![4/19Mohamed, Soutenance M2 Pro ACBPI , 6 Septembre 2010
1. Introduction & contexte
Production par l’organisme ou conséquence d’une administration exogène ? (deux publications)
Fin 90’s: Détection urinaires de 17α-Boldénone ou 17β-Boldénone = administration illégale
(Arts et al.,1996): Urine blanches de bovins, 25 % des échantillons testés par GC-MS, traces 17α-Boldénone (0,1 à 2,7 ppb)
DG SANCO Expert Meeting 2003:
[17α-boldénone] > 2 µg.L-1
= échantillon suspect
Réunion de LNR UE 2003: Présence de 17α-Boldénone et 17β-Boldénone dans les fèces
- « La présence de 17α-Boldénone utilisation illégale »
Analyse supplémentaire obligatoire = Confirmation](https://image.slidesharecdn.com/msc2profdefencetalk-130907102745-/85/Development-of-a-method-of-confirmation-by-GC-C-IRMS-to-determine-the-origin-of-the-metabolites-of-boldenone-in-urine-of-cattle-4-320.jpg)
![5/19Mohamed, Soutenance M2 Pro ACBPI , 6 Septembre 2010
1. Introduction & contexte
Recherche d’un critère discrminant :
Métabolites marqueurs : β-boldénone sulfate, 6β-OH-boldénone
[Métabolites] faibles Proche de la limite de détection (appareil)
Alternative (sujet de stage) :
Analyse GC-C-IRMS : grande pureté, quantité suffisante (limite de sensibilité) Méthode de purification
(sujet de stage)
Structure du métabolite
M1 5β-androst-1-en-3,17-dione
M2 5β-androst-1-en-17α-ol-3-one
M3 5α-androst-1-en-17ξ-ol-3-one
M4 5β-androst-1-en-17β-ol-3-one
M5 5ξ-androst-1-en-3ξ-ol-17-one
M6 5α-androst-1-en-3α-ol-17-one
M7 Androst-1,4-diene-3,17-dione
M8 Androst-1,4-dien-17α-ol-3-one
M9 Androst-1,4-dien-17β-ol-3-one
Stéroïdes endogènes: CER, origine naturelle
Boldénone administrée: appauvrissement en 13
C,
origine synthétique
∆ = δ BOLD - δ ENDO ≈ 0 Même origine
Origine ≠∆ = δ BOLD - δ ENDO < - 3 ‰](https://image.slidesharecdn.com/msc2profdefencetalk-130907102745-/85/Development-of-a-method-of-confirmation-by-GC-C-IRMS-to-determine-the-origin-of-the-metabolites-of-boldenone-in-urine-of-cattle-5-320.jpg)
Development of a method of confirmation by GC-C-IRMS to determine the origin of the metabolites of boldenone in urine of cattle
- 1. Développement d’une méthodede confirmation par GC-C-IRMS en vue de déterminer l’origine des métabolites de la boldénone dans l’urine de bovin Mohamed TALBI Encadrant: Emmanuelle BICHON Soutenance M2 Pro ACBPI LABERCA, 6 septembre 2010 Laboratoire d’Etude des Résidus et Contaminants dans les Aliments Ecole Nationale Vétérinaire, Agroalimentaire et de l’Alimentation Nantes Atlantique www.laberca.org – www.saraf-educ.org
- 2. Plan 1. Introduction &contexte 2. Optimisation de la méthode 4. Conclusion & Perspectives 3. Analyse sur un échantillon d’urine réel par GC-C-IRMS
- 3. 3/19Mohamed, Soutenance M2Pro ACBPI , 6 Septembre 2010 1. Introduction & contexte Réglementation: Fin 80’s ,hormones stéroïdes en élevage: interdiction dans UE (directive 96/22/EC) Contrôle, méthodes d’analyses, application de la réglementation (96/23/EC) Hormones stéroïdes synthétiques: Bonne maîtrise d’extraction (sécurité alimentaire, dopage,…), matrices biologiques Mais… Contrôle des hormones stéroïdes « naturelles »: Cas différent, double statut (exogène ou endogène). Cas de la boldénone
- 4. 4/19Mohamed, Soutenance M2Pro ACBPI , 6 Septembre 2010 1. Introduction & contexte Production par l’organisme ou conséquence d’une administration exogène ? (deux publications) Fin 90’s: Détection urinaires de 17α-Boldénone ou 17β-Boldénone = administration illégale (Arts et al.,1996): Urine blanches de bovins, 25 % des échantillons testés par GC-MS, traces 17α-Boldénone (0,1 à 2,7 ppb) DG SANCO Expert Meeting 2003: [17α-boldénone] > 2 µg.L-1 = échantillon suspect Réunion de LNR UE 2003: Présence de 17α-Boldénone et 17β-Boldénone dans les fèces - « La présence de 17α-Boldénone utilisation illégale » Analyse supplémentaire obligatoire = Confirmation
- 5. 5/19Mohamed, Soutenance M2Pro ACBPI , 6 Septembre 2010 1. Introduction & contexte Recherche d’un critère discrminant : Métabolites marqueurs : β-boldénone sulfate, 6β-OH-boldénone [Métabolites] faibles Proche de la limite de détection (appareil) Alternative (sujet de stage) : Analyse GC-C-IRMS : grande pureté, quantité suffisante (limite de sensibilité) Méthode de purification (sujet de stage) Structure du métabolite M1 5β-androst-1-en-3,17-dione M2 5β-androst-1-en-17α-ol-3-one M3 5α-androst-1-en-17ξ-ol-3-one M4 5β-androst-1-en-17β-ol-3-one M5 5ξ-androst-1-en-3ξ-ol-17-one M6 5α-androst-1-en-3α-ol-17-one M7 Androst-1,4-diene-3,17-dione M8 Androst-1,4-dien-17α-ol-3-one M9 Androst-1,4-dien-17β-ol-3-one Stéroïdes endogènes: CER, origine naturelle Boldénone administrée: appauvrissement en 13 C, origine synthétique ∆ = δ BOLD - δ ENDO ≈ 0 Même origine Origine ≠∆ = δ BOLD - δ ENDO < - 3 ‰
- 6. Plan 1. Introduction &contexte 2. Optimisation de la méthode 4. Conclusion et Perspectives 3. Analyse sur un échantillon d’urine réel par GC-C-IRMS
- 7. 7/19Mohamed, Soutenance M2Pro ACBPI , 6 Septembre 2010 2. Optimisation de la méthode
- 8. 8/19Mohamed, Soutenance M2Pro ACBPI , 6 Septembre 2010 2. Optimisation de la méthode 2.2. Optimisation de l’étape sur SPE C18 Matrice URINE Déconjugaison des glucuroconjugués SPE C18 Rinçage:H20 et n-hexane Elution: MeOH/AE (40:60) Extraction liquide/liquide Dissolution du résidu pH 14 Extraction avec le pentane pH 14 Extraction avec l’éther Androgènes « A » Reprendre dans 75 µL d’AE et 100 µL de n-hexane Reprendre et 100 µL SPE SiOH Rinçage:10 mL Hexane/AE (90:10) Elution: 10 mL Hexane/AE (50:50) SP Rinça Hexane Eluti Hexane/A Hexane Evaporer à sec et dissoudre dans le MeOH HPLC N(CH3)2 Collecter six fractions Evaporer à dans AF1 à AF6 HPLC Collecte EF1 HPLC C18 Collecter cinq fractions AF’1 à AF’5 HP Collecter EF’1 Dérivation: acétylation Dérivatio GC-MS injection des fractions G injection GC-C-IRMS mesure isotopique 13 C/12 C δ‰ GC- mesure isoto 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 100,00 rendement M1 Etio DHEA Boldione (M7) M2 17α-T (M8) (M9) 17a-E 6b-OH- BOLD analytes standards SPE C18 sur urine blanche supplémentée SPE C18-1: MeOH/AE(30:70) SPE C18-2:MeOH/AE(40:60) Eau MilliQ vs 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 100,00 M 1 Etiocholanolone D HEA Boldione (M 7) M 4 M 2 17a-Testostérone 17a-boldénone (M 8) 17b-boldénone (M 9) 17a-estradiol 6b-O H -boldénone Rendementen% Choix du mélange MeOH/AE (40:60) MeOH/AE (30:70)
- 9. 9/19Mohamed, Soutenance M2Pro ACBPI , 6 Septembre 2010 2. Optimisation de la méthode 2.3. Optimisation de l’étape LLE LLE sur matriceEau MilliQ vs URINE Déconjugaison des glucuroconjugués SPE C18 Rinçage:H20 et n-hexane Elution: MeOH/AE (40:60) Extraction liquide/liquide Dissolution du résidu pH 14 Extraction avec le pentane pH 14 Extraction avec l’éther Androgènes « A » Estradiol et 6b- OH-boldénone Reprendre dans 75 µL d’AE et 100 µL de n-hexane Reprendre dans 75 µL d’AE et 100 µL de n-hexane SPE SiOH Rinçage:10 mL Hexane/AE (90:10) Elution: 10 mL Hexane/AE (50:50) SPE SiOH Rinçage:10 mL Hexane/AE (90:10) Elution: 10 mL Hexane/AE (50:50) puis Hexane./AE (30:70) Evaporer à sec et dissoudre dans le MeOH HPLC N(CH3)2 Collecter six fractions Evaporer à sec et dissoudre dans le MeOH AF1 à AF6 HPLC N(CH3)2 Collecter six fractions EF1 à EF6 HPLC C18 Collecter cinq fractions AF’1 à AF’5 HPLC C18 Collecter cinq fractions EF’1 à EF’5 Dérivation: acétylation Dérivation: acétylation GC-MS injection des fractions GC-MS injection des fractions GC-C-IRMS mesure isotopique 13C/12C δ‰ GC-C-IRMS mesure isotopique 13C/12C δ‰ 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 100,00 M 1 Etiocholanolone DHEA Boldione (M 7) M 4 M 2 17a-Testostérone 17a-boldénone (M 8) 17b-boldénone (M 9) 17a-estradiol 6b-O H-boldénone F-A3 F-A2 F-A1 F-A1: extraction par pentane F-A2: extraction par pentane F-A3: extraction par éther 0,00 10,00 20,00 30,00 40,00 50,00 60,00 70,00 80,00 90,00 100,00 M 1 E tiochola nolone D H E A B oldione (M 7 ) M 2 17 a-T esto stéro ne 5a -A ndro st-1-en-3 b,17a diol 17 a-bo ld énon e (M 8) 5a -and rosta n-3b ,17 a-d io l 17 b-bo ld énon e (M 9) 17 a-estradiol 6b -O H -B O L D A1 A2 E1 E2 A1: extraction par pentane à pH 14 A2: extraction par éther à pH 14 E1: extraction par éther à pH 5,2 E2:extraction par éther à pH 5,2 pH14
- 10. 10/19Mohamed, Soutenance M2Pro ACBPI , 6 Septembre 2010 2. Optimisation de la méthode 2.4. Optimisation de l’étape sur SPE SiOH Dissolution du résidu pH 14 Extraction avec le pentane pH 14 Extraction avec l’éther Androgènes « A » Estradio OH-boldé Reprendre dans 75 µL d’AE et 100 µL de n-hexane Reprendre dans 75 µL d’AE et 100 µL de n-hexane SPE SiOH Rinçage:10 mL Hexane/AE (90:10) Elution: 10 mL Hexane/AE (50:50) SPE SiOH Rinçage:10 mL Hexane/AE (90:10) Elution: 10 mL Hexane/AE (50:50) puis Hexane./AE (30:70) Evaporer à sec et dissoudre dans le MeOH HPLC N(CH3)2 Collecter six fractions Evaporer à sec et dissoudre dans le MeOH AF1 à AF6 HPLC N(CH3)2 Collecter six fractions EF1 à EF6 HPLC C18 Collecter cinq fractions AF’1 à AF’5 HPLC C18 Collecter cinq fractions EF’1 à EF’5 Dérivation: acétylation Dérivation: acétylation GC-MS injection des fractions GC-MS injection des fractions GC-C-IRMS mesure isotopique 13C/12C δ‰ GC-C-IRMS mesure isotopique 13C/12C δ‰ Polarités: Boldénone ++ Hydroxy-boldénone +++ Méthode initiale: élution avec 11mL Hexane/AE (60:40) pour éluer les «A» Se1(Hex/AE) Se2(Hex/AE) Se3 (Hex/AE) Se4(Hex/AE) Se5 (Hex/AE)Se6(Hex/AE) Se7(Hex/AE) (90/10) (80/20) (70/30) (60/40) (50/50) (40/60) (30/70) M1 Etiocholanolone DHEA Boldione(M7) M2 17α-Testostérone 17α-boldénone(M8) 17β-boldénone(M9) 17α-estradiol 6β-OH-BOLD Profil d’élution: Hexane/AE (50:50) Androgènes Hexane/AE (70:30), Hexane/AE (30:70) Estradiol et 6β-OH-boldénone
- 11. 11/19Mohamed, Soutenance M2Pro ACBPI , 6 Septembre 2010 2. Optimisation de la méthode 2.5. Optimisation de la séparation sur colonne HPLC N(CH3)2 Colonne HPLC semi-préparative N(CH3)2 pour les stéroïdes 0 5 10 15 20 25 mAU 0 20 40 60 80 100 120 140 160 DAD1 A, Sig=250,4 Ref=360,100 (2010-04EH080451.D) 6.515 10.598 16.882 DAD1 B, Sig=200,16 Ref=360,100 (2010-04EH080451.D) 2.519 2.817 4.034 6.002 6.192 6.489 10.611 16.884 DAD1 C, Sig=210,8 Ref=360,100 (2010-04EH080451.D) 2.519 2.813 4.034 6.003 6.192 6.488 10.598 16.887 DAD1 D, Sig=230,16 Ref=360,100 (2010-04EH080451.D) 2.655 2.816 4.034 6.003 6.192 6.503 10.598 16.882 DAD1 E, Sig=280,16 Ref=360,100 (2010-04EH080451.D) 1 2 3 4 7 5 et 6 AF1 AF2 AF3 AF4 AF6AF5 1: M1 2: M2 3: M4 4: Boldione (M7) 5 et 6: 17α-boldénone (M8), 17β-boldénone (M9) 7: 6β-OH-boldénone Idem pour la fraction « EF » Extraction avec pH 1 Extraction av Reprendre dans 75 µL d’AE et 100 µL de n-hexane SPE SiOH Rinçage:10 mL Hexane/AE (90:10) Elution: 10 mL Hexane/AE (50:50) Evaporer à sec et dissoudre dans le MeOH HPLC N(CH3)2 Collecter six fractions AF1 à AF6 HPLC C18 Collecter cinq fractions AF’1 à AF’5 Dérivation: acétylation GC-MS injection des fractions GC-C-IRMS mesure isotopique 13C/12C δ‰
- 12. 12/19Mohamed, Soutenance M2Pro ACBPI , 6 Septembre 2010 2. Optimisation de la méthode 2.6. Optimisation de la séparation sur GC- MS: étude de l’acétylation Dérivation (avec et sans) des métabolites de la boldénone: 21.00 22.00 23.00 24.00 25.00 26.00 27.00 28.00 29.00 30.00 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 Time--> Abundance TIC:04081004.D 17a-boldénoneacétylée 17a-boldénonenative TIC:06081004.D 20.00 21.00 22.00 23.00 24.00 25.00 26.00 27.00 28.00 29.00 30.00 31.00 0 500000 1000000 1500000 2000000 2500000 3000000 3500000 Time--> Abundance TIC:04081008.D 6b-OH-boldénoneacétylé TIC:06081008.D Avec dérivation: Pic plus fin, signal Ex: Boldénone et 6β-OH-boldénone (avant et après acétylation) 6β-OH-boldénone non dérivé pas observé Dérivation obligatoire Hexane/AE (90:10) Elution: 10 mL Hexane/AE (50:50) Evaporer à sec et dissoudre dans le MeOH HPLC N(CH3)2 Collecter six fractions AF1 à AF6 HPLC C18 Collecter cinq fractions AF’1 à AF’5 Dérivation: acétylation GC-MS injection des fractions GC-C-IRMS mesure isotopique 13C/12C δ‰
- 13. 13/19Mohamed, Soutenance M2Pro ACBPI , 6 Septembre 2010 2. Optimisation de la méthode 2.7. Optimisation de la séparation sur colonne HPLC C18 Colonne HPLC semi-préparative C18 pour les métabolites de boldénone: 1: M1 2: M2 3: M4 4: Boldione (M7) 5: 17α-boldénone (M8) 6: 17β-boldénone (M9) 7: 6β-OH-boldénone 0 5 10 15 20 25 30 35 40 mAU 0 100 200 300 400 DAD1 A, Sig=250,4 Ref=360,100 (2010-03EH010433.D) 11.309 15.832 16.594 17.458 21.004 DAD1 B, Sig=200,16 Ref=360,100 (2010-03EH010433.D) 1.268 2.944 12.317 17.459 18.496 21.004 30.100 38.459 DAD1 C, Sig=210,8 Ref=360,100 (2010-03EH010433.D) 1.267 2.497 2.8272.954 12.316 14.584 18.496 21.007 38.455 DAD1 D, Sig=230,16 Ref=360,100 (2010-03EH010433.D) 2.961 11.309 14.584 15.832 16.594 17.458 21.009 38.448 DAD1 E, Sig=280,16 Ref=360,100 (2010-03EH010433.D) 2.513 2.951 4 7 5 6 3 et 2 1 AF’1 AF’2 AF’3 AF’4 Idem pour la fraction « EF » Elution: 10 mL Hexane/AE (50:50) Evaporer à sec et dissoudre dans le MeOH HPLC N(CH3)2 Collecter six fractions AF1 à AF6 HPLC C18 Collecter cinq fractions AF’1 à AF’5 Dérivation: acétylation GC-MS injection des fractions GC-C-IRMS mesure isotopique 13C/12C δ‰ m
- 14. 14/19Mohamed, Soutenance M2Pro ACBPI , 6 Septembre 2010 2. Optimisation de la méthode 2.7. Optimisation de la séparation sur colonne HPLC C18 Intérêt d’une purification sur colonne HPLC C18 semi-préparative: AVANT HPLC C18 APRES HPLC C18 -Identification et évaluation de la pureté des composés en GC-MS - Ex: Echantillon d’urine Analyse par GC-C-IRMS
- 15. Plan 1. Introduction &contexte 2. Optimisation de la méthode 4. Conclusion et perspectives 3. Analyse sur un échantillon d’urine réel par GC-C-IRMS
- 16. 16/19Mohamed, Soutenance M2Pro ACBPI , 6 Septembre 2010 3.1. Précautions analytiques (appareil) Avant analyse: 10 « pulses » CO2 Stabilité: Intensité d’ion 45/44 Constant Écart toléré: 0,5 ‰ Mesure du ratio 13 C/12 C Fraction AF’3 17α-testostérone Urine : 3 jours après administration de boldénone undécylénate 3. Analyse sur un échantillon d’urine par GC-C-IRMS
- 17. 17/19Mohamed, Soutenance M2Pro ACBPI , 6 Septembre 2010 3.3. Résultats finaux DEVIATIONS ISOTOPIQUES OBTENUES APRES CORRECTIONS Valeurs isotopiques corrigées obtenues pour les CER δ (17α-testostérone)= -21,6 ‰ δ (étiocholanolone)= -20,6 ‰ Valeurs isotopiques corrigées obtenues pour les métabolites δ (17α-boldénone)= -32,4 ‰ δ (M4)= - 32,4 ‰ δCER(moyenne)= -21,1 ‰ δBOLD(moyenne)= -32,4 ‰ ∆(CER-BOLD)= -11,3 ‰ Différence significativement < -10 ‰ = NON CONFORME 3. Analyse sur un échantillon d’urine par GC-C-IRMS
- 18. Plan 1. Introduction &contexte 2. Optimisation de la méthode 4. Conclusion et perspectives 3. Analyse sur un échantillon d’urine par GC-C-IRMS
- 19. 19/19Mohamed, Soutenance M2Pro ACBPI , 6 Septembre 2010 4.Conclusion & Perspectives Protocole développé Confirmation d’une administration frauduleuse de boldénone Premiers résultats Fenêtre de temps après administration à déterminer Échantillons extraits tardivement après administration Bovins