卒業研究：小胞体モデル異常タンパク質△proに対するO型糖鎖付加の試験管内再構成 #卒論
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自分の大学時代の卒業研究の発表スライドです。 ファイルの整理をしていて偶然見つけたので懐かしくなってアップしました。 実験生物学の研究です。 実験結果の図表ばかりで説明があまりなく、いかにも実験系という発表です。 発表時の台本はこちら http://www.slideshare.net/teapipin/proo-16714706 卒業論文はこちら http://www.slideshare.net/teapipin/proo-16720850
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卒業研究：小胞体モデル異常タンパク質△proに対するO型糖鎖付加の試験管内再構成 #卒論
- 2. 小胞体品質管理 リボソーム mRNA サイトゾル プロテアソーム Sec61p Sec61p タンパク質 小胞体 修復 異常タンパク質 正常タンパク質 ゴルジ体以降へ
- 3. 小胞体品質管理 小胞体関連分解 リボソーム （ERAD） mRNA サイトゾル プロテアソーム Sec61p Sec61p タンパク質 小胞体 修復 異常タンパク質 正常タンパク質 ゴルジ体以降へ
- 4. O型糖鎖付加 サイトゾル Sec61p Pmt 小胞体内腔 M:マンノース 異常タンパク質
- 5. O型糖鎖付加 サイトゾル in vivo in vitro Sec61p Pmt DGpaF ○ ○ Dpro ○ 小胞体内腔 M:マンノース 異常タンパク質
- 6. O型糖鎖付加 サイトゾル in vivo in vitro Sec61p Pmt DGpaF ○ ○ Dpro ○ 小胞体内腔 M:マンノース 本研究の目的 モデル異常タンパク質 Dproを基質とした ERAD/O型糖鎖付加の 異常タンパク質 in vitro再構成
- 7. in vitro ERAD / O型糖鎖付加 assay系 pDGpaF ミクロソーム Reference McCracken, A.A., and Bordsky, J.L. (1996). J. Cell Biol. 132, 291-298.
- 8. in vitro ERAD / O型糖鎖付加 assay系 pDGpaF ミクロソーム pDGpaF Sec61p ミクロソーム DGpaF Reference McCracken, A.A., and Bordsky, J.L. (1996). J. Cell Biol. 132, 291-298.
- 9. in vitro ERAD / O型糖鎖付加 assay系 pDGpaF ミクロソーム pDGpaF Sec61p ミクロソーム DGpaF サイトゾル プロテアソーム + サイトゾル画分 + ATP再生系 Reference McCracken, A.A., and Bordsky, J.L. (1996). J. Cell Biol. 132, 291-298.
- 10. in vitro ERAD / O型糖鎖付加 assay系 pDGpaF ミクロソーム pDGpaF Sec61p ミクロソーム DGpaF ERAD O型糖鎖付加 サイトゾル プロテアソーム Pmt + サイトゾル画分 30℃ MMM + ATP再生系 インキュベート M:マンノース Reference McCracken, A.A., and Bordsky, J.L. (1996). J. Cell Biol. 132, 291-298.
- 11. pDproのin vitro翻訳反応 pDGpaF pDpro 泳動量 2 ml 4 ml 2 ml 4 ml 46.0 kDa 30.0 kDa 20.5 kDa
- 12. pDproの翻訳終了後の膜透過反応 トリプシン - + + Triton X-100 - - + min 0 10 30 60 0 10 30 60 0 10 30 60 pDpro リボソーム mRNA pDpro pDpro Sec61p
- 13. pDproの翻訳終了後の膜透過反応 トリプシン - + + Triton X-100 - - + min 0 10 30 60 0 10 30 60 0 10 30 60 pDpro リボソーム mRNA pDpro pDpro Sec61p
- 14. pDproの翻訳と共役した膜透過反応 トリプシン - + + Triton X-100 - - + min 0 10 30 60 0 10 30 60 0 10 30 60 pDpro Dpro リボソーム mRNA Sec61p Dpro
- 15. Dproのin vitro ERAD / O型糖鎖付加 assay 野生株由来のミクロソーム トリプシン - + + Triton X-100 - - + chase (min) 0 10 30 60 0 10 30 60 0 10 30 60 pDpro Dpro 120 100 Dpro Dproの存在量 80 スメアバンド 60 （％） 40 20 0 10 20 30 40 50 60 min
- 16. Dproのin vitro ERAD / O型糖鎖付加 assay 野生株由来のミクロソーム トリプシン - + + Triton X-100 - - + chase (min) 0 10 30 60 0 10 30 60 0 10 30 60 pDpro Dpro 120 合計量 100 Dpro Dproの存在量 80 スメアバンド 60 （％） 40 20 0 10 20 30 40 50 60 min
- 17. Dproのin vitro ERAD / O型糖鎖付加 assay Dpmt2株由来のミクロソーム トリプシン - + + Triton X-100 - - + chase (min) 0 10 30 60 0 10 30 60 0 10 30 60 pDpro Dpro 120 100 Dproの存在量 80 Dpro 60 （％） 40 20 0 10 20 30 40 50 60 min
- 18. 本研究のまとめ 1. in vitroにおいて、Dproを翻訳と共役した 膜透過反応によってミクロソームに 取り込ませることに成功した。 2. in vitroアッセイにおいても、Dproは Pmt2p依存でO型糖鎖付加された可能性が 考えられた。 3. DproがERADでの分解が起こらなかったのは in vitroでは、DGpaFの場合でもERADでの 分解効率が低く、O型糖鎖付加の方が進行 しやすいことと一致する。