Luận văn: Định lượng hoạt chất thuốc kháng sinh nhóm Sulfamid

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
.....o0o…..
Vũ Thị Huệ
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT THUỐC
KHÁNG SINH THUỘC NHÓM SULFAMID BẰNG PHƯƠNG PHÁP
PHỔ KẾ HỒNG NGOẠI GẦN VÀ TRUNG BÌNH
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Hà Nội - 2015

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------
Vũ Thị Huệ
NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG MỘT SỐ HOẠT CHẤT THUỐC
KHÁNG SINH THUỘC NHÓM SULFAMID BẰNG PHƯƠNG PHÁP
PHỔ KẾ HỒNG NGOẠI GẦN VÀ TRUNG BÌNH
Chuyên ngành: Hóa phân tích
Mã Số: 60440118
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. TẠ THỊ THẢO
Hà Nội – 2015

LỜI CẢM ƠN
Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Tạ Thị
Thảo đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn
thành luận văn này.
Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc sự hộ trợ kinh phí và thiết bị
máy móc từ đề tài nghị định thư với Cộng hòa Pháp Lotus 2014- 2016, mã
số 39/2014/HD- NĐT.
Cuối cùng, tôi xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, người thân cùng các
thầy cô, cán bộ trong bộ môn Hóa phân tích, các anh chị em học viên K23
chuyên ngành Hóa phân tích đã tạo điều kiện, giúp đỡ tôi rất nhiều trong
suốt quá trình nghiên cứu.
Hà Nội, ngày 16 tháng 6 năm 2015
Học viên
Vũ Thị Huệ

Luận Văn Thạc Sĩ Khoa Học Vũ Thị Huệ - K23 Hóa Học
Chuyên ngành hóa phân tích Trường ĐHKHTN
Mục Lục
MỞ ĐẦU.....................................................................................................................1
CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .......................................................................................2
1.1. Tổng quan về thuốc giả và hiện trạng sử dụng thuốc tại Việt Nam………….2
1.1.1. Định nghĩa về thuốc giả............................................................................2
1.1.2. Hiện trạng sử dụng thuốc giả....................................................................2
1.2. Tổng quan về thuốc kháng sinh nhóm Sulfamid…………………………….3
1.2.1. Lịch sử ra đời nhóm Sulfamid ..................................................................3
1.2.2. Cấu tạo chung của nhóm Sulfamid...........................................................4
1.2.3. Tính chất vật lý và hóa học của các sulfamid...........................................6
1.2.4. Phân loại sulfamid.....................................................................................6
1.2.5. Dược động học..........................................................................................7
1.2.6. Độc tính của sulfamid...............................................................................7
1.2.7. Giới thiệu về Sulfaguanidin, Sulfamethoxazol và Trimethoprim.............8
1.3. Tổng quan về phương pháp phân tích các hoạt chất nhóm sulfamid.............10
1.3.1. Phương pháp định tính sulfamid.............................................................10
1.3.2. Phương pháp định lượng.........................................................................11
1.3.1.1. Phương pháp chuẩn độ thể tích........................................................11
1.3.1.2. Phương pháp trắc quang ..................................................................12
1.3.1.3. Phương pháp trắc quang kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến ....12
1.3.1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao..........................................13
1.4. Phương pháp quang phổ kế hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với thuật
toán hồi quy đa biến..............................................................................................14
1.4.1. Sơ lược về phương pháp quang phổ hồng ngoại ....................................14
1.4.1.1. Lịch sử ra đời của phương pháp phân tích phổ hồng ngoại.............14
1.4.1.2. Nguyên tắc của phép đo phổ hồng ngoại.........................................14
1.4.1.3. Điều kiện hấp thụ bức xạ hồng ngoại ..............................................16
1.4.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu đo phổ hồng ngoại ...................16
1.4.1.5. Các kỹ thuật chuẩn bị mẫu và đo phổ hồng ngoại...........................17

1.4.1.6. Một số ứng dụng của phương pháp phổ hồng ngoại .......................18
1.4.2. Định lượng các chất bằng phương pháp phổ hồng ngoại gần và trung
bình kết hợp với chemometrics.........................................................................19
1.4.2.1. Cơ sở lý thuyết của phương pháp hồi quy đa biến ...........................19
1.4.2.2. Xác định đồng thời các chất bằng phương pháp quang phổ hồng
ngoại gần và trung bình kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến ......................27
CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM................................................................................30
2.1. Nội dung và phương pháp nghiên cứu……………………………………...30
2.1.1. Nội dung nghiên cứu...............................................................................30
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu ........................................................................30
2.2. Phương pháp phân tích đối chứng xác định các sulfamid.............................32
2.2.1. Phương pháp đối chứng xác định Sulfaguanidin....................................32
2.2.2. Phương pháp đối chứng xác định Sulfamethoxazol và Trimethoprim...32
2.3. Hóa chất và thiết bị…………………………………………………………34
2.3.1. Hóa chất ..................................................................................................34
2.3.2. Thiết bị và phần mềm máy tính ..............................................................34
2.4. Chương trình máy tính của các phương pháp hồi quy đa biến......................35
2.4.1. Phương pháp bình phương tối thiểu thông thường (CLS)......................35
2.4.2. Phương pháp bình phương tối thiểu nghịch đảo ( ILS) ..........................36
2.4.3. Phương pháp bình phương tối thiểu từng phần (PLS)............................37
2.4.4. Phương pháp hồi qui cấu tử chính (PCR)...............................................38
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..........................................................41
3.1. Khảo sát điều kiện tối ưu xác định đồng thời sulfaguanidin, sulfamethoxazol
và trimethoprim trong cùng hỗn hợp....................................................................41
3.1.1. Khảo sát phổ hấp thụ của các hoạt chất..................................................41
3.1.2. Khảo sát tỷ lệ khối lượng mẫu / KBr......................................................44
3.1.3. Khảo sát độ lặp lại của quá trình ép viên................................................44
3.1.4. Khảo sát ảnh hưởng của các tá dược ......................................................45

3.2. Phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính xác định riêng từng hoạt chất nhóm
sulfamid khi có mặt các tá dược………………………………………………...48
3.2.1. Xây dựng mô hình hồi quy đa biến gồm hoạt chất sulfaguanidin và các
tá dược………………………………………………………………………..48
3.2.2. Đánh giá phương pháp phân tích sulfaguanidin .....................................50
3.3. Phương pháp hồi quy đa biến tuyến tính PCR xác định đồng thời
sulfaguanidin, sulfamethoxazol và trimethoprim……………………………….58
3.3.1. Xây dựng phương trình đường chuẩn đa biến xác định sulfaguanidin,
sulfamethoxazol và trimethoprim bằng phương pháp PCR..............................58
3.3.2. Đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi quy đa biến ......................61
3.3.3. Xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương pháp hồi
quy cấu tử chính xác định đồng thời SFG, SFM, TMP và tá dược ..................64
3.4. Ứng dụng phân tích mẫu thực tế……………………………………………65
3.4.1. Phương pháp xác định một số hoạt chất thuốc kháng sinh thuộc nhóm
Sulfamid bằng phương pháp phổ kế hồng ngoại gần và trung bình.................66
3.4.1.1. Định tính mẫu thực tế ......................................................................66
3.4.2. Định lượng mẫu thực tế ..........................................................................72
CHƯƠNG IV: KẾT LUẬN ......................................................................................76
TÀI LIỆU THAM KHẢO………………………………………………………83

DANH MỤC HÌNH
Hình 3.1: Phổ hồng ngoại của Sulfaguanidin trên hai loại thiết bị khảo sát.............41
Hình 3.2: Phổ hồng ngoại của Sulfamethoxazol tren hai thiết bị khảo sát...............42
Hình 3.3: Phổ hồng ngoại của Trimethoprim trên hai loại thiết bị khảo sát.............42
Hình 3.4: Phổ hồng ngoại của ba hoạt chất Sulfaguanidin, sulfamethoxazol và
trimethoprim ............................................................................................43
Hình 3.5: Phổ hồng ngoại của Canxiphosphat..........................................................46
Hình 3.6: Phổ hồng ngoại của Tinh bột sắn..............................................................46
Hình 3.7: Phổ hồng ngoại của Maltodextrin.............................................................46
Hình 3.8: Phổ hồng ngoại của Magie Stearat............................................................47
Hình 3.9: Phổ hồng ngoại của Talcum......................................................................47
Hình 3.10: Đồ thị score plot và đồ thị loading plot của tín hiệu phân tích 25 mẫu
chuẩn........................................................................................................54
Hình 3.11: Đồ thị score plot và đồ thị loading plot của tín hiệu phân tích 30 mẫu
chuẩn........................................................................................................60
Hình 3.12: Phổ hồng ngoại của Sulfaguanidin .........................................................66
Hình 3.13: Phổ hồng ngoại của Sulfamethoxazol.....................................................66
Hình 3.14: Phổ hồng ngoại của Trimethoprim .........................................................67
Hình 3.15: Kết quả định tính mẫu tự tạo...................................................................67
Hình 3.16: Kết quả định tính mẫu thực tế S1............................................................68
Hình 3.20: Kết quả định tính mẫu thực tế ST1 .........................................................70

DANH MỤC BẢNG
Bảng 1.1: Công thức cấu tạo của một số Sulfamid phổ biến......................................5
Bảng 3.1: Kết quả ảnh hưởng của tỷ lệ khối lượng mẫu/KBr đến độ hấp thụ quang
tại các số sóng đặc trưng..........................................................................44
Bảng 3.2: Kết quả khảo sát độ lặp lại giữa các lần ép viên ......................................45
Bảng 3.3: Ma trận hàm lượng bốn cấu tử SFT, Tbot, Malt, Ca3(PO4)2 trong hỗn hợp.......49
Bảng 3.4: Ma trận nồng độ các mẫu tự tạo chứa SFG, Tbot, Ca3(PO4)2 và Malt để
đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi quy.....................................50
Bảng 3.5: Hàm lượng SFG tìm được trong các hỗn hợp mẫu kiểm tra....................51
Bảng 3.6: Hàm lượng Tbot tìm được trong các hỗn hợp mẫu kiểm tra....................52
Bảng 3.7: Hàm lượng Ca3(PO4)2 tìm được trong các hỗn hợp mẫu kiểm tra ...........52
Bảng 3.8: Hàm lượng Malt tìm được trong các hỗn hợp mẫu kiểm tra....................53
Bảng 3.9: Hàm lượng SFG và ba tá dược tìm được trong hỗn hợp các mẫu kiểm tra
.................................................................................................................56
Bảng 3.10: Hàm lượng SFG và tổng tá dược tìm được trong các hỗn hợp mẫu kiểm
tra theo phương pháp PCR.......................................................................57
Bảng 3.11: Ma trận chuẩn hàm lượng bốn cấu tử SFG, SFM, TMP và tá dược trong
hỗn hợp ....................................................................................................59
Bảng 3.12: Ma trận nồng độ các mẫu tự tạo chứa SFG, SFM, TMP và tá dược để
đánh giá tính phù hợp của phương trình hồi quy.....................................62
Bảng 3.13: Hàm lượng SFT, SFM, TMP và tổng tá dược tìm được trong các hỗn
hợp mẫu kiểm tra theo phương pháp PCR ..............................................63
Bảng 3.14: Giá trị LOD, LOQ của phương pháp hồi quy cấu tử chính xác định đồng
thời SFG, SFM, TMP và tá dược.............................................................65
Bảng 3.15: Mẫu thực tế.............................................................................................65
Bảng 3.16: Khối lượng bột viên và tá dược tinh bột trộn thêm vào các mẫu...........73
Bảng 3.17: Hàm lượng (mg/viên) của SFG trong các mẫu thực tế...........................74
Bảng 3.18: Hàm lượng (mg/viên) của SFM và TMP trong các mẫu thực tế............74

BẢNG KÍ HIỆU NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT
Bình phương tối thiểu thông thường
(classical least square)
CLS
Bình phương tối thiểu nghịch đảo
(inverse least square)
ILS
Bình phương tối thiểu từng phần
(partial least square)
PLS
Cấu tử chính (Principal component) PC
Dược điển Anh 2009 BP 2009
Dược điển Mỹ 34 USP 34
Dược điển Việt Nam 4 DĐVN 4
Khối lượng trung bình viên KLTB
Hồi qui cấu tử chính (principal
component regression)
PCR
Maltodextrin Malt
Sulfaguanidin SFG
Sulfamethoxazol SFM
Tinh bột Tbot
Trimethoprim TMP
 Ghi chú: Trong luận văn này chúng tôi sử dụng các tên hóa chất và hoạt
chất theo quy định trong Dược điển Việt Nam 4 [1]

Chuyên ngành hóa phân tích 1 Trường ĐHKHTN
MỞ ĐẦU
Từ xưa đến nay, việc sử dụng thuốc trong phòng, chữa bệnh và tăng cường
sức khỏe đã trở thành nhu cầu tất yếu quan trọng đối với đời sống con người. Cùng
với sự tiến bộ và phát triển của xã hội loài người các loại mặt hàng thuốc được
nghiên cứu, sản xuất và đưa ra thị trường cũng ngày một phong phú và đa dạng.
Tuy nhiên bên cạnh các loại thuốc chính hãng đảm bảo chất lượng thì trên thị
trường thuốc cũng tồn tại không ít các mặt hàng thuốc giả, thuốc kém chất lượng
của một bộ phận các cá nhân hay doanh nghiệp đưa ra thị trường vì mục đích trục
lợi. Việc kiểm soát chất lượng của các loại mặt hàng này thường đòi hỏi thời gian
dài với nhiều công đoạn phức tạp và chi phí kiểm định khá cao. Vì vậy ngày nay thế
giới đang có xu hướng tìm kiếm những phương pháp và thiết bị cho phép kiểm định
nhanh thuốc đang lưu thông trên thị trường.
So với phương pháp phân tích truyền thống để định lượng hoạt chất thuốc là
sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thì định lượng chất bằng phương pháp quang
phổ hồng ngoại gần và trung bình có ưu điểm đơn giản trong quá trình tiền xử lý
mẫu, phân tích trực tiếp mẫu rắn nhanh, giá thành rẻ do không tốn dung môi và nếu
kết hợp với thuật toán hồi qui đa biến thì không phải tách riêng các chất trước khi
phân tích nên có thể phân tích đồng thời các thuốc trong cùng nhóm thuốc. Đây
chính là lí do chúng tôi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu định lượng một số hoạt chất
thuốc kháng sinh thuộc nhóm Sulfamid bằng phương pháp phổ kế hồng ngoại gần
và trung bình”. Luận văn này là một phần trong chương trình hợp tác quốc tế giữa
Việt Nam và Pháp với mục đích nghiên cứu phát triển phương pháp quang phổ
hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với các phương pháp hồi quy đa biến tuyến
tính để kiểm định nhanh chất lượng thuốc. Nghiên cứu này sẽ góp phần khẳng định
xu hướng đưa các phép phân tích ra khỏi nghiên cứu đơn thuần và áp dụng nhanh
trong thực tế, đồng thời cho phép tiết kiệm thời gian, hóa chất và đặc biệt là tăng
tính thời sự của công tác giám định chất lượng.

CHƯƠNG I: TỔNG QUAN
1.1. Tổng quan về thuốc giả và hiện trạng sử dụng thuốc tại Việt Nam
1.1.1. Định nghĩa về thuốc giả
Theo định nghĩa của Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), thuốc giả là sản phẩm
được sản xuất và dán nhãn dưới dạng thuốc với ý đồ lừa đảo về nguồn gốc và lai
lịch sản phẩm. Các sản phẩm giả mạo có thể có dược chất sai hoặc không có dược
chất, không đủ lượng dược chất hoặc bao gói giả mạo [38].
Theo định nghĩa của Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Hoa Kỳ (FDA):
Thuốc giả bao gồm bất kỳ dược phẩm nhái hoặc kém chất lượng nào không đáp ứng
được tiêu chuẩn của FDA nhưng cố tình che giấu sự thật [36]. Thuốc giả có thể có
một hoặc nhiều hay tất cả các yếu tố sau:
- Quá mạnh hoặc quá yếu.
- Thiếu các thành phần chính.
- Được sản xuất từ các thành phần nguy hiểm.
- Nhiễm chất lạ, thậm chí có chất độc.
- Được sản xuất trong điều kiện mất vệ sinh hoặc không vô trùng.
- Được tạo ra theo các tiêu chuẩn không an toàn.
- Được dán nhãn, cất giữ hay bảo quản không đúng cách.
- Quá hạn sử dụng (hết hạn).
1.1.2. Hiện trạng sử dụng thuốc giả
Theo thống kê của WHO, đã có sự bùng nổ thuốc giả trên phạm vi toàn cầu.
Thuốc giả chiếm tới 10% thị trường dược phẩm thế giới với doanh thu 45 tỉ
euro/năm, trung bình mỗi năm có khoảng 200.000 người tử vong do thuốc giả [35].
Tại Việt Nam, theo Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, năm 2011, trong
số hơn 31.000 mẫu thuốc được kiểm tra gần đây thì đã có hơn 1.000 mẫu không đạt
tiêu chuẩn chất lượng như nhiễm khuẩn, không đủ độ hòa tan, không đủ định lượng.
Nguồn tin từ Bộ Y tế cũng cho biết, trong hơn 10 ngày đầu tháng 2/2012, hầu như
ngày nào Bộ cũng phát hiện thuốc giả, thuốc kém chất lượng.[3]

Các thuốc giả, thuốc nhái có thể chứa bất cứ thành phần nào từ phấn bảng,
bê-tông nghiền, acid boric hoặc những gì tệ hơn thế và được bán như thuốc thật.
Thuốc giả không chỉ đánh lừa người tiêu dùng, chúng còn vô hiệu hóa các liệu pháp
điều trị để cứu sống bệnh nhân. Trong rất nhiều trường hợp thuốc giả gây ra tác hại
to lớn như gây ra các phản ứng dị ứng, nhiễm độc kim loại nặng cũng như làm bệnh
nhân dễ kháng thuốc [23]. Tuy nhiên, việc phát hiện thuốc giả lưu thông trên thị
trường gặp rất nhiều khó khăn. Thông thường, do doanh số bán (lượng tiêu thụ) của
một mặt hàng thuốc nào đó giảm nghiêm trọng, nhà sản xuất hoặc nhà phân phối
hàng chính hãng mới đặt vấn đề với cơ quan chức năng về hiện tượng làm giả thuốc
này và khi đó cơ quan chức năng mới tiến hành xác minh (kiểm tra đột xuất tại các
cơ sở sản xuất kinh doanh; niêm phong mẫu và đem phân tích theo các phương
pháp tiêu chuẩn trong phòng thí nghiệm, rồi đưa ra kết luận) [3]. Quá trình này
thường rất tốn kém và mất thời gian, do đó đòi hỏi cần phải nghiên cứu tìm ra một
phương pháp kiểm nghiệm mới, nhanh chóng, đơn giản và tiết kiệm để kiểm định
nhanh được chất lượng thuốc ngoài hiện trường.
1.2. Tổng quan về thuốc kháng sinh nhóm Sulfamid
1.2.1. Lịch sử ra đời nhóm Sulfamid
Ngay từ những năm đầu thế kỉ các nhà khoa học nhận thấy rằng các phẩm
nhuộm có tác dụng kháng khuẩn, tuy nhiên các phẩm nhuộm thường rất độc. Trong
những cố gắng tìm những thuốc kháng khuẩn trên cơ sở các thuốc nhuộm năm
1913, người ta đã tìm thấy phẩm azoic cryzoidin có tác dụng diệt khuẩn và tương
đối ít độc [28]. Đồng thời khi thêm nhóm –SO2NH2 các phẩm nhuộm thường rất
bền vì gắn chặt vào protein, vì vậy người ta cũng gắn thêm vào phân tử cryzoidin
nhóm sulfamido, kết quả là cho một chất có khả năng chống tụ cầu và liên cầu
prontosil. Đây là chất kháng khuẩn đầu tiên thu được bằng phương pháp tổng hợp
toàn phần. Prontosil khó tan trong nước nên người ta thêm vào đó nhóm COOH từ
đó có thể tạo muối dễ tan. Năm 1935, Domagk, Trefouel và Levaditikhisi dùng
prontosil kháng khuẩn thì nhận thấy: mặc dù có kết quả tốt trên liên cầu trên in vivo
nhưng lại không có tác dụng trên in vitro, như vậy có thể khi vào cơ thể, prontosil

đã chuyển hóa thành chất khác có tác dụng kháng khuẩn [15]. Khi phân tích công
thức của prontosil ta thấy đó là các azoic được điều chế bằng cách diazo hóa p-
amino benzene sulfonamid(sulfanilamid) ngưng tụ với m-phenylendiamin. Khi thay
m-phenylendiamin bằng các amin hoặc các phenol khác chúng ta thu được các dẫn
chất có tác dụng kháng khuẩn nhưng khi thay sulfanilamid bằng các anilin khác
nhau thì thu được các chất không có tác dụng kháng khuẩn. Như vậy, có thể các
sulfanilamid là phần có tác dụng kháng khuẩn. Thật vậy, khi thử tác dụng của
sulfanilamid cho thấy có tác dụng kháng khuẩn tốt. Khi kiểm tra nước tiểu của
người uống prontosil thấy có mặt sulfanilamid dưới dạng acetyl hóa. [6, 13]
Sulfanilamid đã trở thành sulfamid đầu tiên trong lịch sử. Việc phát hiện ra
prontosil và sulfanilamid đã mở ra một kỉ nguyên mới cho việc hóa trị liệu các bệnh
nhiễm khuẩn. Dựa trên cấu trúc của sulfanilamid người ta đã tổng hợp rất nhiều
sulfamid, trong đó có khoảng 40 loại được sử dụng làm thuốc. Ngày nay, việc ra đời
của các kháng sinh có tác dụng kháng khuẩn rất mạnh nên các sulfamid được sử
dụng ít hơn. Tuy nhiên việc sử dụng các sulfamid có ưu điểm:
 Có thể sản xuất lớn, giá thành rẻ
 Nhiều sulfamid có tác dụng khác: lợi tiểu, hạ đường huyết
 Các tác dụng phụ của sulfamid đã được khắc phục tốt
1.2.2. Cấu tạo chung của nhóm Sulfamid
Các sulfamid kháng khuẩn là dẫn chất của p- aminobenzensulfonamid, có
công thức cấu tạo chung là:
HNR2 SO2 NH R1
Trong đó thường gặp R2 là H, và cũng chỉ khi R2 là H thì sulfamid mới có
hoạt tính kháng khuẩn, khi R2 ≠H, thì chất đó là tiền thuốc. R1 có thể là mạch thẳng,
dị vòng. Tuy nhiên, nếu R1 là dị vòng thì hiệu lực kháng khuẩn mạnh hơn, thông
thường là các dị vòng 2 – 3 dị tố. Khi R1 và R2 đều là gốc hidro thì thu được
sulfamid là có cấu tạo đơn giản nhất (sulfanilamid) [6].

Sulfamid có công thức cấu tạo gần giống với PABA (para amino benzoic
acid) là nguồn nguyên liệu cần thiết cho vi khuẩn tổng hợp acid folic để phát triển.
Do đó sulfamid tranh chấp với PABA ngăn cản quá trình tổng hợp acid folic của vi
khuẩn. Ngoài ra, sulfamid còn ức chế dihydrofolat synthetase, một enzym tham gia
tổng hợp acid folic. Về mặt lý thuyết, phổ kháng khuẩn của sulfamid rất rộng, gồm
hầu hết các cầu khuẩn, trực khuẩn gram (+) và (-). Hiện nay, tỷ lệ kháng thuốc và
kháng chéo giữa các sulfamid đang rất cao nên đã hạn chế việc sử dụng sulfamid rất
nhiều. Mặt khác do có nhiều độc tính và đã có kháng sinh thay thế, sulfamid ngày
càng ít dùng một mình, thường dùng dạng phối hợp sulfamethoxazol với
trimethoprim để tăng khả năng điều trị của thuốc. Dưới đây là công thức cấu tạo của
một số sulfamid phổ biến
Bảng 1.1: Công thức cấu tạo của một số Sulfamid phổ biến
Tên Công thức R1 R2
Sulfaguanidin C7H10N4O2S
NH2
NH
-H
Sulfadiazin
C10H10N4O2S
N
N
-H
Sulfamethoxazol C10H11N3O3S
N
O
CH3
-H
Sulfadoxin C12H14N4O4S
N
N
H3OC OCH3
-H

1.2.3. Tính chất vật lý và hóa học của các sulfamid
 Tính chất vật lý
Sulfamid ở dạng tinh thể màu trắng hoặc màu vàng nhạt trừ prontosil, không
mùi, thường ít tan trong nước, benzen, chloroform. Sulfamid tan trong dung dịch
acid vô cơ loãng và hydroxyd kiềm (trừ sulfaguanidin) [6]. Các sulfamid có các
thông số xác định về: độ chảy, phổ IR, phổ UV (do có chứa nhân thơm).
 Tính chất hóa học
Hầu hết các Sulfamid đều có tính chất lưỡng tính: [6]
- Tính acid (trừ sulfaguanidin): do có H ở N- amid linh động
- Tính bazơ: Có tính kiềm do có nhóm amin thơm tự do, nên tan trong dung
dịch acid.
Các sulfamid có thể tham gia phản ứng diazo hoá do có nhóm amin thơm tự
do (có thể tham gia phản ứng ghép đôi với 2-naphtol/kiềm để cho sản phẩm màu đỏ
da cam).
Tác dụng với một số muối kim loại (CuSO4, CoCl2) tạo thành phức màu tủa
với Cu2+
, Co2+
đặc trưng cho từng sulfamid, nên thường được dùng để phân biệt các
sulfamid với nhau. Đốt khô trong ống nghiệm, sulfamid bị phân huỷ, để lại cặn có
màu điển hình cho từng sulfamid, ví dụ, đốt sunfanilamid sẽ giải phóng ammoniac
và cho cặn màu xanh tím.
1.2.4. Phân loại sulfamid
Sulfamid là một trong những kháng sinh tổng hợp đầu tiên được loài người
phát hiện và sử dụng. Việc tìm thấy sulfamid đã mở ra một kỷ nguyên mới của các
thuốc chống nhiễm khuẩn trước khi có penicilin. Khi phân loại kháng sinh theo tác
dụng, nhóm sulfamid được xếp vào nhóm các loại kháng sinh có tác dụng kìm
khuẩn. Do tác dụng của sulfamid đều giống nhau, việc điều trị dựa vào dược động
học của thuốc cho nên người ta chia các sulfamid làm 4 loại: Loại hấp thu nhanh,
thải trừ nhanh: nồng độ tối đa trong máu sau uống là 2 - 4h. t1/2 =6-8h, thải trừ 95%
trong 24h. Dùng điều trị nhiễm khuẩn theo đường máu như sulfadiazin, sulfisoxazol
(Gantrisin), sulfamethoxazol (Gantazol). Loại hấp thu rất ít: dùng chữa viêm ruột,

viêm loét đại tràng như sufaguanidin (Ganidan). Loại thải trừ chậm: duy trì được
nồng độ điều trị trong máu lâu, t1/2 có thể tới 7 - 9 ngày nên chỉ cần uống 1 lần/ngày.
Hiện dùng sulfadoxin (Fanasil), phối hợp với pyrimethamin trong Fansidar để dự
phòng và điều trị sốt rét kháng cloroquin. Loại để dùng tại chỗ: ít hoặc khó tan
trong nước. Dùng điều trị các vết thương tại chỗ (mắt, vết bỏng) dưới dạng dung
dịch hoặc kem. Có sulfacetamid, silver sulfadiazin, mafenid. [2]
Hiện nay hầu hết các vi khuẩn đều kháng với sulfamid nên thuốc này rất ít
được sử dụng. Để khắc phục nhược điểm này người ta thường dùng sulfamid ở dạng
phối hợp. Dạng phối hợp phổ biến nhất của sulfamid là việc kết hợp giữa
sulfamethoxazol và trimethoprim với tỉ lệ 1 trimethoprim và 5 sulfamethoxazol
nhằm tạo ra kháng sinh có khả năng kháng khuẩn, tăng hiệu quả điều trị và giảm tỉ
lệ kháng thuốc của vi khuẩn, thuốc hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, t/2 của thuốc từ
9-11 giờ. [2]
1.2.5. Dược động học
Các sulfamid được hấp thu nhanh qua dạ dày và ruột (trừ loại sulfaguanidin),
70 - 80% liều uống vào được máu, gắn với protein huyết tương 40 - 80%, nồng độ
tối đa đạt được sau 2- 4 giờ. Từ máu, sulfamid khuếch tán rất dễ dàng vào các mô,
vào dịch não tuỷ (bằng 1/2 hoặc tương đương với nồng độ trong máu), qua rau thai,
gây độc. Các quá trình chuyển hóa chủ yếu ở gan của sulfamid gồm: Phản ứng liên
hợp với acid glucuronic thành dạng bất hoạt nhưng có tính hòa tan. Phản ứng acetyl
hóa tạo thành dạng bất hoạt và không tan nên thường gây độc (hình thành dạng tinh
thể ở thận). Sau đó các sulfamid được bài thải qua thận là chủ yếu (trừ các sulfamid
kháng khuẩn đường ruột), một ít qua phân, sữa. [2]
1.2.6. Độc tính của sulfamid
Tác dụng phụ khi sử dụng sulfamid là khoảng 5% khác nhau đối với mỗi cá
thể và đối với mỗi loại sulfamid. Dưới đây là một số tác dụng có thể gặp khi sử
dụng sulfamid:
Rối loạn hệ thống tạo máu: cơ chế tác dụng rất khác nhau, có trường hợp là
do mẫn cảm, trường hợp khác do sự tan huyết liên quan đến sự hoạt hóa glucose- 6

photsphat dehydrogenase. Phản ứng này không phụ thuộc vào nồng độ sulfamid mà
vào từng cá thể. Phản ứng thường xảy ra trong tuần đầu dùng thuốc. Triệu chứng có
thể là: buồn nôn, sốt, chóng mặt, vàng da, xanh xao, trong trường hợp nặng có thể là
thiếu máu bất sản. Một số trường hợp có thể gây tím tái do tạo methemoglobin.
Thận: đây là trường hợp không mong muốn thường gặp nhất khi sử dụng
sulfamid. Sulfamid có thể gây kết tinh ở thận, gây tổn thương thận, viêm thận, sỏi
thận, đái ra máu. Nhược điểm này đã được khắc phục dần do tìm được những
sulfamid ít acetyl hóa, ít kết tinh…
Phản ứng tăng nhạy cảm: phản ứng rất khác nhau với từng loại sulfamid và
với từng người, thường xuất hiện khi sử dụng các loại sulfamid tác động chậm.
Triệu chứng có thể là nổi ban đỏ, xuất huyết…Khi dùng ngoài da có thể gây nám da
do sự kích thích sự nhạy cảm của da khi tiếp xúc với tia tử ngoại. [2]
1.2.7. Giới thiệu về Sulfaguanidin, Sulfamethoxazol và Trimethoprim
Trong số những kháng sinh nhóm sulfamid đã được tổng hợp, sulfaguanidin
và sulfamethoxazol là một trong những hoạt chất được sử dụng phổ biến nhất hiện
nay. Tuy nhiên, do khả năng kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng tăng nên hiện nay
người ta thường sử dụng dạng phối hợp của sulfamid với trimethoprim như
sulfamethoxazol, sulfadiazin với trimethoprim để tăng thêm hiệu quả điều trị [2].
Do đó trong luận văn này chúng tôi đã tiến hành đi sâu nghiên cứu ba hoạt chất là:
sulfaguanidin, sulfamethoxazol (thuộc nhóm sulfamid) và trimethoprim (dạng phối
hợp phổ biến với sulfamid).
 Giới thiệu về Sulfaguanidin
Công thức: C7H10N4O2S
KLPT: 214,2
Sulfaguanidin là (4-aminophenylsulfonyl)guanidin, tồn tại ở dạng bột kết
tinh mịn màu trắng hoặc gần như trắng. Rất khó tan trong nước và ethanol 96 %,

khó tan trong aceton, thực tế không tan trong methylen clorid, tan trong dung dịch
acid vô cơ loãng. [6]
Sulfaguanidin được sử dụng để trị các bệnh đường ruột như tả, lỵ, viêm ruột.
Là kháng sinh ít tan trong kiềm, không hấp thu ở ruột, ít độc nên có thể dùng với
liều cao. Tuy nhiên sulfaguanidin có ảnh hưởng tới vi khuẩn đường ruột, nên khi
dùng nên uống thêm men tiêu hóa và uống kèm vitamin B1
 Giới thiệu về Sulfamethoxazol
Công thức: C10H11N3O3S
KLPT: 253,3
Sulfamethoxazol là 4-amino-N-(5-methylisoxazol-3-yl)benzensulfonamid,
tồn tại ở dạng bột kết tinh màu trắng hoặc gần như trắng. Thực tế không tan trong
nước, dễ tan trong aceton, hơi tan trong ethanol 96 %, tan trong dung dịch natri
hydroxyd loãng và dung dịch acid loãng. [6]
Sulfamethoxazol là sulfamid có tác động trung gian dùng trị nhiễm trùng
đường tiểu, sinh dục, nhiễm trùng da.
 Giới thiệu về Trimethoprim
Công thức: C14H18N4O3
KLPT: 290,3
Trimethoprim là 2,4 diamino-5-(3,4,5-trimethoxybenzyl) pyrimidin, tồn tại ở
dạng bột trắng hoặc trắng hơi vàng. Rất khó tan trong nước, khó tan trong ethanol
96 %, hơi tan trong cloroform, thực tế không tan trong ether. [6]

Triemthoprim được sử dụng trong các trường hợp điều trị đợt cấp của viêm
phế quản mạn, dự phòng lâu dài nhiễm khuẩn tiết niệu tái phát, nhiễm khuẩn tiết
niệu dưới cấp tính nhạy cảm với trimethoprim, viêm phổi do Pneumocystis carinii.
Hiện nay so khả năng kháng các thuốc nhóm sulfamid ngày càng cao nên
người ta thường sử dụng dạng phối hợp giữa sulfamethoxazol và trimethoprim để
tăng cường khả năng kháng khuẩn của thuốc. Bản chất của sulfamethoxazol là một
sulfonamid, ức chế cạnh tranh sự tổng hợp acid folic của vi khuẩn. Trimethoprim là
một dẫn chất của pyrimidin, ức chế đặc hiệu enzym dihydrofolat reductase của vi
khuẩn. Khi phối hợp trimethoprim và sulfamethoxazol như vậy sẽ ức chế hai giai
đoạn liên tiếp của sự chuyển hóa acid folic, do đó ức chế có hiệu quả việc tổng hợp
purin, thymin và cuối cùng DNA của vi khuẩn. Sự ức chế nối tiếp này có tác dụng
diệt khuẩn. Cơ chế hiệp đồng này cũng chống lại sự phát triển vi khuẩn kháng thuốc
và làm cho thuốc có tác dụng ngay cả khi vi khuẩn kháng lại từng thành phần của
thuốc. [2]
1.3. Tổng quan về phương pháp phân tích các hoạt chất nhóm sulfamid
1.3.1. Phương pháp định tính sulfamid
 Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Phương pháp sắc ký lớp mỏng là một phương pháp khá đơn giản được sử
dụng để định tính các sulfamid. Trong phương pháp này người ta thường sử dụng
các hệ dung môi khai triển như dicloromethan- methanol- acid formic khan
(70:20:10) để định tính sulfaguanidin; hệ cloroform - methanol - dimethylformamid
(20 : 2 : 1), hoặc cloroform - methanol (19 :1) để định tính sulfamethoxazol; hệ
heptan - cloroform - dung dịch methanol 5 % (v/v) trong ethanol - acid acetic băng
tỷ lệ (4 : 4 : 4 : 1) để định tính sulfadoxin [1]. Tiến hành chấm riêng biệt mỗi dung
dịch lên bản mỏng silica gel GF254. Triển khai sắc ký tới khi dung môi đi được
khoảng 15 cm, lấy bản mỏng ra để ở nhiệt độ phòng. Quan sát dưới ánh sáng tử
ngoại ở bước sóng 254 nm. Vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch thử phải phù
hợp về vị trí, màu sắc và kích thước với vết chính trên sắc ký đồ của dung dịch đối
chiếu.

 Phương pháp phổ hồng ngoại
Phương pháp phổ hồng ngoại cho phép nhận dạng sự xuất hiện và có mặt của
các nhóm chức đặc trưng [13, 7]. Cụ thể, xác định sự có mặt nhóm sulfoamid bậc 2
(-SO2-NH-) cho các băng sóng hấp thu ở gần 3265 cm-1
, dị vòng isoxazol có băng
sóng hấp thụ dao động trong vùng 3500- 3200 cm-1
, băng sóng hấp thụ ở 3335 cm-1
thuộc về dao động hóa trị của nhóm N-H (amin bậc 2). Băng sóng hấp thụ ở vùng
3100- 3000 cm-1
thuộc về dao động hóa trị của nhóm C-H thuộc vòng aren. Các dao
động hóa trị của C=N- thuộc vùng 1250-1020 cm-1
, vùng 1360- 1250 cm-1
là dao
động hóa trị của C-N (vòng thơm), vùng 1340-1250 cm-1
là vùng dao động hóa trị
của nhóm N-H (amin thơm bậc một).
Để định tính các mẫu thuốc, tiến hành đo phổ IR của các mẫu thử sau đó so
sánh với phổ IR của mẫu chuẩn trong các thư viện phổ tham chiếu.
1.3.2. Phương pháp định lượng
1.3.1.1. Phương pháp chuẩn độ thể tích
- Dựa trên cơ sở phản ứng diazo hóa các sulfamid trong môi trường acid các
Sulfamid được xác định theo phương pháp chuẩn độ nitrit chậm, điểm tương đương
được phát hiện bằng phương pháp chuẩn độ điện thế [1]. Đây là một phương pháp
định lượng rất nhanh chóng, đơn giản, tiết kiệm được áp dụng phổ biến để xác định
các Sulfamid trong dược phẩm
- Nhóm tác giả D. Amin, B. Shaba và các cộng sự đã sử dụng dung dịch
brôm làm thuốc thử để xác định các sulfamid trong dược phẩm bằng phương
pháp chuẩn độ gián tiếp [17]. Theo đó phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng
của các sulfamid với một lượng dư nước brom bão hòa để tạo thành các dẫn xuất
N- bromo tương ứng, quá trình này giải phóng một lượng tương đương của iot
khi phản ứng với iot. Iot tự do có thể được xác định bằng phương pháp chuẩn độ
vởi natri thiosulfat, sử dụng hồ tinh bột làm chỉ thị. Hiệu suất thu hồi của phương
pháp là từ 97,8- 102,1 %, hệ số biến thiên là từ 0,1- 2,2 % tùy thuộc vào hàm
lượng của các sulfamid trong dược phẩm.

1.3.1.2. Phương pháp trắc quang
Nhóm tác giả Nagaraja P1, Naik SD và cộng sự đã tìm ra một phương pháp
đơn giản, có độ nhạy cao dùng để xác định một số sulfamid trong các chế phẩm
dược [30]. Phương pháp này dựa trên cơ sở phản ứng diazo hóa của sulfacetamid,
sulfadiazin, sulfaguanidin, sulfamerazin, sulfamethazin, sulfamethoxazol và các liên
kết của chúng với 8-hydroxyquinolin trong môi trường kiềm tạo ra sản phẩm màu
đỏ có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng 500 nm. Nồng độ tuân theo định luật Beer từ
0,1 đến 7,0 mg/ml. Giới hạn phát hiện và giới hạn đinh lượng của phương pháp lần
lượt là 0,03- 0,05 và 0,11-0,18 mg/ml. Độ chính xác của phương pháp là từ 97,3-
100,8 %. Phương pháp này khá thành công trong việc định lượng các sulfamid
trong các mẫu dược phẩm.
Cũng trên cơ sở phản ứng diazo hóa các sulfamid các tác giả Padmarajaiah
Nagaraja, Hemmige S Yathirajan, Kallanchira R Sunitha, Ramanathapura A
Vasantha [31] lại đưa ra phương pháp xác định các sulfamid như sulfathiazol,
sulfadiazine, sulfacetamid, sulfamethoxazol, sulfamerazin, sulfaguanidin và
sulfamethazin trong dược phẩm dựa trên phản ứng diazo hóa các sulfamid trên, sau
đó tiến hành tạo phức với dopamine trong sự có mặt của ion molybdat trong môi
trường acid H2SO4 tỷ lệ (1:1). Sản phẩm của phản ứng này là dung dịch có màu đỏ
có độ hấp thụ trong vùng từ 490-510 nm, các dung dịch này có độ bền trong 48 giờ
tại 27C. Nồng độ tuân theo định luật Beer từ 0,04 đến 8,0 µg/ml. Phương pháp này
được áp dụng thành công trong việc xác định các sulfamid trong các sản phẩm
thuốc viên và thuốc nhỏ mắt. Các tá dược trong thuốc không ảnh hưởng đến kết quả
đo. Do đó đây là phương pháp khá đơn giản, nhanh chóng, kinh tế và có độ nhạy
cao áp dụng để phân tích các sulfamid tron dược phẩm mà không cần chiết tách hay
gia nhiệt.
1.3.1.3. Phương pháp trắc quang kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến
Phương pháp trắc quang kết hợp với các thuật toán hồi quy đa biến như: bình
phương tối thiểu thông thường (CLS), bình phương tối thiểu từng phần (PLS ), hồi
qui cấu tử chính ( PCR) là một phương pháp khá đơn giản, nhanh chóng và tiết

kiệm để xác định đồng thời các thuốc kháng khuẩn như sulfamid và trimethoprim
trong dược phẩm. Tập hợp các dung dịch mẫu được hòa tan và pha loãng với dung
dịch ethanol pH = 9,9 đến nồng độ thích hợp và đo phổ hấp thụ trong vùng bước
sóng từ 200- 350 nm. Tiến hành nghiên cứu trên 5 hoạt chất: sulfadiazin,
sulfadimidin, sulfamethoxazol, sulfanilamid and trimethoprim xác định được
khoảng tuyến tính của các đường chuẩn đơn biến đều nằm trong khoảng nồng độ từ
1,0 – 24,0 mg/l, giới hạn phát hiện là 0,2 – 1,0 mg/l. Mô hình chuẩn của ba phương
pháp đa biến được xây dựng trên cơ sở dữ liệu phổ của các mẫu hỗn hợp chứa đồng
thời các hoạt chất trên. Kết quả phân tích cho thấy độ thụ hồi của hai mô hình PCR
và PLS xấp xỉ 100 %, trong khi mô hình CLS có độ thu hồi kém hơn hẳn. Mô hình
PCR dựa trên ma trận dữ liệu thô đã được lựa chọn áp dụng cho việc phân tích xác
định hàm lượng năm hoạt chất nghiên cứu trong các loại thuốc thành phẩm. [39]
1.3.1.4. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao
Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là phương pháp phổ biến có độ
chính xác, độ nhạy cao, giới hạn phát hiện thấp được áp dụng rộng rãi để xác định
các sulfamid trong các sản phẩm dược phẩm.
Theo đó Sulfadoxin (trong viên nén Sulfadoxin và pyrimethamin) được định
lượng bằng phương pháp sắc ký lỏng với hệ pha động là: Dung dịch đệm pH 5,9 -
acetonitril (4 : 1). Dung dịch đệm pH 5,9: Thêm 1 ml triethylamin và 200 ml
acetonitril vào 700 ml nước, điều chỉnh đến pH 5,9 bằng dung dịch acid acetic 1 %,
sau đó thêm nước vừa đủ 1000 ml, trộn đều, lọc. Điều kiện sắc ký: Cột thép không
gỉ (30 cm × 3,9 mm) được nhồi pha tĩnh B (5 m) với detector quang phổ tử ngoại
đặt ở bước sóng 230 nm, tốc độ dòng: 2,0 ml/phút, thể tích tiêm: 20 l. [1].
Theo dược điển Mỹ USP 34- NF 29 [37] Sulfamethoxazol (trong hỗn hợp
thuốc chứa Sulfamethoxazol và trimethoprim) được xác định với điều kiện sắc ký:
Cột C 18 (250 x 4,6 mm; 5µm), detector UV: 254 nm, tốc độ dòng: 1,8 ml/ phút,
thể tích tiêm: 20 µl. Pha động: 700ml nước + 200ml Acetonitril + 1ml triethylamin
(điều chỉnh pH 5,9 ± 0,1 bằng dung dịch acid acetic 1% hoặc dung dịch natri
hydroxyd 0,2N, thêm nước vừa đủ 1000 ml.

Nhóm tác giả Cemal Akay, Sibel A. Ozkan [16] đã tiến hành nghiên cứu
thành công quy trình định lượng Sulfamethoxazol (trong hỗn hợp thuốc chứa
Sulfamethoxazol và trimethoprim) theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với
pha động là hỗn hợp của methanol : nước (60: 40) điều chỉnh đến pH=3,0 bằng acid
phosphoric 10 %. Điều kiện sắc ký: Cột C18, detector quang phổ tử ngoại đặt ở bước
sóng 213 nm, tốc độ dòng 1,8 ml/min, thể tích tiêm 10 l. Khoảng tuyến tính của
phương pháp là từ 2,0-10,0 µg/ ml đối với trimethoprim và từ 10,0- 50,0 0 µg/ ml
đối với sulfamethoxazol. Giới hạn phát hiện tương ứng với trimethoprim và
sulfamethoxazol lần lượt là 0,45 và 1,21 µg/ ml.
1.4. Phương pháp quang phổ kế hồng ngoại gần và trung bình kết hợp với
thuật toán hồi quy đa biến
1.4.1. Sơ lược về phương pháp quang phổ hồng ngoại
1.4.1.1. Lịch sử ra đời của phương pháp phân tích phổ hồng ngoại
Quang phổ hồng ngoại gần lần đầu tiên được sử dụng vào năm 1881 bởi
Abney và Festing khi làm việc với các tấm ảnh [25]. Họ đã phát hiện ra sự tồn tại
của các bức xạ nhiệt ở ngoài vùng phổ của ánh sáng nhìn thấy và chứng minh được
sự hấp thụ của các bức xạ này có liên quan đến các thành phần hóa học trong các
hợp chất nghiên cứu. Wiliam W.Coblentz là một trong những người tiên phong đầu
tiên nghiên cứu về quang phổ hồng ngoại. Năm 1905, ông công bố kết quả nghiên
cứu của các hợp chất mà ông ghi lại từ 1000 nm đến 16.000 nm. Việc Coblentz
công bố kết quả đã tạo ra một bước đột phá mới cho các nhà nghiên cứu, có liên
quan đến quang phổ của các nhóm nguyên tử trong phân tử, liên quan đến sự hấp
thụ ở giữa (2500-50,000nm). Từ đó, chúng ta có thể hiểu về liên kết hóa học như
dao động giữa hai hay nhiều nguyên tử, các liên kết sẽ dao động và khi năng lượng
được bổ sung thì các dao động này sẽ mạnh hơn. Dao động hóa trị đòi hỏi năng
lượng cao hơn so với dao động biến dạng.
1.4.1.2. Nguyên tắc của phép đo phổ hồng ngoại
Phương pháp phân tích theo phổ hồng ngoại là một trong những kĩ thuật
phân tích rất hiệu quả. Một trong những ưu điểm quan trọng nhất của phương pháp

phổ hồng ngoại vượt hơn những phương pháp phân tích cấu trúc khác (nhiễu xạ tia
X, cộng hưởng từ điện tử…) là phương pháp này cung cấp thông tin về cấu trúc
phân tử nhanh, không đòi hỏi các phép tính toán phức tạp.[27]
Kỹ thuật này dựa trên hiệu ứng đơn giản là: các hợp chất hóa học có khả
năng hấp thụ chọn lọc bức xạ hồng ngoại. Sau khi hấp thụ các bức xạ hồng ngoại,
các phân tử của các hợp chất hóa học dao động với nhiều vận tốc dao động và xuất
hiện dải phổ hấp thụ gọi là phổ hấp thụ bức xạ hồng ngoại. [7]
Các đám phổ khác nhau có mặt trong phổ hồng ngoại tương ứng với các
nhóm chức đặc trưng và các liên kết có trong phân tử hợp chất hóa học. Bởi vậy,
phổ hấp thụ hồng ngoại là phổ dao động quay vì khi hấp thụ bức xạ hồng ngoại thì
cả chuyển dộng dao động và chuyển động quay đều bị kích thích. Bức xạ hồng
ngoại (IR) là một vùng phổ bức xạ điện từ rộng nằm giữa vùng trông thấy và vùng
viba, vùng này có thể chia thành ba vùng nhỏ:
 Hồng ngoại gần (near infrared): 14000- 4000 cm-1
(0,8- 2,5µm).
 Hồng ngoại trung (medium infrared): 4000- 400 cm-1
(25- 2,5μm).
 Hồng ngoại xa (far infrared): 400- 10 cm-1
(50-100µm).
Hầu hết các nhóm nguyên tử trong các hợp chất hữu cơ hấp thụ ở vùng 4000-
650cm-1
. Vùng phổ từ 4000-1500 cm-1
được gọi là các vùng nhóm chức vì chứa hầu
hết các vân hấp thụ của các nhóm chức như OH, NH, C=O, C=N, C=C…Vùng phổ
nhóm chức tập trung làm bốn vùng mà mỗi vùng, tần số đặc trưng nhóm có giá trị
thay đổi phụ thuộc vào cấu tạo phân tử. Vùng 3650-2400 cm-1
chứa các vân dao
động hóa trị của X-H (X:O, N, C, S, P…); vùng từ 2400-1900 cm-1
gồm các vân
dao động hóa trị của các nhóm mang liên kết ba hoặc hai liên kết đôi kề nhau; vùng
1900-1500 cm-1
chứa các vân dao động hóa trị của các nhóm mang liên kết đôi và
do dao động biến dạng của nhóm –NH2. Vùng phổ từ 1500-700 cm-1
, mặc dù chứa
các vân hấp thụ đặc trưng cho dao động hóa trị của các liên kết đơn như C-C, C-N,
C-O…và các vân do dao động biến dạng của các liên kết C-H, C-C… nhưng thường
được dùng để nhận dạng toàn phân tử hơn là để xác định các nhóm chức, vì ngoài
các vân hấp thụ trên còn có nhiều vân hấp thụ xuất hiện do tương tác mạnh giữa các

dao động. Các vân hấp thụ này đặc trưng cho chuyển động của các phân tử chứ
không thuộc riêng nhóm nguyên tử nào, và vì vậy, vùng phổ này thường được gọi là
vùng chỉ vân tay. Vùng phổ từ 650-250 cm-1
cung cấp các thông tin có giá trị đối
với hợp chất vô cơ và phức chất, vì chứa các vân phổ liên quan đến dao động hóa trị
của C-Br, C-I và M-X(M- kim loại;O,N,S,C…) nhưng không phải máy hồng ngoại
nào cũng đo được ở vùng này.[7]
1.4.1.3. Điều kiện hấp thụ bức xạ hồng ngoại
Không phải bất kỳ phần tử nào cũng có khả năng hấp thụ bức xạ hồng ngoại.
Mặt khác bản thân sự hấp thụ đó cũng có tính chất chọn lọc. Một phân tử chỉ có khả
năng hấp phụ bức xạ hồng ngoại khi chúng phải thỏa mãn 2 yếu tố sau [7]. Một là
tần số dao động tự nhiên của một phần phân tử (các nguyên tử hoặc nhóm nguyên
tử cấu tạo nên phân tử đó) bằng chính tần số dao động cùng tần số của bức xạ tới.
Hai là phân tử đó phải có momen lưỡng cực, vì khi phân tử lưỡng cực được giữ
trong điện trường, các điện tích trái dấu sẽ chịu ảnh hưởng bởi các lực theo những
chiều ngược nhau, và làm các nguyên tử tích điện này dao dộng, chúng hấp thụ bức
xạ hồng ngoại. Vì vậy các phân tử như O2, N2 không xuất hiện phổ hấp thụ hồng
ngoại.
1.4.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu đo phổ hồng ngoại
Tín hiệu đo phổ hồng ngoại đặc trưng cho tần số dao động của phân tử [7].
Do đó phổ hồng ngoại bị ảnh hưởng bởi các yếu tố chính như sau:
Ảnh hưởng do cấu trúc của phân tử: do tần số dao động của phân tử phụ
thuộc vào sự bền vững của liên kết, các hiệu ứng electron, hiệu ứng không gian và
liên kết nội phân tử.
Ảnh hưởng do tương tác giữa các phân tử: ở trạng thái khí các phân tử
chuyển động tự do và hầu như không có tương tác với nhau nên phổ hồng ngoại của
các chất ở thể kí phản ánh khá trung thực cấu trúc của phân tử. Tuy nhiên kỹ thuật
đo mẫu ở thể khí lại rất phức tạp, do đó thường đo mẫu hồng ngoại ở dạng rắn hoặc
dạng lỏng. Các phân tử ở dạng rắn có thế tồn tại dưới dạng các tinh thể khác nhau,
do đó phổ hồng ngoại của chúng có thể sẽ bị thay đổi do tương tác giữa cấc phân tử

khi thay đổi mạng tinh thể. Khi phân tử tồn tại ở các hệ dung môi khác nhau thì hấp
thụ hồng ngoại cũng khác nhau, nguyên nhân là do sự tạo thành liên kết hidro giữa
các phân tử làm dịch chuyển số sóng và mở rộng các vân hấp thu.
Ảnh hưởng của cường độ và hình dạng vân phổ hồng ngoại: Phương pháp
định lượng bằng phổ hồng ngoại có độ chính xác không cao còn do hệ số hấp thu
mol ít lặp lại giữa các lần đo. Ngoài ra khi trong quá trình ép viên mẫu rất khó có
thể xác định chính xác được độ dày viên mẫu (do mỗi viên mẫu chỉ có kích thước
tầm vài µm). Bên cạnh đó trạng thái vật lý, dung môi, nhiệt độ, đều đóng góp vào
ảnh hưởng đến cường độ, hình dạng peak của hợp chất [18].
1.4.1.5. Các kỹ thuật chuẩn bị mẫu và đo phổ hồng ngoại
 Các kỹ thuật đo phổ hồng ngoại
Hiện nay có hai phương pháp chính để đo phổ hồng ngoại là phương pháp đo
hấp thụ và phương pháp đo phản xạ. Hai phương pháp này được đặc trưng bởi hai
loại phổ kế là: phổ kế tán sắc và phổ kế biến đổi Fourier. Kỹ thuật đo phổ tán sắc là
loại phổ biến trước đây, máy ghi phổ quét trong cả vùng từ 4000 cm-1
đến 200 cm-1
,
tốc độ quét khoảng 1 phút/ mẫu nhanh hơn nhiều so với loại máy hồng ngoại sơ
khai đầu tiên nhưng vẫn rất chậm để phân tích thời gian thực. Phổ kế hồng ngoại
hiện đại là loại phổ kế biến đổi Fourier. Loại phổ kế mới này khác loại phổ kế tán
sắc cũ là thay bộ đơn sắc (lăng kính hoặc cách tử) bằng một giao thoa kế
Michelson cho phép khe sáng rộng hơn nên cường độ bức xạ vào detector cũng sẽ
lớn hớn. Tỉ lệ tín hiệu trên nhiễu (S/N) tăng lên nhờ giảm được nhiễu do đó phổ
nhận được có chất lượng tốt hơn, đặc biệt thời gian ghi phổ nhanh, chỉ khoảng 30
giây. Khi kết hợp với sự hỗ trợ của máy tính kết nối giúp cho việc đo phổ được tự
động hóa ở mức cao và phổ có thể được lưu trữ và đối chiếu với phổ chuẩn có trong
thư viện của máy. [7]
 Các kỹ thuật chuẩn bị mẫu
Phép đo phổ hồng ngoại cho phép đo các chất ở thể rắn, thể lỏng tinh khiết,
trong dung dịch hoặc thể hơi. Đối với mỗi thể khác nhau chúng ta có các cách
chuẩn bị mẫu tương ứng như sau:[7, 12]

- Mẫu ở thể rắn: có hai cách đo khi mẫu ở thể rắn
Phương pháp Nujol: trộn mẫu với parafin lỏng, nghiền kỹ và đều rồi bôi một
lớp mỏng lên mặt tấm cửa sổ, sau đó đặt vào giá cuvet để đo trên máy.
Phương pháp ép KBr (film): trộn mẫu thật đồng đều với bột KBr theo tỷ lệ
khối lượng/ khối lượng là 1:10 đến 1:100, nghiền kỹ bằng cối mã não. Ép mẫu
thành màng mỏng gần như trong suốt bằng bộ ép viên cầm tay hoặc máy ép thủy
lực, đặt mẫu vào giá đỡ cuvet để đo.
- Mẫu ở thể lỏng tinh khiết: chuẩn bị mẫu bằng cách ép một lượng nhỏ chất
lỏng giữa hai tấm NaCl để có một màng mỏng dày khoảng 0,01- 0,1 mm.
- Mẫu trong dung dịch: Thông thường dung dịch 1-5% của hợp chất được đưa
vào cuvet đặc biệt có độ dài 0,1 -1 mm và được làm bằng NaCl. Để loại bỏ các chất
hấp thụ của dung môi, một cuvet so sánh có chứa dung môi tinh khiết được đặt ở tia
sáng.
- Mẫu ở thể hơi: Hơi hay khí được đưa vào trong cuvet đặc biệt thường có độ
dài 10 cm và có thành làm bằng NaCl cho phép bức xạ IR truyền qua. Trong thực tế
để phân tích các chất hữu cơ phức tạp, người ta thường sử dụng máy hồng ngoại
được ghép với máy sắc ký khí, khi đó mỗi hợp phần sau khi được tách ra từ hệ sắc
ký khí sẽ được ghi phổ hồng ngoại và được lưu giữ lại trong máy tính.
1.4.1.6. Một số ứng dụng của phương pháp phổ hồng ngoại
Cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật phương pháp đo phổ hồng
ngoại ngày càng chứng minh được tính ưu việt của mình và dần trở thành phương
pháp ứng dụng trong nhiều lĩnh vực. Dưới đây là một số những ứng dụng chính của
phương pháp này trong phân tích dược phẩm.
- Xác định kích thước hạt: sự khác nhau về kích thước hạt thường được quan
sát thấy dưới dạng một đường nền dốc, tăng lên về phía các bước sóng dài. Năm
1985, tác giả Ciurczak đã chứng minh rằng có sự liên hệ tuyến tính giữa độ hấp thụ
tại bất kì bước sóng nào với kích thước hạt. [21]
- Độ ẩm: hàm lượng nước trong các mẫu là nguyên nhân chính gây ra hệ số
suy giảm cường độ hấp thụ trong phổ hồng ngoại của các vật liệu dược phẩm. Dựa

vào đặc tính này J. Luypaert và các đồng nghiệp đã sử dụng NIR để xác định hàm
lượng nước thông qua việc xác định độ ẩm của mẫu với nhiều loại hoạt chất. [25]
- Độ cứng: đây là một trong các ứng dụng quan trọng của phương pháp hồng
ngoại trong quá trình quản lý chất lượng của quá trình sản xuất. Phương pháp IR có
thể xác định được độ cứng của viên thuốc trong quá trình ép viên mà không cần phá
mẫu. Sự thay đổi về độ cứng của thuốc có thể dược quan sát dưới dạng đường phổ
nền dốc dịch chuyển khi độ cứng tăng lên thì độ hấp thụ cũng tăng lên. Điều này rõ
rệt hơn ở các bước sóng dài bởi hiệu ứng tán xạ của ánh sáng. [25, 29]
- Định lượng các hoạt chất trong dung môi hay trong hỗn hợp [7]: Cơ sở của
phương pháp này dựa trên phương trình định luật Lambert – Beer biểu hiện mối
quan hệ giữa sự hấp thụ ánh sáng và nồng độ chất:
Log =
Theo phương trình trên, ở một bước sóng xác định, sự hấp thụ ánh sáng tỷ lệ
với nồng độ C, chiều dày cuvet d và bản chất của chất mẫu. Như vậy, khi phân tích
một chất, đo ở một bước sóng xác định với một cuvet có chiều dày d đã biết thì độ
hấp thụ quang A chỉ còn tỷ lệ với nồng độ C của mẫu chất. Do phương trình trên chỉ
chính xác với dung dịch có nồng độ loãng nên phương pháp phân tích định lượng
bằng phổ hồng ngoại chỉ áp dụng đo trong dung dịch, còn theo phương pháp ép mẫu
rắn (ép KBr) thì chỉ phân tích bán định lượng do tín hiệu độ hấp thụ quang bị ảnh
hưởng bởi các yếu tố như tính chất vật lý, nhiệt độ, độ ẩm, độ dày viên mẫu.
Phương pháp phổ hồng ngoại chỉ có thể áp dụng để phân tích định lượng hỗn hợp
các mẫu khi sử dụng các thuật toán hồi quy chemometris.
1.4.2. Định lượng các chất bằng phương pháp phổ hồng ngoại gần và trung
bình kết hợp với chemometrics
1.4.2.1. Cơ sở lý thuyết của phương pháp hồi quy đa biến
Chemometrics được định nghĩa là việc ứng dụng các phương pháp toán học,
thống kê, đồ hoạ,… để qui hoạch thực nghiệm, tối ưu hoá các thông tin hoá học
trích ra từ tập số liệu phân tích và đưa ra tối đa những thông tin hữu ích từ tập số

liệu ban đầu [8]. Ra đời từ những năm đầu của thập kỉ 70, cho tới nay
Chemometrics đã xác lập được một vị trí quan trọng cho mình trong ngành hoá học,
đặc biệt là trong hoá học phân tích hiện đại. Một mảng lớn trong Chemometrics
phát triển nhanh gắn liền với toán học và tin học là hồi qui đa biến – kỹ thuật đa
biến được dùng rộng rãi trong phòng thí nghiệm hoá học giúp giải quyết các bài
toán xác định đồng thời nhiều cấu tử cùng có mặt trong hỗn hợp mà không cần tách
loại trước. Về nguyên tắc, chỉ cần xây dựng dãy mẫu chuẩn có mặt tất cả các cấu tử
cần xác định với nồng độ biết trước trong hỗn hợp (các biến độc lập x), đo tín hiệu
phân tích của các dung dịch này dưới dạng một hay nhiều biến phụ thuộc y và thiết
lập mô hình toán học mô tả quan hệ giữa hàm y (tín hiệu đo) và các biến độc lập x
(nồng độ các chất trong hỗn hợp). Dựa trên mô hình này có thể tìm được nồng độ
của các cấu tử trong cùng mẫu định phân khi có tín hiệu phân tích của dung dịch đó.
Trong luận văn này chúng tôi đã sử dụng phương pháp phổ hồng ngoại gần
và trung bình kết hợp với các thuật toán hồi quy đa biến tuyến tính để định lượng
các sulfamid. Tùy thuộc vào đặc điểm của hàm phụ thuộc, có thể chia các phương
pháp hồi qui đa biến tuyến tính thành 2 nhóm chính: các phương pháp hồi qui đa
biến tuyến tính sử dụng phổ toàn phần như phương pháp CLS, PLS, ... và phương
pháp sử dụng dữ liệu phổ riêng phần như ILS.
 Phương pháp bình phương tối thiểu thông thường (classical least square-
CLS)
- Từ dạng tổng quát y = XK +e (1)
K là vecto hệ số của phương trình hồi qui. K là ma trận (kx1) nếu y là véc tơ
cột biểu diễn tín hiệu đo của một dung dịch chuẩn với y là vecto (mx1), X là ma
trận (mxk), và e là vecto số dư (mx1). K là ma trận (kxp) nếu y là số liệu dạng ma
trận (mxp) biểu diễn tín hiệu của dung dịch chuẩn được đo tại nhiều thời điểm (ví
dụ đo độ hấp thụ quang tại p bước sóng).

 Phương pháp bình phương tối thiểu nghịch đảo (inverse least squares-
ILS)
Phương pháp bình phương tối thiểu nghịch đảo (ILS) hay còn gọi là phuơng
pháp ma trận P được xây dựng trên giả thiết rằng nồng độ của tín hiệu phân tích là
hàm của tín hiệu đo [4, 5, 8]:
C = P . A
Trong phương pháp hồi qui đa biến, phương trình trên có thể khai triển
thành:
C1 = P11A1 + P12A2 + … + P1mAm
C2 = P21A1 + P22A2 + … + P2mAm
…
Cx = Px1A1 + Px2A2 + … + PxmAm
Trong đó:
Am : Giá trị tín hiệu đo ở thời điểm m
Pxm : Giá trị hệ số hồi qui của cấu tử thứ x tại thời điểm m.
Cx : Nồng độ cấu tử thứ x.
Các bước tính toán trong mô hình ILS bao gồm
* Xây dựng các ma trận dữ liệu chuẩn:
Để xây dựng đường chuẩn sử dụng kĩ thuật ILS ta cần xác định ma trận hệ số
hồi qui P từ mẫu chuẩn có ma trận nồng độ C và ma trận tín hiệu đo A. P là ma trận
chứa hệ số hồi qui của phương trình, trong đó mỗi hàng chứa hệ số hồi qui của một
cấu tử, vì vậy số hàng của P là số cấu tử, số cột là số thời điểm đo.
Do trong tập số liệu C và A đều có chứa sai số ngẫu nhiên nên để P mô tả
chính xác quan hệ giữa C và A ta cần xác định P bằng phương pháp bình phương tối
thiểu (tổng bình phương của sai số giữa giá trị tính theo mô hình và giá trị thực
nghiệm là nhỏ nhất).
* Xác định công thức tính P:
C = A . P

AT
. C= AT
. A . P
[AT
. A]-1
. AT
. C = [AT
. A]-1
. [AT
. A] . P
[AT
. A]-1
. AT
. C = P
Để ma trận nghịch đảo của [AT
. A] - nghịch đảo giả của A - tồn tại, A cần có
số hàng tối thiểu bằng số cột. Mỗi hàng trong A là tín hiệu của một mẫu, mỗi cột là
tín hiệu của các mẫu ở một thời điểm nhất định. Vì vậy, trong phương pháp ILS số
mẫu không được ít hơn số thời điểm đo. Do yêu cầu về số mẫu tối thiểu như trên
nên để tiến hành sử dụng phương pháp này, ta cần lựa chọn số thời điểm đo tối
thiểu đặc trưng nhất trên toàn dải phổ, vì vậy, phương pháp ILS còn được gọi là
phương pháp phổ riêng phần. Các điểm đo đặc trưng này thường là những điểm
thỏa mãn các yêu cầu sau:
- Giá trị tín hiệu đo tại các thời điểm này lớn so với các điểm đo khác để tăng
độ nhạy.
- Tín hiệu của các cấu tử khác nhau tại mỗi điểm đo được lựa chọn phải biến
đổi khác nhau tức là có sự khác biệt lớn về tín hiệu đo tại mỗi điểm của các cấu tử.
- Tại các điểm này, tín hiệu của các ion cản trở phép đo là nhỏ nhất.
* Dự đoán thông tin của mẫu chưa biết:
Với mẫu chưa biết nồng độ, từ ma trận tín hiệu đo Aunk của mẫu sẽ xác định
được nồng độ các chất dựa vào ma trận P đã tính:
Cunk = Aunk . P
 Phương pháp bình phương tối thiểu từng phần (partial least square-PLS )
PLS là phương pháp đa biến dùng để mô hình hoá mối quan hệ giữa biến độc
lập X và biến phụ thuộc Y, từ đó có thể đoán được thông tin trong Y khi đã biết các
thông tin của X và ngược lại. PLS sẽ tối ưu hoá giá trị đồng phương sai (covariance)
giữa ma trận X và Y. Hai ma trận X và Y được phân tích thành một ma trận số
(score matrices) T chung và ma trận nạp (loading matrices) P và Q.
Hay X= T x P + E

Y= T x Q + F
Tính chất quan trọng của PLS là chúng ta có thể nhận được một ma trận T
chung cho cả 2 phương trình [4, 8].
 Phương pháp hồi qui cẩu tử chính (principal component regression-PCR)
PCR - phương pháp hồi quy cấu tử chính, gồm 2 quá trình: Phân tích cấu tử
chính chuyển sang tập dữ liệu mới, chứa một số ít các yếu tố quan trọng, cần thiết.
Sau đó sử dụng phương pháp bình phương tối thiểu nghịch đảo để phân tích tập dữ
liệu mới này.
Trước tiên, chiếu tập số liệu tín hiệu phân tích đó lên không gian có ít chiều
hơn theo PCA mà không làm mất đi các thông tin quan trọng và tiến hành phân tích
hồi qui đa biến trên không gian mới này. Nó giả thiết rằng mỗi thành phần trong tập
số liệu có thể được gán một giá trị định lượng đầu tiên cần tạo mô hình PCA cho tập
số liệu và sử dụng giá trị riêng của các biến ảo (score) để xây dựng phương trình hồi
qui đa biến tuyến tính trong đó giá trị y là giá trị hàm mục tiêu.
Cũng cần lưu ý rằng, do phương pháp này phát triển trên cơ sở của phương
pháp ILS nên để sử dụng được các phương pháp này trong phân tích phổ hồng
ngoại chúng ta cần số mẫu chuẩn tối thiểu phải bằng số thời điểm sử dụng trong
đường chuẩn mã hóa, tức là số mẫu chuẩn không nhỏ hơn số PC lựa chọn. Lấy một
ví dụ cụ thể, khi đo phổ của 15 mẫu chuẩn tại 100 bước sóng, để sử dụng phương
pháp ILS, chúng ta cần phải giảm kích thước phổ xuống số bước sóng không quá
15. Cách đơn giản nhất là chọn ít hơn 15 bước sóng để đo độ hấp thụ nhưng sai số
sẽ lớn nếu không chọn được các bước sóng đặc trưng cho phổ các chất. Với mô
hình PCR ta có thể sử dụng toàn phổ để tính các PC, sau đó chọn số PC nhỏ hơn 15
để tính toán tiếp. Thông thường, với một tập số liệu có mức độ tập trung tốt thì chỉ
có một số ít các PC đầu tiên là có nghĩa (có tổng phương sai tích lũy đủ lớn để coi
rằng chúng đã chứa toàn bộ thông tin hữu ích đặc trưng của tập số liệu). Như vậy,
sử dụng mô hình PCR có thể giảm được kích thước tập số liệu mà không làm mất
thông tin đồng thời có thể loại được tín hiệu nhiễu của dữ liệu gốc [4, 8].

* Các bước chính của PCR bao gồm:
1. Xử lý ban đầu (không bắt buộc)
Nội dung chính của bước này là chuẩn hóa tập số liệu.
2. Các xử lý cần thiết:
Với một tập số liệu đã chuẩn hóa hoặc chưa chuẩn hóa, trước khi sử dụng đều cần
bước bình phương toàn tập dữ liệu - đây là yêu cầu bắt buộc đối với hầu hết các
hàm tính vectơ riêng.
D = AT
. A
Trong đó A là ma trận số liệu biểu diễn độ hấp thụ quang theo các thời điểm đo của
các dung dịch chuẩn và AT
là ma trận chuyển vị của ma trận A.
3. Xác định các vectơ riêng hay các PC:
Có thể tính toán các vectơ riêng của tập số liệu bằng nhiều hàm toán học khác nhau.
Có 3 hàm chính, thường sử dụng là hàm NIPALS (hàm phi tuyến lặp sử dụng kĩ
thuật bình phương tối thiểu riêng phần), hàm SVD (hàm phân tách các giá trị riêng)
và hàm Princomp (hàm tính các cấu tử chính). Cần lưu ý rằng, tất cả các hàm này
đều tính toán và đưa ra tất cả các cấu tử nhưng thường không sử dụng tất cả mà chỉ
sử dụng N cấu tử đầu đủ để xác định không gian mới :
NIPALS là hàm lặp thường sử dụng cho các tập số liệu kích thước lớn hoặc
có độ đa cộng tuyến cao. Với tập số liệu có kích thước nhỏ, quá trình tính lặp trong
hàm NIPALS sẽ làm khuếch đại sai số của tập số liệu nên thông thường người ta
không sử dụng hàm này để tính các PC.
SVD là hàm tính PC sử dụng phương pháp tách tập số liệu ban đầu thành các
nhân tố. Các vectơ riêng và trị riêng của ma trận dữ liệu đều là những tập con riêng
của các nhân tố trong SVD. Hàm SVD sử dụng hình thức chéo hóa cho phép khống
chế thang đo một cách hợp lí nên giảm thiểu được sai số do làm tròn. Vì vậy hàm
này sử dụng được với các kiểu tập số liệu rộng rãi hơn hàm NIPALS.
Princomp là hàm tính toán trực tiếp các cấu tử chính (PC) có vai trò tương
đương các vectơ riêng. Tuy nhiên, so với hàm SVD thì việc sử dụng hàm Princomp
với tập số liệu lớn có ưu điểm là phương sai tập trung không cao nên vị trí các PC

sẽ chênh lệch không quá lớn, do đó sai số trong quá trình làm tròn số và chuyển hóa
tập số liệu sẽ nhỏ hơn.
Các hàm toán học trên đều đưa ra một ma trận cột chứa các vectơ riêng - Vc -
là ma trận trong đó mỗi cột là một vectơ hay nhân tố mới - PC - của ma trận dữ liệu
và số hàng ma trận là số thời điểm đo. Mỗi nhân tố hay vectơ này lại là tổ hợp bậc
nhất của các điểm phổ ban đầu, phần đóng góp của các điểm này vào mỗi vectơ là
khác nhau tùy thuộc vào giá trị hàm phụ thuộc tại điểm đó. Những điểm có giá trị
đóng góp lớn vào các PC chứa phương sai lớn sẽ là những điểm đo có ảnh hưởng
quyết định tới kết quả tính ma trận hệ số hồi qui và kết quả hồi qui sau đó. Ma trận
kết quả thứ hai cũng rất quan trọng là ma trận phương sai của các PC: đó là dạng ma
trận chéo đối với hàm SVD, là một vectơ cột đối với hàm NIPALS và hàm
Princomp.
4. Lựa chọn các vectơ có nghĩa
Đây là bước có ảnh hưởng đặc biệt quan trọng đến bước xử lý tiếp theo. Nếu
giữ lại nhiều vectơ hơn số cần dùng thì những vectơ đó sẽ chứa cả tín hiệu nhiễu và
như vậy, kết quả hồi qui sẽ mắc phải sai số. Nếu giữ lại không đủ số vecto cần thiết
sẽ làm mất đi thông tin có ích từ tập dữ liệu, điều này cũng sẽ gây nên sai lệch giữa
mô hình hồi qui thu được và mô hình thực. Vì vậy, việc đánh giá và lựa chọn các
vectơ có nghĩa là rất quan trọng. Dưới đây là một số phương pháp phổ biến để xác
định số PC có nghĩa :
 Dùng các hàm chỉ thị: Có rất nhiều hàm chỉ thị khác nhau như CPV
(tính phần trăm phương sai tích lũy), hàm IEF, ...
 Tính toán PRESS (tổng bình phương sai số dự đoán) để đánh giá thông
tin từ dữ liệu.
 Phương pháp đánh giá chéo
 Phương pháp đánh giá Xu – Kailath
 Đánh giá theo tiêu chuẩn Akaike
 Tính phương sai của sai số tái lập VRE

Các phương pháp này đều có những ưu điểm riêng khi sử dụng và kết quả
đánh giá tương đối thống nhất với nhau. Phương pháp được sử dụng rộng rãi để lựa
chọn các PC có nghĩa khi các PC này được tính bằng hàm SVD hay Princomp là
phương pháp tính và đánh giá qua phần trăm phương sai tích lũy của các PC đó.
Cách tính này đơn giản hơn và các hàm tính PC trên đã cho sẵn dữ liệu để có thể
đánh giá nhanh.
5. Tính toán lại
Sau khi loại bỏ các vectơ riêng không có nghĩa, chúng ta cũng loại được tín
hiệu nhiễu của dữ liệu gốc và cần tính lại dữ liệu sau khi loại bỏ sai số. Như vậy,
khi tính toán ở hệ tọa độ mới ta đã loại bỏ được tín hiệu nhiễu trong tập dữ liệu ban
đầu.
6. Xây dựng đường chuẩn
Khi xây dựng đường chuẩn PCR theo phương pháp ILS, điểm khác biệt duy
nhất là tập số liệu sử dụng.
Các bước tiến hành bao gồm:
- Xác định phép chiếu trong hệ tọa độ mới:
Aj = A . Vc
Trong đó:
Aj: ma trận số liệu ở hệ tọa độ mới
A: ma trận gốc
Vc: ma trận các vectơ riêng có nghĩa
- Thay thế A bằng Aj trong phương trình hồi quy
C = Aj . F , trong đó F được tính theo công thức:
F = (Aj
T
. Aj)-1
. Aj
T
. C
Nồng độ chất phân tích trong mẫu chưa biết được tính theo công thức:
Cx = Ax . Vc . F
= Ax . Fcal
với Fcal = Vc . F đóng vai trò tương tự ma trận P trong phương trình của ILS
Ưu điểm của phương pháp PCR:

- Hội tụ đầy đủ các ưu điểm của phương pháp ILS đồng thời khắc phục
được các nhược điểm của phương pháp ILS do tiến hành tính toán trên toàn phổ.
- Phương pháp này cho phép loại bỏ sai số nhiễu phổ và sai số ngẫu
nhiên trong quá trình đo khi lựa chọn được số PC phù hợp.
- Đối với trường hợp sử dụng phổ toàn phần, khi dùng các phương pháp
khác như CLS, kết quả tính cuối cùng là kết quả tính trung bình trên toàn phổ nên
kém chính xác hơn trường hợp dùng phổ chọn lọc. Khi sử dụng mô hình PCR, tuy
kết quả vẫn tính trên tất cả các điểm nhưng đóng góp của các điểm đo sẽ khác nhau
tùy theo lượng đóng góp của từng điểm này vào các PC được chọn mà lượng đóng
góp này lại được phân tích dựa trên tín hiệu đo tại từng điểm của các mẫu chuẩn.
Do có sự phân biệt và chọn lọc trong đánh giá mỗi điểm đo nên kết quả thu được sẽ
chính xác hơn phương pháp tính trung bình trên toàn phổ ở các phương pháp phổ
toàn phần khác [4, 8].
1.4.2.2. Xác định đồng thời các chất bằng phương pháp quang phổ hồng
ngoại gần và trung bình kết hợp với thuật toán hồi quy đa biến
Trong vòng hai thập kỷ trở lại đây NIR đã trở thành một trong những công
cụ hữu ích ứng dụng trong phân tích công nghiệp. Đây là một kỹ thuật phân tích rất
nhanh: chỉ với cần một máy quang phổ hồng ngoại ta có thể đo phổ hồng ngoại chỉ
trong vòng một vài giây [22]. So với phương pháp phân tích truyền thống để định
lượng hoạt chất thuốc là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thì định lượng chất hữu
cơ trong phổ hồng ngoại gần và trung bình có ưu điểm nổi trội về đơn giản trong
quá trình tiền xử lý mẫu, lượng mẫu phân tích ít, quá trình chuẩn bị mẫu đơn giản,
chi phí thấp do đó có thể hạn chế được các sai số trong quá trình chuẩn bị mẫu [25].
Tuy nhiên, NIR có một số nhược điểm như: giới hạn phát hiện cao do đó không phù
hợp với các phép phân tích lượng vết, không đưa ra được các thông tin đặc trưng
nếu chỉ đo tại một bước sóng. Kết quả đo phổ hồng ngoại chịu ảnh hưởng mạnh mẽ
của các thông số như điều kiện vật lý của mẫu, môi trường đo mẫu, độ dày của viên
mẫu, tỷ lệ ép viên. Vì thế NIR thường không được sử dụng như một kỹ thuật phân
tích trực tiếp.

Việc sử dụng phổ hồng ngoại kết hợp với các thuật toán hồi quy đa biến đã
góp phần đưa phương pháp phổ hồng ngoại tham gia vào các quá trình định lượng
mẫu. Năm 2011, Mafalda Cruz Sarraguca và các cộng sự [27] đã nghiên cứu thành
công phương pháp định lượng nhanh aminoglycosides bằng phép đo hồng ngoại
gần. Không giống như các phương pháp định lượng truyền thống là dựa trên cơ sở
các phản ứng dẫn xuất hay phương pháp xét nghiệm vi sinh để định lượng
aminoglycosides [34, 37], trong nghiên cứu này các tác giả đã đưa ra một phương
pháp hoàn toàn mới để xác định các hoạt chất này. Theo đó, phương pháp này đã
được phát triển dựa trên nền mẫu thuốc thương mại có chứa neomycin sulphate và
ba tá dược là lactose, bột talc và magnesi stearat. Các mẫu tổng hợp và mẫu thêm đã
được chế tạo cho mục đích này, đồng thời họ cũng đã sử dụng ba lô mẫu thuốc rắn
thương mại để thực hiện việc nghiên cứu xác định neomycin sulphate. Mẫu được
tiến hành đo phổ hồng ngoại gần với chế độ đo phản xạ sử dụng biến đổi Fourier.
Phương pháp hồi quy đa biến đã được sử dụng để hiệu chỉnh phổ hồng ngoại gần
phù hợp với hàm lượng neomycin sulphate. Nhóm nghiên cứu đã sử dụng phương
pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao để kiểm tra hàm lượng neomycin sulphate trong các
mẫu thương mại. Kết quả thu được cho thấy neomycin sulphate đã được xác định
thành công bằng phương pháp đo phổ hồng ngoại gần với sai số 6,6%.
Đối với roxithromycin thông thường người ta sẽ sử dụng phương pháp sắc ký
lỏng hiệu năng cao với các loại detector khác nhau để xác định. Tuy nhiên phương
pháp này đòi hỏi một lượng lớn hóa chất, dung môi để xử lý và chạy sắc ký. S.T.H.
Sherazi [33] đã sử dụng phương pháp hồng ngoại biến đổi Fourier để xác định
roxithromycin từ phổ của mẫu thuốc kết hợp với phương pháp hồi quy phân tích
thống kê đa biến. Phương pháp này cho phép rút ngắn thời gian phân tích xuống còn
khoảng 3 phút nên rất phù hợp để áp dụng kiểm tra nhanh các mẫu.
Thêm một ứng dụng thành công của phương pháp đo phổ hồng ngoại gần kết
hợp với kỹ thuật thống kê đa biến cho phép giám sát liên tục để phân tích đồng thời
glycerol và clavulanic acid trong một hỗn hợp kháng sinh phức tạp [32].

Phương pháp phổ hồng ngoại kết hợp với chemometric đã mở ra một kỷ
nguyên mới cho phép phân tích nhanh, hiệu quả, thân thiện với môi trường- công
nghệ hóa học xanh. Tuy nhiên, đây vẫn là một hướng nghiên cứu khả mới mẻ trên
thế giới. Hiện nay, tại phòng thí nghiệm Hóa phân tích thuộc AgroParisTech (Pháp),
nhóm nghiên cứu đã ứng dụng các thuật toán để xử lý các tín hiệu phân tích của hỗn
hợp các chất trong sự tương tác phức tạp đa biến và đưa ra các kết quả của từng
biến đã có rất nhiều nghiên cứu thu được kết quả tốt [20, 22, 24]. Đặc biệt, việc áp
dụng các thuật toán đã mở ra những phương pháp đo nhanh có thể đưa các phép
phân tích ra khỏi phòng thí nghiệm. Tại các nước như Mỹ, Anh cũng có giới thiệu
các thiết bị cầm tay để xác định thuốc giả. Các máy này đều có ưu điểm là khá gọn
nhẹ, nhưng có hạn chế là khi đo chất trong các nền khác nhau thường không đưa ra
được các kết quả có độ chính xác cao. Phần mềm và cơ sở dữ liệu của chúng lại
không cho phép can thiệp nên khó khăn trong việc bổ sung thêm cơ sở dữ liệu. Do
đó việc nghiên cứu phát triển phương pháp quang phổ hồng ngoại gần và trung bình
kết hợp với các thuật toán hồi quy đa biến để kiểm tra nhanh chất lượng thuốc là
một vấn đề vô cùng cần thiết.
Hiện tại chưa có một nghiên cứu nào về định lượng nhanh nhóm Sulfamid
bằng phương pháp quang phổ hồng ngoại gần và trung bình được công bố. Đây
chính là cơ sở để chúng tôi lựa chọn tiến hành nghiên cứu định lượng một số hoạt
chất thuốc kháng sinh thuộc nhóm Sulfamid bằng phương pháp quang phổ kế hồng
ngoại gần và trung bình. Kết quả thu được từ nghiên cứu này mở ra hướng nghiên
cứu mới sử dụng các thiết bị đơn giản để xác định nhanh các chất trong mẫu đo
phức tạp mà không cần phá mẫu hoặc xử lý nhanh tại chỗ, tạo điều kiện đưa phép
phân tích ra khỏi phòng thí nghiệm.

CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM
2.1. Nội dung và phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Nội dung nghiên cứu
Để xây dựng qui trình phân tích định lượng nhanh ba hoạt chất
sulfaguanidin, sulfamethoxazol và trimethoprim bằng phương pháp phổ hồng ngoại
kết hợp với chemometrics cần giải quyết các vấn đề sau:
- Nghiên cứu lựa chọn các điều kiện tối ưu để đo phổ IR trong vùng hồng
ngoại gần và trung bình của các hoạt chất sulfaguanidin, sulfamethoxazol và
trimethoprim.
- Nghiên cứu xây dựng thuật toán hồi qui đa biến tuyến tính, lựa chọn các
thông số tối ưu của các mô hình trên cơ sở của mẫu chuẩn.
- Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến tín hiệu đo độ hấp thụ của chất phân
tích trong vùng hồng ngoại gần và trung bình.
- Nghiên cứu xác định giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng của phương
pháp hồi quy đa biến xác định đồng thời các hoạt chất trên.
- Ứng dụng phương pháp nghiên cứu được để định lượng nhanh thành phần
hoạt chất trong các mẫu thuốc đang lưu thông trên thị trường. So sánh kết quả tìm
được với phương pháp tiêu chuẩn qui định trong dược điển
2.1.2. Phương pháp nghiên cứu
Cơ sở của phương pháp nghiên cứu là dựa vào phổ hấp thụ của ba hoạt chất
là sulfaguanidin, sulfamethoxazol (thuộc nhóm sulfamid) và trimethoprim (thường
dùng kết hợp với sulfamethoxazol để tăng cường khả năng kháng khuẩn của thuốc)
trong vùng phổ hồng ngoại từ 3600- 3000 cm-1
để định lượng nhanh các hoạt chất
trên trong dược phẩm bằng phương pháp hồi quy đa biến.
Tiến hành xây dựng mô hình hồi quy đa biến xác định một hoạt chất và các
tá dược gồm 25 mẫu chuẩn và 10 mẫu kiểm tra, mô hình hồi quy đa biến xác định
cả ba hoạt chất và các tá dược gồm 30 mẫu chuẩn và 15 mẫu kiểm tra bằng cách
chuẩn bị các mẫu chuẩn, mẫu kiểm tra theo như quy trình như dưới đây:

- Bước 1: chuẩn bị các mẫu chuẩn, mẫu kiểm tra chứa đồng thời các hoạt
chất là sulfaguanidin, sulfamethoxazol, và trimethoprim cùng với ba tá dược là tinh
bột sắn, maltodextrin, Ca3(PO4)2 với tỷ lệ thay đổi trong khoảng nồng độ khảo sát
sao cho tín hiệu độ hấp thụ thay đổi trong vùng tuyến tính.
- Bước 2: Nghiền và trộn từng mẫu trong 15 phút để hỗn hợp được đồng
nhất.
- Bước 3: Lấy 2 mg chất vừa trộn được trộn với 98 mg KBr rồi tiến hành
nghiền mịn đồng nhất mẫu trong cối mã não trong 10 phút.
- Bước 4: Lấy khoảng 15 mg lượng bột vừa nghiền được cho vào bộ ép viên
để thu được viên mẫu đem đo phổ hồng ngoại trong vùng phổ nghiên cứu từ 3600-
3000 cm- 1
, ghi lại độ hấp thụ quang của từng mẫu, xuất số liệu thu được dưới dạng
ASCII và chuyển toàn bộ dữ liệu vào phần mềm matlab để tính toán kết quả.
- Bước 5: Đường chuẩn đa biến và các bộ dữ liệu dự đoán được xây dựng
trên ma trận độ hấp thụ quang của các mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra đã chuẩn bị ở
phần trên. Nhập số liệu ma trận nồng độ các mẫu chuẩn, ma trận các mẫu kiểm tra
và các ma trận tín hiệu đo tương ứng vào phần mềm Matlab, chạy chương trình tính
toán ma trận hệ số hồi qui theo 4 phương pháp CLS, ILS, PLS và PCR trên phần
mềm và sử dụng ma trận này để tìm nồng độ mỗi hoạt chất trong từng mẫu. So sánh
sai số tương đối của mỗi phương pháp, lựa chọn ra phương pháp tối ưu nhất để tiến
hành định lượng các mẫu thực tế.
- Bước 6: Tiến hành định lượng các mẫu thực tế bằng cách trộn một lượng
bột viên với tá dược để pha loãng nồng độ hoạt chất về nồng độ nằm trong ma trận
chuẩn đã xây dựng, đo phổ của các mẫu này, ghi lại phổ và chuyển dữ liệu thu được
vào phần mềm Matlab để tính toán kết quả. Từ đó tiến hành tính toán hàm lượng
hoạt chất trong các mẫu thuốc viên theo công thức dưới đây:
( / ê ) tb
t
X m
HL mg vi n
m



Trong đó:
X: Lượng (mg) hoạt chất tìm được từ mô hình hồi qui đa biến
mt: khối lượng cân của mẫu thử (mg)
mtb: khối lượng trung bình của 1 viên của thuốc (mg)
2.2. Phương pháp phân tích đối chứng xác định các sulfamid
2.2.1. Phương pháp đối chứng xác định Sulfaguanidin
Tiến hành: Định lượng bằng phương pháp chuẩn độ thể tích theo DĐVN 4.
Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình viên và nghiền thành bột mịn. Cân
chính xác một lượng bột viên tương ứng với khoảng 0,2 g sulfaguanidin, thêm 15
ml dung dịch acid hydrocloric 25% và 50 ml nước. Lắc kỹ, tiến hành chuẩn độ bằng
nitrit (1 ml dung dịch natri nitrit 0,1M tương đương với 21,42 mg C7H10N4O2S.).
Hàm lượng (%) sulfaguanidin trong chế phẩm được tính toán theo công thức
dưới đây
21,42
( / ê ) t a TB
T
V k m
HL mg vi n
m
  

Trong đó: Vt: thể tích dung dịch natri nitrit 0,1M đã chuẩn độ (ml)
ka: hệ số hiệu chỉnh của dung dịch natri nitrit nếu nồng độ của
dung dịch này không phải là 0,1M.
mt: khối lượng cân của mẫu thử (mg)
mtb: khối lượng trung bình của một viên thuốc (mg)
21,42: là hệ số quy đổi 1 ml dung dịch natri nitrit 0,1M tương
đương với 21,42 mg C7H10N4O2S.
2.2.2. Phương pháp đối chứng xác định Sulfamethoxazol và Trimethoprim
Tiến hành theo phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao như dược điển Mỹ
USP 34- NF 29 [37]. như sau:
Điều kiện sắc ký: Cột C 18 (250 x 4,6 mm; 5µm), detector UV: 254 nm, tốc
độ dòng: 1,8 ml/ phút, thể tích tiêm: 20 µl. Pha động: 700ml nước + 200ml
Acetonitril + 1ml triethylamin, điều chỉnh pH 5,9 ± 0,1 bằng dung dịch acid acetic
1% hoặc dung dịch natri hydroxyd 0,2N, thêm nước vừa đủ 1000 ml.

- Dung dịch chuẩn: Cân chính xác khoảng 320mg sulfamethoxazol chuẩn và
khoảng 64mg trimethoprim chuẩn vào bình định mức 100,0 ml, thêm 50ml
methanol, lắc siêu âm hoà tan để nguội, thêm methanol đến vạch, lắc đều. Hút chính
xác 5,0 ml dịch trên vào bình định mức 50,0ml, thêm pha động vừa đủ đến vạch.
Lắc đều, lọc qua màng lọc 0,45µm.
- Dung dịch thử: Cân 20 viên, tính khối lượng trung bình rồi nghiền thành
bột mịn. Cân chính xác một lượng bột chế phẩm tương ứng khoảng 320mg
Sulfamethoxazol vào bình định mức 100,0ml, thêm 50ml methanol, lắc siêu âm hoà
tan để nguội, thêm methanol đến vạch, lắc đều, lọc bỏ dịch đầu. Hút chính xác 5,0
ml dịch lọc trên vào bình định mức 50,0ml, thêm pha động vừa đủ đến vạch. Lắc
đều, lọc qua màng lọc 0,45µm. Tiến hành sắc ký lần lượt với dung dịch chuẩn và
dung dịch thử. Tính lượng hàm lượng Sulfamethoxazol (C10H11N3O3S) và
Trimethoprim (C14H18N4O3) có trong chế phẩm dựa vào diện tích pic trên sắc ký đồ
của dung dịch thử, dung dịch chuẩn, hàm lượng của Sulfamethoxazol chuẩn,
Trimethoprim chuẩn và các thông số liên quan.
 Công thức tính toán hàm lượng sulfamethoxazol (mg/ viên)
S S tbT
S t
m HL mE
HL (mg/viê )=
E m
n
 

Trong đó: ES, Et: lần lượt là diện tích pic của dung dịch chuẩn, thử
mS, mt: lần lượt là khối lượng cân của chuẩn, của thử (mg)
HLS: hàm lượng nguyên trạng của sulfamethoxazol chuẩn (%)
 Công thức tính toán hàm lượng trimethoprim (mg/ viên)
S S tbT
S t
m HL mE
HL (mg/viê )=
E m
n
 

Trong đó: ES, Et: lần lượt là diện tích pic của dung dịch chuẩn, thử
mS, mt: lần lượt là khối lượng cân của chuẩn, của thử (mg)
HLS: hàm lượng nguyên trạng của trimethoprim chuẩn (%)

Luận văn: Định lượng hoạt chất thuốc kháng sinh nhóm Sulfamid

Luận văn: Định lượng hoạt chất thuốc kháng sinh nhóm Sulfamid

Recommandé

Recommandé

Contenu connexe

Tendances

Tendances (20)

Similaire à Luận văn: Định lượng hoạt chất thuốc kháng sinh nhóm Sulfamid

Similaire à Luận văn: Định lượng hoạt chất thuốc kháng sinh nhóm Sulfamid (20)

Plus de Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864

Plus de Dịch Vụ Viết Bài Trọn Gói ZALO 0917193864 (20)

Dernier

Dernier (20)

Luận văn: Định lượng hoạt chất thuốc kháng sinh nhóm Sulfamid