1. BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ TP. HCM
ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP
Đề tài :
NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN
QUÁ TRÌNH TÁCH CHIẾT VÀ TINH SẠCH ENZYME
PROTEASE TỪ NỘI TẠNG CÁ BASA.
NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC
GIẢNG VIÊN HƯỚNG DẪN : PGS.TS NGUYỄN TIẾN THẮNG
CN ĐỖ THỊ TUYẾN
SINH VIÊN THỰC HIỆN : TRẦN TÚ NHI
MSSV : 107111115 LỚP : 07DSH3
TP. HỒ CHÍ MINH, 2011

2. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 1 MSSV : 107111115
MỞ ĐẦU
A. TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI :
Trong sản xuất và đời sống, các loại enzyme nói chung và protease nói riêng
được sử dụng ngày càng phổ biến. Chế phẩm protease được sản xuất chủ yếu nhờ vi
sinh vật, một số ít có nguồn gốc từ thực vật, mô động vật. Gần đây, do yêu cầu về
vệ sinh an toàn thực phẩm ngày càng nghiêm ngặt, chi phí cho kiểm tra chất lượng
ngày càng cao. Trong khi đó chế phẩm protease thu nhận từ mô động vật và thực
vật được coi là tuyệt đối an toàn nên ngày càng thu hút được sự quan tâm của các
phòng thí nghiệm cũng như các nhà sản xuất, cung ứng chế phẩm protease thương
mại. Nguồn nguyên liệu từ nội tạng động vật để thu chế phẩm protease ngày càng
khan hiếm và không kinh tế do nội tạng động vật thường được dùng làm thực phẩm
và dùng để ghép tạng cho những bệnh nhân đặc biệt. Protease trong cơ thể cá, đặc
biệt là ở cơ quan tiêu hóa đã được biết đến từ lâu nhưng lại chưa được nghiên cứu
đầy đủ và cũng chưa có công nghệ thu nhận, tinh chế protease từ nội tạng cá. Vì
vậy, những công trình nghiên cứu về protease nội tạng và phương pháp chiết rút
chúng đang được ráo riết tiến hành ở nhiều nước có nghề cá phát triển.
Việt Nam là một trong những quốc gia có nghề cá phát triển, với trên 200
loài cá kinh tế, sản lượng 1,5 triệu tấn/năm. Tuy sản lượng lớn nhưng phần được sử
dụng hữu ích từ cá chỉ chiếm khoảng gần 50%. Nghĩa là hàng năm có trên 700.000
tấn phế liệu, trong đó có trên 30.000 tấn nội tạng cá. Theo thói quen, nội tạng cá chỉ
được sử dụng làm bột cá chăn nuôi, một phần được chế biến nước mắm, phần lớn bị
thải bỏ vào môi trường vừa lãng phí vừa là nguồn gây ô nhiễm môi trường.
Tình hình trên đặt ra yêu cầu cấp bách cho các nhà khoa học là sử dụng hợp
lý và hiệu quả lượng phế liệu cá rất lớn do các nhà máy chế biến cá tạo ra hàng
ngày để sản xuất ra những sản phẩm mới, có giá trị cao.

3. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 2 MSSV : 107111115
Với mong muốn góp phần giải quyết yêu cầu trên, em thực hiện đề tài
“Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết và tinh sạch
enzyme protease từ nội tạng cá Basa”.
B. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU :
Mục đích chung là nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tách chiết
và tinh sạch enzyme từ nội tạng cá, cũng như tính chất của enzyme này.
C. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU :
1. Xác định quy trình tách chiết và tinh sạch enzyme protease từ nội tạng cá :
- Xác định tỷ lệ dung môi chiết : mẫu.
- Xác định dung môi chiết enzyme protease.
- Xác định thời gian chiết enzyme protease.
- Xác định tỷ lệ (nồng độ) tác nhân kết tủa thu chế phẩm enzyme thô.
- Xác định tác nhân kết tủa thu chế phẩm enzyme thô.
- Tinh sạch chế phẩm enzyme thô bằng sắc ký lọc gel.
- Xác định trọng lượng phân tử bằng phương pháp điện di SDS – PAGE.
2. Khảo sát một số tính chất của enzyme protease nội tạng cá :
- Khảo sát sự biến đổi hoạt tính enzyme protease theo nhiệt độ.
- Khảo sát độ bền nhiệt của enzyme protease.
- Khảo sát sự biến đổi hoạt tính enzyme protease theo pH.
- Khảo sát sự biến đổi hoạt tính enzyme protease theo nồng độ muối ăn.
- Khảo sát sự biến đổi hoạt tính enzyme protease khi có mặt một số ion kim
loại, chất đặc hiệu nhóm.

4. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 3 MSSV : 107111115
D. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU :
1. Phương pháp tách chiết, thu nhận và tinh sạch enzyme protease :
- Chiết rút thu dịch chiết.
- Thu nhận chế phẩm enzyme protease.
- Tinh sạch enzyme protease bằng sắc ký lọc gel.
- Phân tách enzyme protease bằng điện di trên gel polyacrylamide.
2. Các phương pháp phân tích :
- Xây dựng đường chuẩn albumin.
- Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Bradford.
- Xây dựng đường chuẩn tyrosine.
- Xác định hoạt tính protease theo phương pháp Amano.
E. KẾT CẤU ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP :
Đồ án tốt nghiệp gồm :
- Chương 1 : Tổng quan tài liệu
- Chương 2 : Vật liệu và phương pháp nghiên cứu
- Chương 3 : Kết quả và thảo luận
- Chương 4 : Kết luận và đề nghị

5. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 4 MSSV : 107111115
CHƯƠNG I
TỔNG QUAN TÀI LIỆU

6. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 5 MSSV : 107111115
1.1 MỘT SỐ KHÁI NIỆM CƠ BẢN VỀ ENZYME :
1.1.1 Giới thiệu chung về enzyme :
Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein. Enzyme tham gia xúc
tác cho hầu hết các phản ứng hóa học xảy ra trong cơ thể sống, đảm bảo cho quá
trình chuyển hóa các chất trong cơ thể với tốc độ nhịp nhàng, cân đối theo chiều
hướng xác định. Do đó đảm bảo cho sự tồn tại của cơ thể sống.
Hiện nay người ta đã khám phá hơn 2000 enzyme trong đó hơn 200 enzyme
thu được ở dạng tinh thể. Enzyme ngày nay được ứng dụng rộng rãi và có hiệu quả
trong mọi lĩnh vực như y dược, chăn nuôi, thú y, một số ngành công nghiệp đặc biệt
là công nghiệp chế biến thực phẩm : bia, rượu, bánh mì, tương chao, nước mắm…
1.1.2 Bản chất, cấu trúc enzyme :
1.1.2.1 Bản chất của enzyme :
Enzyme là protein có hoạt tính sinh học nên nó có đủ tính chất của protein.
Giống với các protein hình hạt khác, enzyme có thể hòa tan trong nước, dung dịch
đệm phosphate, dung dịch đệm Tris, dung dịch muối sinh lý…
Dung dịch enzyme có tính chất của dung dịch keo ưa nước. Enzyme trong
dung dịch dễ dàng bị kết tủa dưới tác dụng của muối trung hòa như sulphatamon
hoặc các dung môi hữu cơ như ethanol, acetone ở nhiệt độ thấp nhưng không bị mất
hoạt tính xúc tác. Do đó, có thể dùng các tác nhân này để thu chế phẩm enzyme.
Ngược lại dưới tác dụng của các yếu tố gây biến tính protein (nhiệt độ cao, acid
hoặc kiềm đặc, muối kim loại nặng nồng độ cao) enzyme thường bị mất khả năng
xúc tác. Và mức giảm hoạt tính tương ứng với mức độ biến tính của phân tử protein
– enzyme.
1.1.2.2 Cấu trúc enzyme :
Phân tử enzyme một thành phần cũng như hai thành phần đều chứa phần
protein. Enzyme một cấu tử trong thành phần phân tử chỉ có protein. Enzyme hai
cấu tử trong thành phần cấu tạo gồm : protein (“feron” hoặc “apoenzyme”) và phi
protein (“agon” hoặc “coenzyme”). Trung tâm hoạt tính của enzyme chiếm phần rất

7. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 6 MSSV : 107111115
nhỏ với phân tử enzyme nhưng có vai trò quan trọng trong việc tham gia kết hợp
đặc hiệu với cơ chất trong quá trình xúc tác.
Ở các enzyme một cấu tử, trung tâm thường bao gồm một tổ hợp các nhóm
chức acid amin liên kết lại với nhau. Nhờ có cấu trúc bậc 3,4 các nhóm này tuy nằm
cách xa nhau trong mạch polypeptide, nhưng do xoắn cuộn mạch mà được gần nhau
hơn. Với enzyme hai cấu tử, ngoài một số nhóm chức của acid amin còn có nhóm
ngoại tham gia trung tâm hoạt tính enzyme.
1.1.3 Danh pháp và phân loại enzyme :
Theo quy ước quốc tế, tên enzyme thường được gọi theo cơ chất đặc hiệu
của chúng cùng với tên kiểu phản ứng mà chúng tham gia. Theo đó tên enzyme
thường có hai phần : phần đầu là tên cơ chất, phần sau chỉ khái quát bản thân của
phản ứng.
Năm 1960, Hiệp hội hóa sinh quốc tế đã thống nhất phân loại enzyme ra làm
6 lớp sau :
- Oxydoreductase : enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử.
- Transpherase : enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị.
- Hydrolase : enzyme xúc tác cho quá trình thủy phân.
- Liase : enzyme tham gia xúc tác cho phản ứng loại CO2 hay phản ứng tách
thuận nghịch phân tử nước.
- Isomerase : enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển hóa tương hỗ phức tạp
giữa galactose và glucose.
- Ligase : enzyme này xúc tác cho phản ứng carboxyl hóa pyruvic tạo thành
oxaloacetic acid.
1.1.4 Cơ chế tác dụng của enzyme :
Bản chất của phản ứng enzyme là khi có sự tham gia xúc tác của enzyme,
các cơ chất sẽ được hoạt hóa mạnh, từ đó làm thay đổi tính chất hóa học của cơ
chất, kết quả sau phản ứng sẽ tạo ra những sản phẩm của phản ứng. Do tác dụng của

8. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 7 MSSV : 107111115
enzyme cơ chất có thể có những thay đổi không chỉ về cấu trúc hóa học, mà còn
thay đổi tính chất hóa học. Quá trình xúc tác của enzyme xảy ra 3 giai đoạn :
- Giai đoạn thứ nhất : enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng những liên kết yếu,
nhờ đó sẽ tạo ra phức hệ enzyme – cơ chất. Phức hệ này thường không bền.
Phản ứng tạo ra phức hệ enzyme – cơ chất thường xảy ra nhanh và đòi hỏi
một ít năng lượng.
- Giai đoạn thứ hai : khi cơ chất tạo phức với enzyme thì sẽ bị thay đổi cả cấu
hình không gian, cả về mức độ bền vững của các liên kết. Kết quả các liên
kết bị phá vỡ và tạo ra sản phẩm.
- Giai đoạn thứ ba : đây là giai đoạn cuối cùng, sản phẩm được tạo thành và
tách khỏi enzyme.
Cơ chế xúc tác tổng quát của enzyme được trình bày như sau :
E + S  ES  E + P
E : enzyme ; S : cơ chất ; ES : Phức hệ enzyme – cơ chất ; P : Sản phẩm
1.1.5 Các yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ phản ứng của enzyme :
Phản ứng do enzyme xúc tác phụ thuộc vào nhiều yếu tố như : bản chất và
nồng độ cơ chất, nồng độ enzyme, pH môi trường phản ứng, nhiệt độ, các ion kim
loại, các chất vô cơ và hữu cơ khác ( có tác dụng kìm hãm hay hoạt hóa enzyme).
1.1.5.1 Ảnh hưởng của nồng độ cơ chất :
Ở giai đoạn đầu của phản ứng, khi nồng độ cơ chất thấp, tốc độ enzyme sẽ
phụ thuộc tuyến tính vào nồng độ cơ chất. Khi nồng độ cơ chất đủ lớn sao cho tất cả
nồng độ enzyme đều tham gia phản ứng để tạo ra phức hợp enzyme – cơ chất, phản
ứng sẽ tạo ra được vận tốc cực đại. Nhưng đôi khi tiếp tục tăng nồng độ cơ chất lên
thì tốc độ phản ứng cũng sẽ không tăng.
1.1.5.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme :
Nói chung, trong điều kiện thừa cơ chất, tốc độ phản ứng phụ thuộc tuyến
tính vào nồng độ enzyme. Nhưng nếu tăng nồng độ enzyme quá lớn, tốc độ phản
ứng tăng chậm hoặc không tăng.

9. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 8 MSSV : 107111115
1.1.5.3 Ảnh hưởng của các chất kìm hãm và các chất hoạt hóa :
Hoạt tính enzyme có thể thay đổi dưới tác dụng của một số chất vô cơ và hữu
cơ khác nhau. Các chất này có thể làm tăng, hoặc làm giảm hoạt tính enzyme. Tác
dụng của chúng có thể là đặc hiệu hoặc không đặc hiệu và thay đổi tùy từng chất,
từng enzyme khác nhau.
Chất kìm hãm (chất ức chế) là các chất khi có mặt trong phản ứng enzyme sẽ
làm cho enzyme bị giảm hoạt tính nhưng không bị chuyển hóa bởi enzyme. Các
chất này có thể là những ion, các phân tử vô cơ, hữu cơ kể cả protein, kìm hãm
thuận nghịch hoặc không thuận nghịch, cạnh tranh hay không cạnh tranh. Khi biết
được tác dụng ức chế của các chất này đối với từng loại enzyme trong từng phản
ứng cụ thể ta có thể điều chỉnh được phản ứng.
Chất hoạt hóa là những chất làm tăng hoạt tính xúc tác của enzyme. Các chất
này thường có bản chất hóa học khác nhau, có thể là các anion, các ion kim loại
hoặc các chất hữu cơ. Chất hoạt hóa có thể làm tăng hay phục hồi hoạt tính của
enzyme một cách trực tiếp hay gián tiếp. Cơ chế của sự kích hoạt này có các chất
tác dụng trực tiếp với trung tâm hoạt tính của enzyme, làm thay đổi cấu hình không
gian của nó theo hướng có lợi cho hoạt tính xúc tác hoặc cho gián tiếp thông qua
việc loại trừ các chất ức chế ra khỏi hỗn hợp phản ứng, nhưng không tác dụng trực
tiếp với phân tử enzyme.
1.1.5.4 Ảnh hưởng của pH môi trường :
pH môi trường có ảnh hưởng rõ rệt đến tốc độ phản ứng enzyme vì nó ảnh
hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, ion hóa enzyme và độ bền của protein –
enzyme. pH thích hợp của phần lớn enzyme là 7.
pH thích hợp của enzyme còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố khác nhau như đặc
tính và nồng độ cơ chất, dung dịch đệm, nhiệt độ phản ứng…
1.1.5.5 Ảnh hưởng của nhiệt độ :
Do bản chất hóa học của enzyme là protein nên khác với các phản ứng hóa
học, vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khi tăng nhiệt độ trong một
giới hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúc enzyme.

10. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 9 MSSV : 107111115
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến vận tốc phản ứng enzyme
cho thấy nhiệt độ thích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40 – 500
C, trên 500
C
hoạt tính thường bị giảm mạnh do làm hỏng cấu trúc phân tử enzyme. Các enzyme
có nguồn gốc thực vật và một số enzyme vi sinh vật có nhiệt độ thích hợp cao hơn.
Nhiệt độ thích hợp của enzyme còn phụ thuộc vào các yếu tố khác nhau như : thời
gian xác định hoạt tính, pH…
Ở nhiệt độ thấp dưới 00
C, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều, nhưng có thể hồi
phục khi đưa về nhiệt độ bình thường.
Ở nhiệt độ 700
C, phần lớn enzyme bị mất hoàn toàn hoạt tính, gọi là nhiệt độ
tới hạn. Ở nhiệt độ tới hạn, enzyme bị biến tính, hiếm khi được hồi phục hoạt tính
trở lại.
1.1.5.6 Ảnh hưởng của các ion kim loại :
Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa enzyme. Các ion kim loại
nặng ở nồng độ gây biến tính protein, có tác dụng kìm hãm không thuận nghịch
enzyme.
Tác dụng của ion kim loại phụ thuộc nhiều vào nồng độ của chúng, mức độ
hoạt hóa chỉ tăng theo nồng độ ion kim loại ở những nồng độ thấp trong một giới
hạn xác định, khi vượt quá nồng độ này lại có tác dụng kìm hãm enzyme. Giới hạn
nồng độ có tác dụng hoạt hóa enzyme của mỗi ion kim loại có thể khác nhau, vì vậy
ở cùng một nồng độ, cùng điều kiện phản ứng, đối với một enzyme, hai ion có thể
có tác dụng trái ngược nhau. Hiện tượng này thường xảy ra giữa các ion cùng hóa
trị.
1.2 ENZYME PROTEASE VÀ LƯỢC SỬ NGHIÊN CỨU :
1.2.1 Giới thiệu chung :
Protease là một nhóm các enzyme có khả năng xúc tác cho quá trình thủy
phân các liên kết peptide trong phân tử protein. Trong cơ thể cá còn sống các
protease là tác nhân xúc tác quá trình trao đổi chất phục vụ hoạt tính sống của cá.
Sau khi cá chết, khả năng xúc tác quá trình thủy phân của các enzyme này vẫn còn

11. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 10 MSSV : 107111115
và là nguyên nhân gây ra sự biến đổi thịt cá sau khi chết, khi tách ra khỏi cơ thể cá
thì protease vẫn giữ được khả năng xúc tác quá trình thủy phân. Do đó, cần nghiên
cứu các đặc tính của protease nội tạng nhằm sử dụng nguồn enzyme này từ phế liệu
cá trong công nghiệp chế biến thủy sản, tạo ra các sản phẩm có giá trị cao từ thịt cá.
1.2.2 Phân loại enzyme protease :
Theo Baret và Donald (1986) thì protease được chia thành hai nhóm lớn là
endopeptiase (proteinase) và exopeptidase.
Nhóm endopeptiase
Là các enzyme phân giải các liên kết ở giữa chuỗi mạch polypeptide. Theo
phân loại của Ủy ban enzyme thuộc Hội Hóa Sinh quốc tế, các enzyme nhóm này
gồm 4 phân nhóm là :
- Phân nhóm 1 : Proteinase – xerin : gồm các enzyme như tripsin,
chimotripsin.
- Phân nhóm 2 : proteinase – xistein hay proteinase – thiol : gồm các enzyme
cathepsin.
- Phân nhóm 3 : aspactic – protease hay protease acid : gồm các enzyme
pepsin, gastricsin…
- Phân nhóm 4 : metalo – proteinase như colagenase, calpain…
Nhóm exopeptidase :
Là các enzyme thủy phân liên kết peptide ở đầu mút của chuỗi mạch peptide.
Các enzyme thuộc nhóm này gồm cacboxyl – peptidase, amino – peptidase,
dipeptidase. Các exopeptidase không có khả năng thủy phân liên kết peptide ở trung
tâm mà chỉ tác dụng thủy phân liên kết ngoài cùng của chuỗi polypeptide, hoặc đầu
amin, hoặc đầu cacboxyl, tuần tự tách từng acid amin ra khỏi chuỗi polypeptide.
1.2.3 Protease nội tạng cá và các động vật thủy sản :
Hệ tiêu hóa của cá gồm nhiều bộ phận khác nhau. Mỗi bộ phận có chức năng
và các đặc điểm riêng của quá trình chuyển hóa, hấp thu thức ăn. Do đó, hệ enzyme

12. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 11 MSSV : 107111115
protease trong các bộ phận này cũng khác nhau. Tuy nhiên hoạt tính của enzyme
chủ yếu diễn ra ở dạ dày và ruột cá.
Enzyme dạ dày
Dạ dày của cá là cơ quan duy nhất có pepsin xúc tác cho quá trình thủy phân
protein trong môi trường acid mạnh. Trong dạ dày có cả hai loại enzyme chính là
pepsin và parapepsin.
Pepsin là enzyme chủ yếu tiêu hóa thức ăn có protein trong dạ dày, được sinh
tổng hợp trong các tế bào màng nhày của dạ dày và tiết ra dưới dạng không hoạt
tính gọi là pepsinogen. Pepsinogen có khối lượng phân tử 39.000 – 40.000 Da, bền
trong môi trường trung tính và acid yếu, nhưng dưới tác dụng của acid clohydric và
sự có mặt của một lượng nhỏ pepsin tự do trong dạ dày, sẽ chuyển hóa thành pepsin
dạng hoạt tính là một chuỗi polypeptide có khối lượng 32.700 Da. Pepsin có tác
dụng của một proteinase, transpeptidase và esterase nhưng chủ yếu có tác dụng của
endopeptidase và thủy phân chủ yếu các liên kết peptide sát gốc Lα – acid amin
thơm và dicacboxyl.
Enzyme đường ruột
Trong màng nhày ruột và trong dịch ruột, người ta xác định được có 22
enzyme tham gia vào quá trình tiêu hóa thức ăn. Trong đó các enzyme protease gồm
: enterokinase, amino – peptidase, amino – tripeptidase, dipeptidase,
cacboxylpeptidase.
 Enterokinase
Là enzyme hoạt hóa đặc hiệu tripsinogen và chymotripsinogen. Enterokinase
được tổng hợp từ tế bào màng ruột, nhờ tác dụng của các muối mật mà xâm nhập
vào khe ruột và hoạt hóa tripsinogen trên bề mặt màng nhày của ruột cũng như ở
trong khoang ruột. Dưới tác dụng của enterokinase, phân tử tripsinogen bị cắt một
đoạn 6 acid amin tại vùng giữa lysin và isoleusin và do đó chuyển thành dạng hoạt
tính. Ngoài ra, tuyến tụy còn tiết ra một lượng enterokinase cân bằng với tripsin để
hoạt hóa chymotripsinogen thành chymotripsin.

13. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 12 MSSV : 107111115
 Chymotripsin
Là enzyme thuộc nhóm proteinase – serin, khối lượng phân tử khoảng
25.000 Da gồm 3 chuỗi polypeptide gắn với nhau bằng hai cầu nối sulfua.
Chymotripsin xúc tác cho phản ứng thủy phân các liên kết peptide trong đó có
nhóm – CO - của các acid amin thơm hoặc methionin. Nó cũng xúc tác cho phản
ứng thủy phân este của các acid amin này.
Tripsin và chymotripsin có khả năng cắt đứt các liên kết ở giữa mạch
polypeptide của phân tử protein, kết quả hoạt tính thủy phân protein của chúng tạo
thành các đoạn polypeptide. Các đoạn này khi vào khoang ruột sẽ được các protease
khác tiếp tục thủy phân tạo thành sản phẩm cuối cùng là các acid amin.
1.2.4 Lược sử nghiên cứu về protease :
Loài người sử dụng enzyme protease trong sản xuất và đời sống từ lâu đời
trước khi biết đến chúng. 5000 năm trước công nguyên, con người đã sử dụng renin
có trong dạ dày bê như chất đông tụ để sản xuất phomat. Các thổ dân Nam Mỹ cổ
đại đã sử dụng lá đu đủ để làm mềm thịt và phương pháp này đã được kế thừa, phát
triển thành kỹ thuật làm mềm thịt nhân tạo bằng papain và các enzyme protease
khác. Ở Việt Nam, từ lâu đời, ông cha ta đã chế biến nước mắm trên cơ sở quá trình
tự phân giải thịt cá nhờ hệ enzyme có sẵn trong nội tạng và cơ thịt cá, trong điều
kiện nồng độ muối cao.
Đến thế kỷ 18, Reomur mới phát hiện dịch dạ dày của loài chim ăn thịt có
khả năng tiêu hóa thịt. Năm 1836 Schwann nghiên cứu hoạt tính phân giải protease
của dịch vị trong dạ dày chó. Năm 1857, Corvisart tách được chế phẩm thô tripsin
từ dịch tụy. Năm 1862, Danilevxki tách được tripsin và amylaza từ tụy tạng. Từ
những năm 50 của thế kỷ 20, các nhà khoa học bắt đầu nghiên cứu, thu nhận và ứng
dụng enzyme protease từ vi sinh vật, đồng thời phát triển và hoàn thiện công nghệ
thu nhận protease từ các mô động vật và thực vật. Từ đó đến nay, hàng loạt các
protease từ vi sinh vật, từ động vật và thực vật đã được sản xuất và ứng dụng vào
mọi lĩnh vực sản xuất và đời sống. Đặc biệt, những năm cuối thế kỷ 20, đầu thế kỷ

14. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 13 MSSV : 107111115
21, công nghệ enzyme phát triển vô cùng nhanh chóng, các loại protease được sử
dụng trong hầu hết các lĩnh vực sản xuất, đời sống, y học và nghiên cứu khoa học.
Nếu như năm 1980, cả thế giới sản xuất và tiêu thụ khoảng 1300 tấn enzyme các
loại trong đó có protease chiếm 40,7% thì đến năm 1985, thị trường enzyme thế
giới đã có sản lượng được mua bán là 45000 tấn, trị giá gần 650 triệu USD và đến
năm 1990, doanh thu từ các enzyme công nghệ của thế giới đạt 1,5 tỷ USD, trong
đó thị phần enzyme protease là 48%. Như vậy có khoảng 5 năm, lượng enzyme
được sản xuất và tiêu thụ trên toàn thế giới tăng gấp đôi, trong đó lượng enzyme
protease chiếm khoảng 50%. Các cường quốc về sản xuất và tiêu thụ enzyme
protease công nghiệp là Mỹ, Pháp, Nhật, Đức, Ý, Thụy Điển, Hà Lan, Đan Mạch,
Trung Quốc… hầu hết thuộc các nước công nghiệp phát triển. Dự báo, trong thế kỷ
21, sản xuất và tiêu thụ enzyme của thế giới sẽ tăng với tốc độ hàng năm khoàng
20%.
Tuy protease được sản xuất từ nhiều nguồn khác nhau nhưng cho đến những
năm gần đây, các protease sử dụng trong công nghiệp chủ yếu có nguồn gốc từ vi
sinh vật, các protease có nguồn gốc từ thực vật và động vật có vị trí thứ yếu.
1.3 ỨNG DỤNG PROTEASE VÀ PROTEASE CỦA CÁ TRONG CHẾ BIẾN
THỦY SẢN :
1.3.1 Giới thiệu chung :
So với các protease có nguồn gốc từ vi sinh vật, thực vật và động vật trên
cạn, protease của động vật thủy sinh nói chung, cá nói riêng ít được ở trong quy mô
công nghiệp. Những nguyên nhân của tình trạng trên có thể là:
 Nguồn nguyên liệu thủy sản mang tính mùa vụ lại không tập trung, cố định
nên việc cung cấp nguồn thu enzyme không ổn định, khó tổ chức sản xuất
chế phẩm enzyme ở quy mô công nghiệp.
 Trong cơ thể động vật thủy sản, cơ quan tập trung enzyme lớn và có hoạt
tính cao là nội tạng nên thường được sử dụng làm nguồn thu enzyme. Tuy

15. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 14 MSSV : 107111115
nhiên, nội tạng cá thường có mùi tanh hôi, không hấp dẫn đối với công nhân
sản xuất, lại rất khó bảo quản ở điều kiện tự nhiên.
 Protease của động vật thủy sản là một hệ gồm rất nhiều loại protease khác
nhau. Để tách riêng và làm tinh sạch từng enzyme cần trải qua hàng chục
bước khác nhau với kỹ thuật phức tạp. Chính vì vậy, cho đến nay, trên thị
trường chưa có protease thương mại từ nguyên liệu thủy sản. Để phát triển
sản xuất chế phẩm enzyme từ thủy sản phải nghiên cứu, hoàn thiện công
nghệ và giảm giá thánh sản phẩm.
Từ những năm 50 của thế kỷ trước, ở nhiều nước đã phát triển công nghệ sản
xuất các chế phẩm enzyme từ vi sinh vật. Hàng trăm loại chế phẩm protease từ các
chủng vi sinh vật khác nhau đã được sản xuất và mua bán trên thị trường sản lượng
các chế phẩm protease thương mại tăng nhanh, liên tục và tỷ trọng các protease từ
vi sinh vật trong tổng doanh số enzyme trên thị trường thế giới luôn ở mức cao nhất
với các protease từ các nguồn khác. Việc sản xuất các chế phẩm protease thương
mại từ vi sinh vật có những ưu điểm như :
- Có nhiều chủng vi sinh vật có khả năng tổng hợp protease, chu kỳ sinh
trưởng của vi sinh vật ngắn, có thể thu nhận enzyme hàng chục lần trong
năm, có thể chủ động về nguyên liệu.
- Có thể dễ dàng điều hòa, định hướng quá trình sinh tổng hợp enzyme cần
thiết trên cơ sở tác động vào môi trường nuôi cấy vi sinh vật, chọn lọc hoặc
gây đột biến ở các chủng vi sinh vật.
- Hiệu suất sinh tổng hợp enzyme trong môi trường nuôi cấy tổng hợp cao hơn
việc thu nhận enzyme thuận lợi.
- Môi trường nuôi cấy vi sinh vật dễ chế tạo, chi phí thấp, giá thành enzyme
hạ.
Tuy nhiên, hiện nay việc sử dụng các chủng vi sinh vật để sản xuất enzyme
công nghiệp gặp phải một số trở ngại. Các chủng vi sinh vật protease phải được
đánh giá, kiểm tra nghiêm ngặt về độc tính để bảo đảm an toàn, vệ sinh cho sản
phẩm. Việc phân tích, kiểm tra phải tiến hành thường xuyên, liên tục với độ chính

16. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 15 MSSV : 107111115
xác cao nên cần phải có các phòng thí nghiệm, phân tích chuyên dùng, trang bị
dụng cụ hiện đại, chi phí đầu tư lớn.
Trong khi đó, các enzyme protease có nguồn gốc từ động vật và thực vật
luôn được đánh giá an toàn, sau khi thu nhận có thể sử dụng ngay vào quá trình chế
biến mà không cần kiểm tra độc tính. Với sản lượng 100 triệu tấn cá biển và 30
triệu tấn cá nước ngọt hằng năm, cả thế giới có tới 6,5 – 9 triệu tấn nội tạng và nếu
đưa vào để thu nhận enzyme protease, nguồn lợi thu được là không nhỏ.
1.3.2 Nghiên cứu và ứng dụng protease trong chế biến thủy sản ở Việt Nam :
Đến nay trong phạm vi quốc gia, ngành thủy sản chưa có một cơ quan, đơn
vị chuyên nghiên cứu và ứng dụng enzyme trong chế biến thủy sản. Các Viện
nghiên cứu, các trường đào tạo cán bộ khoa học công nghệ chuyên ngành thủy sản
chưa có chương trình nghiên cứu và ứng dụng enzyme nói chung, enzyme thủy sản
nói riêng. Chính vì vậy, có thể nói ở Việt Nam, kết quả nghiên cứu về enzyme của
cá và động vật thủy sinh cũng như các hướng ứng dụng chúng vào sản xuất và đời
sống, vào chế biến thủy sản hầu như chưa có gì. Những năm gần đây, một số nhà
khoa học và công nghệ đã bắt đầu quan tâm đến vấn đề này, nhưng mới chỉ là
những nỗ lực cá nhân, chưa được sự quan tâm của nhiều người, chưa được sự đầu
tư về tài, lực cho nghiên cứu nên kết quả mới là bước đầu và còn rất khiêm tốn. Các
tài liệu, số liệu về enzyme thủy sản và ứng dụng enzyme trong ngành thủy sản còn
nghèo nàn, thiếu hệ thống.
Tuy nhiên có một ngành chế biến có truyền thống lâu đời là chế biến nước
mắm. Các công trình nghiên cứu về nước mắm đều đi đến kết luận là nước mắm là
sản phẩm của quá trình thủy phân protein trong thịt cá dưới tác dụng của hệ enzyme
protease của bản thân nguyên liệu. Quá trình thủy phân thịt cá bằng enzyme thực
hiện trong điều kiện có muối ăn ở nồng độ cao, để ngăn hoạt tính của các vi khuẩn
gây thối rữa, tạo thành các chất đạm hòa tan, chủ yếu là acid amin và peptide ngắt
mạch. Do thủy phân thịt cá bằng hệ enzyme của bản thân nguyên liệu trong điều
kiện muối mặn nên quá trình chế biến nước mắm trong điều kiện tự nhiên có thời

17. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 16 MSSV : 107111115
gian dài, từ trên 10 tháng tới 1 - 2 năm. Trong quá trình lâu dài ấy, đồng thời với
quá trình thủy phân thịt cá còn có các quá trình lên men khác với sự tham gia của hệ
vi sinh vật yếm khí hình thành các hợp chất bay hơi, các acid hữu cơ… Làm cho
nước mắm có hương vị, màu, mùi đặc trưng, có giá trị dinh dưỡng và cảm quan đặc
biệt.
Bên cạnh ứng dụng protease trong chế biến nước mắm, các nhà khoa học
công nghệ nước ta cũng đã quan tâm mở rộng thêm nhiều lĩnh vực ứng dụng
protease trong chế biến thủy sản. Các lĩnh vực sử dụng protease trong chế biến thủy
sản chủ yếu tập trung vào lĩnh vực nâng cao hiệu quả sử dụng phế liệu thủy sản
cũng như nguồn cá tạp, cá kém giá trị kinh tế.
So với kết quả nghiên cứu về enzyme protease của thực vật, động vật máu
nóng và vi sinh vật có lịch sử phát triển hàng trăm năm thì việc nghiên cứu, ứng
dụng enzyme protease cá trong chế biến thủy sản mới chỉ tập trung vào việc tận
dụng enzyme protease có sẵn trong nguyên liệu. Các lĩnh vực nghiên cứu, ứng dụng
protease trong chế biến thủy sản còn hạn chế, chỉ mới dừng ở trong phòng thí
nghiệm, chưa chuyển giao công nghệ để sản xuất công nghiệp.
Yêu cầu sản xuất chế phẩm protease từ thủy sản để sử dụng trong chế biến
cũng như cung cấp cho ngành khác đang đặt ra trực tiếp và cấp bách. Các công trình
nghiên cứu về protease của cá và các lĩnh vực ứng dụng đang tăng lên nhanh chóng
ở nhiều nước có nghề cá phát triển. Tiềm năng phát triển sản xuất chế phẩm
protease từ thủy sản và ứng dụng để chế biến ra những sản phẩm mới rất là to lớn.
Trong thời đại bùng nổ thông tin, sự hội nhập và trao đổi thông tin đang rất khẩn
trương và thuận lợi, các nhà khoa học công nghệ nước ta cần nhanh chóng tiếp thu
các thành tựu mới trong lĩnh vực này để áp dụng vào sản xuất, góp phần phát triển
nhanh chóng công nghệ chế biến thủy sản ở đất nước.

18. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 17 MSSV : 107111115
1.3.3 Nguồn thu enzyme protease :
Enzyme nói chung và enzyme protease nói riêng được thu nhận chủ yếu từ
ba nguồn cơ bản : mô và cơ quan động vật, mô và cơ quan thực vật, tế bào vi sinh
vật.
Enzyme được tách từ các mô như : tụy tạng, dạ dày, ruột … của một số động
vật thủy sản (mực , cá…) thường là trypsin, pepsin, chymotrypsin, cathepsin… Từ
thực vật có thể thu nhận được một số enzyme thủy phân như : papain từ nhựa đu đủ,
bromelin từ thân, lá và vỏ dứa. Ngoài ra còn có thể thu nhận được một số enzyme
khác như : amylase, urease, peroxydase…
1.3.4 Ứng dụng enzyme protease :
Enzyme nói chung và enzyme protease nói riêng có thể sử dụng theo hai
hướng sau :
 Hướng 1 : Sử dụng trong quá trình thủy phân trong cơ thể. Các enzyme này
là các enzyme nội bào. Chúng tham gia vào quá trình trao đổi chất của tế bào
sống, nhưng khi sinh vật chết quá trình thủy phân protein vẫn diễn ra. Như vậy,
protease tham gia vào quá trình thủy phân protein của chính nguyên liệu chứa
nó. Việc sử dụng enzyme theo hướng này rất đơn giản, có thể làm tăng hương
vị, màu sắc của sản phẩm. Tuy vậy, chỉ có thể sử dụng enzyme loại này đối với
quy trình chế biến nguyên liệu chứa nó.
 Hướng 2 : Tách enzyme ra khỏi nguyên liệu ở dạng chế phẩm và sử dụng
chúng vào trong các quá trình sản xuất. Việc tách chiết enzyme dựa vào tính
chất của chúng : enzyme tan được trong nước, trong dung dịch muối sinh lý, các
dung dịch đệm. Dịch chiết thu được chứa enzyme, protein tạp, các chất hữu cơ
và vô cơ nên phải tiến hành tinh sạch để thu chế phẩm. Các chế phẩm enzyme
được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau.
a. Trong công nghiệp thực phẩm :
- Enzyme protease được sử dụng trong chế biến thịt, làm cải biến giá trị cảm
quan, làm tăng giá trị sản phẩm. Người ta sử dụng protease từ dứa, đu đủ, nội

19. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 18 MSSV : 107111115
tạng động vật để thủy phân làm mềm nguyên liệu, hoặc thủy phân nguyên
liệu tạo thành dịch dễ hấp thu, dễ tiêu hóa.
- Trong chế biến nước giải khát, trong công nghiệp bia, các chế phẩm protease
được sử dụng làm trong dịch quả, dịch bia.
- Dùng protease trong công nghiệp chế biến sữa, làm pho mát.
- Protease được dùng làm tăng giá trị sản phẩm về mặt thương mại của sản
phẩm có giá trị thấp. Ví dụ như dùng protease để thủy phân protein trong phế
liệu công nghiệp thực phẩm (xương, collagen…) thành các dạng hòa tan, thu
dịch đạm thủy phân làm thức ăn cho người hoặc thức ăn chăn nuôi.
- Dùng protease để thủy phân màng tế bào gan cá để trích ly dầu cá.
b. Trong công nghiệp dệt :
Dùng chế phẩm protease để sản xuất dung dịch hồ tơ làm tăng độ bóng,
không ảnh hưởng đến độ bền của tơ.
c. Trong công nghệ phim ảnh :
Protease được sử dụng để sản xuất gellatin trên bề mặt phim ảnh, dùng để tái
sinh ảnh, giấy ảnh và các phim chụp X – quang.
d. Trong công nghiệp da :
Sử dụng protease để tẩy sơ bộ da nguyên liệu, làm mềm da, tăng lượng lông
thu hồi (tỷ lệ thu hồi tăng 25 – 30 % so với khi dùng phương pháp hóa học),
và da có chất lượng cao.
e. Trong công nghệ sản xuất xà phòng, chất tẩy rửa, công nghiệp mỹ phẩm :
Protease được thêm vào để sản xuất xà phòng, kem đánh răng… có tác dụng
tẩy sạch các vết mủ, hay bổ sung protease vào kem bôi mặt để loại các lớp
biểu bì chết, làm mịn da.
f. Trong công nghiệp dược phẩm :
Dùng protease để bổ sung vào thuốc chữa bệnh thiếu enzyme tiêu hóa, thuốc
tiêu mủ ở các vết thương, thuốc chữa nghẽn mạch máu để làm sạch vết
thương và giảm đau cho người bệnh.

20. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 19 MSSV : 107111115
g. Trong chế biến thủy sản :
Nước mắm được hình thành từ quá trình thủy phân protein trong thịt cá dưới
tác dụng của hệ enzyme protease có sẵn trong nguyên liệu trong điều kiện
muối mặn và thời gian dài. Người ta đã sử dụng chế phẩm protease để bổ
sung trong quá trình sản xuất nước mắm với lượng nhất định nhằm rút ngắn
thời gian chế biến. Nhờ vậy mà làm tăng hiệu quả kinh tế, tăng sự luân
chuyển vốn.
Ngoài ra, người ta còn sử dụng enzyme protease vào việc sản xuất bột đạm
cá, bột đạm hòa tan, … từ các loại cá có giá trị kinh tế thấp (như cá mối, cá
tạp…). Sở dĩ làm như vậy vì hướng sản xuất này có thể tận dụng được các
phế liệu trong quá trình chế biến, tiết kiệm nguyên liệu, tăng giá trị sản
phẩm, … đem lại hiệu quả kinh tế cao.
1.4 SƠ LƯỢC VỀ SẮC KÝ LỌC GEL :
1.4.1 Bản chất của phương pháp :
Phương pháp được sử dụng để tinh sạch protein, xác định trọng lượng phân
tử và phân tích định lượng tương tác phân tử.
Hình 1.1. Tách các phân tử bằng lọc gel

21. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 20 MSSV : 107111115
Một số thông số vật lý của phương pháp:
+ Giới hạn tách (exclution limit) : Là trọng lượng phân tử (MW) của phân tử
nhỏ nhất không chui vào bên trong hạt gel. Thí dụ giới hạn tách của G - 50 có FR từ
1.500 - 30.000 Daltons, có nghĩa là các phân tử lớn hơn đều không chui vào hạt gel.
+ Phạm vi tách (Fructionation range) : Thí dụ, sephadex G - 50 có FR từ 1.500 -
30.000 Daltons, có nghĩa là các phân tử nằm trong khoảng MW nói trên sẽ được
phân tách dễ dàng bởi G - 50.
+ Độ ngậm nước (water regain) : Là trọng lượng nước mà 1 gam bột gel khô hút
nước. Thí dụ G - 50 có WR là 5,0  0,3g. Giá trị này chưa tính đến lượng nước bao
quanh hạt. Do vậy không thể sử dụng nó để tính thể tích của cột.
+ Thể tích nền (bed volume) : Là thể tích cuối cùng mà 1 gam gel khô hấp thu
khi trương nở trong nước. G - 50 có thể tích nền 9 - 11 ml/g gel khô.
+ Hạt gel (Gel particle) : Hạt gel hình cầu có nhiều lỗ. Kích thước hạt xác định
bằng mesh hoặc đường kính hạt (bead diameter) tính theo m. Hạt có kích thước
lớn (50 - 100 mesh, 100 - 300 m) cho tốc độ dòng chảy qua cột cao, nhưng kết
quả tách thấp. Ngược lại những hạt mịn (400 mesh, 10 - 40 m) lại cho tốc độ dòng
chảy qua cột nhỏ, tách cũng không tốt. Thường người ta chọn hạt gel có kích thước
100 - 200 mesh (50 - 150 m).
+ Thể tích trống (void volume) : Là tổng thể tích không gian bao quanh hạt gel
trong cột. Xác định nhờ chất màu blue dextran có MW 2.000.000 Daltons.
+ Thể tích thổi (elution volume) : Là thể tích đệm cần thiết để rửa chất cần tách
ra khỏi cột.
1.4.2. Đặc tính của gel :
Có 4 loại gel thường được sử dụng.

22. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 21 MSSV : 107111115
Dextran – có bản chất là polysaccharide tự nhiên do hãng Pharmacia – LKB
(Thụy Điển) cung cấp với tên thương mại là Sephadex (bảng trang 84). Giới hạn
tách của gel dextran - 600.000 Daltons, vì dextran tự nhiên chứa ít liên kết ngang
nên khó giữ nguyên vẹn hạt nếu kích thước lỗ to hơn. Tuy nhiên nếu dextran được
bổ sung thêm các liên kết ngang bởi N,N’-methylene bisacrylamide thì dextran có
giới hạn tách gia tăng (xem sephacryl cũng do Pharmacia –LKB cung cấp).
Gel polyacrylamide : Tạo bởi quá trình đồng hóa polymer của acrylamide và
N,N’-methylene bisacrylamide (Bio-Rad cung cấp – Biogel –P là tên thương mại)
Gel agarose : Là thành phần polysaccharide tự nhiên của agar, cấu tạo từ
galactose và anhydrogalactose. Mạng gel được ổn định nhờ liên kết hydro nhiều
hơn là do các liên kết ngang. Hãng Bio - Rad cung cấp agarose với tên thương mại
là Bio - gel A, còn Pharmacia – cung cấp tên thương mại là sepharose và seperose.
Gel kết hợp polyacrylamide và agarose có tên thương mại là ultragel, nó cho
phép có độ phân tách cao với cấu trúc khá vững của agarose cho phép sử dụng áp
suất để tách.

23. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 22 MSSV : 107111115
CHƯƠNG II
VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

24. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 23 MSSV : 107111115
2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM TIẾN HÀNH :
- Thời gian thực hiện bắt đầu từ tháng 10/2010 đến tháng 12/2011.
- Quá trình nghiên cứu tại phòng “ Các chất có hoạt tính sinh học” thuộc Viện
Sinh Học Nhiệt Đới thành phố Hồ Chí Minh.
2.2 ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU :
Đối tượng nghiên cứu của đề tài này là nội tạng cá basa
Giới thiệu chung về cá Basa :
Hình 2.1 Cá Basa
- Cá Basa còn có tên gọi là cá giáo, cá sát bụng là loài cá da trơn cá giá trị kinh
tế cao, được nuôi tập trung nhiều nước trên thế giới.
- Theo hệ thống phân loại Tyson Roberts phân loại cá basa như sau :
 Cá basa thuộc bộ cá nheo Silurifomes, họ cá tra Pangasiidae, giống cá basa
Pangasius, loài cá basa Pangasius bocuorti (sau vage 1880).
 Họ Pangasiidae có 21 loài thuộc 2 giống : giống Pangasius có 19 loài và
giống Helicophagus có 2 loài. Có một số loài sống trong nước lợ, và 2 loài
sống ở biển.

25. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 24 MSSV : 107111115
 Trong họ Pangasiidae hai loài cá tra và basa là cá nuôi kinh tế của đồng bằng
sông Cửu Long.
- Đặc điểm hình thái, sinh lý cá Basa :
 Về ngoại hình, cá Basa rất dễ phân biệt với các loài cá khác trong họ cá tra.
Thân ngắn hình thoi, hơi dẹp bên, lườn tròn, bụng to tích lũy nhiều mỡ, chiều
dài tiêu chuẩn bằng 2,5 lần chiều cao bên thân.
 Đầu cá ngắn hơi tròn, dẹp đứng. Miệng hẹp, chiều rộng miệng ít hơn 10% chiều
dài chuẩn. Dải răng trên to rộng có thể nhìn thấy được khi miệng khép lại, có
hai đôi râu, râu hàm trên bằng ½ chiều dài đầu, râu hàm dưới bằng 1/3 chiều dài
đầu. Có 40 - 60 lược mang trên cung mang thứ nhất, vây hậu môn có 31 - 36
tia vây, chiều cao của cuống đuôi hơn 7% chiều dài chuẩn, lưng dầy màu xám
xanh và trắng.
- Phân bố :
 Cá Basa chủ yếu phân bố ở khu vực sông Mê Công có mặt ở cả 4 nước Việt
Nam, Lào, Campuchia, Thái Lan. Ở nước ta những năm trước đây khi chưa
có sinh sản nhân tạo, cá bột và cá giống được vớt trên sông Tiền và sông Hậu.
 Cá trưởng thành chỉ thấy trong ao nuôi, rất ít gặp trong địa phận Việt Nam.
Do cá có tập tính di cư ngược dòng sông Mê Công để sinh sống và tìm nơi
sinh sản tự nhiên. Bãi đẻ của cá nằm khu vực ngã tư giao tiếp 2 con sông Mê
Công và Tonlesap, nơi giáp Campuchia và Lào. Nhưng tập trung nhất từ
Kampi đến hết Rongiev thuộc địa giới 2 tỉnh Kratie và Stung Treng.
- Tỷ trọng :
 Cá Basa có tốc độ lớn khá nhanh, sau một năm nuôi lớn được 0,7-1,3kg/ con.
Nuôi trong bè sau 2 năm đạt 2,5kg/ con. Trong tự nhiên gặp cỡ cá dài 0,5m.

26. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 25 MSSV : 107111115
2.3 THU THẬP VÀ BẢO QUẢN MẪU :
Mẫu nghiên cứu là nội tạng cá Basa được thu gom tại chợ Thủ Đức vào sáng
sớm ngay khi cá mới về.
Mẫu sau khi thu thập được sẽ được xác định khối lượng ban đầu, đem bảo
quản trong ngăn đá tủ lạnh ở nhiệt độ - 40
C.
Khi cần sử dụng, mẫu được đem ra, cân chính xác lượng cần dùng trong thời
gian nhanh chóng và vẫn trong điều kiện lạnh, và chuyển phần mẫu còn lại vào tủ
lạnh để bảo quản ở nhiệt độ âm, tránh làm mất hoạt tính mẫu.
2.4 DỤNG CỤ, THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT :
2.4.1 Dụng cụ và thiết bị :
- Ống nghiệm thủy tinh, pippet, cốc thủy tinh, phễu thủy tinh, ống đong …
- Máy đo quang phổ UV – Vis
- Máy sắc ký lọc gel
- Cân điện tử
- Máy khuấy từ
- Máy đo pH
- Máy ly tâm
- Bể ủ nhiệt
2.4.2 Hóa chất :
- Hóa chất dùng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn dùng cho phân tích trong
phòng thí nghiệm.
- Cơ chất để xác định hoạt tính enzyme là casein.
- Hóa chất dùng trong quá trình chiết : NaCl, Na2HPO4.12H2O,
NaH2PO4.2H2O…
- Hóa chất dùng trong quá trình tủa : acetone, ethanol, sulphatamol.
- Các thuốc thử hàm lượng, hoạt tính của protease.

27. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 26 MSSV : 107111115
2.5 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU :
2.5.1 Phương pháp xác định hàm lượng protein theo Bradford :
. Nguyên tắc :
Phương pháp này dựa trên sự thay đổi bước sóng hấp thu cực đại của thuốc
nhuộm Coomassie Brillant Blue khi tạo phức hợp với protein. Trong dung dịch
mang tính acid khi chưa kết nối với protein thì thuốc nhuộm ở dạng màu đỏ có bước
sóng hấp thu cực đại là 465nm và khi kết hợp với protein thì thuốc nhuộm chuyển
sang dạng màu xanh dương và được hấp thu cực đại ở bước sóng 595nm.
Để xác định protein trong mẫu, đầu tiên ta xây dựng một đường chuẩn với
dung dịch protein chuẩn đã biết được nồng độ. Dung dịch protein chuẩn thường là
bovine serum albumin. Sau khi cho dung dịch protein vào dung dịch thuốc nhuộm,
màu sẽ xuất hiện sau 2 phút và bền tới 1 giờ. Tiến hành đo dung dịch bằng máy
quang phổ kế ta được ODx, độ hấp thu sẽ tỷ lệ với protein trong mẫu. Thực hiện
một đối chứng với nước cất (OD0). Lấy giá trị OD = ODx – OD0. Lượng protein
mẫu trong dung dịch đo được xác định bằng cách dựa vào đường chuẩn từ giá trị
OD ở trục tung, từ đó suy ra giá trị nồng độ protein tương ứng trên trục hoành.
 Dụng cụ - Hóa chất:
a. Dụng cụ :
- Máy đo quang phổ
- Ống nghiệm
- Pipette 5 ml, 1 ml
- Giấy thấm
- Giá để ống nghiệm
- Bình tia đựng cồn

28. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 27 MSSV : 107111115
b. Hóa chất :
 Dung dịch Albumine 0,1 mg/ml : Cân chính xác 10 mg albumine pha trong
100 ml nước cất. Lắc đều cho tan. Giữ ở 200
C. Khi dùng pha loãng 100 lần, được
dung dịch albumine có nồng độ 0,01 mg/ml.
 Nước cất.
 Dung dịch thuốc thử Bradford : dung dịch thuốc thử có thành phần trong
100 ml như sau :
 Coomassie Brilliant Blue : 0,001g.
 Ethanol tuyệt đối : 4,7g
 Phosphoric acid 85% : 8,5g
Phẩm màu Coomassie Brilliant Blue được hòa tan trong ethanol trong một
chai đựng màu tối có nắp, bổ sung phosphoric acid 85% và chỉnh tới 100ml bằng
nước cất.
 Dựng đường chuẩn Albumine:
Pha loãng dung dịch Albumine thành các nồng độ khác nhau: 0, 10, 20, 30,
40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 µ
g/ml

29. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 28 MSSV : 107111115
Bảng 2.1 Xây dựng đường chuẩn Albumine
Ống nghiệm Đối
chứng
1 2 3 4 5 6 7 8 9
Nồng độ (µ
g/ml) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
Dung dịch Albumine
(ml)
0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9
Nước cất (ml) 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
Thuốc thử Bradford
(ml)
2 2 2 2 2 2 2 2 2 2
Ống số 0 tương ứng với ống đối chứng chứa nước cất. Tất cả các ống sau khi
pha đúng nồng độ, để khoảng 20 phút.
Tiến hành đo mật độ quang dung dịch ở bước sóng 595nm.
 Dựng đường chuẩn.
Định lượng protein trong mẫu ống nghiệm.
Lấy 1ml mẫu thí nghiệm cho vào ống nghiệm, thêm vào 2ml thuốc thử
Bradford.
Đem đo mật độ quang ở bước sóng 595nm.
Từ đó suy ra hàm lượng protein có trong mẫu thí nghiệm.
Mẫu được pha loãng sao cho mật độ quang đo được trong khoảng đường
chuẩn.
 Kết quả tính toán:

30. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 29 MSSV : 107111115
Từ phương trình đường chuẩn và mật độ quang của mẫu khảo sát ta suy ra
hàm lượng protein của mẫu là X (µ
g/ml) có trong m (g) nguyên liệu.
Vậy lượng protein có trong 1g nguyên liệu là:
Hàm lượng protein (mg/g) =
xm
X
1000
2.5.2 Phương pháp xác định hoạt tính protease theo phương pháp Amano :
 Nguyên tắc :
Dùng casein làm cơ chất, xác định hoạt tính phân giải protein của enzyme
protease trên cơ sở định lượng sản phẩm tạo thành trong phản ứng màu với thuốc thử
Folin. Dựa vào đồ thị chuẩn để tính lượng tyrosine tương ứng với lượng sản phẩm
thủy phân dưới tác dụng của enzyme. Hoạt tính của enzyme được biểu hiện bằng
đơn vị hoạt tính thủy phân protein của enzyme.
 Hóa chất và thiết bị :
 Hóa chất :
- Dung dịch HCl 0,1 M
- Dung dịch Na2CO3 0,4 M
- Dung dịch Cl3CCOOH 0,4 M
- Tyrosine tinh khiết
- Thuốc thử Folin (pha loãng 5 lần khi sử dụng )
- Đệm phosphate pH = 7 ; 0,1 M
- Dung dịch casein 1% : cân 1 g casein từ sữa (hãng Merck) thêm vào vừa đủ
100ml dung dịch đệm phosphate pH = 7 ; 0,1 M.
 Dụng cụ và thiết bị :
- Ống nghiệm, pippet, bình định mức, giấy lọc.
- Bể ổn nhiệt.
- Máy đo quang phổ UV – Vis
- Máy đo pH

31. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 30 MSSV : 107111115
 Các bước tiến hành :
 Xây dựng đường chuẩn Tyrosine :
Pha dung dịch Tyrosine ở các nồng độ khác nhau : 10; 20; 30; 40; 50; 60; 70;
80; 90 μg tyrosine/ml HCl như Bảng 3.2
Bảng 2.2 Xây dựng đường chuẩn Tyrosine
Ống nghiệm Nồng độ
(μg/ml)
Dung dịch
Tyrosine
chuẩn (μl)
Dung dịch
HCl (μl)
Na2CO3
(ml)
Thuốc thử
Folin (ml)
ĐC 0 0 1000 5 1
1 10 10 990 5 1
2 20 20 980 5 1
3 30 30 970 5 1
4 40 40 960 5 1
5 50 50 950 5 1
6 60 60 940 5 1
7 70 70 930 5 1
8 80 80 920 5 1
9 90 90 910 5 1
Thêm 5 ml dung dịch Na2CO3 0,4 M vào dung dịch tyrosine ở các nồng độ
khác nhau và thêm 1 ml thuốc thử Folin vào dung dịch hỗn hợp. Sau khi lắc đều, để

32. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 31 MSSV : 107111115
ổn định dung dịch ở 37 ± 0,50
C trong 20 phút. Đo độ hấp thụ của dung dịch này ở
bước sóng 660 nm. Ghi nhận kết quả As10, As20, As30, As40, As50, As60, As70, As80, As90.
Đối với ống đối chứng dùng 1 ml HCl 0,1 M thay cho tyrosine. Đo độ hấp thụ
của dung dịch này ở bước sóng 660 nm và ghi nhận kết quả này là As0.
Trị số mật độ quang của các ống từ 1 đến 9 sau khi trừ đi trị số của ống đối
chứng sẽ được giá trị từ OD1 đến OD9. Vẽ đồ thị dựa vào biến thiên của OD theo
nồng độ protein. Đồ thị này gọi là đường chuẩn tyrosine.
 Xác định hoạt tính của enzyme protease :
- Hoạt tính của enzyme được khảo sát ở 370
C và pH = 7.
- Cho 1 ml cơ chất casein 1% vào ống nghiệm ủ ở 37 ± 0,50
C trong 10 - 15
phút.
- Sau thời gian ủ cho 1 ml dịch chiết enzyme thô vào lắc đều. Đem ủ hỗn hợp ở
37 ± 0,50
C trong 60 phút.
- Cho vào 2 ml dung dịch Cl3CCOOH 0,4 M để ngừng phản ứng.
- Để ổn định trong 25 phút, sau đó lọc dung dịch này qua giấy lọc để loại tủa.
- Cho 5 ml dung dịch Na2CO3 0,4 M vào 1ml dịch lọc.
- Thêm 1 ml thuốc thử Folin.
- Lắc đều, để yên ở 37 ± 0,50
C trong 20 phút.
- Khi dung dịch xuất hiện màu xanh, đem đo độ hấp thụ ở bước sóng 660 nm
(ghi nhận kết quả này là Am).
Mẫu đối chứng : lấy 1 ml nước cất thay cho 1 ml enzyme và tiến hành các
bước tương tự như mẫu thí nghiệm với cùng điều kiện. Ghi nhận kết quả độ hấp thụ
này là Ao.
Hàm lượng tyrosine được giải phóng do protease thủy phân được tính bằng
cách lấy Am – Ao rồi lấy kết quả so với đường chuẩn tyrosine để xác định hoạt tính
protease theo tính toán sau :

33. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 32 MSSV : 107111115
Một đơn vị hoạt tính (ĐVHT) enzyme protease được xác định là lượng
enzyme để tạo ra lượng amino acid tương đương với 100 μg tyrosine trong 1 ml dịch
lọc dưới điều kiện thí nghiệm.
F = (10/As10 + 20/ As10 + 30/ As10 + 40/ As10 + 50/ As10 + 60/ As10 + 70/ As10 + 80/
As10 + 90/ As10 ) / 9
Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/ml) = (Am – Ao).F.1/100.n
Hoạt tính enzyme protease (ĐVHT/g) = (Am – Ao) . F. 1/100. n.V.1/m
Trong đó :
Am : Độ hấp thụ của mẫu
Ao : Độ hấp thụ của ống đối chứng
F : Hệ số tương quan giữa hàm lượng tyrosine và độ hấp thụ ở
bước sóng 660 nm trên đường chuẩn.
n : Hệ số pha loãng của enzyme
1/100 : Hệ số chuyển đổi
V : Thể tích của dung dịch enzyme
m : Khối lượng nội tạng
Tính toán hoạt tính riêng (HTR) của enzyme protease : từ kết quả hàm lượng
protein (mg/ml) và hoạt tính enzyme protease (U/ml) tính hoạt tính riêng của
enzyme.
HTR (U/mg) = Số đơn vị hoạt tính / mg protein enzyme.
2.5.3 Phương pháp tách chiết, thu nhận và tinh sạch enzyme protease :
Tiến hành tách chiết và thu nhận enzyme protease từ các phần riêng khác
nhau : nội tạng cá. Toàn bộ quá trình tách chiết thu enzyme được tiến hành trong
điều kiện nhiệt độ thấp (0 – 40
C) để hạn chế sự biến tính của protein – enzyme dưới
tác động của môi trường. Nội tạng cá được nghiền mịn với cát thạch anh trong cối
inox đặt trong một thau đá.
2.5.3.1 Chiết rút thu dịch chiết :

34. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 33 MSSV : 107111115
Dùng một số dung môi có khả năng hòa tan enzyme (nước cất, dung dịch
muối sinh lý, dung dịch đệm phosphate) với tỷ lệ và thời gian thích hợp để chiết rút
thu enzyme. Nhiệt độ dung môi trước khi phối trộn là 0 – 40
C. Trong quá trình chiết
rút, ta khuấy liên tục (ở 0 – 40
C), sau đó ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút để thu
dịch chiết. Xác định hoạt tính enzyme dịch chiết theo phương pháp Amano, chọn tỷ
lệ dung môi và thời gian thích hợp.
2.5.3.2 Thu nhận chế phẩm protease :
Kết tủa protein – enzyme trong dịch chiết thu được từ nội tạng bằng các tác
nhân : acetone, ethanol, (NH4)2SO4. Các hóa chất đã làm lạnh được cho từ từ vào
dịch chiết với tỷ lệ và nồng độ thích hợp, để gây kết tủa protease. Quá trình kết tủa
enzyme được tiến hành trong điều kiện lạnh 0 – 40
C. Sau đó ly tâm 6000 vòng/phút
trong 10 phút thu chế phẩm thô. Chế phẩm thô được bảo quản trong dung dịch đệm
phosphate 0,1 M ở pH = 7. Xác định hoạt tính enzyme chế phẩm thô theo phương
pháp Amano, chọn tỷ lệ, tác nhân, thời gian tủa thích hợp.
2.5.3.3 Phương pháp tinh sạch enzyme bằng sắc lý lọc gel :
Hình 2.2 Bộ máy chạy sắc ký lọc gel
 Nguyên tắc :

35. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 34 MSSV : 107111115
Kỹ thuật sắc ký lọc gel dùng để tách những phân tử có kích thước, trọng
lượng phân tử khác nhau bằng cách cho chúng đi qua cột gel. Những phân tử có
kích thước đủ nhỏ để lọt vào bên trong lỗ gel sẽ bị trì hoãn và di chuyển chậm qua
cột, trong khi những phân tử lớn hơn di chuyển bên ngoài các hạt gel nên sẽ di
chuyển nhanh và được thoát ra khỏi cột sớm hơn các phân tử nhỏ chạy trong lỗ gel.
 Hóa chất
Gel Sephadex G - 50 có các đặc tính : Dạng hạt mịn, kích thước hạt 45 -
90m; khả năng ngậm nước : 12ml/1g gel khô; phạm vi phân tách : 4.000 - 150.000
daltons.
Đệm Phosphate pH 7.0 : Dùng khử bọt khí trước khi dùng.
 Các bước tiến hành
 Chuẩn bị mẫu :
Mẫu chạy sắc ký là enzyme hòa tan được hòa tan hoàn toàn trong dung dịch
đệm phosphate pH 7.
 Chuẩn bị gel và chạy mẫu :
Cân 5g gel “Sephadex G - 50” khô, cho bột gel từ từ vào dung dịch đệm
phosphate pH 7.0 đựng trong cốc. Dùng dung dịch đệm phosphate pH 7.0 nhiều gấp
2 lần so với thể tích lớp nền gel cần cho trong cột. Cụ thể dùng ít nhất 53 x 2 =
106ml dung dịch đệm. Để gel ổn định cho đến khi 90 - 95% số hạt ổn định. Gạn
hoặc loại lớp nổi trên bề mặt bằng cách hút để loại các hạt mịn. Lặp lại công việc
trên 4 lần để loại > 90% hạt mịn làm cản trở quá trình lọc gel.
Gắn phễu đổ gel vào cột, đóng lỗ thoát của cột và cho dung dịch đệm làm
đầy 20% thể tích cột.
Rót đều dung dịch gel vào cột thành một dòng di chuyển nhẹ. Tránh làm bắn
gel ra ngoài, đảm bảo việc nhồi cột đều và tránh bị bọt khí.

36. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 35 MSSV : 107111115
Khi lớp nền đã hình thành trong cột từ 2 - 5cm, mở khóa đầu ra của cột cho
đến khi cột được nạp đầy gel (packed). Khi cột đã được nạp đầy gel, khóa đầu ra
(outlet) của cột.
Mở khóa đầu ra của cột và cho dung dịch đệm với thể tích gấp hai lần thể
tích lớp nền (106ml) chảy qua cột khi điều khiển tốc độ chảy.
 Nạp mẫu :
Mẫu chạy sắc ký phải sạch (không bị nhiễm bẩn và không lẩn các vật rắn),
hoàn toàn hòa tan trong dung dịch đệm.
Cho mẫu quá nhiều vào cột làm giảm tốc độ phân tách, ít quá làm mẫu bị
loãng. Để tách nhóm chất có thể cho nhiều mẫu vào cột tới 10 – 20% tổng thể tích
cột. Để phân tích chỉ được phép đưa 1 lượng mẫu nhỏ vào 1/55 tổng thể tích cột (là
thể tích nước tương đương chiều cao nền cột đã nhồi).
Tốc độ dòng chảy nên điều chỉnh ở mức độ thấp hơn một chút so với dòng
chảy tự do. Thông thường đối với gel có kích thước lỗ nhỏ, nên sử dụng tốc độ 8 –
12 ml/cm2
mặt cắt ngang (15 – 25 ml/h), còn đối với gel lỗ lớn 2 – 5 ml/cm2
(5 – 10
ml/h). Dòng chảy có thể theo cách chảy tự do hoặc nhờ bơm nén.
Phương pháp lọc gel bằng cách cho chảy tự do rất phổ biến vì đơn giản và
cho kết quả tốt đối với gel bằng lỗ nhỏ. Tuy nhiên gel lỗ lớn yêu cầu tốc độ dòng
chảy ổn định nên phải dùng bơm nén.
Khởi động cho máy chạy mẫu, mẫu tinh sạch sẽ hòa vào trong đệm
phosphate pH 7.0 và đi ra các ống nghiệm đựng mẫu. Dựa vào sắc ký đồ hiển thị
trên máy tính ta biết được những ống nghiệm nào chứa enzyme có cùng trọng lượng
phân tử.
 Thu và xác định mẫu tách được :
Dịch ra khỏi cột được đo ở bước sóng 280 nm bằng bộ tách sóng trong hệ sắc
ký và được thể hiện độ hấp thụ dưới dạng sắc ký đồ bằng phần mềm LP data view

37. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 36 MSSV : 107111115
trên máy tính. Dịch được thu tự động bằng máy thu mẫu (collector ), mỗi phân đoạn
2 ml.
Dựa vào sắc ký đồ, tiến hành gom các phân đoạn thuộc cùng một peak sau đó
phân tích hàm lượng protein và xác định hoạt tính.
2.5.4 Phân tách protein bằng điện di trên gel polyacrylamide
(Polyacrylamide Gel Electrophoresis) :
2.5.4.1 Nguyên tắc :
Gel polyacrylamide là gel được tạo thành do sự polymer hóa các phân tử
acrylamide và N,N’-methylene-bis-acrylamide. Quá trình polymer hóa được xúc tác
bởi hệ thống ammoniumpersulfate (APS); N,N,N’,N’-tetramethylethylenediamine
(TEMED). Sự di chuyển của các phân tử trên gel phụ thuộc vào điện trường và kích
thước của lỗ gel. Khả năng phân tách cũng như giới hạn trọng lượng phân tử của
các phân tử sinh học mà gel có thể phân tách tùy thuộc vào nồng độ acrylamide và
bis-acrylamide : nếu nồng độ thấp sẽ tạo ra lỗ gel lớn, cho phép phân tách các phân
tử sinh học có kích thước lớn và ngược lại.
SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
là một kĩ thuật điện di trên gel polyacrylamide khi có sự hiện diện của SDS, đây là
một tác nhân làm biến tính và âm tính hóa các phân tử protein. Trong kĩ thuật này
protein được xử lý với chất tẩy SDS và tác nhân khử cầu nối disulfite là
mercaptoethanol hoặc dithiotheitol (DTT). Với các tác nhân này protein từ cấu trúc
bậc 2, 3, 4 được biến đổi thành chuỗi polypeptide (bậc 1) và tất cả các protein đều
được tích điện âm. Nhờ đó, sự di chuyển trong gel của các phân tử protein chỉ phụ
thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn
những phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua một lỗ gel có kích thước nhất định.
Dưới tác dụng của điện trường các phân tử tích điện âm sẽ di chuyển về cực
dương và các phân tử tích điện dương sẽ di chuyển về cực âm của điện trường.

38. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 37 MSSV : 107111115
Để xác định phân tử lượng của một protein, người ta thường so sánh với một
thang phân tử lượng chuẩn, là một hỗn hợp các protein có trọng lượng phân tử khác
nhau đã biết.
Để đưa các protein trong mẫu về cùng một vạch xuất phát đồng thời tạo ra sự
phân tách tốt hơn, người ta thường sử dụng phương pháp điện di trên gel không liên
tục (discontinuous gel). Trong phương pháp này gel gồm 2 lớp :
+ Lớp gel gom (stacking gel) (lớp trên) : các protein trong mẫu được dồn lại
và tạo một lớp băng mỏng.
+ Lớp gel phân tách (separating gel) (lớp dưới) : tạo ra các băng protein có
trọng lượng phân tử, kích thước khác nhau từ một hỗn hợp protein xuất phát ban
đầu.
Hai lớp gel này được phân biệt nhau bởi dung dịch đệm, nồng độ acrylamide
và vị trí.
Kĩ thuật SDS-PAGE có thể xác định được những phân tử protein có trọng
lượng phân tử từ 10.000 - 200.000 Daltons. Những phân tử protein có trọng lượng
lớn hơn 200.000 Daltons thường được xác định trên gel có nồng độ acrylamide ít
hơn 2,5%.
Ngoài kĩ thuật SDS-PAGE là phương pháp điện di trong điều kiện làm biến
tính protein (Denaturing condition), người ta còn dùng một số kĩ thuật điện di trên
gel polyacrylamide khác nhằm phân tích protein trong điều kiện không biến tính
(Nondenaturing condition) không có sự hiện diện của SDS hoặc để khắc phục một
số vấn đề về SDS gây ra một số ảnh hưởng đến đặc tính của protein như tạo liên kết
(cross-linked) giữa các protein với nhau. Một số protein không có sự tỉ lệ giữa điện
tích và khối lượng với những protein khác người ta sử dụng kĩ thuật điện di tập
trung điểm đẳng điện (Isoelectric focussing gel electrophoresis).
2.5.4.2 Các bước tiến hành :
Đổ gel :

39. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 38 MSSV : 107111115
 Gel phân tách : Cho các thành phần theo thứ tự vào becher 50ml sạch
40% Acrylamide / Bis 29:1 2,5ml
Tris – HCl 1.5M pH 8.8 – 0.4 % SDS 2,5ml
Nước cất 4,445ml
TEMED 5l
Ammonium persulfate 10% 50l
Sau khi cho Ammonium pesulfate 10% vào, lắc nhẹ ống Falcon vài lần
(tránh tạo bọt khí). Dùng pipetteman bơm dung dịch gel vào khuôn, đổ gel sao cho
mức dung dịch gel cao hơn 7cm (tránh tạo bọt khí trong khuôn gel). Sau đó đặt một
lớp nước cất trên lớp gel để mặt gel được phẳng. Chờ gel đông 20- 30 phút.
Gel gom : Tương tự cho các thành phần vào becher 50ml sau
40% Acrylamide / 0.8 % bisacrylamide 0,5ml
Tris – HCl 0,5M pH 6,8 - 0,4 % SDS 1ml
Nước cất 2,46 ml
TEMED 4l
Ammonium persulfate 10 % 20l
Sau khi gel phân tách đã trùng ngưng hoàn toàn đổ hết lớp nước bên trên.
Tiến hành dùng pipetteman bơm dung dịch gel gom vào khuôn. Đồng thời đưa lược
vào gel để tạo các giếng mẫu (tránh tạo bọt khí). Sau khi đã trùng ngưng, tháo lược,
lắp đĩa gel vào bộ phận diện di. Cho dung dịch điện di vào buồng điện di.
 Chuẩn bị mẫu và chạy điện di :

40. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 39 MSSV : 107111115
 Xử lý mẫu : Hút 30l dung dịch nạp mẫu (2X treatment buffer ) và 30l
dung dịch mẫu protein vào eppendorf sạch, đậy nắp và búng nhẹ cho đều, đun sôi
cách thủy 5 - 10 phút. Ly tâm 10.000 v/p trong 1 – 5 giây.
Đối với thang chuẩn protein (Bio – Rad) hút 2l vào eppendorf 1ml chứa
8l nước cất và 10l dung dịch nạp mẫu.
Tiến hành chạy điện di :
Dùng pipetteman 10l nạp mẫu vào các giếng.
Tiến hành chạy điện di ổn định dòng 100V.
Sau khi điện di, nhuộm gel với dung dịch nhuộm đã chuẩn bị trước. Sau đó
tiến hành nhuộm bằng cách ngâm gel trong dung dịch giải nhuộm cho đến khi nền
gel trong suốt không màu. Sau khi nhuộm xong, protein được phát hiện nhờ các
vạch màu xanh lam trên nền gel trong suốt.
2.4.5.3 Xác định trọng lượng phân tử của protein :
i. Đo khoảng cách di chuyển của các band protein từ gel phân tách tới các band
protein và khoảng cách di chuyển từ gel phân tách tới vạch màu cuối cùng.
ii. Tính giá trị Rf :
Khoảng cách di chuyển của protein
Rf =
Khoảng cách di chuyển của vạch màu bromophenol Blue
iii. Vẽ biểu đồ log10 của các giá trị trọng lượng phân tử của các protein chuẩn và
các giá trị Rf của chúng.
2.5.5 Bố trí thí nghiệm :
2.5.5.1 Khảo sát lựa chọn dung môi và điều kiện chiết rút enzyme protease :

41. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 40 MSSV : 107111115
Với mục đích chung của đề tài là nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến việc
tách chiết và tinh sạch enzyme protease từ nội tạng cá ba sa. Quá trình nghiên cứu
được tiến hành theo sơ đồ hình 2.3
Hình 2.3 Sơ đồ tổng quát quá trình nghiên cứu.
Nội tạng cá
Nghiền mịn
Chiết rút enzyme protease
Ly tâm thu dịch chiết
Dịch chiết
Tủa enzyme protease
Ly tâm thu chế phẩm thô
Chế phẩm thô
Tỷ lệ dung
môi : nội
tạng
Dung môi
chiết
Thời gian
Tỷ lệ tác
nhân :dchiết
Tác nhân
tủa
Thời gian
pH
t0
Xác định hoạt tính
và hàm lượng
Xác định các yếu
tố ảnh hưởng đến
hoạt tính protease
Độ bền
nhiệt
Nồng

42. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 41 MSSV : 107111115

43. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 42 MSSV : 107111115
a. Xác định tỷ lệ dung môi chiết : mẫu
Tỷ lệ dung môi là một trong những yếu tố ảnh hưởng lớn đến hoạt tính của
enzyme. Dựa trên khả năng hòa tan của enzyme, tiến hành chiết rút enzyme
protease bằng các dung môi (nước cất, dung dịch muối sinh lý, dung dịch đệm
phosphate) với các tỷ lệ khác nhau, thời gian 30 phút, ly tâm dịch chiết. Xác định
hoạt tính enzyme protease của từng dịch chiết theo phương pháp Amano.
Hình 2.4 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chiết rút enzyme protease theo ty lệ dung môi
mẫu.
 Nước cất : tiến hành chiết rút enzyme theo hình với tỷ lệ nước cất : mẫu (ml/g)
1:1 2:1 3:1 4:1 5:1 6:1 7:1 8:1 9:1 10:1
 Dung dịch nước muối sinh lý (NaCl 0,9 %) : tiến hành chiết rút enzyme protease
theo hình với tỷ lệ dung dịch muối sinh lý : mẫu (ml/g)
1:1 2:1 3:1 4:1 5:1 6:1 7:1 8:1 9:1 10:1
Nội tạng (đã nghiền)
Chiết bằng dung môi
Tỷ lệ 1
Chọn tỷ lệ dung môi chiết / mẫu thích hợp
Xác định hoạt tính enzyme
Tỷ lệ 2 Tỷ lệ 3 ... Tỷ lệ 10

44. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 43 MSSV : 107111115
 Dung dịch đệm phosphate 0,05 M ở pH7 : tiến hành chiết rút enzyme protease
theo hình với tỷ lệ đệm phosphate : mẫu (ml/g)
1:1 2:1 3:1 4:1 5:1 6:1 7:1 8:1 9:1 10:1
a. Lựa chọn dung môi chiết thích hợp :
Với các dung môi khác nhau thì khả năng chiết rút thu enzyme khác nhau.
Do vậy, sau khi xác định được các tỷ lệ dung môi chiết : mẫu thích hợp, ta so sánh
hoạt tính protease trong dịch chiết từ nước cất, dung dịch muối sinh lý, dung dịch
đệm phosphate để chọn dung môi chiết thích hợp.
b. Xác định thời gian chiết :
Hiệu suất của quá trình chiết còn phụ thuộc vào thời gian chiết. Sau khi xác
định được tỷ lệ, dung môi chiết, tiến hành xác định thời gian chiết thích hợp của
enzyme. Sau mỗi khoảng thời gian 10, 20, 30, …, 70 phút, ly tâm thu dịch chiết,
xác định hoạt tính enzyme, chọn thời gian thích hợp.
Hình 2.5 Sơ đồ bố trí thí nghiệm chiết rút enzyme protease theo thời gian chiết
mẫu.
Nội tạng (đã nghiền)
Chiết rút với tỷ lệ, dung môi thích hợp trong thời gian (phút)
10
Chọn thời gian chiết thích hợp
Xác định hoạt tính enzyme
20 30 ... 70

45. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 44 MSSV : 107111115
2.5.5.2 Khảo sát chọn tác nhân và điều kiện kết tủa enzyme protease :
a. Xác định tỷ lệ (nồng độ) tác nhân tủa : dịch chiết
Tỷ lệ tác nhân tủa là một trong những yếu tố có ảnh hưởng đến hoạt tính của
enzyme. Tiến hành kết tủa enzyme protease bằng các dung môi như acetone,
ethanol, (NH4)2SO4 với các tỷ lệ (nồng độ) khác nhau, thời gian 60 phút, ly tâm thu
sản phẩm. Xác định hoạt tính enzyme protease của từng chế phẩm thô theo phương
pháp Amano.
Hình 2.6 Sơ đồ bố trí thí nghiệm tủa enzyme protease theo tỷ lệ tác nhân tủa/dịch
chiết.
 Acetone : tiến hành kết tủa enzyme theo hình với tỷ lệ acetone : dịch chiết (ml/ml)
1:1 2:1 3:1 4:1 5:1 6:1 7:1 8:1
Dịch chiết nội tạng
Kết tủa bằng các tác nhân
Tỷ lệ 1
Chọn tỷ lệ tác nhân tủa / dịch chiết thích hợp
Xác định hoạt tính enzyme
Tỷ lệ 2 Tỷ lệ 3 ... Tỷ lệ 10

46. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 45 MSSV : 107111115
 Ethanol : tiến hành kết tủa enzyme theo hình với tỷ lệ ethanol : dịch chiết (ml/ml)
1:1 2:1 3:1 4:1 5:1 6:1 7:1 8:1
 (NH4)2SO4 : bổ sung muối (dạng hạt) vào dịch chiết để kết tủa enzyme protease
theo hình với nồng độ muối bão hòa: dịch chiết (g/ml)
45% 50% 55% 60% 65% 70%
Chế phẩm thô sau khi kết tủa bằng (NH4)2SO4 với các nồng độ được loại
muối bằng phương pháp thẩm tích. Cho chế phẩm thô vào túi thẩm tích, đặt trong
cốc thủy tinh chứa nước cất. Dung dịch nước cất này được thay thường xuyên (ít
nhất là 3 lần). Thẩm tích thực hiện ở nhiệt độ thấp 0 – 40
C, được khuấy nhẹ bằng
máy khuấy từ trong 12 giờ. Sau đó xác định hoạt tính enzyme.
b. Lựa chọn tác nhân tủa thích hợp :
Với các tác nhân khác nhau, khả năng kết tủa thu protein – enzyme là khác
nhau. Do vậy, sau khi xác định được các tỷ lệ (nồng độ) tác nhân tủa / dịch chiết
thích hợp ta tiến hành so sánh hoạt tính enzyme của chế phẩm thô được kết tủa bằng
acetone, ethanol, (NH4)2SO4 thẩm tích để chọn tác nhân tủa thích hợp.
2.5.5.3 Khảo sát một số yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính protease của dịch chiết
và chế phẩm thô từ nội tạng cá Basa :
a. Xác định ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme protease dịch chiết và
chế phẩm thô từ nội tạng cá Basa :
pH là yếu tố ảnh hưởng lớn đến hoạt tính enzyme. Mỗi enzyme có pH hoạt
tính thích hợp nhất định. Việc nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến hoạt tính protease
được thực hiện bằng cách : xác định hoạt tính protease dịch chiết và chế phẩm thô
của nội tạng ở các giá trị pH = 6, 7, 8, …, 11

47. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 46 MSSV : 107111115
Hình 2.7 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của pH đến hoạt tính enzyme
protease.
b. Xác định ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease dịch
chiết và chế phẩm thô của nội tạng :
Hoạt tính enzyme chịu ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ. Xác định nhiệt độ
thích hợp cho hoạt tính protease của chế phẩm thô nội tạng bằng cách cho tác dụng
với casein trong 60 phút. Sau đó nhanh chóng làm lạnh, tiến hành xác định hoạt tính
enzyme theo phương pháp Amano.
Protease chế phẩm thô nội tạng
Tác dụng với casein ở các pH
6
Chọn pH thích hợp
Xác định hoạt tính enzyme
7 8 ... 11

48. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 47 MSSV : 107111115
Hình 2.8 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt tính
enzyme protease.
c. Xác định độ bền nhiệt của nhiệt độ đến hoạt tính enzyme protease dịch
chiết và chế phẩm thô nội tạng :
Độ bền nhiệt đối với từng loại enzyme khác nhau thì khác nhau. Độ bền
nhiệt của protease được xác định bằng cách giữ protease ở nhiệt độ thích hợp cho
hoạt tính enzyme trong các khoảng thời gian khác nhau : 0, 10, 20, …, 70 phút. Sau
đó nhanh chóng làm lạnh bằng nước máy trong 5 phút, đưa về cùng nhiệt độ là 370
C
và xác định hoạt tính enzyme.
Protease chế phẩm thô nội tạng
Tác dụng với casein ở các nhiệt độ (0
C)
25
Chọn nhiệt độ thích hợp
Xác định hoạt tính enzyme
30 35 ... 80

49. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 48 MSSV : 107111115
Hình 2.9 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát độ bền nhiệt của enzyme protease.
d. Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối ăn đến hoạt tính enzyme proteae
dịch chiết và chế phẩm thô từ nội tạng cá Basa :
Tiến hành xác định hoạt tính enzyme chế phẩm thô của nội tạng ở các nồng
độ muối : 1, 3, 5, …., 27, 29%.
Protease chế phẩm thô
Xử lý enzyme ở nhiệt độ thích hợp trong thời gian (phút)
0
Xác định hoạt tính enzyme
10 20 ... 70

50. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 49 MSSV : 107111115
Hình 2.10 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của nồng độ muối ăn đến
hoạt tính enzyme protease.
e. Khảo sát ảnh hưởng của một số ion kim loại, chất đặc hiệu nhóm đến
hoạt tính enzyme protease dịch chiết và chế phẩm thô từ nội tạng cá
Basa :
Tiến hành bổ sung các ion kim loại : Mn2+
, CN, Cu2+
, Hg, Zn2+
, Ba2+
, Mo,
Fe2+
, Ca2+
, EDTA, Pb2+
, Mg sao cho nồng độ ion kim loại trong hỗn hợp là 10-3
M,
ủ hỗn hợp 15 phút ở 300
C. Xác định hoạt tính enzyme theo điều kiện tiêu chuẩn.
Protease chế phẩm thô nội tạng
Tác dụng với casein + NaCl
1%
Xác định hoạt tính enzyme
3% 5% ... 29%

51. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 50 MSSV : 107111115
Hình 2.11 Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát ảnh hưởng của một số kim loại, chất đặc
hiệu nhóm đến hoạt tính enzyme protease.
2.6 PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU :
Mỗi thí nghiệm bố trí song song 3 mẫu, lấy kết quả trung bình cộng của 3
mẫu. Mỗi thí nghiệm lặp lại 3 lần, kết quả trung bình cộng của 3 lần thí nghiệm.
2.7 TÍNH TOÁN KẾT QUẢ :
a. Xác định hàm lượng protein trong mẫu theo phương pháp Braford đã trình
bày ở mục 2.5.1
b. Xác định hoạt tính của enzyme protease theo phương pháp Amano đã trình
bày ở mục 2.5.2
c. Xác định hoạt tính riêng của enzyme protease
Protease chế phẩm thô nội tạng
Tác dụng với casein bổ sung
CN
Xác định hoạt tính enzyme
Cu Mo Ca Mg
Pb
EDTA Ba
Zn Fe
Hg
Mn

52. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 51 MSSV : 107111115
 Hoạt tính riêng trước khi tinh sạch :
ĐVHT/ ml dung dịch enzyme pha loãng
HTR trước tinh sạch =
Hàm lượng protein trong 1 ml dd pha loãng
 Hoạt tính riêng sau khi tinh sạch :
ĐVHT / ml dd E sau khi tinh sạch
HTR sau tinh sạch =
Hàm lượng protein trong 1 ml dd sau khi tinh sạch
d. Xác định độ tinh sạch và hiệu suất tinh sạch enzyme :
 Hiệu suất thu hồi enzyme :
Hoạt tính E sau tinh sạch
Hiệu suất thu hồi =
Hoạt tính E trước tinh sạch
 Độ tinh sạch của enzyme sau sắc ký :
HTR của E sau tinh sạch
HTR sau tinh sạch =
HTR của E trước tinh sạch
e. Xác định trọng lượng phân tử của protein .

53. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 52 MSSV : 107111115
CHƯƠNG III
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN

54. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 53 MSSV : 107111115
3.1 KHẢO SÁT, LỰA CHỌN DUNG MÔI VÀ ĐIỀU KIỆN CHIẾT RÚT
ENZYME PROTEASE :
3.1.1 Xác định tỷ lệ dung môi chiết : mẫu
Tỷ lệ dung môi / mẫu ảnh hưởng lớn đến quá trình chiết rút thu enzyme. Do
vậy việc xác định tỷ lệ chiết là cần thiết. Căn cứ vào tính tan và các yếu tố ảnh
hưởng đến hoạt tính enzyme của các loại dung môi khác nhau, tiến hành thử trên ba
loại dung môi khác nhau là nước cất, dung dịch muối sinh lý và dung dịch đệm
phosphate pH 7 để chiết rút enzyme.
Dung môi và mẫu nội tạng được bố trí ở các tỷ lệ khác nhau để chiết rút
enzyme trong điều kiện lạnh trong 30 phút. Sau đó đem ly tâm lạnh 10.000
vòng/phút trong 10 phút, thu phần dịch trong, đó là dịch chiết nội tạng, đem xác
định hoạt tính protease.
3.1.1.1 Xác định tỷ lệ nước cất : mẫu
Nội tạng được chiết rút bằng nước cất trong thời gian 30 phút.
Kết quả xác định hoạt tính enzyme protease được trình bày ở Bảng 3.1 và Hình 3.1
Bảng 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước cất : mẫu đến quá trình chiết protease.
Tỷ lệ
mẫu :
nước cất
Hàm lượng
(mg)
Hoạt tính (U/g)
Hoạt tính tương đối
(% so với cực đại)
1:1 34,95 48,69 32,12
1:2 51,07 56,41 37,22
1:3 83,43 103,02 67,97
1:4 93,17 105,52 69,62

55. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 54 MSSV : 107111115
1:5 98,80 122,03 80,51
1:6 120,73 151,57 100,00
1:7 130,36 130.24 85,93
1:8 129,87 127,30 83,99
1:9 161,44 122,99 81,14
1:10 170,15 95,10 62,74
0
20
40
60
80
100
120
140
160
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tỷ lệ nước cất : mẫu
Hoạt
tính
enzyme
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Hàm
lượng
protein
Hoạt tính (U/g) Hàm lượng (mg)
Hình 3.1 Ảnh hưởng của tỷ lệ nước cất / mẫu đến quá trình chiết protease.
Kết quả khảo sát cho thấy : Với mỗi phần khác nhau, tỷ lệ nước cất / mẫu
thích hợp cho việc tách chiết enzyme là khác nhau. Khi tăng dần lượng nước cất so
với mẫu thì hoạt tính protease trong dịch chiết từ nội tạng tăng dần và đạt cực đại
với tỷ lệ nước cất / nội tạng là 6 / 1, tương ứng với hoạt tính cực đại của enzyme là

56. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 55 MSSV : 107111115
151,57 U/g. Sau đó, hoạt tính enzyme trong dịch chiết sẽ giảm nhanh khi tăng
lượng nước cất so với mẫu.
Như vậy, tỷ lệ nước cất / mẫu thích hợp cho nội tạng là 6 / 1.
3.1.1.2 Xác định tỷ lệ dung dịch muối sinh lý : mẫu
Nội tạng được chiết rút bằng dung dịch NaCl 0,9% trong thời gian 30 phút.
Kết quả xác định hoạt tính enzyme protease được trình bày ở Bảng 3.2 và Hình 3.2
Bảng 3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung dịch muối sinh lý : mẫu đến quá trình chiết
protease.
Tỷ lệ mẫu :
muối sinh
lý
Hàm lượng
(mg)
Hoạt tính (U/g)
Hoạt tính tương
đối (% so với cực
đại)
1:1 47,31 70,76 30,57
1:2 71,44 143,40 61,95
1:3 77,40 162,48 70,19
1:4 88,05 179,06 77,35
1:5 102,61 186,10 80,40
1:6 109,52 231,48 100,00
1:7 103,35 183,95 79,47
1:8 127,05 176,79 76,37
1:9 135,02 174,09 75,21
1:10 150,30 106,13 45,85

57. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 56 MSSV : 107111115
0
50
100
150
200
250
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tỷ lệ dd muối sinh lý : mẫu
Hoạt
tính
enzyme
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Hàm
lượng
protein
Hoạt tính (U/g) Hàm lượng (mg)
Hình 3.2 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung dịch muối sinh lý / mẫu đến quá trình chiết
protease.
Kết quả thực nghiệm cho thấy : Khi tăng dần lượng nuớc muối so với mẫu
thì hoạt tính protease trong dịch chiết từ nội tạng tăng dần và cực đại ứng với tỷ lệ
dung dịch NaCl 0,9 % / nội tạng là 6 / 1, tương ứng với hoạt tính cực đại của
enzyme là 231,48 U/g. Sau đó, hoạt tính enzyme trong dịch chiết sẽ giảm nhanh khi
tăng lượng dung môi chiết so với mẫu.
Như vậy, tỷ lệ dung dịch NaCl 0,9 % : mẫu thích hợp cho nội tạng là 6 : 1.
3.1.1.3 Xác định tỷ lệ dung dịch đệm phosphate : mẫu
Nội tạng được chiết rút bằng dung dịch đệm phosphate pH 7 trong thời gian
30 phút. Kết quả xác định hoạt tính enzyme protease được trình bày ở Bảng 3.3 và
Hình 3.3

58. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 57 MSSV : 107111115
Bảng 3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung dịch đệm phosphate : mẫu đến quá trình chiết
protease.
Tỷ lệ mẫu
: đệm
phosphate
Hàm lượng
(mg)
Hoạt tính (U/g)
Hoạt tính tương
đối (% so với
cực đại)
1 : 1 49,92 33,52 18,36
1 : 2 58,97 94,55 51,79
1 : 3 93,17 182,55 100,00
1 : 4 101,07 153,54 84,11
1 : 5 116,54 142,38 78,00
1 : 6 140,06 102,63 56,22
1 : 7 106,93 84,95 46,54
1 : 8 149,71 84,21 46,13
1 : 9 171,29 82,67 45,29
1 : 10 196,89 62,37 34,17

59. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 58 MSSV : 107111115
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
200
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Tỷ lệ dd đệm phosphate : mẫu
Hoạt
tính
enzyme
0
50
100
150
200
250
Hàm
lượng
protein
Hoạt tính (U/g) Hàm lượng (mg)
Hình 3.3 Ảnh hưởng của tỷ lệ dung dịch đệm phosphate / mẫu đến quá trình chiết
protease.
Khi tăng lượng dung dịch đệm phosphate so với mẫu thì hoạt tính protease
trong dịch chiết nội tạng tăng dần và đạt cực đại ứng với tỷ lệ dung dịch đệm
phosphate / nội tạng là 3 /1, tương ứng với hoạt tính cực đại của enzyme là 182,55
U/g. Sau đó, hoạt tính enzyme trong dịch chiết sẽ giảm khi tăng lượng dung môi so
với mẫu.
Như vậy, tỷ lệ dung dịch đệm phosphate : mẫu thích hợp cho nội tạng là 3/1.
3.1.1.4 Nhận xét chung :
Mối quan hệ tỷ lệ thuận khi tăng tỷ lệ dung môi và mẫu có thể lý giải là khi
lượng dung môi tăng, hiệu suất chiết rút protein – enzyme tăng. Quá trình chiết rút
là quá trình khuếch tán các chất tan trong nội tạng đã nghiền ủ vào dung môi. Quá
trình khuếch tán tuân theo định luật Fick : “ Lượng chất khuếch tán tỷ lệ thuận với
diện tích bề mặt tiếp xúc giữa dung môi và chất tan, với gradien nồng độ và thời
gian khuếch tán”.

60. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 59 MSSV : 107111115
Khi tỷ lệ dung môi : nội tạng tăng thì diện tích tiếp xúc giữa dung môi và
mẫu tăng. Lượng dung môi tăng làm chênh lệch nồng độ chất tan giữa bề mặt tiếp
xúc của mẫu với lớp các dung môi bên ngoài (gradien nồng độ) tăng. Cả hai tác
nhân trên đã làm cho lượng chất tan chiết rút tăng khi tỷ lệ dung môi : mẫu tăng.
Tuy nhiên, khi lượng dung môi đạt đến giới hạn thì nồng độ enzyme trong
dịch chiết giảm, dẫn đến hoạt tính enzyme giảm.
3.1.2 Lựa chọn dung môi thích hợp :
Với mỗi loại dung môi chiết khác nhau thì protease có hoạt tính khác nhau.
Do vậy cần xác định dung môi chiết thích hợp cho enzyme bằng cách tiến hành thí
nghiệm chiết rút enzyme ở 3 loại dung môi nước cất, dung dịch muối sinh lý, dung
dịch đệm phosphate pH 7 ở cùng tỷ lệ 6 : 1 trong thời gian 30 phút.
Kết quả thể hiện ở Bảng 3.4 và Hình 3.4
Bảng 3.4 Ảnh hưởng của các loại dung môi đến quá trình tách chiết.
Loại
dung môi
Hàm lượng
(mg)
Hoạt tính (U/g)
Hoạt tính tương
đối (% so với cực
đại)
Đệm
phosphate
122,11 89,36 28,42
Muối
sinh lý
142,66 131,81 41,93
Nước cất 151,71 314,39 100,00

61. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 60 MSSV : 107111115
0
50
100
150
200
250
300
350
Đệm
phosphate
Muối sinh lý Nước cất
Dung môi chiết mẫu
Hoạt
tính
enzyme
0
20
40
60
80
100
120
140
160
Hàm
lượng
protein
Hoạt tính (U/g) Hàm lượng (mg)
Hình 3.4 Ảnh hưởng của các loại dung môi đến quá trình chiết protease.
Từ số liệu thực nghiệm cho thấy : Các dung môi khác nhau có ảnh hưởng
đến hoạt tính enzyme protease. Hoạt tính enzyme trong nội tạng khi chiết bằng
nước cất là cao nhất, kế đến là muối sinh lý và đệm phosphate. Điều này có thể giải
thích nuớc cất có khả năng hòa tan được nhiều protein – enzyme nhất. Do đó ta
chọn nuớc cất là dung môi dùng để chiết rút thu enzyme protease.
3.1.3 Xác định thời gian chiết :
Tiến hành chiết rút protease từ nội tạng trong nước cất với tỷ lệ dung môi
mẫu là 6 : 1, khuấy đảo hỗn hợp bằng máy khuấy từ. Thời gian khuấy để chiết thay
đổi lần lượt là 10, 20, …, 70 phút. Sau đó ly tâm thu dịch chiết, xác định hoạt tính
enzyme của dịch chiết thu được.
Kết quả được trình bày ở Bảng 3.5 và Hình 3.5

62. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 61 MSSV : 107111115
Bảng 3.5 Ảnh hưởng của thời gian đến quá trình chiết rút protease.
Thời
gian
chiết
( phút)
Hàm lượng
(mg)
Hoạt tính (U/g)
Hoạt tính tương
đối (% so với cực
đại)
10 159,15 123,61 63,21
20 134,10 125,95 64,40
30 109,45 157,45 80,51
40 133,80 188,13 96,20
50 119,41 195,56 100,00
60 117,49 159,02 81,32
70 136,84 157,73 80,66

63. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 62 MSSV : 107111115
0
50
100
150
200
250
10 20 30 40 50 60 70
Thời gian chiết (phút)
Hoạt
tính
enzyme
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Hàm
lượng
protein
Hoạt tính (U/g) Hàm lượng (mg)
Hình 3.5 Ảnh hưởng của thời gian chiết đến quá trình chiết rút protease.
Khi thời gian chiết tăng lên thì khả năng khuếch tán của enzyme protease
vào dung môi tăng. Với thời gian chiết rút là 50 phút, dịch chiết từ nội tạng cho hoạt
tính cao nhất là 195,56 U/g. Nếu ta kéo dài thời gian chiết thì hoạt tính protease thu
được trong dịch chiết sẽ giảm. Điều này có thể giải thích rằng, khi thời gian chiết
càng dài, lượng protein – enzyme hòa tan trong dịch chiết càng nhiều. Khi thời gian
quá dài, hiệu suất chiết rút protein tăng nhưng không phải tăng lượng enzyme
protease mà tăng lượng protein tạp nên hoạt tính enzyme của dịch chiết không tăng.
Hơn nữa, khi thời gian chiết dài, các phân tử protease trong dịch chiết có thể thủy
phân lẫn nhau, làm giảm hoạt tính chung của enzyme trong dịch chiết.
Như vậy, thời gian chiết thích hợp cho enzyme từ nội tạng cá là 50 phút.

64. Đồ án tốt nghiệp GVHD: PGS.TS. Nguyễn Tiến Thắng
CN. Đỗ Thị Tuyến
SVTH : Trần Tú Nhi 63 MSSV : 107111115
3.2 KHẢO SÁT, LỰA CHỌN TÁC NHÂN VÀ ĐIỀU KIỆN TỦA ENZYME
PROTEASE :
3.2.1 Xác định tỷ lệ (nồng độ ) tác nhân tủa : dịch chiết
Các loại dung môi hữu cơ và hoá chất thường dùng để kết tủa thuận nghịch
protease trong dịch chiết mà không làm giảm hoạt tính của chúng là acetone,
ethanol và muối sulphate amoni (NH4)2SO4. Quá trình kết tủa cần tiến hành trong
điều kiện lạnh, nồng độ tác nhân và các điều kiện tủa thích hợp.
3.2.1.1 Xác định nồng độ (NH4)2SO4 bão hòa : dịch chiết (g/ml)
Kết tủa protease dịch chiết bằng (NH4)2SO4 với các nồng độ khác nhau 45%,
50%,…,70% trong 40 phút. Sau khi kết tủa, ly tâm cặn tủa, hòa vào dung dịch đệm
phosphate để bảo quản. Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.6 và Hình 3.6
Bảng 3.6 Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến quá trình kết tủa protease.
Nồng độ
(NH4)2SO4
bão hòa
Hàm lượng
(mg)
Hoạt tính (U/g)
Hoạt tính tương
đối (% so với cực
đại)
45% 9,83 30,60 57,78
50% 15,02 33,35 62,97
55% 18,18 36,88 69,64
60% 11,04 52,96 100,00
65% 13,58 38,10 71,94
70% 12,69 37,22 70,28