Vai trò của protein giàu methionine trên cây Arabidopsis thaliana, 9đ

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
---------------------
Lê Thị Ngọc Quỳnh
NGHIÊN CỨU VAI TRÒ CỦA
PROTEIN GIÀU METHIONINE
TRÊN CÂY ARABIDOPSIS THALIANA
Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm
Mã số: 60420114
LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC
Cán bộ hướng dẫn: TS. Lê Tiến Dũng
PGS. TS Nguyễn Quang Huy
Hà Nội  2015

LỜI CẢM ƠN
Lời đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Lê Tiến Dũng và PGS.TS.
Nguyễn Quang Huy, những người Thầy đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt
quá trình học tập, nghiên cứu khoa học và thực hiện luận văn này.
Tôi xin trân trọng cảm ơn các thầy, cô giáo trong Khoa Sinh học, Trường Đại học
Khoa học Tự nhiên đã tận tình giảng dạy, dìu dắt tôi trong thời gian học tập tại Trường.
Tôi cũng xin được gửi lời cảm ơn chân thành tới toàn thể cán bộ và học viên tại
Phòng thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Di truyền
Nông nghiệp đã hết lòng giúp đỡ tôi thực hiện thành công luận văn này.
Cuối cùng, nhưng không kém phần quan trọng, tôi vô cùng biết ơn gia đình và
bạn bè đã khích lệ, động viên, giúp đỡ và là chỗ dựa vững chắc cho tôi trong thời gian
qua.
Luận văn được thực hiện trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu cơ bản “Nghiên cứu
protein mẫn cảm với oxy hóa methionine và vai trò của enzyme methionine sulfoxide
reductase của cây nông nghiệp” do Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia
tài trợ mã số 106-NN.02-2013.46.
Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2015
Học viên
Lê Thị Ngọc Quỳnh

DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1. Các ROS trong cơ thể sinh học..................................................................9
Bảng 1.2. Một số yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi........................................12
Bảng 1.3. Số lượng gen MsrA và MsrB ở một số nhóm sinh vật .............................17
Bảng 2.1. Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu. ................................23
Bảng 2.2. Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu.............................................24
Bảng 2.3. Trình tự của một số yếu tố điều hòa cis trong điều hòa biểu hiện gen
đáp ứng với điều kiện bất lợi ...................................................................................27
Bảng 3.1. Phân loại chức năng gen mã hóa MRP trong Arabidopsis theo MAPMAN ..31
Bảng 3.2. Các MRP được dự đoán có đích tác động là ty thể và lục lạp...................35
Bảng 3.3. Gen AtMRP đáp ứng phiên mã với hạn hán và độ mặn cao......................38
Bảng 3.4. Kết quả phân loại chức năng gen bằng MAPMAN của các gen đáp ứng
phiên mã với điều kiện bất lợi..................................................................................41
Bảng 3.5. Một số yếu tố cis có mặt trên promoter của các gen AtMRP.....................42

DANH MỤC CÁC HÌNH
Hình 1.1. Quá trình sinh tổng hợp Methionine...........................................................4
Hình 1.2. Sự tạo thành Met sulfoxide và Met sulfone từ Met...................................13
Hình 1.3. Phản ứng khử MetO về Met của các Msr .................................................16
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm được sử dụng trong nghiên cứu ....................................25
Hình 3.1. Sự phân bố gen mã hóa MRP trong các quá trình sinh học khác nhau của
Arabidopsis..............................................................................................................31
Hình 3.2. Phân loại chức năng của các gen AtMRP theo quá trình sinh học. ............32
Hình 3.3. Phân loại chức năng của các gen AtMRP theo thành phần tế bào..............33
Hình 3.4. Phân loại gen AtMRP theo tham gia vào chức năng phân tử.....................33
Hình 3.5. Dự đoán vị trí của các MRP trong tế bào của Arabidopsis thaliana bằng
phần mềm ChloroP, pSORT và CELLO ..................................................................34
Hình 3.6. Dự đoán vị trí của MRP trong tế bào của Arabidopsis thaliana bằng
phần mềm Blast2GO ...............................................................................................36
Hình 3.7. Biểu đồ Venn thể hiện số lượng gen mã hóa MRP đáp ứng tăng và giảm
gấp hơn 2 lần trong các điều kiện chịu mặn và hạn hán ...........................................37
Hình 3.8. Số lượng các gen AtMRP có chứa các yếu tố cis khác nhau......................44
Hình 3.9. Dòng cây RBC1 được nảy mầm, A. môi trường ½ MS đặc chứa kháng sinh
hygromycin 15mg/l, B. môi trường ½ MS đặc.........................................................45
Hình 3.10. Hình thái dòng cây RBC1 và cây đối chứng kiểu dại trên đĩa thạch........46
Hình 3.11. Hình thái dòng cây RBC1 và cây đối chứng trên giá thể đất...................48
Hình 3.12. Đĩa thạch mang cây RBC1 và cây kiểu dại trên môi trường ½ MS .........50
Hình 3.13. Thử nghiệm chịu mặn trên dòng cây đối chứng và dòng RBC1. ...........51
Hình 3.14. Thử nghiệm cadmium trên dòng cây đối chứng và dòng RBC1. ............52
Hình 3.15. Thử nghiệm paraquat trên dòng cây đối chứng và dòng cây RBC1........54

BẢNG KÍ HIỆU VÀ CÁC CHỮ VIẾT TẮT
Chữ viết tắt,
kí hiệu
Tiếng Anh Tiếng Việt
ABA Abscisic acid Axit abscisic
ABRE ABA responsive element Yếu tố đáp ứng ABA
AtMRP
Arabidopsis thaliana
Methionine-rich protein
Protein giàu Methionin trên
Arabidopsis thaliana
ATP Adenosine triphosphate Adenosin triphotphat
bHLH basic Helix loop helix Cấu trúc xoắn vòng xoắn
bZIP Basic region-leucine zipper Khóa kéo cơ bản vùng leucine
CELLO
subCELlular LOcalization
predictor
Dự đoán vị trí cư trú trong tế
bào
CgS
Cystathionine gamma-
synthase
Cystathionin gamma-synthaza
cs Cộng sự
FOX
Full-length cDNA Over-
eXpressing
Biểu hiện quá mức cDNA
hoàn chỉnh
ICEr2
Induction of CBF
Expression region 2
Vùng 2 biểu hiện cảm ứng bởi
CBF
Met Methionine Methionin
MetO Methionine sulfoxide Methionin sufoxit
MetO2 Methionine sulfone Methionin sulfone
MRP Methionine-rich protein Protein giàu methionin
MS Murashige & Skoog Môi trường MS
Msr
Methionine sulfoxide
reductase
Methionin sulfoxit reductaza
OPH O-phosphohomoserine O-phosphohomoserine
PCR Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi trùng hợp
PEL Pseudo-Etiolation in Light Sự giả vàng úa dưới ánh sáng
PSORT
Protein Subcellular
lOcalization pRedicTion
Dự đoán vị trí cư trú của
protein trong tế bào
RBC1 RIKEN Bioresource Center
Dòng cây chuyển gen từ TT
Tài nguyên Sinh học RIKEN
ROS Reactive oxygen species Các dạng oxy phản ứng
RSRE
Rapid Stress Response
Element
Yếu tố đáp ứng nhanh với điều
kiện lạnh
SAM S - Adenosyl Methionine S - Adenosyl Methionine
TS Threonine synthase Threonine synthaza

MỤC LỤC
MỞ ĐẦU ..................................................................................................................1
Chương 1- TỔNG QUAN .........................................................................................2
1.1. Methionine và protein giàu Methionine ..............................................................2
1.1.1. Tổng quan chung về Methionine...................................................................2
1.1.2. Các protein giàu Methionine.........................................................................5
1.2. Quá trình oxy hóa và sửa chữa oxy hóa Methionine............................................7
1.2.1. Những điều kiện bất lợi, nguyên nhân tạo các dạng oxy phản ứng................7
1.2.2. Quá trình oxy hóa Methionine bởi các dạng oxy phản ứng .........................12
1.2.3. Quá trình sửa chữa oxy hóa Methionine .....................................................15
1.3. Tình hình nghiên cứu về protein có methionine mẫn cảm với các dạng oxy
phản ứng..................................................................................................................19
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới..............................................................19
1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam...............................................................21
Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP ........................................................23
2.1. Vật liệu.............................................................................................................23
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu ....................................................................................23
2.1.2. Hóa chất.....................................................................................................23
2.1.3. Thiết bị.......................................................................................................24
2.2. Phương pháp nghiên cứu ..................................................................................24
2.2.1. Phương pháp tiếp cận bằng tin sinh học......................................................24
2.2.2. Phương pháp tiếp cận bằng thực nghiệm ....................................................28
Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN..............................................................30

3.1. Phân tích tin sinh học cho các gen mã hóa MRP ...............................................30
3.1.1. Tìm kiếm và xác định các gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis ..............30
3.1.2. Đánh giá biểu hiện gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis trong điều kiện
thường và điều kiện bất lợi...................................................................................37
3.1.3. Dự đoán yếu tố điều hòa cis trên promoter của các gen mã hóa MRP đáp ứng
điều kiện bất lợi....................................................................................................41
3.2. Phân tích thực nghiệm trên cây Arabidopsis tăng cường biểu hiện gen At3G55240
(dòng RBC1) ...........................................................................................................44
3.2.1. Kiểm tra tỷ lệ đồng hợp tử/dị hợp tử của dòng cây chuyển gen...................44
3.2.2. Đánh giá hình thái của dòng cây chuyển gen ..............................................45
3.2.3. Đánh giá đáp ứng của dòng cây chuyển gen với các điều kiện bất lợi.......49
KẾT LUẬN.............................................................................................................58
TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................................59
Tài liệu tiếng Việt....................................................................................................59
Tài liệu tiếng Anh....................................................................................................59
PHỤ LỤC...................................................................................................................i

1
MỞ ĐẦU
Ở thực vật, sự hình thành và loại bỏ các dạng oxy phản ứng (ROS) được kiểm
soát chặt chẽ thông qua con đường dẫn truyền tín hiệu. Tuy nhiên, trong tình trạng
môi trường bất lợi, nồng độ ROS tăng lên một cách đột ngột do mất kiểm soát, gây
ra tổn thương cho các chất phân tử lớn trong tế bào như lipit, protein, axit nucleic dẫn
đến giảm tuổi thọ hoặc sức sống của sinh vật.
Các dạng oxy phản ứng ảnh hưởng bất lợi tới sinh trưởng của tế bào thông qua
nhiều quá trình khác nhau, trong đó bao gồm cả oxy hóa Methionine (Met), một axit
amin chứa lưu huỳnh có mặt trong phân tử protein, tạo thành Met sulfoxide (MetO).
Đây là một trong những nguyên nhân gây mất hoạt tính, mất đi khả năng điều hòa
trao đổi chất của protein, dẫn đến làm giảm sức đề kháng, giảm sức sống của cây
trồng. Trong cơ thể sinh vật, MetO được sửa chữa bằng enzyme Methionine sulfoxide
reductase (Msr). Quá trình sửa chữa này tạo ra những tác động tích cực, đặc biệt là
tăng khả năng đề kháng cao, chống lại sự oxy hóa gây ra bởi các điều kiện bất lợi từ
môi trường trên thực vật.
Nghiên cứu quá trình oxy hóa Met và sửa chữa MetO thông qua những hiểu
biết về các protein giàu Met là đích tác động của Msr sẽ cho phép tiếp cận vấn đề
này, tạo tiền đề cho nghiên cứu phát triển các giống cây trồng có khả năng chống chịu
với các điều kiện bất lợi. Tuy nhiên, các protein giàu Met hiện chưa được công bố
một cách hệ thống ở cả những nghiên cứu trong và ngoài nước. Xuất phát từ những
lý do trên, chúng tôi chọn đề tài: “Nghiên cứu vai trò của protein giàu methionine
trên cây Arabidopsis thaliana”.
Luận văn nằm trong khuôn khổ đề tài nghiên cứu cơ bản “Nghiên cứu protein
mẫn cảm với oxy hóa methionine và vai trò của enzyme methionine sulfoxide
reductase của cây nông nghiệp” do Quỹ Phát triển Khoa học và Công nghệ Quốc gia
tài trợ.

2
Chương 1- TỔNG QUAN
1.1. Methionine và protein giàu Methionine
1.1.1. Tổng quan chung về Methionine
Methionine (Met) là một α – axit amin chứa lưu huỳnh, được sử dụng trong
nhiều con đường chuyển hóa tế bào như thành phần cấu tạo nên protein, bộ ba mở
đầu (AUG) mã hóa cho tín hiệu bắt đầu quá trình sinh tổng hợp chuỗi polypeptide.
Ngoài ra Met đóng vai trò như một phân tử tham gia vào quá trình điều hòa thông
qua dạng dẫn xuất là S - Adenosyl Methionine (SAM) [40]. SAM đóng vai trò chìa
khóa cho nhiều con đường chuyển hóa khác nhau thông qua việc cung cấp nhóm
methyl (-CH3) trong tế bào. Bên cạnh đó, SAM cũng là tiền chất cho các hợp chất
chuyển hóa như: ethylene (CH2=CH2) - hormone quan trọng liên quan đến sự kiểm
soát của nhiều quá trình ở thực vật như làm chín và già hóa, vitamin B1, 3-
dimethylsulphoniopropionate (chất bảo vệ thẩm thấu, giúp thực vật chống lại những
điều kiện bất lợi về thẩm thấu), và đóng vai trò như là nguồn sulfur của khí quyển:
dimethylsulphide [8]. SAM là hợp chất cung cấp nhóm propyl amin cho quá trình
sinh tổng hợp các polyamine, spermidine, spermine, những chất đóng vai trò quyết
định cho quá trình phát triển của thực vật bao gồm sự tăng trưởng và biệt hóa tế bào,
tế bào chết theo chương trình (apoptosis), cân bằng nội môi và điều hòa biểu hiện gen
[7]. Dẫn xuất của Met, S-methylmethionine, được sử dụng như phân tử vận chuyển
chính để giảm lượng sulfur trong một số loài động vật, đây cũng là hợp chất liên quan
đến việc hình thành dạng lưu động và dạng dự trữ của Met [14].
Met là một axit amin thiết yếu, được cung cấp thông qua thức ăn của động vật
không nhai lại. Động vật có vú nói chung và con người nói riêng chỉ có thể tổng hợp
ra khoảng một nửa số axit amin trong tổng số 20 axit amin cơ bản cấu tạo nên protein.
Do đó, những axit amin không thể tổng hợp được cần phải được bổ sung qua chế độ
ăn uống. Cây trồng phổ biến như ngũ cốc (lúa, gạo...) và các loại đậu thường có hàm
lượng Met thấp [40]. Ở các nước đang phát triển, cải thiện chất lượng dinh dưỡng là
cách để giải quyết nhiều vấn đề khi mà thức ăn có nguồn gốc từ thực vật là nguồn

3
cung cấp protein chủ yếu cho con người cũng như cho gia súc và gia cầm. Để giải
quyết nhu cầu cung cấp các axit amin thiết yếu trong thức ăn chăn nuôi, các phụ gia
có thể được thêm vào hoặc là sử dụng đa dạng nguồn thực vật. Do đó, nâng cao hàm
lượng các axit amin thiết yếu trong cây trồng nông nghiệp là mong muốn của nhiều
nhà nghiên cứu, người chăn nuôi và người tiêu dùng [29].
Met, axit amin chứa sulfur (methionine và cysteine) và các axit amin khác như
lysine, threonine và isoleucine đều được tổng hợp từ họ aspartate. Aspartate kinase
là enzyme đầu tiên trong con đường chuyển hóa chung từ aspartate thành lysine,
threonine, Met và isoleucine. Enzyme này xúc tác quá trình phosphoryl hóa aspartate
bằng cách thủy phân ATP tạo thành β-aspartyl phosphate [77]. Thông thường, có ít
nhất hai dạng aspartate kinase được tìm thấy trong thực vật. β-aspartyl phosphate sẽ
được chuyển hóa thành aspartate-semialdehyde và sau đó là homoserine, bởi sự xúc
tác tương ứng của aspartic semialdehyde dehydrogenase và homoserine kinase. Trong
vi khuẩn và nấm, homoserine là điểm trung gian tạo thành threonine và Met [77]. Tuy
nhiên, trong thực vật, điểm trung gian tạo thành threonine và sinh tổng hợp Met là O-
phosphohomoserine (OPH), cơ chất chung cho hai enzyme threonine synthase (TS)
và cystathionine gamma-synthase (CgS). OPH có thể chuyển hóa trực tiếp thành
threonine bởi sự tham gia của TS hoặc là tham gia vào cơ chế ba bước để tạo thành
Met: phản ứng trùng ngưng cysteine và OPH tạo thành cystathionine, sau đó thành
homocysteine và cuối cùng là thành Met, tương ứng nhờ enzyme cystathionine β-
lyase và homocysteine methyltransferase [40] (Hình 1.1). Cuối cùng, chỉ có khoảng
20% Met được sử dụng làm thành phần tạo nên protein, trong khi có đến 80% Met sẽ
được biến đổi để tạo thành SAM, cũng là sản phẩm cuối cùng trong con đường sinh
tổng hợp Met [32].

4
Hình 1.1. Quá trình sinh tổng hợp Methionine [40]
Việc tạo cây trồng biến đổi gen tác động vào hoạt động của các enzyme đã
giúp tăng cường hiểu biết về quá trình sinh tổng hợp các amino axit chứa sulfur [73].
Các nghiên cứu hiện nay đều khẳng định rằng có thể kiểm soát quá trình sinh tổng
hợp Met trong thực vật thông qua mức độ cạnh tranh giữa CgS và TS với cơ chất
chung của chúng là OPH [10, 40, 93]. Khi hoạt động của TS giảm: thể đột biến
Arabidopsis (mto2) thể hiện hoạt tính của enzyme TS thấp, Met tự do được tạo thành

5
trong lá non tăng gấp 20 lần, kèm theo giảm 6% lượng threonine so với đối chứng,
nhưng không có sự khác biệt ở cây trưởng thành [10]. Kết quả này khẳng định rằng,
cây Arabidopsis non điều hòa sinh tổng hợp Met thông qua tương tác qua lại giữa
CgS và TS [10]. Trên khoai tây (Solanum tuberosum), Zeh và cs đã sử dụng RNA đối
mã (RNA antisense) của TS dưới sự kiểm soát của promoter CaMV35S. Kết quả cho
thấy các dòng chuyển gen có hoạt tính của TS giảm xuống 6%, đồng thời giảm 45%
mức độ threonine, trong khi mức độ của Met tăng lên gấp 239 lần so với cây không
chuyển gen. Kết quả này đã tái khẳng định tỉ lệ enzyme TS đóng vai trò là điểm kiểm
soát chính trong quá trình sinh tổng hợp Met trong khoai tây. Điều này góp phần xây
dựng chiến lược tăng cường hàm lượng Met và cải thiện chất lượng protein trong
thực vật [93].
1.1.2. Các protein giàu Methionine
Met được mã hóa chỉ bởi duy nhất bộ ba AUG, đây là mã mở đầu, xác lập tín
hiệu bắt đầu quá trình dịch mã sinh tổng hợp chuỗi polypeptit trên phân tử mRNA.
Do đó, ở nhóm sinh vật nhân chuẩn và vi khuẩn cổ, Met thường xuất hiện ở đầu N
(N-terminal) trong chuỗi peptide. Tuy nhiên, Met có khả năng bị loại bỏ trong quá
trình cải biến protein sau dịch mã. Trung bình một protein chứa khoảng 1,5% gốc
Met trong toàn bộ chuỗi polypeptide [26]. Trong Escherichia coli, hàm lượng Met
trung bình khoảng từ 1-3% (các protein giàu Met nhất: nhân tố kéo dài chuỗi
polypeptide TU: 2,8%; các protein liên quan đến các điều kiện bất lợi oxy hóa KatE:
1,3%; HypT: 2%; MsrA: 3,3%) [26]. Giá trị Met tương tự cũng đã được công bố với
các protein nấm men và protein ở động vật [26].
Ở thực vật, một vài protein giàu Met (MRP) đã được nghiên cứu từ rất sớm
trên nhiều loại cây trồng khác nhau như: quả hạnh nhân của Brazil [5], hạt hướng
dương [50], ngô [49, 66], và lúa [60]. Các MRP được tìm thấy trong hạt đều có hàm
lượng Met trong khoảng 11-22% [6]. Prolamin từ ngô (Zea mays) được gọi là zein,
trong đó chiếm số lượng lớn là α-zein, các nhóm nhỏ hơn là β, γ, δ-zein [22]. β-zein
và δ-zein là MRP với các gốc Met tập trung chủ yếu gần đầu C của phân tử . Trong

6
đó, β-zein trong ngô có trọng lượng phân tử khoảng 17,5 kDa với 160 axit amin, với
18 gốc Met và 7 gốc cysteine [76]. δ-zein được hình thành từ hai tiểu phần có trọng
lượng phân tử khoảng 14,4 kDa và 21,1 kDa. Cả hai tiểu phần này đều giàu Met: tiểu
phần 21,2 kDa có chứa 26,9% Met, tiểu phần 14,4 kDa có chứa 22,8% Met [76]. Phân
tử β-zein do một gen quy định trong khi đó δ-zein do 2 gen khác nhau mã hóa [76].
Gen mã hóa cho một MRP có tên gọi là 2S albumin đã được nghiên cứu khá
kỹ do protein này chứa hàm lượng cao Met, làm tăng giá trị cho cây trồng, đặc biệt
là cho các cây họ đậu và các loại cây trồng thu củ và rễ luôn có hàm lượng thấp các
axit amin chứa sulfur như Met. 2S albumin từ quả hạnh nhân của Brazil chứa 18%
methionine, 2S albumin từ hoa hướng dương chứa 16% methionine [7]. Protein 2S
albumin cũng được biểu hiện trong một số loài thực vật như thuốc lá, hạt cải dầu và
đậu tương [7]. Hạt của một số loài đậu đã được tăng gấp đôi hàm lượng Met trong
các protein do chuyển gen 2S albumin từ hoa hướng dương. Tuy nhiên, việc cải thiện
hàm lượng Met trong các loại hạt đậu vẫn không đủ để đáp ứng về hàm lượng Met
cần thiết trong thức ăn chăn nuôi. Bên cạnh đó, protein 2S albumin từ quả hạnh nhân
Brazil và hoa hướng dương đã được biết là nguyên nhân gây dị ứng trong một số
trường hợp [47]. Chính vì vậy, việc phân lập và nghiên cứu protein giàu Met còn là
cơ sở để ứng dụng kỹ thuật di truyền nhằm cải thiện hàm lượng Met ở cây trồng.
Năm 2000, Chakraborty và cs đã tinh sạch được protein mã hóa bởi gen AmA1
tách chiết từ hạt rau dền đỏ (Amaranthus hypochondriacus) [20]. Protein AmA1 có
hàm lượng cân bằng các axit amin thiết yếu gồm lysine, tryptophan, tyrosine, và axit
amin chứa lưu huỳnh. Đặc biệt là AmA1 không gây dị ứng do không tạo ra phản ứng
với IgE. Biểu hiện quá mức gen này trên khoai tây làm tăng hàm lượng Met 3-7 lần
so với kiểu dại [20].
Năm 2005, Izquierdo và Godwin đã tách dòng trình tự cDNA hoàn chỉnh mã
hóa cho δ-Kafirin, protein dự trữ giàu Met có mặt trong hạt cây cao lương (Sorghum
bicolor L.) và biểu hiện thành công. Protein δ-Kafirin có trọng lượng phân tử khoảng
16 kDa với 147 axit amin trong đó 17% là Met [44]. Sử dụng PCR phiên mã ngược
và Realtime PCR cho thấy δ-kafirin chỉ biểu hiện ở những hạt đang trong giai đoạn

7
phát triển [44]. So sánh trình tự DNA cho thấy gen mã hóa cho δ-Kafirin có độ tương
đồng cao với gen mã hóa cho tiểu phần 14,4 kDa của δ-zein ngoại trừ thiếu đi một
phần quy định vùng giàu Met. Do vậy, hàm lượng Met có mặt trong δ-Kafirin thấp
hơn trong δ-zein [76].
Vai trò của Met trong phân tử protein liên quan đến tính kỵ nước, tạo nên sự
cuộn gấp để tạo thành các bậc cấu trúc không gian cho protein. Met được tìm thấy
nhiều tại phần lõi kỵ nước trong cấu trúc không gian của protein, trong khi ở các
protein màng tế bào, Met liên kết với lớp lipit kép. Tuy nhiên, đối với các protein có
chứa Met bộc lộ bên ngoài bề mặt tiếp xúc thì rất dễ bị oxy hóa thành Met sulfoxide
(MetO) do tác động của các dạng oxy phản ứng [15]. Do đó, MRP được xem như
protein mô hình để nghiên cứu một cách hiệu quả về sự oxy hóa Met trong các loài
sinh vật khác nhau.
1.2. Quá trình oxy hóa và sửa chữa oxy hóa Methionine
1.2.1. Những điều kiện bất lợi, nguyên nhân tạo các dạng oxy phản ứng
Quá trình sinh trưởng, phát triển và năng suất tối ưu của thực vật chịu ảnh
hưởng nghiêm trọng bởi điều kiện bất lợi, đặc biệt là trong bối cảnh khí hậu trái đất
có nhiều thay đổi bất thường như hiện nay. Gần đây, tổ chức Nông Lương Liên Hợp
Quốc (FAO) đã chỉ ra rằng, điều kiện bất lợi từ môi trường sống ảnh hưởng đến 37%
năng suất cây trồng trên toàn thế giới [46]. Hạn hán và mặn hóa là nhân tố bất lợi
chính mà cây trồng gặp phải. Quá trình sống của thực vật và tạo sản phẩm thứ cấp
phụ thuộc chủ yếu vào nước. Gần 20% diện tích đất trên toàn thế giới đang bị thiếu
nước cho sản xuất cây trồng và con số này sẽ ngày càng tăng lên khi diện tích đất
trồng ngày càng bị sa mạc hóa [17]. Điều kiện thiếu nước sẽ làm cho thực vật đóng
các khí khổng, giảm hô hấp và quang hợp, giảm thể tích nước trong các mô thực vật,
dẫn đến quá trình sinh trưởng chậm lại. Do khí khổng đóng nên lượng CO2 trong lá
bị giảm xuống, ức chế quá trình cố định carbon nhưng lại làm tăng lượng các dạng
oxy phản ứng (ROS) có mặt trong thực vật, dẫn đến điều kiện bất lợi do oxy hóa [38].
Đất nhiễm mặn cũng gây ảnh hưởng lớn đến cây trồng, làm giảm đến 23% năng suất

8
cây trồng trên toàn thế giới [86]. Tăng cường nồng độ muối trong đất làm giảm khả
năng hấp thụ nước của thực vật. Khi một lượng lớn Na+
và Cl-
được đưa vào cây
thông qua rễ, cả hai ion Na+
và Cl-
đều gây ảnh hưởng tiêu cực đến sự phát triển do
giảm quá trình trao đổi chất và giảm hiệu suất quang hợp [25].
Do quá trình công nghiệp hóa tăng nên tình trạng đất bị nhiễm ion kim loại
nặng cũng là một vấn đề đáng được đề cập đến. Các kim loại nặng cadmium (Cd),
bạc, thủy ngân xâm nhập vào các hệ sinh thái từ nhiều nguồn khác nhau: khói bụi,
nước thải của các xí nghiệp sản xuất chì, thiếc, sắt, thép, nước thải trong ngành đúc
điện, trong phân lân bón cho cây trồng, trong các nhiên liệu diesel [34]. Cd dễ dàng
được cây hấp thụ và chuyển lên mạch xylem của lá, gây ức chế tăng trưởng, ảnh
hưởng đến khả năng quang hợp, sự hấp thu các hợp chất vi lượng và đa lượng dẫn
đến giảm năng suất cây trồng [11]. Điều quan trọng là Cd sẽ đi vào chuỗi thức ăn và
gây ra mối đe dọa cho sức khỏe con người cũng như các nhóm động vật khác [21].
Kim loại này có thể gây độc tế bào theo cách trực tiếp hay gián tiếp và có thể được
giải thích thông qua cấu trúc hóa học của nó. Cd có thể liên kết với nhóm -SH của
các protein và enzyme, làm cho protein, enzyme bị mất đi cấu hình, không hoạt động
được chức năng, đặc biệt là với nhóm enzyme làm nhiệm vụ thu dọn ROS [24]. Bên
cạnh đó, cơ chế gây độc quan trọng của cadmium với tế bào thực vật do sự tương
đồng về mặt hóa học của Cd2+
và các ion kim loại liên kết với vị trí hoạt động của
enzyme hay các yếu tố truyền tin. Cd2+
ảnh hưởng đến cơ chế nội cân bằng của các
ion kim loại thiết yếu và các ion kim loại hóa trị 2 như Fe và Zn, giải phóng ion Fe/Cu
tự do gây kích thích hiệu ứng Fenton gây ra ROS, tăng các quá trình tổn thương do
oxy hóa [24]. Chính vì vậy, Cd cũng như các ion kim loại nặng khác, dẫn đến điều
kiện bất lợi do oxy hóa và tăng cường hàm lượng ROS trong thực vật bằng cách gây
rối loạn quá trình loại bỏ ROS của các chất chống oxy hóa [24].
Paraquat (1,1 dimethyl-4,4’-bipyridynium dichloride) là thuốc diệt cỏ dạng
bipyridinium, lần đầu tiên được công nhận hoạt tính diệt thực vật vào năm 1955 [39].
Cho đến nay, paraquat vẫn giữ được tầm quan trọng của nó bên cạnh các loại thuốc
diệt cỏ khác có nguồn gốc từ glyphosate và glufosinate. Paraquat là thuốc diệt cỏ có

9
hoạt lực nhanh, làm đảo chiều chiều dòng điện tử của quang hệ I (PSI) xảy ra trong lục
lạp. Kết quả là gây nên sự tích lũy superoxide trong lục lạp [39]. Superoxide được tạo
ra một cách liên tục và nhanh chóng sẽ lấn át các cơ chế bảo vệ nội sinh của thực vật
và gây ra hàng loạt ảnh hưởng tiêu cực đến thực vật. Paraquat có thể dễ dàng thâm
nhập xuyên qua lớp biểu bì lá, làm giảm khả năng quang hợp một cách nhanh chóng,
gây mất sức trương và làm vỡ màng tế bào. Các dấu hiệu này được nhận thấy chỉ sau
vài giờ xử lý với paraquat trong điều kiện ánh sáng liên tục và cuối cùng là các mẫu
mô bị mất nước và mất màu hoàn toàn [39]. Lá cây Arabidopsis thaliana 3 tuần tuổi
kiểu dại được ngâm trong dung dịch paraquat 4 µM. Sau 2 ngày thí nghiệm dưới điều
kiện ánh sáng liên tục, lá cây bị mất màu hoàn toàn do paraquat là hợp chất sản sinh
ROS làm phân hủy diệp lục và phá vỡ các tế bào [91].
Các dạng oxy phản ứng (ROS) là khái niệm để chỉ các dẫn xuất của oxy có khả
năng oxy hóa mạnh. ROS được chia thành hai nhóm: nhóm các gốc tự do (có chứa
electron liên kết chưa cặp đôi) và nhóm các dẫn xuất không phải gốc tự do. Các ROS
không phải gốc tự do dễ dàng chuyển hóa thành các gốc tự do trong quá trình phản ứng
oxy hóa. Một số ROS là gốc tự do điển hình bao gồm hydroxyl, superoxide và nitric
oxide; trong khi oxy mức đơn và peroxynitrile là các ROS không phải gốc tự do thường
gặp trong các quá trình sinh hóa (Bảng 1.1). [19].
Bảng 1.1. Các ROS trong cơ thể sinh học [19]
ROS Ký hiệu
Gốc hydroxyl ∙OH
Gốc superoxide ∙O2
-
Oxy mức đơn 1
O2
Nitric Oxide ∙NO
Peroxynitrite ONOO-
ROS là sản phẩm chuyển hóa tự nhiên của cơ thể và đóng vai trò quan trọng
trong liên lạc tế bào và cân bằng nội môi. ROS được tạo ra ở nhiều bào quan khác nhau

10
trong tế bào, những nơi xảy ra chuỗi dẫn truyền điện tử như lục lạp, ti thể, peroxisome
[31], có khoảng 1-2% oxy trong các mô tế bào thực vật sẽ tạo thành ROS [31]. Dưới
điều kiện ánh sáng, lục lạp và peroxisome là nơi hình thành đa số ROS có mặt trong
các mô, tế bào thực vật, nhưng trong điều kiện không có ánh sáng thì ty thể lại là bào
quan chính tạo nên ROS [31]. Khi được duy trì ở nồng độ thấp, ROS đóng vai trò như
tín hiệu phân tử để kiểm soát quá trình sinh trưởng, phát triển của thực vật, kích thích
các con đường giúp cây chống chịu lại với các điều kiện bất lợi, tín hiệu cho quá trình
già hóa và đưa tế bào vào con đường chết theo chu trình [13].
Tuy nhiên, khi gặp điều kiện sống bất lợi từ môi trường (như hạn hán, lạnh,
nóng, nấm bệnh...), nồng độ ROS tăng lên một cách đột ngột, có thể làm tổn
thương các cấu trúc tế bào do tác động tiêu cực làm thay đổi tính thấm, độ dẫn
điện, phân giải thành phần phospholipid, dẫn đến phá hủy màng nội chất, gây chết
các tế bào, tổn thương các cơ quan [31]. Khi nồng độ ROS càng tăng cao thì càng
đem lại nhiều hậu quả nghiêm trọng. Nghiên cứu cũng chỉ ra ROS có thể đóng các
vai trò phá hủy, bảo vệ hoặc truyền tín hiệu, tùy thuộc vào các quá trình cân bằng
giữa sự sản sinh và loại bỏ ROS tại các trung tâm hoạt động theo thời gian [31].
Khi điều kiện môi trường thay đổi, những tín hiệu đáp ứng sớm được tạo ra bao
gồm: tăng tỷ lệ ion đi qua màng tế bào, tăng cường Ca2+
có mặt trong bào tương,
kích hoạt protein MAPKs và đặc biệt là sản sinh ra ROS chỉ sau một vài phút bị
kích thích bởi các tác nhân sinh học và phi sinh học. ROS được sinh ra ở các bào
quan khác nhau và dẫn đến sự thay đổi của hệ phiên mã trong nhân tế bào, do vậy
thông tin phải được chuyển từ các bào quan đến nhân tế bào. Các tín hiệu thông
qua ROS cần phải được tiếp nhận và khuếch đại, thường là thông qua kinase hay
phosphatase. Cuối cùng, sự thay đổi trong biểu hiện gen xảy ra nhờ hoạt động của
các nhân tố phiên mã và các yếu tố có mặt trên promoter. Vùng promoter của một
số gen cảm ứng bởi điều kiện bất lợi chứa yếu tố cis [90]. Các nhân tố phiên mã
khác nhau tương tác với yếu tố cis và hình thành phức hệ khởi đầu quá trình phiên
mã. Phức hệ khởi đầu phiên mã hoạt hóa RNA polymerase để bắt đầu quá trình
phiên mã của gen đáp ứng khi bị tổn thương [90]. Axit abscisic (ABA) đóng vai

11
trò quan trọng trong đáp ứng của thực vật với điều kiện bất lợi như hạn hán và
chịu mặn, cũng như đóng vai trò trong quá trình nảy mầm và trạng thái ngủ của
hạt [25]. Vùng promoter của một số gen cảm ứng bởi ABA khi so sánh với các
promoter của gen khác thì được nhận thấy là thường chứa vùng trình tự bảo toàn
ACGTGGC, được gọi là yếu tố đáp ứng với ABA (ABRE) [2]. ABRE đầu tiên
được tìm thấy trên gen Em của lúa mì, có chức năng chính trong quá trình phát
sinh phôi của hạt, và gen RAB16 của lúa gạo, đóng vai trò trong quá trình trưởng
thành của hạt và các mẫu mô thực vật bị mất nước [90]. ABRE là yếu tố cis chính
có mặt trong các gen cảm ứng với ABA [2]. Bên cạnh đó, các yếu tố điều hòa trên
promoter của những gen phụ thuộc vào phản ứng với ABA còn chứa trình tự nhận
biết cho các protein MYB và MYC. Trình tự DNA đặc hiệu MYC và MYB là
CACATG (MYCR) và (A/C)ACC(A/T)A(A/C)C (MYBR), được phát hiện trên
vùng promoter của gen RD22. Các nhân tố phiên mã AtMYC và AtMYB bám vào
trình tự DNA đặc hiệu MYCR và MYBR và hoạt hoá biểu hiện gen chức năng
trong điều kiện mất nước [2]. Trong khi ABRE, MYBR, MYCR là trình tự cis cảm
ứng điều kiện khô hạn thì ICEr2 – cảm ứng biểu hiện CBF vùng 2 (Induction of
CBF Expression region 2) lại là yếu tố cis cảm ứng trong điều kiện lạnh [90]. Cuối
cùng, khi gây tổn thương cho mô lá A. thaliana bằng cách tạo ra các điều kiện cực
đoan, một số gen đáp ứng nhanh với điều kiện bất lợi đã được tìm thấy. Trên vùng
promoter của các gen phản ứng nhanh với điều kiện bất lợi, người ta đã tìm thấy
một yếu tố cis mới và được gọi là yếu tố đáp ứng nhanh với điều kiện bất lợi
(RSRE - Rapid Stress Response Element) [12]. Các yếu tố cis tham gia điều hòa
biểu hiện gen trong điều kiện bất lợi được thể hiện qua Bảng 1.2.

12
Bảng 1.2. Một số yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi
Tên yếu tố
cis
Trình tự
Nhân tố phiên
mã bám vào
yếu tố cis
Đáp ứng trong
điều kiện bất lợi
Tài liệu
tham
khảo
ABRE (C/G/T)ACGTG(G/T)(A/C) bZIP Hạn hán, đáp ứng
phụ thuộc ABA
[90]
MYBR (C/G/T)ACGTG(G/T)(A/C) MYB Hạn hán, đáp ứng
phụ thuộc ABA
[90]
MYCR CACATG bHLH Hạn hán, đáp ứng
phụ thuộc ABA
[90]
ICEr2 ACTCCG Chưa biết Chịu lạnh [90]
RSRE CGCGTT CBF1, CBF2,
CBF3, TGA3,
CAMTA
Chịu lạnh, hạn
hán, bị côn trùng
và vi khuẩn tấn
công
[12]
Hydrogen peroxide có khả năng oxy hóa trực tiếp hai axit amin có chứa lưu
huỳnh là Cys và Met. Đặc biệt, việc oxy hóa cysteine đã được tập trung ở nhiều
nghiên cứu khác nhau, tình trạng oxy hóa khác nhau cũng dẫn đến những thay đổi
khác nhau đối với protein [23, 88]. Ngược lại, sự oxy hóa Met nhận được ít sự quan
tâm hơn. Trong thực vật, chức năng của protein bị thay đổi do quá trình oxy hóa Met
đã từng được công bố [45].
1.2.2. Quá trình oxy hóa Methionine bởi các dạng oxy phản ứng
Khi ROS tồn tại ở hàm lượng cao, Met tự do cũng như Met trên các phân tử
protein dễ dàng bị oxy hóa để tạo thành Met sulfoxide (MetO) và Met sulfone
(MetO2) khi gắn thêm các nguyên tử oxy (Hình 1.2) [26]. MetO tồn tại với hai dạng
đồng phân quang học là methionine-S-sulfoxide (Met-S-O) và methionine-R-
sulfoxide (Met-R-O). Ngược lại với MetO2 (một hợp chất hiếm khi được tìm thấy
trong các hệ thống sinh học), cần một lực oxy hóa mạnh và không có tính thuận
nghịch thì quá trình chuyển hóa giữa Met và MetO lại có tính thuận nghịch .

13
Hình 1.2. Sự tạo thành Met sulfoxide và Met sulfone từ Met [26]
Protein là mục tiêu mạnh nhất của quá trình oxy hóa gây ra bởi các gốc tự do
so với các đại phân tử khác như lipid và DNA, chiếm đến 68% phân tử bị oxy hóa
trong tế bào [70]. Trong tự nhiên, Met đóng vai trò như chất chống oxy hóa, bảo vệ
protein cũng như các đại phân tử khác. Dưới điều kiện hiếu khí, có tới 6% Met trong
protein có thể cùng bị oxy hóa đồng thời. Tuy nhiên, không phải tất cả các gốc Met
trong protein có cùng mức nhạy cảm đối với quá trình oxy hóa; mức này phụ thuộc
vào việc các tác nhân oxy hóa có thể tiếp cận Met ở các vị trí khác nhau bên trong
cấu trúc protein như nằm ở bề mặt hay trong phần lõi protein. Shechter đã phát hiện
chỉ các gốc Met trong chuỗi peptide và protein đã bị biến tính đều bị oxy hóa hoàn
toàn, trong khi đối với các protein tự nhiên thì chỉ các gốc Met nằm ở bề mặt mới có
thể bị oxy hóa [74].
Glutamine synthetase có nguồn gốc từ Escherichia coli đã được sử dụng để
nghiên cứu ảnh hưởng của H2O2 đến các gốc Met. Kết quả cho thấy là những gốc Met
nằm trên bề mặt đều bị oxy hóa trong khi những gốc nằm trong phần lõi hầu như
không bị ảnh hưởng bởi H2O2. Trong tổng số 16 gốc Met có mặt trong glutamine
synthetase thì có đến 8 gốc bị oxy hóa nhưng hoạt tính của enzyme lại không hề bị
thay đổi [26]. Điều này được giải thích là do glutamine synthetase có các gốc Met ở
tập trung xung quanh trung tâm hoạt động của enzyme để bảo vệ chúng khỏi các dạng

14
oxy phản ứng. Do đó, Met không những có nhiệm vụ bảo vệ các axit amin khác mà
còn bảo vệ các protein tránh bị mất chức năng dưới tác động của ROS [26].
α-2 Macroglobulin là chất ức chế protease, hoạt động chủ yếu ở những vị trí
bị viêm nhiễm, là nơi rất dễ bị ROS tấn công [48]. Mỗi một tiểu phần α-2
macroglobulin có thể loại bỏ được ít nhất 10 mol dạng oxy hoạt động, tương ứng với
một lượng gốc Met chuyển hóa thành MetO [69]. Nếu dạng oxy phản ứng hoạt động
mạnh, sẽ dẫn đến quá trình oxy hóa gốc tryptophan và làm bất hoạt protease. Chính
vì vậy, Met đóng vai trò như “vệ sĩ phân tử” bảo vệ các gốc tryptophan đơn mang
tính chất quan trọng trong protein [48].
Các gốc Met trong protein thường được bố trí sao cho chúng tạo thành liên kết
kỵ nước với các axit amin mạch vòng như tryptophan, phenylalanine và tyrosine [87].
Liên kết này khá phổ biến và giúp ổn định cấu trúc phân tử protein với mỗi liên kết
chứa 1,0–1,5 kcal/mol, xấp xỉ bằng năng lượng của liên kết ion trong muối ăn NaCl
[87]. Các axit amin mạch vòng rất dễ bị tấn công bởi ROS, bởi vậy thiết lập tương
tác với các gốc Met là cách để chúng tránh khỏi sự tấn công bởi ROS. Tuy nhiên, quá
trình oxy hóa Met cũng sẽ phá vỡ các liên kết kỵ nước, do đó phá vỡ cấu trúc không
gian ba chiều của protein [48]. Ảnh hưởng của quá trình oxy hóa lên đặc tính của các
protein là rất khác nhau. Đối với một số enzyme, oxy hóa Met thành MetO hay thậm
chí là thay thế Met bằng các axit amin khác có thể chỉ có ảnh hưởng nhỏ đến hoạt
tính của enzyme nhưng cũng có thể dẫn đến mất hoạt tính xúc tác, mất đi khả năng
điều hòa các quá trình trao đổi chất [79].
Khi nghiên cứu trên Arabidopsis thaliana, Gustavsson và cs đã nghiên cứu
ảnh hưởng của ROS trên Hsp21, protein sốc nhiệt có hoạt tính giống như chaperone.
Hsp21 có mặt ở lục lạp, với đầu C bảo thủ và đầu N biến đổi. Điều thú vị là đầu N lại
chứa những trình tự giàu Met có tính bảo thủ cao. Cấu trúc bậc 2 của chuỗi protein
này được dự đoán là do sự có mặt của trình tự giàu Met tạo nên chuỗi xoắn α lưỡng
cực do tất cả Met đều nằm về một bên của phân tử. Khi các gốc Met này bị oxy hóa
dẫn đến Hsp21 bị mất đi chức năng do cấu trúc không gian của phân tử protein bị phá
vỡ [35]. Sau đó, để nghiên cứu tầm quan trọng của các gốc Met có mặt trên phân tử,

15
thể đột biến Hsp21 trên Arabidopsis thaliana đã được tạo ra bằng cách thay thế tất cả
các gốc Met thành leucine. Nguyên nhân là do Met và leucine đều là các axit amin
kỵ nước, tương tự nhau về mặt cấu trúc nhưng khác nhau là leucine không có sulfur
do đó không bị ảnh hưởng bởi quá trình oxy hóa bởi ROS. Kết quả cho thấy là thể
đột biến Hsp21 không bị mất đi hoạt tính enzyme, nhưng mất đi khả năng kiểm soát
quá trình oxy hóa khử [36].
Calmodulin chứa trình tự giàu Met, là protein có bốn vị trí gắn với canxi riêng
biệt. Khi được gắn với canxi, calmodulin sẽ hoạt hóa nhiều protein tham gia vào các
chuỗi dẫn truyền tín hiệu tế bào như các nhân tố phiên mã, protein kinase,
phosphatase và các kênh vận chuyển ion [81]. Chuỗi Met có mặt trên phân tử đặc biệt
phù hợp với chức năng này do là chuỗi không phân nhánh, góc xoắn linh hoạt, có
phân tử lưu huỳnh phân cực nên ái lực van der Waal mạnh. Ái lực này sẽ bị giảm
đáng kể khi Met bị chuyển hóa thành MetO. Do đó các MRP có Met bị chuyển hóa
thành MetO dưới ảnh hưởng của ROS sẽ có cấu trúc bậc 2 chuyển từ dạng xoắn α
sang dạng gấp nếp β [35]. Đặc biệt là việc oxy hóa Met nằm gần đầu C dẫn đến việc
calmodium bị mất đi khả năng hoạt hóa Ca-ATPase trên màng tế bào chất [30]. Như
vậy, ROS làm thay đổi cấu trúc của protein do làm thay đổi cơ chế liên kết,
calmodulin bị giảm liên kết tạo chuỗi với Ca-ATPase trên màng tế bào chất, mất đi
khả năng hoạt hóa các enzyme tham gia vào chuỗi dẫn truyền tín hiệu [30]. Trong
sinh vật sống, MetO được sửa chữa thành Met bởi sự xúc tác của enzyme Methionine
sulfoxide reductase (Msr).
1.2.3. Quá trình sửa chữa oxy hóa Methionine
Trong suốt quá trình tiến hóa, thực vật đã sản sinh ra hệ thống kiểm soát và
điều hòa ROS một cách chặt chẽ. Đáng chú ý là 2 cơ chế liên quan đến vai trò của:
(i) Các chất chống oxy hóa nội bào không có hoạt tính enzyme (non‒enzymatic
antioxidant) gồm ascorbate, glutathione, tocopherol, flavonoids, alkaloids và
carotenoid. (ii) Hệ thống các enzyme loại bỏ ROS (enzymatic antioxidant) ở thực
vật gồm superoxide dismutase, catalase, ascorbate peroxidase, methionine sulfoxide

16
reductase (Msr), peroxiredoxin và glutathione peroxidase [46]. Ở Arabidopsis
thaliana, có ít nhất 152 gen đã được biết đến, mã hóa cho các enzyme tham gia vào
quá trình sản sinh và loại bỏ ROS trong tế bào [46].
Oxy hóa Met xảy ra trong điều kiện hiếu khí là điều không thể tránh khỏi,
chính vì vậy các tế bào trong sinh vật sống đã phát triển nhiều cơ chế phức tạp cũng
như các enzyme để chống lại quá trình oxy hóa Met. Ngược lại với MetO2, MetO có
thể được chuyển hóa một cách thuận nghịch thành Met nhờ xúc tác của enzyme Msr.
Msr đầu tiên đã được mô tả trong E.coli vào năm 1981 [16] và sau đó được biết đến
là MsrA. Hai mươi năm sau đó, MsrB cũng đã được phát hiện. Người ta thấy rằng,
MsrA tham gia quá trình khử Met-S-O trong khi MsrB khử Met-R-O về dạng Met
(Hình 1.3). MsrA có thể tham gia khử dạng Met-S-O tự do và Met-S-O trên protein
trong khi MsrB khử Met-R-O tự do thành Met kém hiệu quả hơn so với dạng liên kết
trong protein do ái lực thấp hơn với cơ chất này ở dạng tự do [55]. Cả MsrA và MsrB
đều là những enzyme có tính bảo thủ cao trong vi khuẩn nhân thực, tế bào nhân thực
bao gồm cả tế bào người và hầu hết các sinh vật có chứa cả 2 dạng enzyme MsrA và
MsrB. MsrA là một dạng enzyme phổ biến, được tìm thấy trong hầu hết các sinh vật
từ vi khuẩn [63] đến cây trồng [72] đến động vật có vú [63], trong đó có cả người
[51]. Gần đây, một họ enzyme Msr mới được tìm thấy ở E.coli, chỉ có tính đặc hiệu
trong hoạt tính khử Met-R-O dạng tự do và không có khả năng khử MetO liên kết
trong protein được gọi là fRMsr (free Met-R-O). Đặc biệt, fRMsr chỉ được tìm thấy
trong một vài sinh vật đơn bào [26].
Hình 1.3. Phản ứng khử MetO về Met của các Msr
Protein
Protein
Protein
Protein
Methionine-S-Sulfoxide
Methionine-R-Sulfoxide
MetMet ROS

17
Arabidopsis thaliana chứa 5 gen mã hóa cho 5 protein MsrA khác nhau bao
gồm MsrA1, MsrA2, MsrA3 nằm trong bào tương, MsrA4 nằm trong lục lạp và MsrA5
với đích đến là các con đường tiết trong cơ thể [45]. Chín MsrB có mặt trong
Arabidopsis cũng có đích đến là các bào quan khác nhau; MsrB1 và B2 có mặt trong
lục lạp, MsrB3 đích đến là con đường tiết, trong khi 6 MsrB còn lại có mặt trong bào
tương của tế bào [45]. Phân tích biểu hiện của những gen này dựa vào kỹ thuật
microarray (vi dãy) cho thấy msrB1, msrB2 và msrB6 được biểu hiện chủ yếu ở lá trong
khi các msrB5, msrB7, msrB8 và msrB9 lại được tìm thấy chủ yếu trong rễ cây
Arabidopsis [56]. Các loài thực vật khác như các cây thuộc họ bạch dương có chứa 5
gen mã hóa cho MsrA và 4 gen mã hóa cho MsrB, ở lúa gồm 4 protein MsrA và 3
protein MsrB, trong khi ở động vật có vú số lượng Msr tổng số trung bình chỉ khoảng
4 gen mã hóa cho Msr (Bảng 1.3) [45].
Bảng 1.3. Số lượng gen MsrA và MsrB ở một số nhóm sinh vật [45]
Giới Tên sinh vật MsrA MsrB
Sinh vật nhân sơ quang
hợp
Anabaena sp. PCC 7120 2 1
Synechocystis sp. PCC 6803 2 1
Synechococcus sp. CC9311 2 2
Sinh vật nhân chuẩn
quang hợp
Arabidopsis thaliana 5 9
Populus trichocarpa (bạch dương) 5 4
Vitis vinifera (nho) 3 3
Oryza sativa (lúa gạo) 4 3
Physcomitrella patens (rêu) 5 3
Chlamydomonas reinhardtii (tảo) 5 3
Ostreococcus lucimarinus 3 3
Ostreococcus tauri 4 3
Synechocystis sp. PCC 6803 2 1
Synechococcus sp. CC9311 2 2
Sinh vật nhân sơ không
quang hợp
Escherichia coli 1 1
Sinh vật nhân chuẩn
không quang hợp
Homo sapiens (loài người) 1 3
Drosophila melanogaster (Ruồi giấm) 1 1
Saccharomyces cerevisiae (Nấm men) 1 1

18
Việc ứng dụng các kỹ thuật di truyền để bất hoạt hay biểu hiện quá mức các
gen Msr đã chỉ ra 2 chức năng chính của chúng trong tế bào: bảo vệ tế bào chống
lại các điều kiện cực đoan do oxy hóa và điều hòa chu trình sống. Bất hoạt các gen
mã hóa cho MsrA làm tăng độ nhạy cảm của vi khuẩn, nấm men, giun tròn
(Caenorhabditis elegans), chuột và thực vật với các điều kiện bất lợi oxy hóa.
Ngược lại, tăng cường biểu hiện của các gen mã hóa cho MsrA làm tăng khả năng
chống lại điều kiện bất lợi oxy hóa ở ruồi giấm (Drosophila), các tế bào động vật
có vú và thực vật [83]. MsrA2 có vai trò điều hòa quá trình phát triển của A. thaliana
dưới điều kiện bình thường. Khi gen mã hóa cho MsrA2 bị bất hoạt thì quá trình
sinh trưởng và phát triển của cây bị chậm lại dưới điều kiện ngày ngắn, tuy nhiên
lại không bị ảnh hưởng dưới điều kiện ngày dài [26]. Enzyme MsrB7và MsrB8
trong bào tương của A. thaliana giúp cây chống lại những ảnh hưởng tiêu cực khi
bị xử lý với H2O2 và methyl viologen, là gốc hoạt động của paraquat một trong
những thuốc trừ cỏ được sử dụng rộng rãi trong nông nghiệp [26, 56]. MsrB2 trong
một loài ớt (Capsicum annuum) đóng vai trò quan trọng trong cơ chế kháng lại mầm
bệnh [26]. Tuy nhiên, các protein đích của cả MsrA và MsrB trên thực vật vẫn chưa
được biết đến nhiều. Do vậy tác động của Msr này lên các quá trình đặc biệt của tế
bào vẫn chưa được làm rõ [56, 83].
Có thể thấy rằng, khử MetO thành Met với sự tham gia của enzyme Msr là
một quá trình được ghi nhận ở hầu hết các tế bào sinh vật trong sinh giới. Quá trình
này liên quan trực tiếp đến các vấn đề lão hóa, khả năng đề kháng của sinh vật đến
sự thay đổi của môi trường. Tuy nhiên trong điều kiện môi trường sống có nhiều bất
lợi như hiện nay, đảm bảo cân bằng giữa việc sản sinh và loại bỏ ROS bị phá vỡ bởi
nhiều tác nhân bất lợi như ánh sáng cao, hạn hán, nhiệt độ thấp hoặc cao và những
tổn thương cơ học [9]. Chính điều đó đã gây ra ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và
phát triển của cây trồng dẫn đến những thiệt hại lớn về sản lượng.

19
1.3. Tình hình nghiên cứu về protein có methionine mẫn cảm với các dạng oxy
phản ứng
1.3.1. Tình hình nghiên cứu trên thế giới
Trên thế giới, các công trình nghiên cứu về sự oxy hóa Met bởi ROS trên các
phân tử MRP và quá trình sửa chữa bởi enzyme Msr đã được thực hiện khá công phu.
Từ năm 1989, Reddy và cs đã chỉ ra α-2-macroglobulin đóng vai trò như chất ức chế
protease và hoạt động tại những vị trí sưng tấy, nơi có khả năng bị tấn công cao bởi
ROS. Tại đó, mỗi tiểu phần của α-2-macroglobulin có khả năng thu dọn ít nhất 10
mole chất oxy hóa với lượng tương ứng chuyển hóa Met thành MetO. Nhưng nếu cứ
tiếp tục phải đối mặt với các tác nhân oxy hóa, tryptophan sẽ bị chịu tác dụng của
ROS, dẫn đến bất hoạt α-2-macroglobulin [68]. Năm 2002, Gustavsson và cs đã gây
sốc nhiệt nhẹ protein Hsp21 nằm trong lục lạp. Kết quả là protein này bị bất hoạt do
các Met trên bề mặt phân tử chuyển hóa thành MetO. Cuối cùng, protein lại được
hoạt hóa do tác dụng của Msr làm giảm lượng MetO [37].
Các ảnh hưởng của MetO đến các protein trong chuỗi dẫn truyền tín hiệu cũng
được ghi nhận [18, 28, 46]. Nhóm nghiên cứu Takahashi và cs đã nghiên cứu trên
protein Calmodulin tham gia vào quá trình dẫn truyền tín hiệu trong tế bào và chức
năng ổn định ROS trên đối tượng thực vật [81]. Mối liên quan giữa quá trình oxy hóa
Met với sự mất ổn định cấu trúc của protein calmodulin [26] và sự mất chức năng của
protein này [26, 46, 78] cũng được ghi nhận.
Việc phát hiện một cách có hệ thống các protein có Met mẫn cảm với tác nhân
oxy hóa, sự oxy hóa Met cũng như sửa chữa bởi Msr đã được rất nhiều nhà khoa học
tập trung nghiên cứu. Các phương pháp xác định bao gồm khối phổ, sửa đổi các gốc
Met và MetO kết hợp với phân tích axit amin, dựa vào phân tích phóng xạ, sắc ký
lỏng hiệu năng cao (HPLC) và phương pháp miễn dịch sử dụng các kháng thể đặc
hiệu với các dạng MetO [26].
Rosen và cs sử dụng phương pháp khối phổ để phân tích khả năng phân giải
protein của các tế bào E.coli khi bị xử lý bởi H2O2, HOCl hoặc với bạch cầu trung

20
tính (neutrophil). Các phân đoạn peptide được phân tích bằng sắc ký lỏng kết hợp với
đầu dò ion hóa kết hợp phương pháp khối phổ. Peptide được phát hiện tăng 16 Da
[71]. Đây là kết quả của quá trình oxy hóa Met thành MetO. Nhóm tác giả đã phát
hiện có khoảng 10-50% các gốc Met trong protein E.coli bị oxy hóa khi tiếp xúc với
HOCl hoặc bạch cầu phụ thuộc vào điều kiện thí nghiệm. Protein nằm ở vỏ tế bào có
mức độ mẫn cảm cao đối với sự oxy hóa Met, trong khi Met gắn trên các protein
thuộc tế bào chất và nội màng hầu như không bị oxy hóa [71]. Điều này cho thấy các
protein nội bào được bảo vệ trước tác dụng của HOCl. Tuy nhiên, đáng tiếc rằng
nghiên cứu này lại không chỉ ra được danh sách hoàn chỉnh các protein và vị trí các
gốc Met bị mẫn cảm với quá trình oxy hóa.
Shechter và cs đã sử dụng phương pháp sửa đổi bằng hóa học để xác định các
gốc MetO khi vẫn có mặt gốc Met trong phân tử protein. Protein đã bị oxy hóa được
xử lý với cyanogen bromide trong điều kiện 80% axit formic. Phản ứng của protein
có chứa Met với cyanogen bromide làm đứt liên kết peptide tại vị trí carboxyl của
phân tử Met. Phản ứng này làm đứt các liên kết peptide trong chuỗi peptide một cách
có định hướng. Sau khi xử lý, các gốc Met sẽ bị chuyển hóa thành homoserine còn
gốc MetO được giữ nguyên. Mẫu protein lại tiếp tục được đông khô và thủy phân
trong môi trường HCl 6N có chứa dithioerythritol để toàn bộ MetO sẽ bị khử để trở
về dạng Met (trên 95% tổng số lượng MetO sẽ bị chuyển hóa). Cuối cùng, homoserine
và Met sẽ được đo bằng phương pháp phân tích axit amin, tương ứng với hàm lượng
Met và MetO để chỉ ra tổng số gốc Met mẫn cảm với quá trình oxy hóa của protein
[75]. Tuy nhiên, phương pháp này không sử dụng được để phân tích axit amin tự do.
Năm 2008, Le và cs đã rất nỗ lực khi nghiên cứu sự oxy hóa Met và sự khử
MetO thông qua việc sử dụng protein có Met mẫn cảm với các tác nhân oxy hóa.
Nhóm tác giả đã thành công khi phân lập và biểu hiện ba MRP và phát triển các
phương pháp kiểm tra quá trình oxy hóa Met và khử MetO thông qua điện di protein
SDS-PAGE và tạo kháng thể nhận biết MetO nhờ kỹ thuật lai miễn dịch [53]. Le và
cs (2009) cũng đã chỉ ra rằng việc biểu hiện quá mức gen mã hóa Msr có thể đem lại
tính kháng tác nhân oxy hóa cho tế bào nấm men hoặc tế bào động vật [52]. Bên cạnh

21
đó, Liang và cs đã tách dòng, biểu hiện, tinh sạch và phân tích khối phổ cho bốn MRP
mới (chứa > 20% Met, chứa ít hay thiếu cystein) để nghiên cứu quá trình oxy hóa
Met và quá trình sửa chữa được diễn ra nhờ Msr [57]. Thông qua đó, natri
hypochlorite (NaOCl) được chỉ ra là có hiệu quả cao trong việc tạo MetO trên MRP.
Gần đây, Tarrago và cs đã sử dụng sắc ký ái lực như là một cách tiếp cận để
dò tìm các protein là cơ chất (đích tác động) của Msr mà cụ thể là AtMsrB1. Kết quả
đã chỉ ra 24 protein có vai trò trong quá trình quang hợp, dịch mã và tham gia vào
quá trình bảo vệ cây chống lại những bất lợi về oxy hóa cũng như có vai trò trong quá
trình sinh tổng hợp đường và các axit amin. Bên cạnh đó, đa số đích tác động của
MsrB1 là các protein chứa hàm lượng cao Met [84]. Năm 2015, Jacques và cs đã sử
dụng một phương pháp mới được gọi là COFRADIC để khảo sát phân bố của các vị
trí MetO trên hệ protein của cây mô hình trong điều kiện bất lợi oxy hóa [45]. Sử
dụng cây Arabidopsis thaliana bị bất hoạt enzyme catalase 2, nhóm tác giả đã tìm
thấy gần 500 vị trí Met bị oxy hóa trong 400 protein, đồng thời cũng định lượng
protein giữa cây đột biến bất hoạt enzyme catalase 2 và cây kiểu dại. Catalase 2 là
enzyme catalase chính có mặt ở trong lá, với nhiệm vụ là bảo vệ các tế bào khỏi các
tổn thương oxy hóa bằng cách xúc tác quá trình chuyển hóa hydrogen peroxide thành
nước và oxy phân tử. Hoạt tính của hai glutathione S-transferase (GSTF) là GSTF9
và GSTF23 có dấu hiệu giảm rõ rệt trong điều kiện cực đoan [45].
Mặc dù việc oxy hóa và khử gốc oxy hóa ở các gốc Met trong calmodulin và
các protein truyền tín hiệu canxi khác đã được chứng minh là tham gia vào việc điều
hòa chức năng protein [26, 28, 78], tuy nhiên người ta vẫn không biết được các ứng
viên tiềm năng để tiếp cận bằng phương pháp sắc kí ái lực và khối phổ [26, 45, 84].
Hiện nay, có bao nhiêu protein mẫn cảm với oxy hóa Met và trong số đó có bao nhiêu
protein có thể được sửa chữa bởi Msr vẫn là điều chưa được biết đến.
1.3.2. Tình hình nghiên cứu ở Việt Nam
Ở Việt Nam, bước đầu đã có một số nghiên cứu về ảnh hưởng của các dạng
oxy phản ứng đến cây trồng như Mai Văn Chung đã công bố một số kết quả bước đầu

22
về biểu hiện của các dạng oxy phản ứng trong phản ứng bảo vệ của cây đậu (Pisum
sativum L.) khi chịu sự tấn công của rệp đậu (Acyrthosiphon pisum Harris) - loại côn
trùng chích hút nhựa cây có mức độ phá hoại được đánh giá là nguy hiểm đối với
nhiều cây trồng họ Fabaceae [1]. Bên cạnh đó, điều kiện tách chiết cũng là nhân tố
ảnh hưởng lớn đến hoạt tính chống oxy hóa của diệp hạ châu, một loài dược liệu quý
được trồng phổ biến theo quy mô công nghiệp tại nhiều tỉnh của Việt Nam [3].
Tuy nhiên, đó mới chỉ là những nghiên cứu rất sơ lược, bước đầu về ảnh hưởng
của các dạng oxy phản ứng với thực vật tại Việt Nam. Tính đến thời điểm hiện nay,
vẫn chưa có bất kỳ công bố chính thức nào về các protein chứa Met mẫn cảm với các
tác nhân oxy hóa, sự oxy hóa Met và ảnh hưởng qua lại của chúng đến hoạt động của
Msr trên thực vật.
Đồng thời, để phát hiện và chứng minh các protein đích tiềm năng cho việc
can thiệp bằng kĩ thuật di truyền, chúng ta cần phải biết protein nào là mẫn cảm với
oxy hóa Met và bao nhiêu trong số chúng có thể sửa chữa bởi Msr. Chính vì vậy,
chúng tôi đã tiến hành “Nghiên cứu vai trò của protein giàu Methionine trên cây
Arabidopsis thaliana”. Nghiên cứu này hứa hẹn mở ra một hướng nghiên cứu mới
về protein chứa Met mẫn cảm với quá trình oxy hóa tại Việt Nam.

23
Chương 2 – VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP
2.1. Vật liệu
2.1.1. Vật liệu nghiên cứu
Sau khi tìm được các gen mã hóa MRP đáp ứng phiên mã với điều kiện bất
lợi, các dòng Arabidopsis biểu hiện quá mức các gen này được tìm kiếm trên cơ sở
dữ liệu của Trung tâm Tài nguyên Sinh học RIKEN (RIKEN BRC, Nhật Bản). Hạt
Arabidopsis thaliana kiểu dại chủng Columbia (Col-0) được sử dụng cho các thí
nghiệm. Hạt Arabidopsis thaliana biểu hiện quá mức gen mã hóa MRP nằm trong
thư viện dòng FOX (Full-length cDNA Over-eXpressing), được cung cấp bởi Trung
tâm Tài nguyên Sinh học RIKEN, Tsukuba, Nhật Bản. Trong thư viện dòng FOX,
cDNA hoàn chỉnh của Arabidopsis được điều khiển bởi promoter 35S và được chèn
vào plasmid mang gen chống chịu kháng sinh hygromycin. Plasmid được chuyển vào
cây Arabidopsis bằng phương pháp nhúng hoa. Dòng cây chuyển gen biểu hiện quá
mức gen At3G55240 đã được nghiên cứu bởi Ichikawa và cs (2006) [43].
2.1.2. Hóa chất
Các hóa chất chính sử dụng được liệt kê trong Bảng 2.1.
Bảng 2.1. Các hóa chất chính được sử dụng trong nghiên cứu.
STT Hóa chất Hãng cung cấp Mục đích
1
Murashige & Skoog medium
chứa các vitamin
Duchefa (Hà Lan)
Môi trường nảy
mầm hạt và thử
mức độ nhạy
cảm với điều
kiện bất lợi
2 Hygromycin B Sigma (Mỹ)
3 Natri clorua Merck (Mỹ)
4 Paraquat diclorua Syngenta (Indonesia)
5 Cadmium clorua Himedia (Ấn Độ)

24
2.1.3. Thiết bị
Các thiết bị và máy móc thuộc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công
nghệ Tế bào Thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp sử dụng trong nghiên cứu được
thống kê trong Bảng 2.2.
Bảng 2.2. Các thiết bị được sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên thiết bị Hãng sản xuất
1 Cân phân tích Sartorius (Đức)
2 Cân kỹ thuật Sartorius (Đức)
3 Máy cất nước Hamilton (Anh)
4 Nồi hấp tiệt trùng tự động Tomy (Nhật Bản)
5 Tủ an toàn sinh học Esco (Mỹ)
6 Tủ lạnh –20C và 4C Panasonic (Nhật Bản)
7 Tủ sấy Memmert (Đức)
2.2. Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu được tiến hành theo quy trình được trình bày trong Hình 2.1.
2.2.1. Phương pháp tiếp cận bằng tin sinh học
2.2.1.1. Phương pháp chú giải chức năng gen mã hóa MRP
Danh sách các gen mã hóa MRP được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu thuộc
Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc gia Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Di truyền
Nông nghiệp. Trình tự polypeptide của Arabidopsis thaliana lấy từ cơ sở dữ liệu
Phytozome v9.0 được sử dụng để tìm kiếm tất cả các protein có ít nhất 95 axit amin
và chứa nhiều hơn 6 % Met bằng một đoạn mã chạy trên nền java.
Trình tự polypeptide của gen mã hóa MRP với định dạng fasta được đưa vào
phần mềm MAPMAN (http://mapman.gabipd.org) [85] và phần mềm Blast2go Basic
phiên bản 3.0 (https://www.blast2go.com) [33] để tiến hành phân loại chức năng gen

25
thành 3 nhóm: tham gia vào các quá trình sinh học, có chức năng phân tử và là thành
phần của tế bào.
Hình 2.1. Sơ đồ thí nghiệm được sử dụng trong nghiên cứu
Dự đoán vị trí cư trú của protein hỗ trợ cho việc xác định chức năng và tìm
hiểu sự tương tác với phân tử khác trong tế bào. Tế bào nhân chuẩn có mức độ tổ
chức cao nên chức năng của protein trong các quá trình sinh học có mối liên hệ chặt
chẽ với vị trí cư trú của chúng trong tế bào. Trong những năm gần đây, nhiều công
Danh sách các gen
mã hóa MRP
Chú giải chức năng
các gen mã hóa MRP
Yếu tố cis đáp ứng với điều
kiện bất lợi trên promoter
gen mã hóa MRP
Yếu tố cis đáp ứng với điều
kiện bất lợi trên promoter
gen mã hóa MRP
Cây Arabidopsis biểu
hiện quá mức hoặc bị
đột biến gen ứng viên
Đánh giá hình thái
Thử nghiệm điều
kiện bất lợi
Thử kháng mặn
Thử kim loại
nặng Cadmium
Thử paraquat
TIN
SINH
HỌC
THỰC
NGHIỆM

26
cụ dự đoán được phát triển. Phần lớn các công cụ này dựa vào thuật toán nội suy,
xác định vị trí cư trú của protein thông qua việc tìm hiểu đặc điểm vị trí các trình tự
đặc hiệu của các protein đã biết [58]. Mặc dù vậy, cho đến nay, các phương pháp
này vẫn còn bị hạn chế về phạm vi và độ chính xác. Cụ thể, TargetP chỉ tập trung
xác định được 3 vị trí: lục lạp, ty thể và chuỗi peptide có vùng tín hiệu tiết (secretory
pathway signal peptide). Trong đó, TargetP sử dụng ChloroP để dự đoán protein
nằm trong lục lạp. pSORT lại chỉ xác định được 2 vị trí là lục lạp và ty thể [58].
Trong nghiên cứu này, để dự đoán vị trí cư trú của MRP trong tế bào, tệp fasta chứa
toàn bộ trình tự của MRP trên Arabidopsis thaliana được sử dụng làm đầu vào để
tìm kiếm trên 3 cơ sở dữ liệu trực tuyến phổ biến bao gồm ChloroP
(http://www.cbs.dtu.dk/services/ChloroP/) [27], pSORT (http://www.psort.org/)
[41], và CELLO (http://cello.life.nctu.edu.tw/) [92]. Trong đó, vị trí cư trú nằm trên
lục lạp được dự đoán bằng ChloroP và pSORT. Vị trí cư trú nằm trên ty thể được
dự đoán bằng pSORT và CELLO.
2.2.1.2. Đánh giá biểu hiện gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis trong điều
kiện bình thường và điều kiện bất lợi
Sử dụng dữ liệu microarray của những nghiên cứu trước đó để đánh giá mức
độ biểu hiện của MRP dưới điều kiện khô hạn, điều kiện chịu mặn [64, 65]. Các thử
nghiệm này được tiến hành theo quy trình như sau:
Xử lý hạn đã được thực hiện như sau: hạt giống của cây Arabidopsis kiểu dại
(chủng Columbia) được gieo trên môi trường nảy mầm GM đặc có bổ sung 3%
sucrose và giữ ở 4°C trong 4 ngày. Sau đó, hạt được chuyển ra phòng nuôi trong điều
kiện nhiệt độ 22°C, quang chu kỳ sáng:tối là 16:8 giờ, cường độ ánh sáng 60 µmol
m-2
s-1
photon ). Cây 2 tuần tuổi sẽ được chuyển sang môi trường giá thể đất và tưới
nước đầy đủ trong tuần đầu tiên. Cây bắt đầu chuyển sang giai đoạn 3 tuần tuổi sẽ
được ngừng tưới nước trong vòng 10 ngày. Sau 10 ngày thí nghiệm, các lá xếp theo
dạng hoa hồng (rosette) ở cả cây đối chứng và cây chịu hạn sẽ được thu mẫu, làm
lạnh nhanh bằng nitơ lỏng và bảo quản ở ‒80°C cho đến khi tách RNA để phân tích
microarray. Kết quả phân tích được thu thập từ GEO của NCBI. Số hiệu truy cập là

27
GSE42290, công bố ngày 15 tháng 02 năm 2013, cập nhật lần cuối ngày 22 tháng 04
năm 2015, nền tảng là Platforms GPL12621, mẫu phân tích là Samples từ GSM
1037236-GSM 1037247 [65].
Xử lý mặn đã được thực hiện như sau: hạt giống của cây Arabidopsis kiểu
dại (chủng Columbia) được gieo trên môi trường nảy mầm GM đặc có bổ sung 3%
sucrose và giữ ở 4°C trong 4 ngày. Sau đó, hạt được chuyển ra phòng nuôi trong
điều kiện nhiệt độ 22°C, quang chu kỳ sáng:tối là 16:8 giờ, cường độ ánh sáng 60
µmol m-2
s-1
photon). Cây 10 ngày tuổi trên môi trường GM đã được chuyển sang
môi trường ½ MS đặc không có sucrose, chứa 0 mM NaCl (đối chứng) hoặc 200
mM NaCl và được giữ trong vòng 24 giờ. Thí nghiệm được lặp lại 3 lần (10 cây/lần).
Mẫu lá sau khi thu được làm lạnh nhanh bằng nitơ lỏng và bảo quản ở ‒80°C cho
đến khi tách RNA để xác định biểu hiện gen. Dữ liệu của nghiên cứu được truy cập
theo số hiệu series GSE32087, mẫu phân tích là Samples từ GSM795503 -
GSM795514 [64]. Tất cả các dữ liệu này được thu thập để phân tích và tiến hành
khai thác dữ liệu.
Yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi trên promoter của gen mã hóa MRP.
Năm yếu tố cis (ABRE, MYCR, MYBR, ICEr2, RSRE) liên quan đến đáp ứng với
điều kiện bất lợi sẽ được xác định theo trình tự nhận biết như Bảng 2.3. Trình tự 1-
kb ngược dòng từ vị trí bắt đầu phiên mã (+1) của mỗi gen AtMRP được tìm kiếm
yếu tố cis nhờ phần mềm MEGA 4 [82].
Bảng 2.3. Trình tự của một số yếu tố điều hòa cis trong điều hòa biểu hiện gen
đáp ứng với điều kiện bất lợi [90]
Yếu tố cis Trình tự nhận biết
ABRE (C/G/T)ACGTG(G/T)(A/C)
MYBR (A/C)ACC(A/T)A(A/C)C
MYCR CACATG
ICEr2 ACTCCG
RSRE CGCGTT

28
2.2.2. Phương pháp tiếp cận bằng thực nghiệm
2.2.2.1. Đánh giá hình thái cây chuyển gen At3G55240
Hạt giống Arabidopsis chuyển gen và hạt đối chứng được xử lý sơ bộ bằng
ethanol 70% trong 5 phút, sau đó được khử trùng tiếp bằng dung dịch NaClO nồng
độ 1% trong thời gian 1 phút. Tiếp theo rửa hạt 5 lần bằng nước cất vô trùng để loại
bỏ các phần dư thừa của hóa chất vô trùng có thể ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt
và sinh trưởng của cây con sau này.
Hạt Arabidopsis chuyển gen và đối chứng sau khi khử trùng được gieo trên
đĩa petri chứa môi trường ½ MS đặc có và không có kháng sinh hygromycin, trong
điều kiện của phòng nuôi cấy mô tế bào, quang chu kỳ sáng: tối là 16:8 giờ, nhiệt độ
phòng nuôi 24±2o
C. Quan sát hình thái cây trong đĩa thạch ½ MS ở các giai đoạn
khác nhau. Chọn các cây 14 ngày tuổi (có kích thước tương đương nhau) trên môi
trường ½ MS chuyển sang giá thể đất. Quan sát sự thay đổi hình thái cây trên giá thể
đất ở tuần tuổi khác nhau.
2.2.2.2. Đánh giá mức độ đáp ứng của cây chuyển gen trong các điều kiện bất lợi
Thử nghiệm tính kháng mặn: Gieo hạt cây chuyển gen và cây đối chứng trên
môi trường ½ MS có và không có kháng sinh hygromycin. Chuyển cây 12 ngày tuổi
sang môi trường ½ MS, có bổ sung NaCl ở nồng độ 175 mM. Cây sống sót trên môi
trường có bổ sung NaCl sẽ được đếm từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 7.
Thử nghiệm tính kháng với kim loại nặng cadmium: Gieo hạt cây chuyển gen
và cây đối chứng trên môi trường ½ MS có và không có kháng sinh hygromycin.
Chuyển cây 12 ngày tuổi sang môi trường ½ MS, có bổ sung cadmium cloride ở nồng
độ 750 µM. Cây sống sót trên môi trường có bổ sung CdCl2 sẽ được đếm từ ngày thứ
3 đến ngày thứ 8.
Thử nghiệm với paraquat trên lá cây Arabidopsis: Thí nghiệm được tiến hành
dựa trên nghiên cứu trước đây của Yang và cs (2007) [91] có cải biến. Gieo hạt cây
chuyển gen và đối chứng trên môi trường ½ MS đặc có và không có kháng sinh
Hygromycin. Chọn các cây 14 ngày tuổi (có kích thước tương đương nhau) trên môi
trường ½ MS chuyển sang giá thể đất. Lá cây 3 tuần tuổi được cắt ra và ngâm trong

29
dung dịch paraquat ở các nồng độ khác nhau: 0µM (đối chứng), 0,5µM, 1µM và 2µM,
được giữ trong điều kiện tránh ánh sáng trong vòng 1-2h sau đó được chuyển ra điều
kiện ánh sáng liên tục ở 24 o
C và quan sát sự mất màu của lá sau 24 giờ.

30
Chương 3 – KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Phân tích tin sinh học cho các gen mã hóa MRP
3.1.1. Tìm kiếm và xác định các gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis
Tất cả những gen mã hóa cho protein có kích thước lớn hơn 95 gốc axit
amin và chứa hàm lượng Met từ 6 % được coi là MRP. Danh sách 121 gen AtMRP
được cung cấp bởi nhóm nghiên cứu thuộc Phòng Thí nghiệm Trọng điểm Quốc
gia Công nghệ Tế bào Thực vật - Viện Di truyền Nông nghiệp (Phụ lục). Trong
số toàn bộ AtMRP, hàm lượng Met lớn 7 % được tìm thấy ở 47 gen (chiếm 38,8
% tổng số gen mã hóa cho MRP), đặc biệt có 2 gen AT4G16980 và AT1G33820
mã hóa cho phân tử protein có kích thước tương ứng là 164 và 182 axit amin, chứa
15,95 % và 16,02 % Met.
MAPMAN là một công cụ cho phép chú giải chức năng gen. Theo Thimm và
cs (2004), MAPMAN xác định chức năng của gen có thể tham gia vào một phần của
quá trình trao đổi chất, hoặc có chức năng cụ thể (như tổng hợp protein), đáp ứng
sinh học (như gen tham gia vào trao đổi chất và/ hoặc đáp ứng với hormone), hoặc
mã hóa cho các họ enzyme mà chức năng của chúng chưa rõ [85]. Kết quả phân tích
cho thấy khoảng 50 % gen AtMRP chưa rõ hoặc chưa xác định được chức năng trong
tế bào. Số còn lại đóng vai trò quan trọng trong tế bào (Hình 3.1 và Bảng 3.1). Trong
đó, điều hòa phiên mã RNA (có 20 AtMRP tham gia, chiếm 18 %), biến đổi protein
(12 AtMRP tương đương 11 %) và con đường tín hiệu Ca2+
(tương ứng với 6 AtMRP,
chiếm 5 %) là 3 nhóm chức năng chính được quan tâm khi phân tích MRP. Bên cạnh
đó, một số MRP cũng phân bố rải rác trong các chu trình quan trọng khác như liên
kết và vận chuyển kim loại, tương tác với yếu tố bất lợi, xử lý RNA sau phiên mã,
chu kỳ tế bào, liên quan đến sự phát triển của tế bào. Những phân tích trên MRP đã
biết chức năng đều cho thấy vai trò thiết yếu của các protein giàu Met nói riêng tham
gia vào trong tế bào thực vật.

31
Bảng 3.1. Phân loại chức năng gen mã hóa MRP trong Arabidopsis theo MAPMAN
Nhóm chức năng gen AtMRP
Kiểm soát ion kim loại 2
Phản ứng điều kiện bất lợi 1
Xử lý RNA 4
Điều hòa phiên mã RNA 20
Biến đổi protein 12
Truyền dẫn tín hiệu (Ca2+
) 6
Chu trình tế bào 3
Sự phát triển 1
Vận chuyển (kim loại) 6
Chưa biết chức năng 56
(Một số gen có thể được phân loại vào nhiều hơn một nhóm chức năng)
Hình 3.1. Sự phân bố gen mã hóa MRP trong các quá trình sinh học khác nhau của
Arabidopsis

32
Sản phẩm của các gen AtMRP cũng được phân loại dựa vào phần mềm
BLAST2GO phiên bản 3.0 để phân loại thành nhóm chức năng: quá trình sinh học
(Hình 3.2), thành phần của tế bào (Hình 3.3) và chức năng phân tử (Hình 3.4).
Kết quả phân loại chức năng gen nhờ phần mềm BLAST2GO cũng cho thấy tầm
quan trọng của MRP, tham gia vào nhiều chức năng trong các quá trình sinh học
của thực vật, giữ chức năng phân tử cũng như tham gia vào các thành phần quan
trọng của tế bào.
Hình 3.2. Phân loại chức năng của các gen AtMRP theo quá trình sinh học
(Các gen có thể được phân loại vào nhiều hơn một nhóm chức năng)

33
Hình 3.3. Phân loại chức năng của các gen AtMRP theo thành phần tế bào
Hình 3.4. Phân loại gen AtMRP theo tham gia vào chức năng phân tử

34
Lục lạp và ty thể là hai bào quan sản sinh ra ROS ở mức độ cao. Như vậy,
việc xác định vị trí hoạt động của MRP trong bào quan có thể góp phần làm sáng tỏ
về chức năng của chúng. Để nhận biết đích đến của MRP trong tế bào, chúng tôi đã
sử dụng 3 công cụ bao gồm ChloroP, pSORT và CELLO để dự đoán dựa trên trình
tự polypeptide của 121 MRP ở định dạng fasta. Kết quả là 21 MRP được dự đoán
có đích đến ở lục lạp bởi ChloroP và/hoặc pSORT, trong khi chỉ có 9 MRP được dự
đoán là cư trú trong ty thể của tế bào thực vật bởi pSORT và/hoặc CELLO (Bảng
3.2 và Hình 3.5). Trong đó, chỉ có 2 protein cùng được dự đoán là nằm trên lục lạp
bởi ChloroP và pSORT và chỉ có 1 protein cũng được dự đoán ở ty thể bởi pSORT
và CELLO (Hình 3.5).
Hình 3.5. Dự đoán vị trí của các MRP trong tế bào của Arabidopsis thaliana bằng
phần mềm ChloroP, pSORT và CELLO
Việc có ít trùng lặp trong kết quả dự đoán giữa các phương pháp tin sinh học
về vị trí lưu trú của các protein đặc hiệu đã được nhóm tác giả Liu và cs nêu rõ, cụ
thể là do sự khác nhau trong thuật toán và cơ sở dữ liệu mẫu của mỗi phương
pháp nên thường các công cụ dự đoán khác nhau cho ra những kết quả cũng khá là
khác nhau [58]. Do đó, chúng tôi quan tâm nhiều hơn đến tổng số lượng dự đoán
của MRP có kết quả là đích đến là lục lạp và ty thể từ cả 2 phần mềm, bởi kết quả
này có thể bổ trợ cho nhau.
10 92
ChloroP pSORT
A. Lục lạp
21
2 61
CELLO pSORT
B. Ty thể
9

35
Bảng 3.2. Các MRP được dự đoán có đích tác động là ty thể và lục lạp
TT Tên protein
Chloro P WoLF PSORT CELLO
Lục lạp Lục lạp Ty thể Ty thể
1 At1G06960.3 Y
2 At1G10590.3 Y
3 At1G22590.1 Y Y
4 At1G32560.1 Y
5 At1G33860.1 Y
6 At1G49800.1 Y
7 At1G68160.1 Y
8 At2G07708.1 Y Y
9 At2G26975.1 Y
10 At2G46600.1 Y
11 At3G07560.1 Y
12 At3G11160.1 Y
13 At3G28190.1 Y
14 At3G28990.1 Y
15 At3G29070.1 Y
16 At3G43410.1 Y
17 At3G46900.1 Y
18 At3G59900.1 Y
19 At4G08395.1 Y
20 At4G32470.2 Y Y
21 At4G34590.1 Y
22 At5G26673.1 Y
23 At5G41170.1 Y
24 At5G59030.1 Y
25 At5G59040.1 Y Y
26 At5G61710.1 Y Y
27 ATMG00500.1 Y
28 ATMG00650.1 Y
Tổng số 12 11 3 7
Y: được dự đoán là có mặt trong bào quan tương ứng

36
Để tăng mức độ tin cậy của kết quả, chúng tôi đã kiểm chứng lại vị trí bào
quan mà 121 AtMRP cư trú bằng phần mềm BLAST2GO phiên bản 3.0. Sử dụng
công cụ Graphs, lựa chọn mục Cellular Component trong GO Category, đã đếm được
9 trình tự AtMRP trên ty thể (Hình 3.6). Điều này làm tăng mức độ tin cậy từ kết quả
dự đoán về đích đến của MRP trong tế bào. Như đã biết, lục lạp và ty thể là hai bào
quan sản sinh ROS [31], chính điều này làm các MRP cư trú trong đó dễ dàng bị oxy
hóa khi dư lượng ROS tăng cao do yếu tố bất lợi tác động. Như vậy, kết quả dự đoán
vị trí cư trú của MRP trong tế bào bước đầu có thể nhận định được vai trò của chúng
tham gia trong các bào quan.
Hình 3.6. Dự đoán vị trí của MRP trong tế bào của Arabidopsis thaliana bằng
phần mềm Blast2GO
Như vậy, để làm rõ hơn đích tác động quá trình oxy hóa và khử Met trong thực
vật, nghiên cứu đã chỉ ra một số lượng lớn MRP tham gia vào các quá trình quan
trọng trong tế bào như kiểm soát quá trình phiên mã RNA, tín hiệu Ca2+
. Sản phẩm
của các gen được dự đoán nằm ở các bào quan giàu ROS là lục lạp và ty thể, góp
phần làm sáng tỏ hơn chức năng của MRP trong tế bào.

37
3.1.2. Đánh giá biểu hiện gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis trong điều
kiện thường và điều kiện bất lợi
Ban đầu, dữ liệu microarray của gen mã hóa MRP trên cây Arabidopsis kiểu
dại ở điều kiện bình thường so với điều kiện chịu mặn và hạn hán [54, 64] được thu
thập để phân tích và tiến hành khai thác dữ liệu. Trong tổng số 121 gen AtMRP, dữ
liệu biểu hiện của 108 gen AtMRP (chiếm 89,26 %) được ghi nhận số liệu (Phụ lục).
Tất cả các gen có sự thay đổi tăng hoặc giảm ≥ 2 lần được coi là có biểu hiện đáp ứng
với điều kiện bất lợi. Kết quả cho thấy có khoảng 50% gen mã hóa MRP có mức độ
phiên mã thay đổi trong điều kiện chịu mặn và/hoặc điều kiện hạn. Trong điều kiện
chịu mặn, 11 và 17 gen có mức độ biểu hiện phiên mã tăng và giảm ít nhất 2 lần.
Trong khi, 23 và 16 gen được lần lượt có mức độ biểu hiện tương ứng là cao hơn và
thấp hơn trong điều kiện chịu hạn. Trong đó, 6 gen cùng có đáp ứng tăng gấp hơn 2
lần và 3 gen cùng giảm biểu hiện đi hơn 2 lần trong cả hai điều kiện cực đoan trong
thí nghiệm (Hình 3.7). Gen At3G59900 có biểu hiện tăng 10,7 lần trong điều kiện
chịu hạn nhưng lại giảm biểu hiện -2,6 lần trong điều kiện chịu mặn. Tổng số 10 gen
mã hóa MRP có mức độ đáp ứng mạnh nhất trong cả điều kiện hạn hán và mặn được
chỉ ra ở Bảng 3.3.
Hình 3.7. Biểu đồ Venn thể hiện số lượng gen mã hóa MRP đáp ứng tăng và giảm
gấp hơn 2 lần trong các điều kiện chịu mặn và hạn hán

38
Bảng 3.3. Gen AtMRP đáp ứng phiên mã với hạn hán và độ mặn cao
TT Tên gen
Met
(%)
Chiều dài
(axit amin)
Số lần thay đổi ở mức độ biểu hiện Mô tả gen
Xử lý hạn Xử lý mặn
1 At1G32560 6,02 134 135,3 3,3 Protein chứa vùng LEA nhóm I
2 At1G33860 8,55 153 2,4 2,2 Protein chưa biết
3 At3G55240 6,12 95 -60,3 -26,9
Biểu hiện quá mức dẫn đến sự “giả vàng
úa dưới ánh sáng”
4 At3G59900 6,2 130 10,7 -2,6 Protein chưa biết
5 At3G62090 6,38 346 64,6 2,3
Nhân tố phiên mã bHLH liên quan đến
yếu tố MYC
6 At4G12334 6,25 113 -9,8 -3,0
Gen giả mã hóa cho protein trong họ chuỗi
truyền điện tử P450
7 At4G33467 8,91 102 337,5 6,2 Protein chưa biết
8 At4G34590 6,33 159 8,3 3,3 Nhân tố phiên mã bZIP11
9 At5G42325 6,03 233 2,7 2,4 Nhân tố phiên mã liên quan đến sự kéo dài
10 At5G67390 7,43 176 -4,2 -4,1 Protein chưa biết

39
Gen At4G33467, mã hóa cho protein chưa biết đến chức năng và là gen có
biểu hiện tăng mạnh nhất trong điều kiện hạn hán, mức độ thay đổi gấp hơn 330
lần so với nhóm đối chứng. Một gen khác như At1G32560, mã hóa cho protein
chứa vùng domain LEA nhóm 1 liên quan đến sự cảm ứng với điều kiện mất nước,
gen này tăng mức biểu hiện gấp khoảng 135 lần trong điều kiện hạn. Gen mã hóa
cho protein LEA như At1G32560 có vai trò trong quá trình phát triển muộn của
phôi. LEA thường xuất hiện nhiều trong hạt và các mẫu mô thực vật trong điều
kiện bất lợi như khô hạn, chịu mặn, nhiệt độ căng thẳng. Họ protein LEA được
chứng minh rằng khi tăng cường biểu hiện sẽ giúp thực vật có khả năng chống
chịu tốt hơn trong điều kiện chịu mặn [64]. Bên cạnh đó, gen At3G62090 mã hóa
cho yếu tố phiên mã bHLH (helix loop helix-HLH) được đặc trưng bởi cấu trúc
xoắn-vòng-xoắn cơ bản, có mức độ biểu hiện được tăng cường gấp 64 và 2 lần
trong khi xử lý hạn và mặn. Ngược lại, trong số các gen có biểu hiện giảm,
At3G55240 bị kìm hãm biểu hiện mạnh nhất, mức độ biểu hiện của gen này bị
giảm tương ứng khoảng 60 và 26 lần trong điều kiện hạn và mặn. Ichikawa và cs
(2006) đã báo cáo về sự biểu hiện quá mức của gen này gây ra hiện tượng “giả
vàng úa trong điều kiện ánh sáng”. At3G55240 mã hóa cho protein nhỏ có chiều
dài 95 axit amin với vùng 3’ không dịch mã tương đối dài (330 bp). Các trình tự
tương đồng với gen này cũng được tìm thấy trong các cây họ đậu và họ lúa nhưng
không được tìm thấy trong động vật có vú. Điều này cho thấy đây là gen mã hóa
cho protein đặc trưng chỉ được biểu hiện trong thực vật [43]. Tuy nhiên, chưa có
bất kỳ một công bố nào cho đến nay báo cáo về sự liên hệ của gen At3G55240 với
sự chống chịu điều kiện bất lợi. Chính vì vậy, chúng tôi đã chọn At3G55240 là
gen ứng viên cho các nghiên cứu tiếp theo để làm rõ hơn vai trò của gen đối với
cây trồng trong các điều kiện cực đoan.
Trong Arabidopsis, có đến 50% gen mã hóa MRP có biểu hiện thay đổi
trong điều kiện bất lợi đều thuộc nhóm protein chưa biết được chức năng (Bảng
3.4). Số còn lại được dự đoán là giữ các chức năng khác nhau trong tế bào, quan
trọng nhất là MRP có vai trò truyền dẫn tín hiệu liên quan đến Ca2+
và là nhân tố

40
phiên mã RNA protein giúp thực vật phản ứng với điều kiện bất lợi. Trong 6
AtMRP mã hóa cho protein tham gia vào quá trình tín hiệu Ca2+
, 3 gen có biểu
hiện đáp ứng trong điều kiện mặn hoặc hạn hán: 1 gen có đáp ứng tăng cường biểu
hiện và 2 gen có biểu hiện đáp ứng giảm biểu hiện (Bảng 3.4). Điều đó cho thấy
rằng tín hiệu Ca2+
đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát tín hiệu khi thực
vật chịu điều kiện bất lợi phi sinh học. Điều này cũng phù hợp với các nghiên cứu
trước đó về vai trò của calmodulin trong quá trình cân bằng ROS ở thực vật [4,
78, 81]. Hoạt tính xúc tác của catalase điều hòa nồng độ H2O2 trong Arabidopsis,
bị kích thích bởi phức hệ Ca2+
/calmodulin để duy trì mức độ cân bằng nội môi
H2O2 [4]. Bên cạnh đó, có đến 13/20 AtMRP đóng vai trò là các nhân tố điều hòa
phiên mã RNA, gồm 7 gen mã hóa MRP được tăng cường biểu hiện và 6 gen mã
hóa MRP bị giảm biểu hiện với điều kiện hạn hán và/hoặc điều kiện chịu mặn.
At3G62090, At5G42325 và At4G34590 đều là những nhân tố phiên mã được tăng
cường biểu hiện trong cả điều kiện hạn hán và chịu mặn. At3G62090 thuộc họ
protein có cấu trúc cơ bản xoắn vòng xoắn (bHLH) hay còn gọi là nhân tố tương
tác với phytochrome (PIF). Penfield và cs đã chỉ ra rằng PIF đóng vai trò quan
trọng trong việc kiểm soát các tín hiệu từ môi trường tác động đến thực vật, đặc
biệt là phản ứng với ánh sáng trong quá trình này mầm của hạt. Gen At3G62090
mã hóa cho PIF6. Trong điều kiện ánh sáng đỏ mạnh, PIF6 làm cho trụ dưới lá
mầm ngắn hơn, trong khi dưới điều kiện ánh sáng xanh thì trụ dưới lá mầm lại có
hình thái bình thường hay khác biệt không đáng kể [67]. At4G34590 hay còn gọi
là gen mã hóa cho nhân tố điều hòa phiên mã bZIP11 (basic region-leucine zipper).
bZIP11 biểu hiện trong toàn bộ đời sống của thực vật và đặc biệt là ở các mô mạch
như các gân xung quanh lá. Đặc biệt là biểu hiện ngoại bào mạnh của bZIP11 gây
nên sự ức chế quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật [59].

41
Bảng 3.4. Kết quả phân loại chức năng gen bằng MAPMAN của các gen đáp ứng
phiên mã với điều kiện bất lợi
Nhóm chức năng gen AtMRP1
srMRP2
Biểu hiện tăng Biểu hiện giảm Tổng số
Kiểm soát ion kim loại 2 1 - 1
Phản ứng điều kiện bất lợi 1 1 - 1
Xử lý RNA 4 - - -
Điều hòa phiên mã RNA 20 7 6 13
Biến đổi protein 12 1 1 2
Tín hiệu (Ca2+
) 6 1 2 3
Chu trình tế bào 3 - 1 1
Sự phát triển 1 1 - 1
Vận chuyển (kim loại) 6 1 3 4
Chưa biết chức năng 56 13 13 26
1
Số lượng các gen, một gen có thể tham gia nhiều hơn một nhóm chức năng
2
srAtMRP: MRP có biểu hiện đáp ứng với điều kiện cực đoan
3.1.3. Dự đoán yếu tố điều hòa cis trên promoter của các gen mã hóa MRP
đáp ứng điều kiện bất lợi
Yếu tố cis nằm trong vùng promoter của gen đóng vai trò như vị trí nhận biết
và bám của các nhân tố phiên mã, cần thiết cho việc biểu hiện của gen đặc hiệu cho
các mô hay các gen đáp ứng với điều kiện bất lợi. Khi phân tích promoter của các
gen, một số yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi đã được chỉ ra, và cũng là yếu
tố điều khiển quan trọng liên quan đến hoạt động của các gen tham gia kiểm soát
quá trình phản ứng với điều kiện bất lợi [2]. Do đó, để xác định các gen ứng viên
AtMRP có thể liên quan đến quá trình phản ứng với điều kiện cực đoan trên
A.thaliana, 5 yếu tố cis liên quan đến phản ứng với điều kiện bất lợi đã được tìm
kiếm trong vùng 1-kb ngược dòng từ vị trí bắt đầu phiên mã (+1) của các gen mã
hóa MRP. Kết quả về dự đoán một số yếu tố cis trên promoter của các gen mã hóa
MRP được trình bày trong Bảng 3.5.

42
Bảng 3.5. Một số yếu tố cis có mặt trên promoter của các gen AtMRP
TT Tên gen ABRE MYBR MYCR ICEr2 RSRE
1 At1G10586.2 1
2 At1G20790.1 1 1
3 At1G32560.1 3
4 At1G40104.1 1
5 At1G43320.1 1
6 At1G56085.1 1
7 At1G63057.1 1 1
8 At1G64405.1 1
9 At1G67350.1 1
10 At1G68160.1 1
11 At1G68240.1 1
12 At1G72510.1 3 1
13 At1G76640.1
14 At1G77682.1 1
15 At2G07708.1 1
16 At2G17200.1 1 1
17 At2G27030.2 1
18 At2G41780.1 2
19 At3G10640.2 2 1
20 At3G11530.1 3
21 At3G11825.1 1 1
22 At3G16960.1 1 1
23 At3G23050.1 1 1
24 At3G28990.1 1
25 At3G29070.1 1
26 At3G44935.1 1
27 At3G49270.3 1
28 At3G50360.1 1
29 At3G52270.1 1
30 At3G55240.1 1
31 At3G56610.1 1 1
32 At3G59900.1 1
33 At3G62090.1 1
34 At3G62420.1 1
35 At4G00850.1 1
36 At4G02450.1 1
37 At4G12334.1 1
38 At4G12860.1 1
39 At4G16980.1 1
40 At4G20440.1 1
41 At4G32470.2 2 1

43
TT Tên gen ABRE MYBR MYCR ICEr2 RSRE
42 At5G21990.1 1
43 At5G26673.1 1
44 At5G37860.1 1
45 At5G39570.1 1
46 At5G41170.1 1
47 At5G42325.1 1
48 At5G49500.1 1
49 At5G59030.1 1 1
50 At5G59040.1 1
51 At5G67060.1 1 1
52 ATMG00500.1 1
53 ATMG00650.1 1 1
Tổng 23 26 16 5 4
Cả 5 yếu tố cis đều được tìm thấy trong các gen AtMRP. Trong đó, MYBR
được tìm thấy trong 21 gen AtMRP, ABRE có mặt trong 19 gen AtMRP, 16 gen
AtMRP có chứa MYC, 5 gen AtMRP có chứa ICEr2 và RSRE có mặt trong 4 gen
AtMRP (Hình 3.8). Khi phân tích sự có mặt của một số yếu tố cis nằm vùng promoter
của AtMRP, ABRE được tìm thấy lặp lại 3 lần trên gen At1G32560, mã hóa cho LEA
nhóm I. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Hundertmark và cs, trong đó chỉ ra
rằng 82% gen LEA có chứa trình tự lõi nhận biết của yếu tố ABRE trong vùng
promoter [42].
Trong nghiên cứu này, chúng tôi phát hiện được có trung bình 0,61 yếu tố cis
đáp ứng với điều kiện bất lợi trên promoter của mỗi gen AtMRP. Ở Arabidopsis, 6
gen mã hóa MRP đáp ứng phiên mã tăng với hạn hán và độ mặn cao có trung bình
0,83 yếu tố cis này trên promoter của mỗi gen. Điều này cho thấy sự tăng về tần số
xuất hiện của các yếu tố cis đáp ứng với điều kiện bất lợi trên promoter của các MRP
có mức độ phiên mã tăng lên trong điều kiện hạn hán và chịu mặn.

44
Hình 3.8. Số lượng các gen AtMRP có chứa các yếu tố cis khác nhau
3.2. Phân tích thực nghiệm trên cây Arabidopsis tăng cường biểu hiện gen
At3G55240 (dòng RBC1)
3.2.1. Kiểm tra tỷ lệ đồng hợp tử/dị hợp tử của dòng cây chuyển gen
Dựa trên các kết quả phân tích tin sinh học, gen ứng viên At3G55240 có mức
độ biểu hiện giảm rất mạnh trong cả điều kiện hạn hán và độ mặn cao đã được chọn
để tiến hành thực hiện những nghiên cứu tiếp theo. Câu hỏi được đặt ra là At3G55240
có vai trò sinh học gì trong cơ thể sinh vật? Một phương pháp tiếp cận để nghiên cứu
chức năng gen là tăng cường biểu hiện gen dựa vào dòng chuyển gen biểu hiện cDNA
hoàn chỉnh của Arabidopsis. Kiểu hình của cá thể mang gen chuyển có thể không
thay đổi nếu vẫn giữ được ít nhất một bản sao bình thường của gen cần chuyển (dị
hợp tử). Do đó, dòng chuyển gen bắt buộc phải chứa cả hai allen mang gen cần chuyển
(đồng hợp tử) để có thể tiến hành được các nghiên cứu về biểu hiện chức năng gen
trong cơ thể.
Chính vì vậy, hạt giống dòng chuyển gen tăng cường biểu hiện của gen
At3G55240 (gọi tắt là dòng RBC1 (RIKEN Bioresource Center)) được tiến hành xác
0
5
10
15
20
25
ABRE MYB MYC ICEr2 RSRE
Sốgen
Các yếu tố cis

45
định tỷ lệ đồng hợp tử/dị hợp tử. Hạt chuyển gen được khử trùng và gieo đồng thời trên
môi trường ½ MS đặc có và không có kháng sinh hygromycin. Kết quả nảy mầm hạt
cây RBC1 trên môi trường chứa và không chứa kháng sinh hygromycin được thể hiện
qua Hình 3.9. Như vậy kết quả này cho thấy, với tỷ lệ nảy mầm 100% trên cả 2 môi
trường và không xuất hiện cây bị chết trắng sau khi nảy mầm, hạt RBC1 là đồng hợp
tử, đủ điều kiện để tiến hành cho các thí nghiệm tiếp theo. Tuy nhiên, sức nảy mầm và
sự phát triển của mỗi hạt có sự khác biệt nhất định, nguyên nhân là do độ mẩy và lép
của hạt thí nghiệm.
Hình 3.9. Dòng cây RBC1 được nảy mầm, A. môi trường ½ MS đặc chứa kháng sinh
hygromycin 15mg/l, B. môi trường ½ MS đặc
3.2.2. Đánh giá hình thái của dòng cây chuyển gen
a. Hình thái cây trên đĩa thạch
Hạt dòng cây chuyển gen RBC1 và hạt đối chứng được gieo trên môi trường
½ MS. Đĩa cây được đặt trong phòng nuôi cấy mô ở nhiệt độ 24°C, quang chu kỳ với
16 giờ chiếu sáng. Quan sát hình thái cây trong đĩa thạch ở các giai đoạn 7, 10 và 14
ngày tuổi. Kết quả so sánh hình thái dòng cây RBC1 và cây đối chứng kiểu dại trên
đĩa thạch được trình bày trên Hình 3.10. Qua phân tích hình thái cây trên đĩa thạch

Vai trò của protein giàu methionine trên cây Arabidopsis thaliana, 9đ

Vai trò của protein giàu methionine trên cây Arabidopsis thaliana, 9đ

Recommandé

Recommandé

Contenu connexe

Tendances

Tendances (20)

Similaire à Vai trò của protein giàu methionine trên cây Arabidopsis thaliana, 9đ

Similaire à Vai trò của protein giàu methionine trên cây Arabidopsis thaliana, 9đ (20)

Plus de Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864

Plus de Dịch vụ viết bài trọn gói ZALO 0917193864 (20)

Dernier

Dernier (20)

Vai trò của protein giàu methionine trên cây Arabidopsis thaliana, 9đ