1. Cereali “antichi” e Celiachia Norberto Pogna CRA - Unità di Ricerca per la Valorizzazione Qualitativa dei Cereali Roma Ancona, 12 Novembre 2008

3.  EVOLUZIONE DEL GRANO (1) Triticum urartu 50.000 geni T. speltoides 50.000 geni T. turgidum ssp dicoccoides 100.000 geni

4. + WHEAT EVOLUTION - 2 Aegilops tauschii 50.000 geni T . turgidum ssp dicoccoides 100.000 geni T. aestivum ssp spelta 150.000 geni

5. Triticum urartu Triticum monococcum genoma AA , 14 cromosomi genoma AA , 14 cromosomi

6. T. turgidum ssp polonicum T. turgidum ssp durum T . turgidum ssp dicoccoides 100.000 geni, genoma AABB, 28 cromosomi Triticum t. ssp dicoccum “Farro”

7. T. aestivum ssp spelta T. aestivum 150.000 geni, genoma AABBDD, 42 cromosomi

8. LE PRINCIPALI SPECIE DI GRANO BB

9. Grano duro (1) e grano tenero (2, 3) sono le due principali specie di frumento coltivate. Il grano duro ha la spiga aristata mentre il grano tenero può avere la spiga aristata (2) o mutica (3) I FRUMENTI COLTIVATI Queste due specie hanno in comune due caratteri importanti: (i) cariosside nuda rachide spighette (ii) spiga rigida

10. ALTRI FRUMENTI COLTIVATI Tetraploide AABB Kamut ( Ka’moet , ‘anima della terra’) ( Triticum turgidum ssp ?) Tetraploide A u A u GG Triticum timopheevii ( T. urartu x T. speltoides ) Esaploide A u A u A m A m GG Triticum zhukovskyi ( T. monococcum x T. timopheevii )

11. Dalla spiga di questi frumenti si liberano le cariossidi ancora avvolte nelle glume I FRUMENTI COLTIVATI I farri hanno spiga rigida ma cariossidi vestite. Il monococco ha una sola cariosside per spighetta

12. l’evoluzione del grano L’evoluzione dei frumenti è avvenuta in una vasta area che comprende Siria, Libano, Giordania, Palestina e parte dell’ Iran, Turchia, Iraq, Kazakistan e Afganistan (ovale). La cerealicoltura ha avuto probabilmente inizio nel cosiddetto Corridoio Levantino (cerchio). Più ristretta è l’area di evoluzione del grano tenero (sud-ovest del Mar Caspio, cerchio nero) e del suo progenitore Ae. tauschii (area grigia)

13. IL GRANO E LA NASCITA DELL’AGRICOLTURA Nel sito di Halo II a sud del lago Tiberiade (Mar di Galilea) risalente a 23.000 anni fa sono stati trovati resti di grano raccolti da una comunità di raccoglitori-cacciatori. Si tratta di grano monococco e grano dicocco a spiga fragile ( T. monococcum ssp aegilopoides , T. urartu , T. turgidum ssp dicoccoides )

14. IL GRANO E LA NASCITA DELL’AGRICOLTURA Nel sito siriano di Abu Hureyra (freccia blu) lungo la parte centrale dell’Eufrate sono state trovate falci usate nel 9500 a.C. da raccoglitori-cacciatori per mietere il grano. Nel vicino sito di Mureybet e nel sito di Aswad nella Sira meridionale (frecce nere) risalenti al 8300-7500 a.C. sono state trovate evidenze di coltivazione di grano diploide e tetraploide vestito a spiga fragile ( T. monococcum . T. urartu , T. turgidum ssp dicoccoides, T. timopheevii ssp armeniacum ).

15. IL GRANO E LA NASCITA DELL’AGRICOLTURA Anche nei siti di Netiv Hagdud e a Gerico nella valle del Giordano a nord del mar Morto risalenti al Neolitico preceramico A (8300-7500 a.C.) sono state trovate evidenze di coltivazione di grano diploide e tetraploide a spiga fragile e cariosside vestita.

16. IL GRANO E LA NASCITA DELL’AGRICOLTURA Solo a partire dal 7000 a.C. nel Corridoio Levantino vengono coltivati i frumenti a spiga rigida, frutto della domesticazione ( T. monococcum ssp monococcum , T. turgidum ssp dicoccum, T. timopheevii ssp timopheevii). Per la riproduzione dei frumenti a spiga rigida è necessario l’intervento dell’uomo .

17. I FRUMENTI COLTIVATI Resti di grano duro sono stati trovati a Can Hassan (sito del 5500–4200 a.C., freccia). Tuttavia questo grano è entrato in coltivazione solo nel III sec a.C. in Egitto. Sono state trovate tracce di campi coltivati a grano tenero risalenti al 3700 a.C. Tuttavia questo grano ha avuto un ruolo molto marginale in agricoltura fino a 500-600 anni fa.

18. IL GRANO E LA NASCITA DELL’AGRICOLTURA L’agricoltura ed il grano si sono diffusi nell’area mediterraanea a partire dal Corridoio Levantino. Nel 6500 a.C. il grano era presente in tutti i paesi del mediterraneo settentrionale, nel 6000 a.C. in tutta l’Europa continentale, isole escluse.

19. La dieta dell’uomo mediterraneo Grano monococco Mezzaluna Fertile Triticum monococcum (AA) è stato il primo grano coltivato su grandi areali nella regione della Mezzaluna Fertile. Con questo grano i Sumeri producevano pane e 7tipi di birra. Ötzi, l’uomo del Similaun (3350-3100 a.C.), si nutriva di pane di grano monococco, legumi, carne. Legumi Nell’età del bronzo in Europa il monococco era ancora grano prevalente

21. I FRUMENTI COLTIVATI I reperti di Pompei (79 d.C.) e l’opera “ De re rustica ” di Columella (I sec d.C.) dimostrano che in epoca romana si coltivavano i grani vestiti, farro medio soprattutto.

22. Dalle “Giornate” (1579) di Agostino Gallo risulta che in pianura padana nel XVI secolo i farri erano scomparsi e sostituiti dal grano tenero. I FRUMENTI COLTIVATI Dall’opera “ Opus commodorum ruralium ” (1303) di Pier de Crescenzi si evince che farro medio e farro grande (spelta) erano ancora i frumenti più coltivati in epoca rinascimentale. Tu proverai si come sa di sale lo pane altrui, e come è duro calle lo scendere e ‘l salir per l’altrui scale

23. WHEAT HAS A VERY LARGE GENOME Specie No. geni ______________________________________________________________________________________________ Saccaromyces c. 5.800 Drosophila m. 13.601 Arabidopsis thaliana 25.498 Homo sapiens 31.780 – 39.114 Triticum aestivum 150.000

25. Il Glutine è responsabile delle esclusive proprietà viscoelastiche degli impasti di farina di grano , dai quali si ottengono miriadi di prodotti alimentari Le GLIADINE (~50 molecole diverse in ciascuna varietà di grano ) sono proteine monomeriche. Le GLUTENINE sono proteine polimeriche composte da subunità HMW (High Molecular Weight , 3-5 molecule diverse in ciascuna varietà ) e LMW (Low Molecular Weight (16-25 molecule).

26. Le straordinarie proprietà tecnologiche del grano

27. Una singola cariosside di grano contiene da 65 a 80 diverse molecole di prolamine codificate da più di un centinaio di geni raggruppati in 20 loci su 6 cromosomi. La composizione in prolamine di varietà diverse di grano è caratterizzata da un polimorfismo estremamente elevato , che riguarda la presenza/assenza, la sequenza aminoacidica , la quantità o le proprietà chimiche di ciascuna molecola prolaminica. Separazione elettroforetica bidimensionale delle gliadine e delle glutenine estratte da un singolo seme di grano tenero Gliadine Glutenine

28. Le gliadine presenti in una varietà coltivata di grano sono costituite da 40 -50 molecole diverse per dimensione e sequenza. In numero ma non in peso, il grano duro contiene meno gliadine del grano tenero. Separazione bidimensionale di gliadine di grano tenero Grano Grano Grano tenero duro tenero

29. Il polimorfismo allelico per le gliadine è molto elevato. Ad esempio, nelle varietà italiane di grano tenero sono state trovati 25 alleli per le  -gliadine codificate dal cromosoma 6A, 22 alleli per il cromosoma 6B e 19 alleli per il cromosoma 6D.

30. Le subunità gluteniniche HMW e LMW contenute in una singola varietà di grano tenero comprendono una trentina di molecole diverse. Formano polimeri ad alto peso molecolare che danno elasticità al glutine. Struttura di una subunità gluteninica HMW

31.  +  GLIADINE HMW-GS  +  GLIADINE & LMW-GS Localizzazione dei geni che codificano per le proteine del glutine

32. Glu-A1 Gli-A3 Glu-A3 Gli-A1 Gli-A5 Gli-A6 Cromosoma 1A Glu-B1 Glu-B2 Gli-B3 Glu-B4 Glu-B3 Gli-B1 Gli-B5 Cromosoma 1B Glu-D1 Glu-D3 Gli-D1 Gli-D5 Cromosoma 1D Gli-A2 Gli-B2 Gli-D2 Cromosomi 6A , 6B e 6D I 20 loci che codificano per le proteine del glutine

33. Two distinct effects of prolamins in Celiac Disease (CD) Cytotoxic activity The weakly immunogenic  -gliadin epytope P31-43 (FPGQQQPFPPQQ), exerts rapid and strong toxic effects on K562 cells, Caco-2 cells and intestinal epithelium, inducing alteration of cytoskeleton, cell proliferation and apoptosis.

34. Two distinct effects of prolamins in Celiac Disease (CD) Immunogenic activity Several immunodominant epytopes (such as QLQPFPQPQLP, QLQPFPQ, QGSFQPSQQN, PSGQGSFQPSQQ and PQPQLPYPQPQLPY) present in  /  -,  -gliadins and LMW glutenin subunits cause a strong lymphocyte-T activation in almost all celiac patients. In addition, several “minor” epytopes act only in a few celiac individuals.

35. Hulled Wheat Species Triticum monococcum “Grano Monococco” Triticum dicoccum “Farro”

36. PEPTIDI E CELIACHIA Peptide ad attività citotossica: (13-mer) 31-43 L GQQQPFPPQQPY P GQQQPFPPQQPY Peptide ad attività protettiva: 10-mer Q Q P Q D A V Q P F Peptide ad attività immunogenica: 33-mer LQLQPFPQPQLPYPQPQLPYPQPQLPYPQPQPF DQ2- α -I DQ2- α -II DQ2- α -III

37. Gli effetti delle gliadine e del peptide P31-43 sulle cellule Caco-2 sono simili a quelli del fattore di crescita EGF Dopo 10-15 min dalla somministrazione, il digesto peptico-triptico delle gliadine (PTG) e il peptide P31-43 inducono nelle cellule Caco-2 il rearrangiamento dell’ actina, mentre il peptide P56-68 immunogenico e le albumine del latte (PTL) non hanno effetto. ELFID

38. Il peptide 31-43 non modifica più l’actina delle cellule Caco-2 se il recettore del fattore di crescita EGFR viene inattivato per trattamento con l’inibitore ZD1839 o l’anticorpo anti-recettore. ELFID

39. Il peptide P31-43, il digesto PT delle gliadine ed il fattore di crescita EGF non inducono più la proliferazione dei fibroblasti di topo se sono somministrati assieme all’inibitore (ZD 1839) del recettore EGFR ELFID

40. Il peptide P31-43, il digesto PT delle gliadine ed il fattore di crescita EGF inducono la proliferazione dei fibroblasti di topo. ELFID

41. Il fattore EGF marcato con il fluorocromo Alexa 488 si lega al suo recettore e viene internalizzato nel citoplasma delle cellule Caco-2, per essere poi degradato nell’arco di 90 minuti (freccia rossa). La somministrazione del peptide immunogenico P56-68 non altera questo processo (freccia bianca), mentre la somministrazione di P31-43 aumenta la vita del complesso EGF-EGFR (freccia gialla) ELFID

42. La mucosa intestinale di celiaco prolifera vistosamente se viene esposta al digesto di gliadina (PTG) o al P31-43 (frecce blu). Il fenomeno non si osserva se si somministrano questi peptidi insieme con l’anticorpo 528 specifico per il recettore EGFR (frecce nere). L’ albumina di latte (PTL) e il peptide immunogenico P56-68 sono inattivi (frecce bianche). Anche le prolamine di grano monococco sono inattive, salvo quelle della cv Monlis ELFID

43. CONCLUSIONI PROLAMINE DI GRANO TENERO E PEPTIDE P31-43 INTERFERISCONO CON LA TRASDUZIONE DEL SEGNALE DEL FATTORE DI CRESCITA EGF, STIMOLANDO LA PROLIFERAZIONE DEGLI ENTEROCITI ED ALTERANDO IL LORO DIFFERENZIAMENTO. LE PROLAMINE DI GRANO MONOCOCCO NON HANNO QUESTO EFFETTO LA PROLIFERAZIONE E L’APOPTOSI DEGLI ENTEROCITI INDOTTA DALLE PROLAMINE PRECEDONO (CONDIZIONANO?) L’ATTIVAZIONE DEL MECCANISMO AUTOIMMUNITARIO INOLTRE, IL PEPTIDE P31-43 INDUCE L’APOPTOSI (MORTE PROGRAMMATA) DEGLI ENTEROCITI ATTRAVERSO UN MECCANISMO CHE NON COINVOLGE IL RECETTORE EGFR ELFID

44. Le prolamine estratte dal monococco contengono peptidi separabili mediante cromatografia (C) che agglutinano le cellule K562(S) . Questi peptidi in presenza di altri peptidi “protettivi” di monococco (B), perdono la capacità di agglutinare. Accessione MAC (mg/l) monococco C C+B ________________________ 362 65 - 363 18 - 1331 72 - 1378 21 - 1382 42 -

45. “ Protective” gliadin peptides Durum wheat cv. Adamello was found to contain the  -gliadin peptide QQPQDAVQPF. This 10-mer sequence is able to prevent both cytotoxic and immunogenic activity of wheat prolamins “in vitro”.

46. “ Monococcum” protective peptides in the B fraction are different from the 10-mer QQPQDAVQPF sequence . Amongst the monocccum wheat accessions analysed, cv. Monlis was found to be quite unique in having cytotoxic effects on K562 cells, Caco-2 cells and celiac intestinal mucosa grown in vitro.

47. Prolamins from “monococcum” wheat ( T. monococcum ) and a few “farro” wheat ( T. turgidum ssp dicoccum ) cultivars are not able to induce caspase synthesis Prolamins from common (bread) wheat and spelt wheat ( Triticum aestivum ssp spelta ) given to Caco-2 cells, stimulate the production of caspases, key enzymes in the apoptosis process. In the presence of the 10-mer protective sequence, the spelt prolamins show a reduced effect.

48. Prolamins from common (bread) wheat and spelt wheat given to Caco-2 cells, stimulate the production of NO, which causes actin modification. In the presence of the 10-mer protective sequence, the spelt prolamins show a reduced effect . Prolamins from “monococcum” wheat and a few “farro” wheat cultivars are not able to increase NO production

49. Prolamins from common (bread) wheat and spelt wheat given to Caco-2 cells, increase tTG synthesis Prolamins from “monococcum” wheat and a few “farro” wheat cultivars are not able to increase tTG production. In the presence of the 10-mer protective sequence, the spelt prolamins show a reduced effect .

50. CYTOTOXIC EFFECTS OF HULLED WHEATS ON CACO-2 CELLS Prolamins Neural Red Caspases NO Variation in from uptake production release transepithelial (O.D.) (R.F.U.) (  M) resistance (%) _______________________________________________________________ Control 0.95 7.5 3.3 0 T. monococcum 0.92 8.2 2.9 0 T. dicoccum Prometeo 0.90 9.7 3.8 - 5 Ersa 6 0.65** 24.0** 5.8** -41** T. spelta 0.83** 22.4** 6.0** -53** T. aestivum 0.68** 23.7** 6.1** -58** T. spelta + PP 0.91 12.1* 4.7* -24* ________________________________________________________ PP = protective peptide Significant at * P< 0.05 or ** P< 0.01

51. POLYMORPHISM OF PROLAMINS IN DICOCCUM LANDRACES AND AGGLUTINATION OF K562S CELLS Prolamins Agglutination from of K562S cells _________________________ Control - T. monococcum - T. dicoccum Prometeo - Ersa 6 + T. spelta + T. aestivum + T. spelta + PP - _________________________ α β γ ω 1 2 3 4 5 6 A-PAGE Fractionation of gliadins by A-PAGE and total proteins by SDS-PAGE in dicoccum landraces. (1-3) Prometeo and (4-12) Ersa 6. HMW-GS Albumins + ω -gliadins LMW-GS + α , β , γ -gliadins 7 8 9 10 11 12 SDS-PAGE

52. Zonula occludens protein-1 (ZO-1) of Caco-2 cells show a different response to exposure to prolamins from the wheat genotypes analysed. It returned to its basal state three hours after exposure to prolamins. EFFECTS OF PROLAMINS FROM HULLED WHEATS ON CACO-2 CELLS Microscopic immunofluorescence images of Caco-2cells incubated with ZO-1 antibody. (1) untreated cells and cells exposed to prolamins from (2) spelt wheat, (3) dicoccum wheat Ersa 6 and (4) dicoccum wheat Prometeo. 2 1 2 3 4 Prolamins from spelt wheat (2) and dicoccum landrace Ersa 6 (3) induced ZO-1 disruption in a very short time. Dicoccum landrace Prometeo (4) did not cause any alteration of this protein.

53. Proliferation of four polyclonal T-cell lines (TCL) after stimulation for 72 hours with the tTG-treated digests of prolamins from bread wheat (GPT) or farro wheat landraces. The farro wheat ladraces 55540, 5558 and 5563 exhibited a Stimulation Index (S.I.) as low as 1-2, not significantly different from that of control (medium alone, S.I= 1)

54. Production of interferon Inf-  by four polyclonal T-cell lines from mucosal explants of celiac patients after in vitro stimulation for 48 hours with the tTG-treated digests of prolamins from bread wheat (GPT) or farro wheat landraces. Prolamins from the farro wheat ladraces 55540, 5558 and 5563 caused a very low increase in Inf-  production as compared to untreated (control) T-cells (ctr).

55. The polyclonal antibodies raised against the cytotoxic peptide P31-43 react strongly with several prolamins from bead wheat, durum wheat and farro wheat. No reaction was found with prolamins from corn ( Zea mays ), oats ( Avena sativa ) and monococcum wheat Monococcum

56. DETECTION OF CYTOXIC PEPTIDE P31-43 SDS-PAGE Western Blotting -6.5 KDa -16.5 KDa -25 KDa -32.5 KDa -47.5 KDa - 62 KDa - 83 KDa 1 2 3 4 5 6 1 2 3 4 5 5 4 3 2 1 6 5 4 3 2 1 Native Native PT-Digested PT-Digested The antiserum developed against the P31-43 peptide (sequence FPGQQQPFPPQQP ), an α-gliadin-derived fragment claimed to be very active in driving enterocyte damage, reacted with several HMW glutenin subunits in the SDS-PAGE patterns of dicoccum wheat landraces (lanes 1-5). Immunoreactive bands were also found in the gel region containing LMW-GS and α-, β- and γ-gliadin bands. However, no reaction was observed in the SDS-PAGE patterns of PT-digested prolamins.

57. “ Protective” gliadin peptides Durum wheat cv. Adamello was found to contain the  -gliadin peptide QQPQDAVQPF. This 10-mer sequence is able to prevent both cytotoxic and immunogenic activity of wheat prolamins “in vitro”.

58. An immunoreactive band having an apparent MW of approximately 32 KDa occurred in the immunoblot of PT-digested prolamins from dicoccum landrace L5563 fractionated by SDS-PAGE and exposed to the anti-PP antiserum. A weak immunoreaction against a protein band of similar MW was also observed in PT-digested prolamins from landraces Prometeo and Ersa 8 . DETECTION OF PROTECTIVE PEPTIDE QQPQDAVQPF Western Blotting 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 6 7 8 9 PT Digested Native SDS-PAGE - 6 KDa - 22 KDa - 64 KDa - 36KDa 9 8 7 6 5 4 3 2 1 11 10 9 8 7 6 5 4 3 2 1 PT Digested Native The arrowhead shows immureactive bands in common wheat cv. FG

59. Il peptide protettivo 10-mer è presente in quantità elevate ma variabili in alcuni legumi come pisello, cece, fava, fagiolo, fagiolo dell’occhio, cicerchia 1: grano tenero, cv. S. Pastore, 2: fagiolo Solfini, 3: fagiolo Salugia, 4: fava, 5: pisello, 6: lenticchia, 7: cicerchia, 8: fagiolo dell’occhio. 1 2 3 4 5 6 7 8 1 2 3 4 5 6 7 8

60. Le proteine di fagiolo svolgono un’azione simile a quella del peptide protettivo 10-mer MAC (mg/L) del digesto PT di prolamine di grano tenero 73 146 292 583 1166 2333 4666 Agglutinazione (%) in presenza di 1,9 g/L di proteine di fagiolo 0 0 0 0 0 0 100 MAC : Minima Concentrazione di digesto PT necessario perché avvenga l’agglutinazione totale delle cellule K562(S) Cellule K562 (S)

61. CONCLUSIONS - Wheat is an heterogeneous group of genotypes with a wide variability in their prolamin composition and, as a consequence, in their effects on the intestinal epithelium. - Prolamins from a few dicoccum landraces were found to lack intestinal cell toxicity and cause very small changes, if any, in ZO-1 localization, intestinal permeability and proliferation of T-cells from mucosal explants of celiac patients. - Monococcum wheat did not show any effects on K562(S), Caco-2 cells or T-cells from celiac patients suggesting that this wheat species is low in prolamin sequences able to trigger lesions in intestinal mucosa. Monocouum cv. Monlis is unique in showing toxic effects. - The 10-mer protective peptide (PP) QQPQDAVQPF occurs in high amounts in several legumes such as bean ( Phaseolus vulgaris), pea (pea), lentils etc. Peptic-tryptic (PT) digests of prolamins from spelt wheat Triticum aestivum ssp . spelta and several landraces of farro wheat T. turgidum ssp. dicoccum are able to agglutinate human myelogenous leukemia K562(S) cells, and exert strong toxic effects on human colon adenocarcinoma Caco-2 cells.

62. Perspectives Dicoccum and monococcum wheat could offer novel dietary opportunity for prevention of celiac disease.

63. Thank you for attention