Examen microscópico de bacterias utilizando coloraciones simples y diferenciales

UNIVERSIDAD NACIONAL DEL SANTA
FACULTAD DE INGENIERIA
E.A.P AGROINDUSTRIAL
EXAMEN MICROSCOPICO DE LAS BACTERIAS

CURSO

: MICROBIOLOGÍA GENERAL

GRUPO

: “B”

DOCENTE

:Blgo.Mblgo. Eterio Alva Muñoz

CÓDIGO

: 0201212051

INTEGRANTES

:VEGA VIERA JHONAS ABNER.

CICLO:

“IV”

NUEVO CHIMBOTE - PERÚ

2013

FACULTAD DE INGENIERÍA AGROINDUSTRIAL

EXAMEN MICROSCOPICO DE LAS BACTERIAS
I. INTRODUCCION
El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de ver
con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre la
célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste es la
utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos
diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes
celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de
actividad respiratoria, etc.
Las células generalmente son tratadas para coagular el protoplasma antes de teñirlas,
proceso llamado fijación. Para bacterias, la fijación por el calor es lo más corriente,
aunque también puede fijarse con sustancias químicas como formaldehido, ácidos y
alcoholes. Después de la fijación, si se añade el colorante, no se producen ulteriores
cambios estructurales en el protoplasma. La fijación se realiza habitualmente en
células que han sido fijadas sobre un portaobjetos, tratando después éste con el
agente fijador, y siguiendo inmediatamente el proceso de tinción. La fijación produce
habitualmente el encogimiento de las células; la tinción, por el contrario, hace que las
células aparezcan mayores que lo que son realmente, de manera que las medidas de
las células que han sido fijadas o teñidas no pueden realizarse con mucha precisión.
La mayoría de los colorantes son compuestos orgánicos que tienen alguna afinidad
específica por los materiales celulares. Muchos colorantes utilizados con frecuencia
son moléculas cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con
los constituyentes celulares cargados negativamente, tales como los ácidos nucleicos
y los polisacáridos ácidos. Ejemplos de colorantes catiónicos son el azul de metileno,
el cristal violeta y la safranina. Otros colorantes son moléculas cargadas
negativamente (aniones) y se combinan con los constituyentes celulares cargados
positivamente, tales como muchas proteínas. Esos colorantes incluyen la eosina, la
fucsina ácida y el rojo Congo. Otro grupo de colorantes son sustancias liposolubles;
los colorantes de este grupo se combinan con los materiales lipídicos de la célula,
usándose a menudo para revelar la localización de las gotículas o depósitos de grasa.
Un ejemplo de colorante liposoluble es el negro Sudán.
Algunos colorantes teñirán mejor sólo después de que la célula haya sido tratada con
otra sustancia química, que no es un colorante por sí mismo. Esta sustancia se
denomina mordiente; un mordiente habitual es el ácido tánico. El mordiente se
combina con un constituyente celular y lo altera de tal modo que ahora sí podrá
atacar el colorante.


Si se desea simplemente incrementar el contraste de las células para la microscopía,
son suficientes los procedimientos simples de tinción. El azul de metileno es un buen
colorante simple que actúa sobre todas las células bacterianas rápidamente y que no
produce un color tan intenso que oscurezca los detalles celulares. Es especialmente
útil para detectar la presencia de bacterias en muestras naturales, puesto que la
mayor parte del material no celular no se tiñe.

II. OBJETIVOS
GENERAL
Observar las formas y estructuras de las bacterias a través de muestras directas y
de cultivo, utilizando coloraciones, simples, diferenciales y estructurales.
ESPECIFICO
Observar las formas fundamentales de las bacterias.
Descubrir las técnicas de coloración simple y diferenciales.
Identificar colonias bacterianas en forma macroscópica.
Observar estructuras bacterianas por técnicas de coloración específicas.


III.

MATERIAL Y METODOS
3.1.

MATERIAL
3.1.1. Cultivos Puros
Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis, Klebsiella sp. Eschirichia
coli

3.1.2. Muestras
Sarro dental
Mucosa labial
Cerumen
3.1.3. Material de vidrio
Laminas cubreobjetos
Laminas portaobjetos
Tubos de ensayo
Placas petri


3.1.4. Equipos
Microscopioóptico de luz

3.1.5. Otros
Coloraciones simples: azul de metileno, cristal violeta,
safranina, verde de malaquita, ácido pícrico, fucsina
acida.
Coloraciones compuestas: set de coloración Gram, set de
coloraciones Zhiel Neelsen.
Coloraciones estructurales: coloración de Wirtz,
coloración de Maneval.
Aceite de cedro.
Asa bacteriológica, mecheros con ron de quemar,
fosforo, etc.


3.2.

METODO: (PROCEDIMIENTO)
3.2.1. COLORACION SIMPLE
Son técnicas en la que se emplea un solo colorante, por ejemplo,
coloración en azul de metileno, con el violeta de genciana, la
fucsina fenicada básicas, el ácido pícrico, etc. Y se utiliza para
determinar formas bacterianas sin distinción de grupos.
Hacer un de la muestra en lámina portaobjetos con
ayuda del asa bacteriológica y agua destilada o solución
salina fisiológica (SSF).
Fijar el frotis por exposición al calor suave cerca del
mechero o a temperatura ambiente.
Teñir con cualquiera de los colorantes, proporcionado en
los materiales, por un tiempo recomendado por
especialistas (generalmente varía entre 0.5 a 5 minutos).
Lavar con agua de caño a chorro suave (de preferencia
agua destilada), para eliminar el exceso de colorante.
Secar el preparado a calor suave o al medio ambiente
(lograr que le secado sea uniforme en toda la lámina),
para no tener interferencias en la observación.
Observa a menor o mayor aumento, teniendo en cuenta
que la lámina este bien seca, sobre todo cuando se utiliza
lente de inmersión. En este último caso usar aceite de
cedro.

Resultados:
Las bacterias se observan de color azul si se colorea con azul de
metileno. Si se colorea con fucsina fenicada el procedimiento es el
mismo solo varia el colorante, las bacterias se observan de color
rojo.

3.2.2. COLORACIONES DIFERENCIALES
Son las coloraciones que se emplean más de un colorante y se
utilizan para colorear las paredes celulares de las bacterias.
Ej. Coloración Gram., Coloración Ziehl Neelsen.


COLORACION GRAM
Fue creada por Christian Gram, estudiante danés, entre 1884 y 1886.
Se utiliza para diferenciar a las bacterias de acuerdo a la composición
química de su pared celular en dos grupos: Gram positivas y Gram
negativas.

Procedimiento.
1. Realizar la extensión de la muestra.
2. Secar la muestra a temperatura ambiente o al calor.
3. Cubrir la muestra con la solución fenicada de violeta de genciana o
la de Hucker, por un tiempo de 30 a 6ª segundos,
aproximadamente.
4. Lavar con agua a chorro.
5. Cubrir con Lugol y dejarlo actuar de 2 a 3 minutos.
6. Lavar con agua de caño a horro suave.
7. Decolorar con alcohol acetona hasta que ya no se desprenda más
colorante de la lámina.
8. Lavar con agua a chorro suave.
9. Contrastar con safranina de 10 a 30 segundos.
10. Lavar, secar y observar a inmersión.
Resultados:
-

Bacterias color violeta: Gram positivos.
Bacterias color rosado: Gram negativos.


Los gérmenes Gram positivos son aquellos en los cuales se ha formado
el complejo Cristal – Violeta – Yodo (CVI). Y, no son decolorados por el
alcohol acetona, manteniendo por lo tanto la coloración violeta.
Los gérmenes Gram positivos son aquellos en los cuales no se forma
complejo Cristal – Violeta – Yodo (CVI). Y, son decolorados por el
alcohol acetona, y al quedar sin coloración están aptos para ser teñidos
por la safranina.
En términos generales, en microbiología clínica, son Gram positivos
todos los cocos a excepción de la neiserias, y son Gram negativos
todos los bacilos a excepción de los esporulados, los micobacterias y
los corinebacterias.
La técnica original de Gram ha sufrido diversas modificaciones, pero su
fundamento sigue siendo el mismo.
Una de las modificaciones consiste en el empleo de la safranina como
colorante de fondo en lugar del Zhiel.

COLORACION ZIEHL NEELSEN
Se utiliza para colorear a las micobacterias o llamadas también bacilos
ácidos alcohol resistentes (b.a.a.r) ya que estos al poseer ácidos
micolicos (ceras) como componentes de su pared celular, hacen que
sea difícil la coloración con el Gram, haciéndose necesario el uso del
mechero y mediante la emisión de vapores se permita el ingreso del
colorante de Ziehl (fucsina fenicada básica). La coloración Ziehl
Neelsen se puede realizar de dos maneras en caliente (técnica más
usual) o en frio (tinción de Kinyoun), que es más simple y rápida que el
método caliente. Facilita
Además el examen de gran número de muestras (por ejemplo, en las
encuestas epidemiológicas). Sin embargo, se utiliza una cantidad
considerable de fucsina fenicada, para el trabajo habitual, en un
laboratorio general, es más adecuado el método caliente.
El bacilo causante de la tuberculosis en el ser humano puede ser de dos
tipos: bacterias típicas (Mycobacterium tuberculosis) o bacterias
atípicas. Estos bacilos son resistentes a los ácidos; es decir, una vez que
se han teñido de rojo con la fucsina fenicada no se pueden decolorar
por medio del alcohol acido.


La fucsina fenicada básica tiñe de rojo todos los microorganismos que
se encuentran en el esputo.
Al alcohol acido realiza la decoloración de todos los microorganismo y
elementos celulares, exceptuando los bacilos alcohol resistentes
(bacilos de la tuberculosis).
El azul de metileno tiñe de azul todos los microorganismos y
decolorados por el alcohol acido, pero los bacilos acido alcohol
resistente se conservan teñidos de rojo.
Al realizar esta coloración se hace necesario aplicar medidas de
bioseguridad como es el uso de los barbijos durante todo el proceso de
coloración. Se puede remplazar el uso del asa bacteriológica por un
abate lenguas.

Procedimiento
1. Realizar la extensión del frotis con el asa bactereologica o con un
abate lenguas.
2. Secar a temperatura ambiente o al calor.
3. Cubrir con el colorante de Ziehl de 3 a 5 minutos.
4. Colocar el mechero de alcohol por debajo de las láminas
preparadas y observar la emisión de vapores 3 o 5 veces.
5. Decolorar con alcohol acido.
6. Lavar con agua a chorro
7. Agregara azul de metileno (colorante de contraste) durante 30
segundos.
8. Lavar, secar y observar a inmersión.
Resultados:
-

Las micobacterias se ven de color rojo sobre un fondo azul.


3.2.3. COLORACIONES ESTRUCTURALES
Son aquellos en los que se utilizan 1 o más colorantes y se
realizan para observar las estructuras bacterianas, como son:
flagelos, capsulas, esporas y corpúsculos metacromaticos.
Coloración de flagelos
1. Se deposita una gota de suspensión bacteriana en una lámina
portaobjetos.
2. Se agrega colorante de Leiffson y se deja durante 5 minutos hasta
que el alcohol se evapore.
3. Lavar con agua, secar y observar a inmersión.
Resultados:
-

El flagelo se observa de un color rojo a negruzco.

Coloración de capsula (Método de Maneval)
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Realizar la extensión de la muestra en la lámina portaobjetos.
Secar.
Agregar una gota de rojo de Congo.
Agregar un colorante de Maneval durante 1 minuto.
Lavar con agua destilada y evitar que la suspensión se despegue.
Secar y observar a inmersión.

Resultado:
-

El cuerpo bacteriano de color rojo, capsula y fondo azul.

Coloración de esporas (Método de Wirtz)
1.
2.
3.
4.
5.
6.

Hacer la extensión de la muestra y fijarla al calor.
Añadir verde de malaquita.
Calentar hasta desprender vapores por 3 o 4 veces.
Lavar.
Agregar safranina como colorante de contraste.
Lavar, secar y observar a inmersión.

Resultado:
-

Espora de color verde y cuerpo bacteriano de color rojo.


Coloración de corpúsculos metacromaticos (Método de Loeffler)
1.
2.
3.
4.

IV.

Realizar la extensión de la muestra y fijarla al calor.
Cubrir con colorante de Loeffler durante 3 minutos.
Lavar con agua destilada.
Secar y observar a inmersión.

RESULTADOS
 EscherichiaColi
Para visualizar la E. Coli se utilizó la tinción Gram, al ser Gram la capa
de péptido glicano que posee es demasiado delgada como para poder
retener el complejo de cristal violeta/yodo que se formó previamente,
y por lo tanto este complejo se escapa, perdiéndose la coloración azulviolácea

 Bacilo Miliar
Para la visualización de esta bacteria, al ser también una bacteria bacilo
pulmonar se utilizó la tinción de ZiehlNeelsen, ya que la paredes de esta
bacteria contiene ácidos grasos (ácidos micolicos) es decir son b.a.a.r.

 StaphylococcusAureus

Habiendo realizado frotis teñidos con Gram, los estafilococos aparecen (el
color muestra su pared Gram positiva) como cocos Gram positivos. Son
cocos Gram-positivos con forma de racimos cuando crecen en medio agar
y aparecen solos, en pares, en cadenas cortas, en pequeños grupos
cuando se aíslan de muestras clínicas.

 Bacilo Pulmonar

Para la visualización de esta bacteria se utilizó la tinción de ZiehlNeelsen,
ya que las paredes de esta bacteria contiene ácidos grasos (ácidos
micólicos) es decir son b.a.a.r.


V.

CUESTIONARIO
1. Fundamento de la coloración de Gram y de Zhiel Neelsen.
FUNDAMENTO DE LA TINCIÓN DE GRAM
La afinidad gram positiva o negativa depende de la composición
química de la pared celular en la parte de su estructura física
Después de las primeros 4 pasos, al observar al microscopio todo se ve
violeta.
Luego del decolorante algunas conservan su color mientras que otras
se decoloran.
Las violetas son Gram positivas, las que pierden su color son Gram
negativas, pues los decolorantes orgánicos utilizados abren poros de la
membrana externa de las bacterias Gramnegativas (principalmente de
lipoproteínas y lipopolisacáridos), permiten la salida del colorante
principal; al agregar el contracolor éstos quedan rojos.
La técnica de Gram se fundamenta en la diferencia existente entre los
microorganismos que poseen pared celular y los que no. Las bacterias
que poseen pared celular y una gruesa capa de peptidoglicano (Gram
+), y las que no poseen pared celular, pero sí una segunda membrana y
una capa delgada de peptidoglicano (Gram -) logran teñirse de violeta,
pero sólo las Gram negativas reaccionan por la acción de un
decolorante, debido a su estructura menos rígida. Al terminar el
procedimiento, se pueden identificar y diferenciar los que son Gram +
(violeta) de los Gram – (rosa) dependiendo de la coloración que tengan
los microorganismos.


FUNDAMENTO DE LA COLORACIÓN DE ZIEHL-NEELSEN
Se basa en que ciertos microorganismos no son desteñidos con alcohol
ácido si han sido previamente teñidos con fucsina fenicada. A estos
microorganismos se denominan ácido-alcohol resistente. Una vez realizada
la decoloración con esta mezcla se utiliza un colorante de contraste (azul de
metileno) para poder observar las células sensibles a la decoloración con
alcohol ácido. Son microorganismos ácido-alcohols resistentes las
Micobacterias, debido a la composición de su pared celular (tiene ácidos
micólicos). Esta tinción tiene interés desde el punto de vista del diagnóstico
clínico puesto que algunos microorganismos patógenos son ácido-alcohol
resistentes, tales como Mycobacterium tuberculosis (tuberculosis) o M.
Leprae (lepra).
La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que el
colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al suspender el
calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva solidificación de los
ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de las bacterias.
Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía cinética de las moléculas
del colorante lo cual también facilita su entrada a las bacterias. Las
bacterias que resisten la decoloración son de color rojo y la que no se ven
de color azul.
Esta técnica esta especialmente diseñada para bacterias acido alcohol
resistente como:
* Mycobacterium tuberculosis
* Micobacterias atípicas.
* MycobacteriumLeprae.
* Mycobacterium Boris.
* Nocardiaasteroides.
* Nocardiabrasiliensis.
* Corynebacteriumamicolatum.


2. ¿Se pueden reemplazar los colorantes e contrastes en las diversas
coloraciones?


No, ya que los exámenes están adaptados para poder observar cada
microorganismo como por ejemplo, en el examen microscópico
directo de las muestras clínicas no se

utiliza ningún tipo

decolorante, las muestras se extiende directamente sobre la
superficie de un porta objetos para su observación. El material que es
demasiado espeso para permitir la diferenciación de sus elementos
puede diluirse con igual volumen de solución salina fisiológica estéril.


En cambio en el examen microscópico de las muestras clínicas
levemente modificadas se utiliza un solo colorante, por lo que todas
las estructurascelulares se tiñen con la misma tonalidad (Tinta china,
AzulMetileno de Loeffler, Azul de lactofenol).



Otra técnica de tinción que permite identificar las cápsulas
bacterianas es el método de Hiss. En el cual se utilizan los mismos
reactivos que en el método de Anthony, pero que se diferencia de este
último porque en el primero es necesario fijar la muestra.

Las técnicas de tinción, en general, matan los microorganismos y no
permiten apreciar la morfología de la célula viva. No permite observar la
movilidad de los microorganismos vivos, dato que en ocasiones tiene
interés analítico. Es imposible observar determinados fenómenos
microscópicos, tales como división celular (células animales, levaduras,
etc.) o formación de esporas.


3. ¿Qué sucede en la coloración de esporas y en la de Zhiel Neelsen se
obvia el calentamiento por tres veces consecutivas?
La coloración clásica de Ziehl-Neelsen requiere calentamiento para que
el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene ceras. Al
suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva
solidificación de los ácidos grasos de modo que el colorante ya no puede
salir de las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energía
cinética de las moléculas del colorante lo cual también facilita su
entrada a las bacterias. Las bacterias que resisten la decoloración son de
color rojo y las que no, se ven de color azul ya que se utiliza azul de
metileno como tinción de contraste.
Si se obviara el calentamiento en esta coloración y en la de esporas este
proceso no podría realizarse y no se observaría la presencia de
bacterias que es lo que se busca con dichas coloraciones.
4. ¿Qué sucedería si la lámina portaobjetos al término de la
coloración hay presencia de gotas de agua?


Permite que los rayos luminosos tengan menos desviaciones
cuando pasen del portaobjetos a los lentes del microscopio.
Cuando cruzan el aire se distorsiona mucho la imagen (le llaman
"aberraciones"). Los microscopios con objetivo de inmersión
utilizan una gota de aceite especial.



Al concluir el proceso de coloración, la lámina se debe colocar de
canto para que se escurra, ya que debe tenerse en cuenta que el
agua y en especial el agua destilada, es un agente decolorante,
por lo que si se deja sobre el portaobjetos después de teñirlo
demasiado tiempo quita parte del colorante y esto nos perjudica
al momento de ver los resultados


VI.

CONCLUSION.

Las bacterias son muy complejas y cada una de sus especies se diferencia de
las otras tanto en los compuestos que emplea para conseguir su energia
como en sus estructuras, las cuales tienen rasgos distintos que le dan
ventajas frente a condiciones específicas, algunas mucho más adaptadas
que otras. Ya que cada una de ellas presenta características específicas los
seres humanos nos hemos visto en la necesidad de implementar distintos
métodos para reconocerlas según su comportamiento estructural frente a
diversos colorantes como los utilizados en cada uno de los procesos
realizados en las prácticas de los laboratorios anteriores en las cuales se
utilizaron distintos colorantes ( safranina, verde malaquita, tinta china)
para identificar la clasificación de la bacteria, en los resultados obtenidos
en los diferentes procesos observamos que hay muchos tipos de
estructuras en la bacterias como lo son las esporas y las capsulas,
aprendiendo mediante estos resultados que rasgos toman las distintas
bacterias ante un agente colorante y frente a cada proceso ya que debido a
su estructura o composición química son capases de asimilar o repeler los
distintos colorantes que se utilizan en este tipo de estudio dándonos así
datos importantes los cuales permiten reconocer y actuar con mayor
eficacia frente a estos microorganismos.
También aprendimos a reconocer los distintos tipos grupos de bacterias
como las grandes negativas, gran positivas, alcohol resistente entre otras.
Por ende también aprendimos a reconocer si era un coco o bacilo que
fueron las formas más observadas atreves del microscopio. En estas
prácticas de laboratorio conocimos los distintos agares en los cuales
podemos hacer una siembra de bacterias el proceso que hay que llevar
acabo si queremos aislar bacterias formadoras de esporas y su respectivo
método para identificarlas.


VII.

BIBLIOGRAFÍA

http://espanol.answers.yahoo.com/question/index?qid=20100325085215AA
2AQDW
http://es.answers.yahoo.com/question/index?qid=20080204090441AAAyrxd
http://www.joseacortes.com/practicas/frotisbact.htm
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm
http://es.answers.yahoo.com/question/index?qid=20110420085349AABYEk
0
https://www.google.com.pe/search?q=Cultivos+Puros&tbm=isch&tbo=u&so
urce=univ&sa=X&ei=Da1cUvH3AYn28wSduIG4Dw&ved=0CD4QsAQ&biw.
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