1. Лекція 3.Лекція 3. Клональне мікророзмноженняКлональне мікророзмноження
рослин.рослин. Одержання безвірусногоОдержання безвірусного
садивного матеріалусадивного матеріалу
ПланПлан
 1. Завдання та переваги клонального1. Завдання та переваги клонального
мікророзмноження.мікророзмноження.
 2. Типи клонального мікророзмноження.2. Типи клонального мікророзмноження.
 3. Основні етапи клонального3. Основні етапи клонального
мікророзмноження.мікророзмноження.
 4. Одержання безвірусного садивного4. Одержання безвірусного садивного
матеріалу.матеріалу.
 5. Вірусологічний контроль садивного5. Вірусологічний контроль садивного
матеріалу.матеріалу.

2. 1. Завдання та переваги1. Завдання та переваги
клонального мікророзмноженняклонального мікророзмноження
 КлональнеКлональне
мікророзмноженнямікророзмноження ––
масове нестатевемасове нестатеве
розмноження рослин,розмноження рослин,
генетично ідентичнихгенетично ідентичних
вихідному екземпляру, звихідному екземпляру, з
використанням технікивикористанням техніки inin
vitrovitro

3. Ця біотехнологія існує наЦя біотехнологія існує на
двох рівнях:двох рівнях:
 --мінірівеньмінірівень -- для здійснення швидкогодля здійснення швидкого
розмноження унікальних рослин – доноріврозмноження унікальних рослин – донорів
цінних генів, стерильних ліній, гібридів,цінних генів, стерильних ліній, гібридів,
мутантів, сомаклональних варіантів длямутантів, сомаклональних варіантів для
селекції;селекції;
 --макрорівеньмакрорівень длодержання значнихдлодержання значних
кількостей посадкового матеріалукількостей посадкового матеріалу
вегетативно розмножуваних рослинвегетативно розмножуваних рослин

4. ПеревагиПереваги клонального мікророзмноженняклонального мікророзмноження
 високі коефіцієнти розмноження (до 10високі коефіцієнти розмноження (до 1055
- 10- 1066
мериклонів за рік);мериклонів за рік);
 скорочення площ в закритому грунті, зайнятихскорочення площ в закритому грунті, зайнятих
під маточними і розмножуваними рослинами;під маточними і розмножуваними рослинами;
 можливість цілорічної роботи в лабораторнихможливість цілорічної роботи в лабораторних
умовах і планування випуску рослин в необхідніумовах і планування випуску рослин в необхідні
строки;строки;
 можливість одержувати вегетативне потомствоможливість одержувати вегетативне потомство
видів рослин, що важко розмножуються ввидів рослин, що важко розмножуються в
звичайних умовах;звичайних умовах;
 можливість одержувати посадковий матеріал,можливість одержувати посадковий матеріал,
оздоровлений від патогенів;оздоровлений від патогенів;
 можливість депонування рослин при низькихможливість депонування рослин при низьких
позитивних температурах або кріозбереженняпозитивних температурах або кріозбереження

5. 2. Типи клонального мікророзмноження.2. Типи клонального мікророзмноження.
 1) активація розвитку вже існуючих в1) активація розвитку вже існуючих в
інтактній рослині меристем (апексінтактній рослині меристем (апекс
стебла, пазушні і сплячі брунькистебла, пазушні і сплячі бруньки
стебла);стебла);
 2) індукція виникнення бруньок або2) індукція виникнення бруньок або
ембріоїдівембріоїдів de novode novo..

6. •Схема мікроклонального розмноження рослин: а - вихідна рослина; б - різні типи
експлантатів, які використовуються для мікророзмноження; в - ті самі експлантати в культурі in vitro;
г - пряма регенерація рослин з існуючих в ізольованих експлантатах меристем або з меристем які
утворюються з диференційованих клітин (наприклад, епідермісу) без виникнення калюсу; д -
регенерація рослин з калюсу шляхом органогенезу (за: Кунах, 2005).

7. Останній тип ділиться наОстанній тип ділиться на тритри
методиметоди::
 а) виникненняа) виникнення
організованих структурорганізованих структур
безпосередньо ізбезпосередньо із
спеціалізованих тканинспеціалізованих тканин
експланту (тканинекспланту (тканин
репродуктивних органів,репродуктивних органів,
епідермісу,епідермісу,
субепідермальних тканин,субепідермальних тканин,
мезофілу листка);мезофілу листка);

8. б) з первинного калусу, утвореногоб) з первинного калусу, утвореного
клітинами експлантуклітинами експланту

9. в) із субкультивованої калусноїв) із субкультивованої калусної
тканини або клітин суспензійноїтканини або клітин суспензійної
культурикультури

10.  Культура меристемКультура меристем – це асептичне– це асептичне
вирощування на живильних середовищахвирощування на живильних середовищах
ізольованої з апексу або пазушної брунькиізольованої з апексу або пазушної бруньки
пагона апікальної меристеми з одним абопагона апікальної меристеми з одним або
двома листковими примордіями.двома листковими примордіями.

11. Культура апікальних меристемКультура апікальних меристем
використовується для:використовується для:
 1) одержання рослин, генетично1) одержання рослин, генетично
ідентичних вихідному генотипу;ідентичних вихідному генотипу;
 2) одержання рослин, вільних від2) одержання рослин, вільних від
патогенів;патогенів;
 3) зберігання зародкової плазми3) зберігання зародкової плазми
(кріозбереження).(кріозбереження).

12. Шляхи клонального мікророзмноженняШляхи клонального мікророзмноження
 1) регенерація пагонів нормальних1) регенерація пагонів нормальних
пропорцій з наступним їх поділом напропорцій з наступним їх поділом на
"однобрунькові" мікроживці, які"однобрунькові" мікроживці, які
використовуються в якості вториннихвикористовуються в якості вторинних
експлантів для повторного циклуексплантів для повторного циклу
розмноження;розмноження;
 2) стимуляція розвитку всіх пазушних2) стимуляція розвитку всіх пазушних
бруньок і меристематичних бугорків вбруньок і меристематичних бугорків в
результаті пригнічення апікальногорезультаті пригнічення апікального
домінування первинного пагону.домінування первинного пагону.
Регенеранти мають вигляд пучків пагонів,Регенеранти мають вигляд пучків пагонів,
кожен з яких може бути рекультивованийкожен з яких може бути рекультивований
з аналогічним результатомз аналогічним результатом

13. Шляхи клонального мікророзмноженняШляхи клонального мікророзмноження

14.  Розроблено основніРозроблено основні
технологічні прийомитехнологічні прийоми
клональногоклонального
мікророзмноження длямікророзмноження для
значної кількості видівзначної кількості видів
рослин, зокрема, зрослин, зокрема, з
родинродин Solanaceae,Solanaceae,
Rosaceae, Asteraceae,Rosaceae, Asteraceae,
Brassicaceae,Brassicaceae, VitaceaeVitaceae
та ін.та ін.

15. 3. О3. Основні етаписновні етапи
клонального мікророзмноженняклонального мікророзмноження
 1-й етап1-й етап – ізолювання експланту,– ізолювання експланту,
введення і ініціація його розвитку ввведення і ініціація його розвитку в
умовахумовах in vitroin vitro;;
 2-й етап2-й етап – власне– власне
мікророзмноження;мікророзмноження;
 3-й етап3-й етап – укорінення мікропагонів;– укорінення мікропагонів;
 4-й етап4-й етап – адаптація мікророслин– адаптація мікророслин
до умовдо умов in vivoin vivo

16. Етапи клонального мікророзмноження лавандиЕтапи клонального мікророзмноження лаванди
1-й етап1-й етап – ізолювання експланту,– ізолювання експланту,
введення і ініціація йоговведення і ініціація його
розвитку в умовахрозвитку в умовах in vitroin vitro
2-й етап2-й етап ––
власне мікророзмноженнявласне мікророзмноження
3-й етап3-й етап ––
укорінення мікропагонівукорінення мікропагонів
4-й етап4-й етап – адаптація мікророслин– адаптація мікророслин
до умовдо умов in vivoin vivo

17. 4. Одержання безвірусного4. Одержання безвірусного
садивного матеріалусадивного матеріалу
 способами одержанняспособами одержання
безвірусних рослин є:безвірусних рослин є:
 1) відбір і розмноження здорових1) відбір і розмноження здорових
маточних рослин на основі ранньої іматочних рослин на основі ранньої і
точної діагностики;точної діагностики;
 2) біотехнологічні прийоми2) біотехнологічні прийоми
оздоровлення садивного матеріалуоздоровлення садивного матеріалу

18. Біотехнологічні методиБіотехнологічні методи
 1) культура апікальних меристем;1) культура апікальних меристем;
 2) термотерапія;2) термотерапія;
 3) хемотерапія.3) хемотерапія.

19. Культура апікальних меристемКультура апікальних меристем
основується на:основується на:
 1) наявності вільної від вірусів зони1) наявності вільної від вірусів зони
верхівкової меристемиверхівкової меристеми
 2) вірусінгібуючій дії компонентів2) вірусінгібуючій дії компонентів
живильного середовища;живильного середовища;
 3) видалення вірусних часточок, що3) видалення вірусних часточок, що
містяться в клітинах меристеми, вмістяться в клітинах меристеми, в
ході диференціації.ході диференціації.

20. обеззаражування рослин від вірусівобеззаражування рослин від вірусів
під дією підвищених температурпід дією підвищених температур
(найчастіше 36–42 0С).(найчастіше 36–42 0С).
 Термотерапія - цеТермотерапія - це

21. МеханізмМеханізм терапевтичного ефектутерапевтичного ефекту
вивчений недостатньо, і може бутививчений недостатньо, і може бути
пояснений декількома гіпотезамипояснений декількома гіпотезами
 1) висока температура призводять до втрати1) висока температура призводять до втрати
інфекційності вірусних часточок, викликаючиінфекційності вірусних часточок, викликаючи
деструкцію їх нуклеїнової кислоти або білковоїдеструкцію їх нуклеїнової кислоти або білкової
оболонки (у термолабільних вірусів);оболонки (у термолабільних вірусів);
 2) висока температура діє на віруси через метаболізм2) висока температура діє на віруси через метаболізм
рослини, викликаючи дисбаланс між синтезом ірослини, викликаючи дисбаланс між синтезом і
деградацією вірусних часточок в сторону деградації;деградацією вірусних часточок в сторону деградації;
 3) під дією високих температур зростає інгібуюча3) під дією високих температур зростає інгібуюча
активність клітин рослини-господаря;активність клітин рослини-господаря;
 4) під дією підвищених температур відбувається4) під дією підвищених температур відбувається
денатурація білкових вірусних рецепторів клітини, якіденатурація білкових вірусних рецепторів клітини, які
беруть участь в початкових етапах інфекційногоберуть участь в початкових етапах інфекційного
процесу, і клітини втрачають сприйнятливість допроцесу, і клітини втрачають сприйнятливість до
вірусу.вірусу.

22. ХемотерапіяХемотерапія –– застосуваннязастосування
вірусінгібуючих речовинвірусінгібуючих речовин
 декілька класів речовин з прямоюдекілька класів речовин з прямою
антивірусною активністю, які пригнічуютьантивірусною активністю, які пригнічують
репродукцію вірусу в рослині (репродукцію вірусу в рослині (рибавірін,рибавірін,
азацитидин та похідні олігоаденілатівазацитидин та похідні олігоаденілатів).).
 сполуки, здатні активувати захиснісполуки, здатні активувати захисні
механізми рослини та індукувати системнумеханізми рослини та індукувати системну
набуту резистентність (набуту резистентність (бензотіадизол,бензотіадизол,
стробілурин-похідні, саліцилова кислота,стробілурин-похідні, саліцилова кислота,
2,6-дихлорізонікотинова кислота та ін2,6-дихлорізонікотинова кислота та ін).).

23. 5. Вірусологічний5. Вірусологічний
контроль садивногоконтроль садивного
матеріалуматеріалу
 Технології одержання вільного відТехнології одержання вільного від
вірусної інфекції посадкового матеріалувірусної інфекції посадкового матеріалу
передбачають застосуванняпередбачають застосування
вірусологічного контролювірусологічного контролю на всіхна всіх
етапах розмноження рослин.етапах розмноження рослин.
 Найбільш ефективним тестом наНайбільш ефективним тестом на
наявність мінімальної кількості вірусу внаявність мінімальної кількості вірусу в
рослині єрослині є імуноферментний аналіз (ІФА,імуноферментний аналіз (ІФА,
ELISA – enzyme-linked-immuno-sorbentELISA – enzyme-linked-immuno-sorbent
assay).assay).

24.  В основі ІФА лежить реакція міжВ основі ІФА лежить реакція між антигеномантигеном, що міститься в досліджуваному, що міститься в досліджуваному
зразку, ізразку, і антитіламиантитілами до нього, міченими ферментом. Антитіла виступають якдо нього, міченими ферментом. Антитіла виступають як
специфічний детектор антигену, а фермент – як маркер імунохімічної реакції,специфічний детектор антигену, а фермент – як маркер імунохімічної реакції,
з допомогою якого візуалізується утворення комплексів посередництвомз допомогою якого візуалізується утворення комплексів посередництвом
кольорової реакції між ферментом і субстратом до нього.кольорової реакції між ферментом і субстратом до нього.
Непрямий варіант ІФАНепрямий варіант ІФА

25.  Безвірусні рослиниБезвірусні рослини відносять до категоріївідносять до категорії
оригінальний садивний матеріалоригінальний садивний матеріал , який, який
використовується для створеннявикористовується для створення оздоровленихоздоровлених
маточниківматочників. У цих маточниках здійснюється. У цих маточниках здійснюється
комплекс профілактичних і захисних заходівкомплекс профілактичних і захисних заходів
проти повторної інфекції: знищення бур’янів-проти повторної інфекції: знищення бур’янів-
резерваторів вірусів, боротьба з хворобами ірезерваторів вірусів, боротьба з хворобами і
шкідниками (можливими переносниками вірусів).шкідниками (можливими переносниками вірусів).
Паралельно проводиться робота з клоновоїПаралельно проводиться робота з клонової
селекції.селекції.
 Потомство оригінальних рослин –Потомство оригінальних рослин – елітнийелітний
садивний матеріалсадивний матеріал служить для закладкислужить для закладки
маточників супереліти та еліти в розсадницькихматочників супереліти та еліти в розсадницьких
господарствах, які передають матеріалгосподарствах, які передають матеріал першоїпершої
репродукціїрепродукції в господарства, що спеціалізуютьсяв господарства, що спеціалізуються
на вирощуванні сільськогосподарської культурина вирощуванні сільськогосподарської культури
з метою одержання товарної продукції.з метою одержання товарної продукції.

26. Дякую за увагу!Дякую за увагу!