobiumleguminosarum (ayuda a las plantas a fijar nitrogeno).
5. Establezca diferencias entre un preparado en fresco y uno
preparado en seco.
Tinción Simplese llama así porque nada más usan un (1) solo colorante,
que puede ser azul de metileno, cristal violeta o carbolfucsina. Con este
tipo de tinción tú vas a poder crear un contraste con el medio donde
estás haciendo el frotis o tinción y vas a poder observar la morfología y
la disposición bacteriana. La importancia está en que es muy fácil de
aplicar.
Tinción Diferenciales aquella donde usas más de un (1) colorante. Con
esta tincióntú vas a poder ver morfología, tamaño, organización de las
bacterias y además categorizar los microorganismos en varios grupos,
según su afinidad con el colorante que tus estas utilizando.
VII.
REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:
Michael T. Madigan, Jhon M. Martinko, Jack Parker; Brock, Biología de
los Microbiología, 11va Edición, Editorial Pearson.
http://www.uphs.upenn.edu/bugdrug/antibiotic_manual/gram.htm
http://es.wikipedia.org/wiki/Escherichia_coli
http://es.wikipedia.org/wiki/Bacillus_subtilis
MICROBIOLOGÍA