En esta investigación se realizaron dos pruebas de biorremediación en suelos contaminados con hidrocarburos de la Refinería Conchán, en la primera prueba se obtuvo un 79% de remoción de hidrocarburos en 90 días, mientras que en la segunda prueba de compostaje se observó entre un 95% a 99% de remoción de hidrocarburos después de 86 días, por lo que la técnica de compostaje fue la mejor para tratar suelos contaminados con hidrocarburos en

2. UNIVERSIDAD
CIENTÍFICA DEL SUR
DIRECTORIO Ing. Jorge Chávez Salas
Ing. José Dextre Chacón Decano de la Facultad de Administración
de Turismo Sostenible y Hotelería
Presidente del Directorio
RECTOR Ing. Juan Guerrero Barrantes
Decano de la Facultad de Ingeniería y Gestión Ambiental
Dr. Agustín Iza Stoll
Dra. Josefina Takahashi Sato
AUTORIDADES Decana de la Facultad de Negocios Agro-Forestales
Mg. Roland Leidinger Ayllón
Dra. Laurietz Seda Ramírez
Vicerrector Académico y Gerente General
Decana de la Facultad de Artes Escénicas y Literatura
Dr. José Amiel Pérez
Ing. Zandra Rivera Chávez
Vicerrector de Investigación Directora de la Facultad de Ingeniería
de Sistemas Empresariales
MBA. Rafael Su-Nobrega Arima
Gerente Pregrado Mg. Larissa Bálsamo Fasce
Directora de la Carrera de Psicología
MA. Tulio Pita Chávarri
Gerente Postgrado Mg. Humberto Espinosa Ariza
Director de la Carrera de Administración
MBA. Jaime Tamashiro Tamashiro de Negocios Internacionales
Director Central de Administración y Finanzas
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Dr. Agustín Iza Stoll Directora de la Carrera de Marketing y Administración
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Directora de la Carrera de Comunicación y Publicidad
Ing. Jorge Ponce Urquiza
Decano de la Facultad de Ingeniería Abg. Mariano Castro Sánchez-Moreno
Económica y de Negocios Director de la Carrera de Derecho
Dr. Rodolfo Valdivia Maibach
Arq. Ignacio Pacheco Díaz
Decano de la Facultad de Estomatología Director de la Carrera de Arquitectura
y Urbanismo Ambiental
Dra. Luzmila Troncoso Corso
Decana de la Facultad de Nutrición y Dietética Lic. Gustavo Luján Zumaeta
Director de Propuesta Educativa
Dr. Manuel Rosemberg Barrón
Decano de la Facultad de Medicina Veterinaria y Zootecnia Lic. Mariza Ríos Olivera
Directora de Servicios Académicos
Ing. José Carlos Dextre Chacón
Decano de la Facultad de Ingeniería Dr. Emilio Guija Poma
de Sistemas Empresariales Director del Instituto de Investigación
Dra. Sonia Valle Rubio Percy Encinas Carranza
Decana de la Facultad de Biología Marina y Econegocios Director del Centro Cultural y del Fondo Editorial

5. CIENTÍFICA
Revista CIENTÍFICA Vol 7 Nº2, mayo-agosto 2010
Director
Dr. José Amiel Pérez
Vicerrector de investigación
Universidad Científica del Sur
jamiel@ucsur.edu.pe
Comité Editorial
Dr. Emilio Guija Poma
Director del Instituto de Investigación
Universidad Científica del Sur
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Decano de la Facultad de Medicina Humana
Universidad Científica del Sur
decamed@ucsur.edu.pe
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Gestión de la Investigación
Universidad Nacional Mayor de San Marcos
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Universidad San Antonio Abad del Cuzco
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Asesora de diseño: Erika Kohatsu
Asistente de prensa: Rodrigo Salazar
Correctora de estilo: Diana Zapata Pratto
Diseño y diagramación: Estudio Ojo Gráfico
CIENTÍFICA, revista de ciencias de la Universidad
Científica del Sur, publica tres números al año.
La revista está dirigida a investigadores científicos,
docentes y estudiantes universitarios.
La Universidad Científica del Sur no se solidariza necesariamente
con las opiniones expresadas en los artículos publicados
en esta edición de CIENTÍFICA. Se autoriza la reproducción
de los textos siempre que se cite la fuente.
revistacientifica@ucsur.edu.pe
Fondo Editorial. Universidad Científica del Sur.
Cl. Cantuarias 398. Miraflores. Lima 18, Perú.
Tel.: +511 6106400 anexo 164
Tiraje: 600 ejemplares.
Hecho el depósito legal en la Biblioteca Nacional del Perú:
Nº 2008-15522 / ISSN: 1997-700X

6. CIENTÍFICA
CONTENIDO
Revista Científica Vol 7 Nº2, mayo-agosto 2010.
COMITÉ CIENTÍFICO 108
EDITORIAL 109
ARTÍCULOS ORIGINALES
IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS NATIVAS QUE DEGRADAN
HIDROCARBUROS: BIORREMEDIACIÓN EN SUELOS CONTAMINADOS
CON «BORRAS» MEDIANTE LA TÉCNICA DE COMPOSTAJE
DENTIFICATION OF NATIVE BACTERIA THAT DEGRADE
HYDROCARBONS: BIOREMEDIATION IN SOILS CONTAMINATED
WITH «BORRAS» USING THE COMPOSTING TECHNIQUE
Pierina Guillén 110
PURIFICACIÓN Y PROPIEDADES DE UNA FOSFATASA ÁCIDA DE BAJO
PESO MOLECULAR DE HÍGADO DE ALPACA (Lama pacos)
PURIFICATION AND PROPERTIES OF A LOW MOLECULAR WEIGHT
ACID PHOSPHATASE FROM ALPACA LIVER (Lama pacos)
Emilio Guija Poma 122
OCURRENCIA DE ECTOPARASITISMO DE Amblyomma rotundatum
KOCH, 1844 (ACARI: IXODIDAE) EN Bufo marinus LINNAEUS, 1758
OCURRENCE OF ECTOPARASITISM OF Amblyomma rotundatum KOCH,
1844 (ACARI: IXODIDAE) ON Bufo marinus LINNAEUS, 1758
Gianmarco Rojas 130
ARTÍCULOS DE REVISIÓN
LA INTEGRACIÓN DE LA SALUD Y EL AMBIENTE EN LAS POLÍTICAS
PÚBLICAS: EVITANDO LA CONTAMINACIÓN DEL AIRE
HEALTH AND ENVIRONMENTAL INTEGRATION IN PUBLIC POLICIES:
PREVENTING AIR POLUTION
Mariano Castro 138
TENDENCIAS Y DESAFÍOS DE LA INNOVACIÓN Y EL ROL DE LAS
UNIVERSIDADES PRIVADAS EN EL PERÚ
TRENDS AND CHALLENGES OF INNOVATION AND THE
ROLE OF PRIVATE UNIVERSITIES IN PERU
Zandra Rivera 148

7. ISSN 1997-700X
LA EDUCACIÓN EN EL PERÚ: LA IMPORTANCIA DE LA INVERSIÓN
EN EDUCACIÓN COMO PORCENTAJE DEL GASTO PÚBLICO 1936-
2007, UNA CARACTERIZACIÓN EMPÍRICA
EDUCATION IN PERU: THE IMPORTANCE OF INVESTMENT IN
EDUCATION AS A PERCENTAGE OF GOVERNMENT EXPENDITURE.
1936 - 2007, AN EMPIRICAL CHARACTERIZATION.
José Ignacio Pacheco Díaz 158
LA PROPUESTA METODOLÓGICA DE KARL POPPER
THE METHODOLOGICAL PROPOSAL OF KARL POPPER
José Eduardo Rosales Trabuco 164
CARTAS AL EDITOR
PROYECTO MAMI-DIGITAL: UNA PROPUESTA PARA DISMINUIR
LA MUERTE MATERNA Y PERINATAL UTILIZANDO NUEVAS
TECNOLOGÍAS DE INFORMACIÓN Y COMUNICACIÓN (NTIC)
Alberto Zapata 172
DIFERENCIAS MORFOLÓGICAS DE NÓDULOS DE Rhizobium Y SU
RELACIÓN CON LA PRODUCTIVIDAD DE CULTIVOS DE ARVEJA
Pisum sativum
Milvio Casaverde Río 178
TESIS
EL PUNTAJE DE LUND-MACKAY Y SU CORRELACIÓN CLÍNICA SEGÚN
EL TIPO DE RINOSINUSITIS, HOSPITAL MILITAR CENTRAL 2009
Yanina Bazán Ponte 192
SALA CABIESES
EL DESAFíO
Fernando Cabieses 204
NOTAS 210
INFORMACIÓN PARA LOS AUTORES 214

8. COMITÉ
CIENTÍFICO
Dr. Paul Schiller
Departamento de Bioquímica y Biología Celular
Universidad de Miami – EE.UU
Dr. Emilio Guija
Vicerrectorado de Investigación
Universidad Científica del Sur
Dr. Ricardo Caballero Merino
Jefe de servicios de Obstetricia y Ginecología
Hospiten Rambla-España
Prof. Ramsés Salas
Facultad de Ciencias Naturales y Matemáticas
Universidad Nacional Federico Villarreal
Dr. Javier Enciso
Vicerrectorado de Investigación
Universidad Científica del Sur
Dr. James Graham
Departamento de Farmacognosis. Facultad de Farmacia
Universidad de Illinois en Chicago – EE.UU
Dr. Alejandro Burga
Facultad de Medicina Humana
Universidad Científica del Sur
Dr. Pedro San Martín Howard
Jefe del Departamento de Pediatría
Hospital Nacional Dos de Mayo
Ing. Óscar Paiba
Facultad de Ingeniería de Sistemas Empresariales
Universidad Científica del Sur
Dra. Nancy Lozano
Facultad de Farmacia y Bioquímica
Universidad Nacional Mayor de San Marcos
Ing. Juan Guerrero Barrantes
Facultad de Ingeniería y Gestión Ambiental
Universidad Científica del Sur
Ing. José Dávila
Facultad de Ingeniería de Sistemas Empresariales
Universidad Científica del Sur
CIENTÍFICA se encuentra
indizada en Latindex

9. EDITORIAL
Los métodos de investigación en la ciencia
Los procedimientos que utilizan las ciencias para validar los conocimientos que ella reconoce han
sido motivo de diversos comentarios y base para la presentación de interesantes teorías acerca de la
validez de los métodos de la ciencia.
En este número de nuestra revista se publica el artículo «La propuesta metodológica de Karl
Popper», en el que José Eduardo Rosales Trabuco revisa los conceptos que Karl Popper elaboró
y expuso desde sus notas iniciales, en 1934, hasta los trabajos finales que han sido editados y
comentados incluso en el presente siglo.
En el artículo mencionado se comentan sus criterios sobre demarcación y conceptos que explican
detalladamente la falsación. Contrariamente al positivismo de Compte, Popper no acepta como
válidos los procedimientos inductivos que aplicamos para comprobar las afirmaciones científicas
que queremos demostrar como realmente verídicas. En cambio, propone sus teorías fundadas en los
intentos de falsación de las hipótesis que, en vez de verificarse, deben someterse a una exhaustiva
búsqueda de fallas para convertirse, así, en «verdades más profundas y permanentes».
Con Mario Bunge, aceptamos como método de la ciencia la definición del problema, la formulación
de la hipótesis de trabajo y su comprobación, utilizando procedimientos que, para el caso de las
ciencias fácticas, necesariamente deberán hacerse con hechos y que tienen la virtud de mostrar
las limitaciones de los nuevos conocimientos así adquiridos, confirmando su temporalidad y
permitiéndonos reconocer que, además de transitorios, son contextuales.
Este reconocimiento hace posible y estimula el desarrollo de la ciencia, la tecnología e innovación,
cuyos aportes se vienen utilizando en favor del bienestar del hombre, quien ve, así, un progreso
continuo y optimista de la condición humana, con la esperanza de un futuro renovado y adecuado
al inexorable crecimiento y expansión del género humano.
El desarrollo de la tecnología de información y de los sistemas, que cuentan con un increíble soporte
de computadoras y sus sorprendentes software, permiten manejar muchas más variables que las
dos fundamentales de siempre, causa y efecto, y ya no es imprescindible reducir tanto el número
amplio de variables presentes en un problema científico y su solución, a solamente unas cuantas
variables relevantes. Hoy en día, se incorporan múltiples variables, tan importantes y numerosas,
que podemos afirmar, sin duda alguna, que las variables constituyen la unidad fundamental del
Método Científico. Estamos seguros de que este debate, estimulado de manera inequívoca por
Popper, continuará. Y nuestra revista está dispuesta a recibir aportes acerca del tema.
Dr. José Amiel Pérez
Director

10. ARTÍCULOS
ORIGINALES
IDENTIFICACIÓN DE BACTERIAS NATIVAS
QUE DEGRADAN HIDROCARBUROS:
BIORREMEDIACIÓN EN SUELOS
CONTAMINADOS CON «BORRAS» MEDIANTE
LA TÉCNICA DE COMPOSTAJE
IDENTIFICATION OF NATIVE BACTERIA THAT DEGRADE
HYDROCARBONS: BIOREMEDIATION IN SOILS CONTAMINATED
WITH «BORRAS» USING THE COMPOSTING TECHNIQUE
Pierina Elizabeth Guillén Zubiate1, Juan Guerrero Barrantes 1
1
universidad nacionaL agraria La MoLina. departaMento de sueLos

11. Identificación de bacterias nativas que degradan hidrocarburos: biorremediación en
suelos contaminados con «borras» mediante la técnica de compostaje
RESUMEN
En esta investigación se realizaron removal from the soil, while in the second
dos pruebas de biorremediación en bioremediation test —Proof of composting—
suelos contaminados con hidrocarburo, was observed that after 86 days, all biopiles
provenientes de la Refinería Conchán. presented between 95% to 99% removal of
Inicialmente, en el laboratorio, se logró hydrocarbon and the TPH levels were below
aislar e identificar bacterias y hongos the limits of oils and fats determined by the
del hidrocarburo pesado (con 17 a 19 regulations of the Ministry of Energy and
grados API), se determinó su actividad Mines of Peru. Therefore we can conclude
degradativa y emulsificante, así como se that for this research, the composting
seleccionó el «consorcio bacteriano selecto» technique was the best treatment for
que fue utilizado en las dos pruebas de hydrocarbon contaminated soil.
biorremediación. En cuanto a los resultados, Key words: bioremediation, composting,
en la primera prueba de biorremediación terrariums, borras.
—Prueba en terrarios—, se observó en el
terrario número cinco (T5) que a los 90 días se
obtuvo el 79% de remoción del hidrocarburo INTRODUCCIÓN
del suelo; mientras que en la segunda
La Refinería Conchán se encuentra ubicada
prueba de biorremediación —Prueba de
al sur de la ciudad de Lima, en el kilómetro
compostaje—, se observó que todas las
38 de la carretera Panamericana Sur y está
biopilas a los 86 días presentaron entre 95%
orientada a la producción de asfaltos y
y 99% de remoción del hidrocarburo y los
combustibles.
niveles de TPH estuvieron por debajo de los
límites de aceites y grasas determinados Particularmente importante fue que
por la normativa del Ministerio de Energía y los residuos industriales de la refinería
Minas de Perú. Con lo que se puede concluir provinieron de la limpieza del fondo de
que, para esta investigación, la técnica de los tanques de almacenamiento de crudo
compostaje fue el mejor tratamiento para el y pozas de recuperación, de la mezcla
suelo contaminado con hidrocarburo. heterogénea de hidrocarburos con sólidos y
agua entrampada como subproducto común
Palabras clave: biorremediación, compostaje,
de la producción de crudos, o mezcladas
terrarios, borras.
con compuestos inorgánicos formados
por arenas, arcillas, lodos provenientes
ABSTRACT del pozo y polvos finos que llegan al crudo
en la superficie por acción del viento,
In this research, two tests have been carried en suelos expuestos a concentraciones
out concerning to the bioremediation of tóxicas de petróleo, etc. Estos residuos
contaminated soils with hydrocarbon from industriales fueron depositados desde 1989
Conchan’s Refinery. At a beginning in the aproximadamente en dos grandes «pozas
laboratory investigation we got to isolate and de borra», dispuestas en el suelo de un cerro
identify bacteria and fungus from the heavy cercano (figura 1).
hydrocarbon (with a 17 to 19 API degree).
It was determined their degradative and La Refinería Conchán brindó las muestras
emulsifier activity, in the same way the “select de hidrocarburo de las «pozas de borra»
bacterial consortium” was selected and used y la investigación estuvo enfocada en
in the two bioremediation tests. As for the la obtención de un consorcio de cepas
results, in the first test of bioremediation bacterianas y hongos con el objetivo de
—Test in terrariums—, was observed in utilizarlas en la biorremediación de suelos
terrarium number five (T5), that after 90 contaminados con borras mediante la
days it was obtained 79% of hydrocarbon técnica de compostaje.
Científica 7 (2), 2010 111

12. Pierina Elizabeth Guillén Zubiate, Juan Guerrero Barrantes
ARTÍCULOS ORIGINALES
Largo promedio:
50,5 m
Ancho promedio:
Poza 2 15,6 m
Profundidad:
Poza 1 0,87 m
Largo promedio: 48,1 m
Ancho promedio: 16,2 m
Profundidad: 0,75 m
Figura 1. pozas de borra ubicadas dentro de La refinería conchán
MATERIALES Y MÉTODOS de cultivo Bushnell-Haas (BH) solidificado
con agar (1), y se utilizó luz ultravioleta
1. Pruebas de laboratorio
como medio de esterilización durante el
a. Aislamiento e identificación de desarrollo de la siembra. Se incubaron a
bacterias y hongos de la borra temperatura de 30-34 ºC. Los hongos no
fueron centrifugados. Se seleccionaron
Se realizó la evaluación fisicoquímica del las placas que tuvieron mayor actividad
hidrocarburo. Del hidrocarburo se aislaron degradativa (consorcio bacteriano selecto),
bacterias y hongos en caldo Tripticasa según «los criterios cualitativos de actividad
Soya (TSB) y fueron incubadas a 42 °C degradativa» determinados durante la
por 24 horas hasta obtener crecimiento. observación, por los cambios generados de
Luego se ejecutaron diluciones hasta 1:104 las bacterias y hongos en medio de cultivo
unidades formadoras de colonias (UFC)/gr BH con hidrocarburo «borra».
y fueron sembrados en agar nutritivo y en
medios de cultivos selectivos para bacterias Para la calificación de la actividad degradativa,
(agar Cetrimide, agar Pseudomona P, agar se dio una calificación alta a las cepas que
Pseudomona F, agar Plate-Count y agar presentaron más de tres períodos del proceso
Sabouraud) por duplicado, y se incubaron de desarrollo de la actividad degradativa por
a 37 ºC por 24-48 h. Para los hongos, se demostrar mayores reacciones degradativas.
sembraron en agar Sabouraud incubadas Luego se realizó una comparación de la
a 48 horas. Se realizó el conteo de número actividad emulsificante de las bacterias que
de colonias, reportándose en UFC/gr. presentaron una alta calificación de actividad
Seguidamente, se realizó la caracterización degradativa (2). Seguidamente, se utilizó la
microscópica y macroscópica de las cepas técnica API 20 NE para la caracterización de
bacterianas y se realizó la evaluación algunas bacterias (3).
bioquímica de las cepas bacterianas para 2. Prueba de campo
determinar enterobacterias. Se realizó
también la característica microscópica y a. Prueba de terrarios en arena
macroscópica de las cepas de hongos.
Se acondicionaron seis terrarios de arena
b. Actividad degradativa, emulsificante sin hidrocarburo (4), con sus respectivas
y aplicación de la técnica del American repeticiones y se les agregaron diferentes
Petroleum Institute (API 20 NE) proporciones de nutrientes (5) (nitrógeno y
fósforo: (NH4)2SO4 y K2HPO4), agua, solución
Para la evaluación de la actividad salina (SS) e hidrocarburo (borra). Luego se
degradativa, las cepas reactivadas fueron colocaron en el terrario 3, terrario 4, terrario
centrifugadas a 7.000 rpm por 10 minutos 5 y terrario 6 diferentes cantidades de pellets
a 6 °C. Los pellets obtenidos se inocularon con bacterias y hongos con solución salina
en cantidades de 100 µl y 50 µl en el medio (tabla 1 y figura 2).
112 Científica 7 (2), 2010

13. Identificación de bacterias nativas que degradan hidrocarburos: biorremediación en
suelos contaminados con «borras» mediante la técnica de compostaje
tabLa 1. contenido de cada terrario
Suelo Borra Pellet SS Nutrientes Agua
N° Terrarios (gr) (gr) (ml) (ml) (ml) (ml)
Terrario N° 1 3.000 75 0 150 0 261,4
Componente N°1
Terrario N° 1,1 3.000 75 0 150 0 261,4
Terrario N° 1 3.000 75 0 150 261,4 0
Componente N°2
Terrario N° 2,1 3.000 75 0 150 261,4 0
Terrario N° 3 3.000 75 150 0 261,4 0
Terrario N° 3,1 3.000 75 150 0 261,4 0
Terrario N° 4 3.000 75 150 0 261,4 0
Terrario N° 4,1 3.000 75 150 0 261,4 0 Componente N°3
Terrario N° 5 3.000 75 150 0 261,4 0
Terrario N° 5,1 3.000 75 150 0 261,4 0
Terrario N° 6 3.000 75 150 0 261,4 0
Terrario N° 6,1 3.000 75 150 0 261,4 0
Figura 2. terrarios en arena
Durante los tres meses que duró la prueba, estiércol de vaca, fermentándolo antes de su
cada tres días se agregaron 100 ml de agua uso (tabla 2).
a cada terrario y se removió manualmente
para oxigenar al sistema. tabLa 2. cantidad en kg de insuMos
requeridos en cada biopiLa de coMpost
b. Prueba de compost
Se utilizó el sistema de compostaje abierto, Peso por Cantidad de Total de
Insumo
que es el más tradicional, en el que los carretilla carretillas insumos (kg)
sustratos a compostar se disponen en pilas Estiércol de vaca 55 kg 5 275 kg
que pueden estar al aire libre o cubiertas.
Caña 30 kg 3 90 kg
Las biopilas de compost tuvieron un volumen
Brócoli 50 kg 2 100 kg
de 1 m3 y las medidas de las pozas fueron:
2,3 m (ancho) x 8,3 m (largo) y 1 m. El suelo Paja de maleza seca 34 kg 7 238 kg
se niveló, compactó y las biopilas fueron Total Insumos 703 kg
revestidas con una geomembrana. Se utilizó
Científica 7 (2), 2010 113

14. Pierina Elizabeth Guillén Zubiate, Juan Guerrero Barrantes
ARTÍCULOS ORIGINALES
La prueba consistió en la formación de seis Para el armado de las biopilas se demarcó
biopilas de compost. La primera biopila el área de la base de la biopila con tallos
fue el control y a las cinco restantes se les secos de caña (tres carretillas), se colocó
aplicaron diferentes proporciones de «borra» en el centro de la base de la biopila un
y solamente a dos de estas biopilas se aplicó tronco de bambú y se incorporó como
el tratamiento de bioaumentación (tabla 3). base una mezcla de tres carretillas de paja
seca, encima dos carretillas de estiércol y
tabLa 3. proporciones de borra para cada biopiLa una carretilla de brócoli. Luego, se echaron
dos carretillas de estiércol mezclada con
Descripción de Biopila (%)
Código Borra kg una parte de la borra requerida; sobre esto
las biopilas en 1 m3 se colocó una carretilla de estiércol con la
Co Biopila control 0 0 última cantidad de la borra. Finalmente,
se terminó con tres carretillas de paja,
CB1
Biopila con borra
25 kg 2,5% hasta completar la altura de 1 m. Se retiró
y mas bioaumentación el tronco de bambú al día siguiente del
C1 Biopila con borra 25 kg 2,5% armado de la biopila (figura 3).
Biopila con borra
CB2 50 kg 5%
y mas bioaumentación
C2 Biopila con borra 50 kg 5%
C3 Biopila con borra 75 kg 7,5%
vertido de paja seca, estiércoL, brócoLi vertido deL hidrocarburo (borra)
Figura 3. arMado de Las biopiLas
Luego, las biopilas se humedecieron bacteriano selecto. Se siguió el mismo
quincenalmente y fueron volteadas cada procedimiento para la obtención de pellets
30 días para mejorar la oxigenación y que fue desarrollado en la «prueba de
homogenización del material compostado. degradación del hidrocarburo en terrarios»,
Los resultados estuvieron en función de con la diferencia de que se preparó mayor
la medición de la temperatura, pH para la material bacteriano. Se obtuvieron 358 ml
obtención del compost, población bacteriana de cada cepa bacteriana en solución salina
y la degradación de los hidrocarburos totales y se incorporaron a las biopilas luego del
de petróleo (TPH). volteo. Consecuentemente, se regaron las
biopilas para controlar la humedad durante
Bioaumentación el proceso de volteo (figura 4).
Se seleccionaron dos biopilas (CB1 y CB2),
a las cuales se les agregó el consorcio
114 Científica 7 (2), 2010

15. Identificación de bacterias nativas que degradan hidrocarburos: biorremediación en
suelos contaminados con «borras» mediante la técnica de compostaje
peLLet para La bioauMentación agregado deL consorcio bacteriano a Las biopiLas
Figura 4. bioauMentación
Se volvió a colocar la caña de bambú en la Se identificaron seis cepas de hongos
biopila para mantener aireado el sistema de que fueron clasificadas según género
compostaje y, al cumplir los 120 días que taxonómico: el género Rhizopus (códigos
duró la prueba, el material que componía el h33, h38 y h39) y el género Aspergillus
compost ya se encontraba descompuesto y (códigos h28, h36 y h30).
de color marrón oscuro, lo que supone una
aceleración de la descomposición de los De la prueba de actividad degradativa con
hidrocarburos. 100 µl de cepas bacterianas en medio
Bushnell-Haas se seleccionaron cuatro
cepas bacterianas (cepa B9.2 con 1.397
RESULTADOS unidades de actividad emulsificante (UAE)/
ml; cepa B1 con 1.029 UAE/ml; cepa B9.1
a. Resultado de la prueba de laboratorio
con 0.936 UAE/ml y cepa B15 con 0.909
Se clasificó al hidrocarburo de las pozas de UAE/ml) que presentaron mayor actividad
borra según su peso API (American Petroleum degradativa y emulsificante del hidrocarburo.
Institute) y registró en promedio de 17 a 19 También se observó que nueve cepas
grados API. Asimismo, según el método de (cepas B2, B35, B5, B12, B7, B24, B14, B10
referencia de la EPA (Environmental Protection y B11) alcanzaron una mediana actividad
Agency), el análisis cromatográfico obtuvo degradativa (figura 5). Estas 13 cepas
151,495 mg/kg (15%) de hidrocarburos totales bacterianas (consorcio bacteriano selecto),
de petróleo, lo cual confirma que las pozas de fueron consideradas para la prueba en
borra contienen hidrocarburo pesado. terrarios y prueba de compost.
Prueba de actividad degradativa y emulsificante con 100 µl de cepas bacterianas
4
Período de la actividad degradativa
3
2
1,397
1,029
0,936 0,909
1
0,683 0,527 0,466
0,3 0,208
0,214 0,11 0,078
0,088
0
B9.2 B1 B9.1 B15 B2 B35 B5 B12 B7 B24 B14 B10 B11
(alta AD) (alta AD) (alta AD) (alta AD) (media AD) (media AD) (media AD) (media AD) (baja AD) (baja AD) (baja AD) (baja AD) (baja AD)
Calificación de la actividad degradativa de las cepas bacterianas
Períodos de actividad degradativa (AD) Actividad emulsificante
Figura 5. Cepas baCterianas (100 μl) Con mayor aCtividad degradativa y emulsifiCante
Científica 7 (2), 2010 115

16. Pierina Elizabeth Guillén Zubiate, Juan Guerrero Barrantes
ARTÍCULOS ORIGINALES
Al consorcio bacteriano selecto se le aplicó la (H37, H26, H34, H38, H36 y H33) que no
técnica API 20 NE, identificándose solo cuatro presentaron ninguna reacción. Del genero
especies de cepas bacterianas: las especies Rhizopus, la cepa H39 tuvo baja actividad
Aeromonas salm. Masoucida/achromogenes degradativa, y nula actividad degradativa las
(cepa B1), Brevundimonas vesicularis (cepa cepas H33 y H38; y, del género Aspergillus
B9.2), Agrobacterium radiobacter (cepa B15) con baja actividad degradativa son las
y Burkholderia cepacia (cepa B5 y cepa B35). cepas H28 y H30 y, con nula actividad
degradativa, la cepa H36.
Se determinó también la actividad
degradativa de los hongos en medio de b. Prueba de campo
cultivo Bushnell Haas (BH) con borra, Prueba en terrarios
donde se registraron seis hongos (H27,
H28, H29, H30, H31 y H39) que presentaron Teniendo el TPH inicial y TPH final de las
una calificación baja, por presentar solo muestras de terrarios evaluadas se determinó
un período del proceso de desarrollo de el porcentaje de remoción del hidrocarburo
la actividad degradativa; y seis hongos (figura 6).
Porcentaje de remoción de TPH en cada terrario
80.00
75.00
70.00
65.00
60.00
55.00
50.00
45.00
40.00
35.00
30.00
25.00
20.00
15.00
10.00
5.00
0.00
Terrario N°1
Terrario N°1.1
Terrario N°2
Terrario N°2.1
Terrario N°3
Terrario N°3.1
Terrario N°4
Terrario N°4.1
Terrario N°5
Terrario N°5.1
Terrario N°6
Terrario N°6.1
Tratamientos de los terrarios
TPH inicial (g/kg) TPH final (g/kg) Límites aceites y grasas 5g/kg MEM Porcentaje de remoción
Figura 6. porcentaje de reMoción de tph en terrarios vs. norMativa peruana
El mayor porcentaje de remoción de TPH una temperatura termofílica similar. A los
se observó en los terrarios T5 (79%) y 30 días (primer volteo), la biopila control
T5.1 (75%), los cuales fueron inoculados (Co) tuvo la temperatura más alta de 69,8
con el consorcio bacteriano selecto. Los °C; a diferencia de las demás biopilas,
resultados fueron comparados con la que aumentaron su temperatura a los 52
normativa nacional vigente, con el criterio días (primer volteo), la biopila C1 a 58 °C
del nivel de saneamiento de 5.000 mg/kg de y la CB1 a 68,7 °C. A los 66 días (segundo
TPH (6). volteo) la temperatura bajó en la biopila Co
(45,7 °C) y a los 122 días alcanzó 23,2 °C.
Prueba de compost Las biopilas C1 y CB1 tuvieron una segunda
El tiempo del seguimiento, control y fase termofílica a los 87 días en la biopila
medición de la temperatura fue de 122 días. C1 (49,1 °C) y bajó más a los 101 días en la
biopila CB1 (39,8 °C). Luego, a los 120 días
En las biopilas Co, C1 y CB1: a los 15 días de la temperatura disminuyó más para las dos
compostado, las tres biopilas presentaron biopilas (figura 7).
116 Científica 7 (2), 2010

17. Identificación de bacterias nativas que degradan hidrocarburos: biorremediación en
suelos contaminados con «borras» mediante la técnica de compostaje
Valor observado de temperatura en la biopila control, biopila C1 y biopila CB1
80
70
Valor observado de temperatura
60
50
40
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130
Días de compostado
T promedio (C°) control Fase Termofílica T° prom. en C1 T° prom. en CB1
Figura 7. variaCión temporal de la temperatura en las biopilas Co, C1 y Cb1
En las biopilas Co, C2, CB2 y C3: a los 15 días volteo), en la biopila Co la temperatura llegó
de compostado, las biopilas presentaron una a 45,7 °C y luego bajó a 23,2 °C a los 122
temperatura termofílica similar. A los 30 días días. La biopila C2 a los 73 días presentó la
(primer volteo) la biopila control (Co) tuvo la segunda fase termofílica con una temperatura
temperatura más alta de 69,8 °C, seguida por de 47,67 °C y, la biopila C3, a 42,4 °C. A los
la biopila C2 (61,97 °C), y las demás biopilas 94 días, la biopila CB2 recién tuvo la fase
recién aumentaron su temperatura a los 38 termofilica con una temperatura de 47,7 °C.
días (primer volteo); en la biopila C3 (50,6 Luego, a los 120 días, la temperatura bajó
°C) y CB2 (52 °C). A los 66 días (segundo para las dos biopilas (figura 8).
Valor observado de temperatura en la biopila control, biopila C2, biopila CB2 y biopila C3
80
70
Valor observado de temperatura
60
50
40
30
20
10
0
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130
Días de compostado
T prom. (C°) control Fase Termofílica T° prom. en C2 T° prom. en CB2 T° prom. en C3
Figura 8. variaCión temporal de la temperatura en las biopilas C2, Cb2 y C3
Científica 7 (2), 2010 117

18. Pierina Elizabeth Guillén Zubiate, Juan Guerrero Barrantes
ARTÍCULOS ORIGINALES
La variación de pH durante los días de 85 días reveló un aumento en la densidad
compostado estuvo en el rango de 5,9 a poblacional de bacterias y una disminución
7,2 en las biopilas C1 y CB1; y de 5,9 a 7,5 en el nivel de TPH. El nivel de TPH alcanzó
en las biopilas C2, CB2 y C3. La variación niveles menores de 5.000 mg/kg de TPH a
de pH durante los días de compostado los 120 días (figura 8). Por tanto, se registró
presentó similares valores. La evaluación el porcentaje de remoción a los 120 días y
de TPH y de la densidad poblacional a los estuvo entre 98% a 99% de remoción del
hidrocarburo (figura 9).
Valor observado de TPH en cada biopila y el nivel de intervención de TPH del MEM
40000
35000
Valor observado de TPH
30000
25000
20000
15000
10000
5000
Biopila C Biopila CB1 Biopila C2 Biopila CB2 Biopila C3
Tipos de biopilas
31/03/2004 31 días 25/05/2004 86 días 28/06/2004 120 días Nivel de Intervención MEM
Figura 9. variación teMporaL de La concentración de tph en cada biopiLa de coMpostaje
Porcentaje de remoción de TPH en cada biopila
105%
100%
Porcentaje de Remoción
95%
90%
85%
80%
75 %
31 días 86 días 120 días
Tiempo del proceso de compost
Biopila C1 Biopila CB1 Biopila C2 Biopila CB2 Biopila C3
Figura 10. porcentaje de reMoción de tph en cada biopiLa
DISCUSIÓN requiere de una concentración mínima de
Se aislaron bacterias y hongos de tres microorganismos específicos degradadores
muestras de borra sólida, borra líquida 10 x 103 a 10 x 104 UFC/gr de suelo y de
y borra con arena, obtenidas de dos organismos heterótrofos totales de 10 x 105
pozas de hidrocarburos ubicadas por a 10 x 106 UFC/gr de suelo (7).
muchos años en la Refinería Conchán. La Para determinar si la bacteria puede
supervivencia de bacterias puras en la fase usarse en la biorremediación, se evaluó
de selección en condiciones de laboratorio la capacidad emulsificante y actividad
sugiere que poseen capacidad para utilizar degradativa mediante la prueba en medio
hidrocarburos alifáticos y aromáticos como Bushnell Haas (BH). En cuanto a su
donadores de electrones. En el caso de capacidad emulsificante, se obtuvieron
suelos contaminados con hidrocarburos, se cuatro mejores cepas bacterianas (cepas
118 Científica 7 (2), 2010

19. Identificación de bacterias nativas que degradan hidrocarburos: biorremediación en
suelos contaminados con «borras» mediante la técnica de compostaje
B9.2, B1, B9.1 y B15) con mayor actividad con la utilización de microorganismos
degradativa que también presentaron mayor autóctonos, previamente aislados desde el
actividad emulsificante, determinándose medio contaminado, para ser reintroducidos
cuantitativamente a través de la conversión masivamente (9).
de la absorbancia en unidades actividad
emulsificante/ml. Asimismo, se obtuvieron El incremento en la densidad poblacional
dos cepas del género Chryseomonas que se considera una medida indirecta de la
mostraron mejor actividad emulsificante actividad metabólica de la población (10,11),
con 0,51 y 0,48 UAE/ml respectivamente. debido a que los hidrocarburos constituyen
En la tesis «Aislamiento e Identificación la fuente de carbono necesaria para el
de cepas bacterianas biorremediadoras crecimiento microbiano, tal como lo señala
y su evaluación sobre suelo contaminado Viñas (9), quien evaluó la capacidad de
con petróleo crudo», de Prudencio (2002) degradación de hidrocarburos provenientes
(8), se obtuvieron seis cepas con valores del petróleo mediante la caracterización
mayores de UAE con tres cepas de Bacillus microbiológica, química y ecotoxicológica.
con 0,718; 0,679; 0,679 UAE/ml; una cepa La disminución del contenido de los
de Pseudomonas con 0,683 UAE/ml; hidrocarburos totales se corresponde con el
Acinetobacter con 0,707 UAE/ml y una cepa incremento de la densidad poblacional de los
no identificada con 0,683 UAE/ml. heterótrofos mesófilos en los tratamientos.
En nuestro trabajo se obtuvieron tres Es así que la densidad poblacional evaluada
cepas con valores mayores de actividad durante tres etapas del proceso de
emulsificante que fueron identificadas según compostaje permitió confirmar el aumento
su taxonomía: cepa de Brevundimonas poblacional de bacterias con la disminución
vesicularis (cepa B9.2) con 1,397 UAE/ de TPH a los 85 días de transcurrido el
ml; cepa Aeromonas salm. Masoucida/ proceso de compostaje.
achromogenes (cepa B1), con 1,029 UAE/ Se puede dar una aproximación según los
ml; y cepa Agrobacterium radiobacter (cepa resultados obtenidos en el presente trabajo:
B15), con 0,909 UEA/ml. Así como una cepa con la incorporación de 75 kg de borra para 1
no identificada (cepa B9.1), con 0,936 UAE/ m3 de biopila a los 120 días se obtuvo un nivel
ml. No se evaluó la actividad emulsificante de de TPH de 4.459 mg/kg, concentración que
los hongos porque no presentaron actividad está muy cerca de los niveles establecidos
degradativa en borras. por la normativa del MINEM. Es importante
De las 27 cepas bacterianas aisladas de la destacar que, si se utilizara mayor cantidad
borra se seleccionaron 13 cepas bacterianas en kilogramos de borra para un tratamiento
con mejor actividad degradativa y mediante compostaje, podría sobrepasar los
emulsificante, las cuales fueron sometidas a la límites establecidos por MINEM de 5.000
prueba de degradación de borras en terrarios mg/kg de TPH (6).
y a la prueba de degradación de borras con Con la prueba en terrarios se pudo determinar
compost, sin y con bioaumentación. que los niveles de hidrocarburos aromáticos
La prueba de los terrarios con arena policíclicos se encuentran presentes en
determinó la buena acción degradativa de cantidades muy altas, así como en la prueba
las 13 cepas bacterianas, que luego de 90 de compostaje se determinó que los niveles
días bajaron la concentración de TPH en la de metales pesados se encuentran presentes
arena. pero en pequeñas cantidades.
En esta investigación, la prueba de
compostaje que dio mejores resultados en CONCLUSIONES
la disminución de TPH fue por el método de 1. El recuento bacteriano presentó una
bioaumentación en compostaje. Al agregar dinámica poblacional distinta, en la
microorganismos exógenos provenientes muestra de borra líquida (superficie de la
especialmente de la borra líquida con poza de borra) con 1,00 x 105 hasta 1,83
una adecuada actividad degradativa y x 106 UFC/gr y en la muestra de borra
emulsificante, se estimuló que el consumo sólida (profundidad de la poza de borra)
del hidrocarburo fuera visible a los 31 días, con 7,30 x 105 hasta 1,74 x 106 UFC/gr.
y a los 86 días ya los niveles de TPH se
encontraron por debajo de los establecidos 2. La prueba de actividad degradativa para
por el Ministerio de Energía y Minas (MINEM). bacterias fue mayor cuando se inocularon
Por tanto, una aproximación muy interesante 100 µl de cepas bacterianas en medio
consistió en combinar la bioestimulación de cultivo Bushnell Haas, de las cuales
Científica 7 (2), 2010 119

20. Pierina Elizabeth Guillén Zubiate, Juan Guerrero Barrantes
ARTÍCULOS ORIGINALES
se seleccionaron 13 cepas bacterianas hidrocarburo y, en la prueba de terrarios,
con mayor actividad degradativa y a los 90 días solo se obtuvo entre 75 y
emulsificante (UAE) identificadas como 79% de remoción del hidrocarburo.
«consorcio bacteriano selecto».
6. En la prueba de terrarios no se logró
3. Se caracterizaron cuatro cepas disminuir, a los 90 días, los niveles de
bacterianas con la técnica API 20 NE TPH para obtener un saneamiento menor
y se las clasificó taxonómicamente: a los 5.000 mg/kg según la normativa
cepa de Brevundimonas vesicularis, peruana para suelos contaminados con
cepa Aeromonas salm. Masoucida/ TPH. Por tanto, el único terrario que
achromogenes, cepa Agrobacterium presentó una mayor disminución de TPH
radiobacter y la cepa Burkholderia fue el terrario T5 con 5.600 mg/kg, el cual
cepacia. Así como dos géneros de se inoculó con el consorcio bacteriano
hongos: Aspergillus y Rhizopus. selecto.
4. La prueba de terrarios y la prueba 7. En la prueba de compostaje, los niveles
de compostaje demostraron mayor de TPH disminuyeron a los 86 días en
degradación del hidrocarburo del suelo tres biopilas: la biopila CB1 (3.008 mg/
contaminado agregando el «consorcio kg), biopila C2 (3.879 mg/kg) y biopila
bacteriano selecto» a las muestras, CB2 (4.310 mg/kg), presentándose por
cuyos microorganismos fueron aislados debajo de los límites de aceites y grasas;
del mismo hidrocarburo «borra». y a los 120 días se logró alcanzar en
todas las biopilas evaluadas un nivel de
5. Utilizando el consorcio bacteriano saneamiento por debajo de 5.000 mg/
selecto se observó que, en la prueba kg para suelos contaminados con TPH
de compostaje, a los 86 días, se (MINEM).
obtuvo entre 95 y 99% de remoción del
120 Científica 7 (2), 2010

21. Identificación de bacterias nativas que degradan hidrocarburos: biorremediación en
suelos contaminados con «borras» mediante la técnica de compostaje
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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hidrocarburos empleando microorganismos: estudio a nivel de columnas. Lima: Universidad
Peruana Cayetano Heredia. Laboratorio de Biotecnología Ambiental; 1999.
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[Tesis de Maestría]. Lima: UNMSM; 1998.
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4. Belloso C, Carrario J, Viduzzi D. Biodegradación de hidrocarburo en suelos contaminados
en terrarios. En: XXVI Congreso Interamericano de Ingeniería Sanitaria y Ambiental; San
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5. Hueseman MH, More KO. The effects of oil type and loading, oxygen and commercial
bacteria on crude oil bioremediation. USA: CRC Press; 1994. p. 58-71.
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Ambiental para el manejo de desechos de las refinerías de petróleo. Vol. VII; 1994.
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de Hidrocarburos; 1995: 497-506.
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evaluación sobre suelo contaminado con petróleo crudo. [Tesis de Licenciatura en Biología].
Lima: Universidad Pedro Ruiz Gallo; 2002.
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microbiológica, química y ecotoxicológica. [Tesis doctoral]. Barcelona: Facultad de Biología.
Departamento de Microbiología; 2005.
10. Atlas R. Microbial degradation of Petroleum Hydrocarbons an Environmental Perspective.
American Society for Microbiology 1981; 45: 180-209.
11. Boopathy R. Factors limiting bioremediation technologies. Bioresource Technology 2000;
74: 63-77.
*trabajo de investigación presentado por pierina guiLLén zubiate para obtener eL grado de Magíster scientiae en ciencias
aMbientaLes. universidad nacionaL agraria La MoLina. escueLa de postgrado
juan guerrero
correspondencia: jguerrerob@LaMoLina.edu.pe
recepción: 02/08/2010
aceptación: 30/08/2010
Científica 7 (2), 2010 121

22. PURIFICACIÓN Y PROPIEDADES DE UNA
FOSFATASA ÁCIDA DE BAJO PESO MOLECULAR
DE HÍGADO DE ALPACA (Lama pacos)
PURIFICATION AND PROPERTIES OF A LOW MOLECULAR WEIGHT
ACID PHOSPHATASE FROM ALPACA LIVER (Lama pacos)
Emilio Guija Poma1*, Hielke Haak Mares†, Fernando Arauco Villar2
†
EstE trabajo sE publica como un homEnajE póstumo al Dr. hiElkE haak marEs, profEsor principal DE la
facultaD DE mEDicina DE la univErsiDaD nacional mayor DE san marcos. lima-pErú.
1*
univErsiDaD nacional mayor DE san marcos. facultaD DE mEDicina. cEntro DE invEstigación DE bioquímica y
nutrición. av. grau 755 lima-1 pErú.
2
univErsiDaD nacional mayor DE san marcos. facultaD DE mEDicina. uniDaD DE postgraDo.

23. Purificación y propiedades de una fosfatasa ácida de bajo peso molecular de hígado de alpaca (Lama pacos)
RESUMEN fosfatasas ácidas de cerdo (3), placenta
Se ha purificado 1.306 veces una fosfatasa humana (4), hígado de bovino (5), cerebro
ácida de bajo peso molecular de hígado de bovino (6), etc.
de alpaca. El procedimiento incluye Esta enzima se presenta en múltiples
fraccionamiento con sulfato de amonio, formas en un mismo tejido, las que difieren
tratamiento ácido, cromatografía de exclusión en razón de sus pesos moleculares
molecular y cromatografía de intercambio y propiedades cinéticas; así mismo,
iónico utilizando SE-sephadex. La enzima muestran especificidades distintas frente
purificada tiene un peso molecular de 16,4 a diversos sustratos. Se han separado
KDa, que se determinó utilizando electroforesis tres formas distintas de fosfatasa ácida
en gel de poliacrilamida en presencia de en hígado de bovino (5); de manera
dodecil sulfato de sodio. La enzima cataliza similar, se ha observado que el hígado de
preferencialmente el p-nitrofenil fosfato y humano contiene tres formas moleculares
muestra un pH óptimo de 5,0; el valor Km de fosfatasa ácida, habiéndose purificado
obtenido a pH 5,0 para el p-nitrofenil fosfato aquella de más bajo peso molecular (7).
fue de 4,0 x 10-5 M y de 1,1 x 10-3 M para Los iones metálicos afectan de una manera
el fenil fosfato. El magnesio, bario y cobalto muy diversa la actividad catalítica de estas
no afectaron significativamente la actividad enzimas; las fosfatasas ácidas de bajo peso
enzimática, pero la enzima fue fuertemente molecular son afectadas por reactivos de
inhibida por mercurio. grupos sulfhidrilo, en cambio, las fosfatasas
Palabras clave: fosfatasa ácida, ácidas de alto peso molecular son inhibidas
purificación, alpaca, hígado. por tartrato y fluoruro. Análogamente, el pH
ejerce efecto sobre el valor Km, el cual es
dependiente de la naturaleza del sustrato
ABSTRACT utilizado. En el presente trabajo se describe
la purificación de una forma de fosfatasa
A low molecular weight alpaca liver acid ácida de bajo peso molecular y algunas de
phosphatase has been purified 1.306-fold. sus propiedades cinéticas.
The procedure involves ammonium sulfate
fractionation, acid treatment, molecular
exclusion chromatography and SE-sephadex MATERIALES Y MÉTODOS
ion exchange chromatography.
Material biológico
The purified enzyme has a molecular weight
of 16,4 KDa as determined by polyacrilamide Se utilizó hígado de alpaca (Lama pacos) de
gel electrophoresis in the presence of animales sacrificados en el Camal Municipal
sodium dodecyl sulphate. The enzyme de Huancavelica, el que se sometió a una
catalyzes preferencially p-nitrophenyl inspección veterinaria macroscópica con el
phosphate and shows an optimum pH of propósito de detectar y descartar órganos
5,0; the Km value obtained at pH 5,0 for con anomalías patológicas; inmediatamente
p-nitrophenyl phosphate was 4,0 x 10-5 M después se procedió a la limpieza y
and 1,1 x 10-3 M by using phenyl phosphate debridación para eliminar la mayor parte del
as substrate. Magnesium, calcium, barium tejido conectivo y grasa, luego se congeló
and cobalto had no effect on the enzyme se trasladó a Lima y se guardó a una
activity significatively, but the enzyme was temperatura de -20 ºC.
strongly inhibited by mercury. Reactivos químicos
Key words: acid phosphatase, purification, El sulfato de amonio, sephadex G-75 (45-
alpaca, liver. 120), sulfoetil sephadex C-50, p-nitrofenol,
fenol, etilendiaminotetraacético (EDTA),
INTRODUCCIÓN D-glucosa-6-fosfato, D-fructosa-6-fosfato,
D,L-a-glicerolfosfato y seroalbúmina bovina
Las fosfatasas ácidas (fosfohidrolasas de se adquirieron de la Sigma Chemical
monoésteres ortofosfóricos EC 3.1.3.2.) Company; el p-nitrofenil fosfato (sal
son enzimas de amplia distribución en disódica), fenil fosfato (sal disódica), ácido
la naturaleza, que tienen la propiedad acético glacial, Folin-Ciocalteu, etanol
de hidrolizar una diversidad de ésteres absoluto, metanol y glicerol se compraron
monofosfóricos y de catalizar reacciones a la Merck Darmstadt. Todos los otros
de transfosforilación (1,2). Se han purificado reactivos fueron de grado analítico.
Científica 7 (2), 2010 123

24. Emilio Guija Poma, Hielke Haak Mares, Fernando Arauco Villar
ARTÍCULOS ORIGINALES
Medida de la actividad enzimática la albúmina sérica de bovino como
estándar. La presencia de proteínas en
La actividad de la enzima se determinó las fracciones que se colectaron de las
midiendo la liberación de p-nitrofenol columnas cromatográficas se evaluaron
utilizando como sustrato el p-nitrofenil fosfato. espectrofotométricamente midiendo la
El medio de ensayo, en un volumen de 2.0 mL absorción a 280 nm.
contenía 50 mmoles de tampón acetato de
sodio pH 5,0, EDTA 0,2 mmoles, p-nitrofenil Electroforesis en gel de poliacrilamida
fosfato 2 mmoles y enzima. La reacción se con SDS
realizó a 37 ºC durante 2 minutos y se detuvo
mediante la adición de 1 mL de NaOH 1 N. El La electroforesis se realizó utilizando un
p-nitrofenol liberado se midió a 400 nm en un sistema vertical en placa de acuerdo con
espectrofotómetro Gilford 240. Para realizar la técnica descrita por Laemmli (11). Las
los cálculos (6) se utilizó un coeficiente de concentraciones finales para el gel de
extinción molar de 1,8 x 104 M-1 cm-1. Bajo resolución fueron: acrilamida 15%, Tris-
estas condiciones experimentales, el sustrato HCl 1.5 M pH 8,8, SDS 0,4%, Temed
hidrolizado no excedió el 3%. Una unidad 0,05% y persulfato de amonio 0,0075%.
de actividad enzimática se define como El gel de stacking tenía las siguientes
la cantidad de enzima que libera 1 mmole concentraciones: acrilamida 3%, Tris-HCl
de p-nitrofenol por minuto. La actividad 0,125 M pH 6,8, SDS 0,1%, Temed 0,024%
específica se expresa como unidades de y persulfato de amonio 0,0075%. El tampón
actividad enzimática por mg de proteína. para los electrodos contenía: Tris-HCl 0,025
M, glicina 0,192 M y SDS 0,1% pH 8,3.
La actividad enzimática también se midió
utilizando como sustrato fenil fosfato. El Determinación del peso molecular de la
medio de ensayo en un volumen de 2 mL enzima
contenía 50 mmoles de acetato de sodio La determinación del peso molecular de
pH 5,0, EDTA 0,2 mmoles, fenil fosfato 10 la fosfatasa ácida se realizó en un gel de
mmoles y enzima. La medición se realizó resolución de manera similar al descrito
a 37 ºC y el tiempo de reacción fue de 10 anteriormente, habiéndose utilizado una
minutos, a cuyo término se detuvo la reacción concentración de acrilamida de 10% y
por adición de 1 mL de NaOH 1 N. El fenol un kit de proteínas estándar (Dalton Mark
liberado se midió a 290 nm y el coeficiente VI), lisozima de clara de huevo 14,3 KDa,
de extinción molar utilizado(8) para realizar b-lactoglobulina de leche de vaca 18,4
los cálculos fue de 2,52 x 103 M-1cm-1. KDa (subunidad), tripsinógeno de páncreas
Especificidad de sustrato de bovino 24 KDa, pepsina de mucosa
estomacal de cerdo 34,7 KDa, albúmina de
Se utilizaron diversos ésteres monofosfóricos huevo 45 KDa y albúmina de plasma bovino
a una concentración final de 2,0 x 10-3M, en 66 KDa.
un medio de ensayo que en un volumen
de 2,0 mL contenía 50 mmoles de tampón
acetato de sodio pH 5,0, EDTA 0,2 mmoles RESULTADOS Y DISCUSIÓN
y enzima, siendo la temperatura de 37 °C;
el tiempo de incubación fue de 20 minutos, Purificación de la fosfatasa ácida
con excepción del medio que contenía Para el proceso de purificación se pesaron
p-nitrofenil fosfato, que fue de 2 minutos. 250 g de hígado de alpaca y se homogenizaron
Las reacciones se detuvieron por adición con 4 volúmenes de tampón acetato de sodio
de 1 mL de ácido tricloroacético al 10% y 0,01 M pH 5,0, EDTA 0,001 M en un Waring
se midió el fosfato liberado (9), para cuyo Blendor, en 3 sesiones de 30 segundos con
propósito se midió una alícuota de 1,0 mL, 1 minuto de reposo en un cuarto frío a 4 ºC.
se añadieron 3,0 mL de agua y 4,0 mL del El homogenizado se centrifugó a 11.600 g
reactivo de color, se incubaron a 37 °C por durante 30 minutos utilizando una centrífuga
90 minutos, a cuyo término se leyeron a 820 refrigerada Sorvall RC-2B y al sobrenadante
nm en el espectrofotómetro, habiéndose resultante se le adicionó sulfato de amonio
preparado una curva estándar para realizar para llevarlo a un 25% de saturación; luego
los cálculos. se centrifugó a 11.600 g por 30 minutos y
Determinación de la concentración de el sobrenadante finalmente se llevó a 60%
proteína de saturación con sulfato de amonio y se
centrifugó como en el caso anterior. El
La determinación de proteína se realizó precipitado se suspendió con el tampón
por el método de Lowry (10), usando de homogenización y se ajustó el pH a 4,5
124 Científica 7 (2), 2010

25. Purificación y propiedades de una fosfatasa ácida de bajo peso molecular de hígado de alpaca (Lama pacos)
mediante la adición de ácido acético diluido; que la reacción para sulfato de amonio fue
se dejó agitando durante 30 minutos, a cuyo negativa, luego se procedió a centrifugar en
término se centrifugó de manera similar a la las condiciones antes descritas.
etapa anterior y el sobrenadante se llevó a
pH 5,0 con una solución diluida de hidróxido Se aplicó el sobrenadante de la etapa
de amonio. anterior a una columna de Sephadex G-75
(110 x 4,5 cm) previamente equilibrada
El sobrenadante anterior se llevó a 70% de con el tampón de homogenización, luego
saturación con sulfato de amonio y luego se se eluyó utilizando el mismo tampón de
centrifugó de manera análoga a las etapas elusión y se colectaron fracciones de 10 mL
anteriores. El precipitado se resuspendió en a las que se midió la actividad enzimática
el tampón de homogenización y se dializó y la presencia de proteínas a 280 nm. Se
con el mismo tampón durante 15 horas, juntaron las fracciones con significativa
cambiando de tampón tres veces, hasta actividad enzimática.
0.6 1.6
1.4
0.5
400 Mm Actividad Enzimática
1.2
0.4
1
200 Proteínas
0.3 0.8
0.6
0.2
D.O.
0.4
D.O.
0.1
0.2
0 0
480 540 600 660 720 780 840 900 960 1.020 1.080 1.140 1.200 1.260 1.320 1.380 1.440 1.500
450 510 570 630 690 750 810 870 930 990 1.050 1.110 1.170 1.230 1.290 1.350 1.410 1.470
Volumen mL
Figura 1. croMatografía en sephadex g-75
El volumen de elusión de la etapa anterior se una gradiente lineal de NaCl (0,0-0,2 M).
aplicó a una columna de sulfoetil sephadex De manera similar a la etapa anterior,
C-50 (4,0 x 1,1 cm) equilibrada previamente los tubos que mostraron alta actividad
con el tampón de homogenización el que enzimática se combinaron y se procedió
sirvió para eluir la muestra. Cuando la a concentrarlos. Este proceso se realizó
densidad óptica a 280 nm fue menor a 0,025 en dos etapas: primero se dializó contra
se aplicó una gradiente discontinua de el tampón de homogenización y se aplicó
fosfato en concentraciones comprendidas a una columna de sulfoetil sephadex C-50
entre 5 x 10-4 M y 1 x 10-2 M en tampón de (4,0-1,1 cm) equilibrada con el tampón
homogenización a pH 6,0; se colectaron de homogenización y se eluyó con NaCl
fracciones de 5 mL a las que se determinaron 0,2 M en el mismo tampón, colectándose
actividad enzimática y densidad óptica a las fracciones con elevada actividad
280 nm como en la columna anterior. Los enzimática; luego se sometió a un proceso
tubos que contenían razonable actividad de ultrafiltración usando presión positiva
enzimática se mezclaron y se llevaron a de nitrógeno en un aparato diseñado por
pH 5,0 mediante adición de ácido acético Amicon Corporation, utilizando para este
diluido. propósito el filtro UM 2, a fin de concentrar
la enzima a un volumen de 3 mL; todas las
El eluido de la etapa anterior se aplicó a etapas de purificación se realizaron a una
una columna de Sulfoetil sephadex C-50 temperatura no mayor de 4 ºC. Un resumen
(4,0 x 1,1 cm) equilibrada con tampón de la purificación de la enzima se muestra
de homogenización, luego se eluyó con en la tabla 1.
Científica 7 (2), 2010 125