PCT

1. PERCOBAAN 4.1
ANALISIS KUALITATIF DAN KUANTITATIF SEDIAAN FARMASI
DENGAN METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI
I. Tujuan Percobaan
1. Dapat melakukan analisis kualitatif tablet parasetamol dengan metode
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.
2. Dapat melakukan analisis kuantitatif tablet parasetamol dengan metode
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi.
3. Dapat menyimpulkan mutu sediaan tablet parasetamol dengan data
kromatogram dan hasil penetapan kadar.
II. Teori Dasar
KCKT adalah instrument untuk pemisahan sejumlah senyawa organik,
anorganik, maupun senyawa biologis, analisis ketidak murnian ( impurities)
dan analisis senyawa-senyawa yang tidak mudah menguap (nonvolatil).
KCKT paling sering digunakan untuk menetapkan kadar senyawa-senyawa
tertentu seperti asam-asam amino,asam-asam nukleat dan protein-protein
dalam cairan fisiologis, menentukan kadar senyawa-senyawa aktif obat dan
lain-lain. Beberapa senyawa organik yang mudah terurai (labil) pada
pemanasan dapat dianalisis dengan cara kromatografi cairan kinerja tinggi
atau HPLC karena HPLC dilakukan pada suhu kamar. Selain senyawa
organic teknik HPLC juga dapat menganalisis senyawa anorganik, cuplikan
yang mempunyai berat molekul tinggi atau titik didihnya tinggi seperti
polimer. Kelebihan KCKT antara lain:
- Mampu memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran.
- Resolusinya baik.
- Kecepatan analisis dan kepekaannya tinggi.
- Dapat dihindari terjadinya dekomposisi/kerusakan bahan yang dianalisis.
- Dapat digunakan bermacam-macam detector.
- Kolom dapat digunakan kembali.

2. - Instrumennya memungkinan untuk bekerja secara automatis dan
kuantitatif .
- Waktu analisis umumnya singkat.
- Kromatografi cair preparatif memungkinkan dalam skala besar.
- Ideal untuk molekul besar dan ion.
- Dapat dilakukan pada suhu kamar
- Mudah dioperasikan secara otomatis.
(Putra, Effendy De Lux. 2004:8)
Keterbatasan metode KCKT adalah untuk identifikasi senyawa, kecuali
jika KCKT dihubungkan dengan spektrometer massa (MS). Keterbatasan
lainnya adalah jika sampelnya sangat kompleks, maka resolusi yang baik sulit
diperoleh. Berikut skema kerja alat yang digunakan dalam HPLC
Larutan sampel yang akan dianalisis diinjeksi kemudian sampel akan
turun ke dalam kolom dan di elusi oleh eluen yang disediakan. Lalu detector
akan mendeteksi waktu retensi dalam bentuk kromatogram. Dari
kromatogram itu kita dapat meganalisis sampel.
HPLC memiliki kekuatan pemisahan yang sangat ampuh bahkan untuk
komponen-komponen yang berhubungan sangat erat; pemisahan penukar ion
yang sukses dari logam tanah yang langka dan asam-asam amino telah
memperlihatkan ini. Komposisi fase gerak dalam HPLC memberikan suatu
dimensi untuk memanipulasi eksperimen yang tidak dijumpai dalam
kromatografi gas. Dalam kromatografi gas faktor pemisahan untuk sepasang

3. komponen sampel tergantung pada sifat dasar stationer, sedangkan dalam
HPLC faktor itu juga bergantung pada fase gerak. Seringkali pelarut
campuran merupakan fase gerak yang lebih baik daripada cairan murni untuk
memisahkan campuran yang rumit dan pengoptimasian komposisi pelarut
dengan cara coba-coba dapat menjadi lebih rumit.
Pemilihan detektor pada HPLC umumnya didasarkan pada persyaratan
sensitivitas, jenis senyawa yang ada di dalam sampel dan faktor lainnya
seperti biaya. Detector yang paling umum didasarkan pada indeks bias dan
eluat kolom, karena hampir semua zat terlarut akan menghasilkan larutan
dengan indeks bias yang berbeda dengan indeks bias pelarut murni.
Pada dasarnya instrumen HPLC terdiri dari tandon (reservoir) cairan fase
gerak, pompa, injector, kolom, detektor dan rekorder.
1. Tandon (Reservoir)
Reservoir yang baik disertai degessing system yang berfungsi untuk
mengusir gas-gas terlarut dalam solvent. Degassing dilakukan dengan
mengalirkan gas inert dengan kelarutan yang sangat kecil, misalnya
helium. Degassing dapat juga dibuat sendiri dengan erlermeyer yang
dilengkapi dengan pengaduk magnet, pemanas dan pompa vacum.
2. Pompa
Fungsi pompa adalah untuk memompa fase gerak (solvent) ke dalam
kolom dengan aliran yang konstan dan reproducible. Pompa harus
memenuhi persyaratann seperti dapat memberi tekanan sampai 6000 psi
(360 atm), tekanan yang dihasilkan bebas pulsa, dapat mengalirkan fase
gerak dengan kecepatan 0,1 sampai 10 ml/ menit, dapat mengalirkan fase
gerak dengan reprodusibilitas yang tinggi, tahan terhadap korosi (biasanya
terbuat dari baja atau teflon). Ada beberapa jenis pompa, antara lain :
a. Reciprocating pump
b. Displacement Pump
c. Pneumatic Pump
3. Katup Injector

4. Bagian ini merupakan tempat dimana sampel diinjeksikan untuk
selanjutnya dibawa oleh fase gerak ke dalam kolom.
4. Kolom (Column)
Kolom merupakan jantung dari HPLC, sebab kunci keberhasilan analisis
sangat tergantung pada efisiensi kolom sebagai alat untuk memisah-
misahkan senyawa dalam campuran yang kompleks. Kolom terbuat dari
stainless steel yang dibor halus atau dari gelas. Ada dua jenis packing
kolom yang telah digunakan dalam kromatografi cair. yaitu berupa partikel
porous dan partikel pelliculer.
5. Detektor
Setelah sampel melewati kolom maka komponen-komponennya akan
terpisah-pisah dan keluar dari kolom dengan waktu yang berbeda-beda.
Komponen yang sudah terpisah ini secara berturut-turut akan melewati
suatu detektor dan akan dibaca kadarnya. Detektor yang digunakan harus
sesuai dengan jenis zat yang dianalisis.
a. Detektor UV
Prinsip kerja detektor ini adalah spektrophotometri abssorbsi. Sampel
yang dianalisis harus menyerap sinar UV. Panjang gelombang sinar
UV yang biasa digunakan adalah 254 nm.
b. Detektor Fluoresensi
Prinsip kerja detektor ini adalah spektrophotometri. Detektor ini lebih
sensitif daripada detektor UV. Pemakaian sumber sinar laser akan
memberikan sensitivitas yang sangat tinggi. Derivatisasi sering
dilakukan terhadap asam amino.
c. Detektor Indeks Refraksi (Refraksi Index Detector = RID)
Detektor ini bekerja atas dasar perbedaan indeks refraksi sampel
dengan solvent. Semua larutan suatu zat mempunyai indeks bias yang
spesifik, oleh karena itu detektor ini dapat digunakan untuk hampir
semua zat.
6. Recorder

5. Hasil pembacaan detektor kemudian diolah oleh suatu processor kemudian
dikirim ke recorder. Recorder akan membuat suatu tampilan. Dalam
kromatografi tampilan ini disebut chromathogram. Untuk HPLC
dilengkapi seperangkat software yang dapat menghitung luas
kromatogram dan bahkan sekaligus menghitung kadarnya.
HPLC sering digunakan antara lain untuk menetapkan kadar senyawa aktif
pada obat, produk hasil samping proses sintesis, atau produk- produk
degradasi dalam sediaan farmasi. Keterbatasan metode HPLC ini adalah untuk
identifikasi senyawa, kecuali jika HPLC dihubungkan dengan spektometer
massa (MS). Keterbatasan lainnya adalah sampel sangat kompleks maka
resolusi yang baik sulit diperoleh.
Parasetamol adalah senyawa yang memiliki sifat polar dan gugus
kromofor yang dimilikinya menyebabkan senyawa ini dapat menyerap sinar
UV. Karakteristik senyawa ini memungkinkan analisis dengan teknik HPLC
menggunakan kolom nonpolar seperti C-18 dan fasa gerak polar seperti
methanol/ air. Parasetamol diabsorbsi cepat dan sempurna melalui saluran
cerna. Konsentrasi tertinggi plasma dicapai dalam waktu ½ jam dan masa
paruh plasma antara 1-3 jam. Obat ini tersebar ke seluruh tubuh. Dalam
plasma, 25% parasetamol terikat protein plasma. Parasetamol digunakan
sebagai analgesik dan antipiretik.
III. Data Fisik dan Kimia
a. Parasetamol (Acetaminophen)
 Rumus molekul :
 Warna : Putih
 Rasa : Pahit
 Bau : -
 Pemerian : Hablur atau serbuk hablur
 Kelarutan : Larut dalam air mendidih dan dalam natrium
hidroksida 1N, mudah larut dalam etanol.
 Berat molekul : 151,16 g/mol

6.  Bobot jenis : 1,293 g/cm3
 pH larutan : 5-7
 Stabilitas : Pada suhu > 40C mudah terdegradasi
 Titik leleh : 169-172C
 Penyimpanan : Dalam wadah tertutup rapat, tidak tembus cahaya.
 Fungsi : Analgetik, antipiretik.
(Farmakope Indonesia Edisi IV hal. 649 & MSDS Acetaminophen
ScienceLab.com Chemicals and Laboratory Equipment)
b. Metanol
 Rumus molekul : CH4OH
 Pemerian : Cairan tidak berwarna, tidak berasa
 Titik didih : 64,5C
 Bobot jenis : 0,7915 g/cm3
 Berat molekul : 32,04 g/mol
 Kerapatan : 1,11
 Titik beku : -98C
 Viskositas : 0,55 Cp
 Perhatian : Dapat menyebabkan iritasi pada mata, kulit, rasa
terbakar, inflamasi, kerusakan kornea, mudah terbakar dan bersifat
toksik.
(MSDS Methanol ScienceLab.com Chemicals and Laboratoty
Equipment))
c. Aqua Bidestilasi
 Pemerian : Cairan jernih tidak berbau, tidak berasa
 pH : 7
 Titik didih: 100C
 Titik beku: 0C
 Stabilitas : Produk yang stabil
 Inkompatibilitas : -
(MSDS H2O ScienceLab.com Chemicals and Laboratory Equipment)

7. IV. Alat dan Bahan
Bahan Alat
- Tablet Parasetamol
- Metanol Pro HPLC
- Aquabidestilata
- Baku pembanding parasetamol
- HPLC Agillent
- Labu takar
- Pipet
- Vial
- Membran filter PTFE 0,45 m
- Detektor UV 243 nm
- ODS
V. Prosedur Kerja
Sistem Kromatografi
Fase Diam : ODS, packing L1
Fase Gerak : Air : Metanol 3:1 (v/v)
Laju Alir : 1,5 ml/menit
Lempeng teoritis : 1000
Tailing factor : maksimal 2
Detektor : UV 243 nm
Uji Kesesuaian Sistem
Larutan standar diinjeksikan berturut-turut sebanyak 7 kali ke dalam
instrumen KCKT, selanjutnya luas area, waktu retensi, faktor ikutan dihitung
nilai simpangan baku relatifnya. Uji kesesuaian sistem dinyatakan memenuhi
syarat jika nilai SBR < 2,0%.
Analisis Kualitatif
Larutan Standar
25 mg baku pembanding parasetamol ditimbang ke dalam labu takar 50 ml
kemudian diencerkan dengan fase gerak hingga tanda batas. Larutan dikocok
hingga homogen. Sebanyak 1 ml larutan dipipet ke dalam labu takar 10 ml
dan diencerkan dengan fase gerak hingga tanda batas. Larutan disaring

8. dengan membran filter PTFE 0,45 m ke dalam vial. Larutan siap
diinjeksikan ke dalam instrumen KCKT.
Larutan Uji
4 tablet parasetamol ditimbang lalu diserbukkan. Kemudian 50 mg serbuk
parasetamol ditimbang dan dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml.
Sebanyak 50 ml fase gerak ditambahkan ke dalam labu takar berisi serbuk
parasetamol lalu dikocok hingga homogen. Kemudian larutan diencerkan
dengan fase gerak hingga tanda batas. Sebanyak 2 ml larutan dipipet ke dalam
labu takar 25 ml dan diencerkan dengan fase gerak hingga tanda batas.
Larutan disaring dengan membran filter PTFE 0,45 m ke dalam vial. 2 ml
filtrat awal dibuang. Larutan hasil filtrasi siap diinjeksikan ke dalam
instrumen KCKT.
Maisng-masing larutan standar dan larutan uji diinjeksikan ke dalam
instrumen KCKT. Kromatogram yang terbentuk direkam dan dibandingkan
antara kromatogram larutan standar dan larutan uji. Waktu retensi puncak
larutan uji harus sama dengan waktu retensi puncak larutan standar.
Analisis Kuantitatif
Larutan Standar
25 mg baku pembanding parasetamol ditimbang ke dalam labu takar 50 ml
kemudian diencerkan dengan fase gerak hingga tanda batas. Larutan dikocok
hingga homogen (larutan stok baku pembanding). Serangkaian pengenceran
dibuat untuk kurva kalibrasi. Sebanyak 0,2; 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 dan 1,2 ml
larutan stok pembanding dipipet ke dalam labu takar 10 ml dan diencerkan
dengan fase gerak hingga tanda batas. Larutan disaring dengan membran
filter PTFE 0,45 m ke dalam vial. Larutan siap diinjeksikan ke dalam
instrumen KCKT. Konsentrasi masing-masing larutan kurva kalibrasi
dihitung.
Larutan Uji

9. 4 tablet parasetamol ditimbang lalu diserbukkan. Kemudian 50 mg serbuk
parasetamol ditimbang dan dimasukkan ke dalam labu takar 100 ml.
Sebanyak 50 ml fase gerak ditambahkan ke dalam labu takar berisi serbuk
parasetamol lalu dikocok hingga homogen. Kemudian larutan diencerkan
dengan fase gerak hingga tanda batas. Sebanyak 2 ml larutan dipipet ke dalam
labu takar 25 ml dan diencerkan dengan fase gerak hingga tanda batas.
Larutan disaring dengan membran filter PTFE 0,45 m ke dalam vial. 2 ml
filtrat awal dibuang. Larutan hasil filtrasi siap diinjeksikan ke dalam
instrumen KCKT.
Cara Kurva Kalibrasi
Masing-masing serangkaian konsentrasi larutan standar dan larutan uji
diinjeksikan ke dalam instrumen KCKT. Luas area masing-masing larutan
standar dan larutan uji kromatogram dicatat kemudian dibuat persamaan garis
dengan kurva kalibrasi. Kadar larutan sampel dihitung.
Metode One Point
Luas kromatogram salah satu larutan pembanding diambil kemudian dihitung
kadar larutan sampelnya menggunakan metode One Point.
𝐶𝑢 =
𝐿𝑢
𝐿𝑠
𝑥 𝐶𝑠
VI. Hasil Pengamatan dan Perhitungan
Konsentrasi larutan stok baku pembanding parasetamol
25 𝑚𝑔
50 𝑚𝑙
=
25 𝑚𝑔
0,05 𝐿
= 500 𝑝𝑝𝑚
Konsentrasi larutan uji
Larutan 0,2 ml
V1 . M1 = V2 . M2
0,2 . 500 = 10 . M2
M2 = 10 ppm
Larutan 0,4 ml
V1 . M1 = V2 . M2
0,4 . 500 = 10 . M2
M2 = 20 ppm
Larutan 0,6 ml Larutan 0,8 ml

10. V1 . M1 = V2 . M2
0,6 . 500 = 10 . M2
M2 = 30 ppm
V1 . M1 = V2 . M2
0,8. 500 = 10 . M2
M2 = 40 ppm
Larutan 1,0 ml
V1 . M1 = V2 . M2
1,0 . 500 = 10 . M2
M2 = 50 ppm
Larutan 1,2 ml
V1 . M1 = V2 . M2
1,2 . 500 = 10 . M2
M2 = 60 ppm
a. Uji kesesuaian sistem
Penyuntikan Luas Area (Auc/Voltz) Waktu Retensi
1 39018837 3,783
2 39347640 3,740
3 39773472 3,713
4 39429424 3,690
5 40040691 3,687
6 39818200 3,673
7 40068274 3,680
Rata-rata 39642363 3,709429
SD 389264,89 0,039652
SBR 0,9819417 % 1,068953 %
b. Uji Kualitatif
Kromatogram Larutan Standar

11. Kromatogram Sampel Uji
Waktu retensi sampel uji tablet parasetamol (3,633 menit) mendekati nilai
waktu retensi larutan standar (3,783 menit).
c. Uji Kuantitatif
Konsentrasi (ppm) Luas Area (Auc/Voltz)
10 11567757
20 14719539
30 18640502
40 30642229
50 38088918
60 45449769

12. Kadar parasetamol dalam tablet parasetamol (Cara kurva kalibrasi)
Y1 = bx + a
29233045 = 718628,3029x + 1366131,4
718628,3029x = 29233045 - 1366131,4
718628,3029x = 27866913,6
x = 38,778 ppm
% konsentrasi
𝑥
𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑡𝑖𝑚𝑏𝑎𝑛𝑔 𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒𝑡
𝑥 100%
38,778
62,025
𝑥 100% = 62,521 %
Y2 = bx + a
27961457 = 718628,3029x + 1366131,4
718628,3029x = 27961457 - 1366131,4
718628,3029x = 26595325,6
x = 37,008 ppm
% konsentrasi
𝑥
𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑡𝑖𝑚𝑏𝑎𝑛𝑔 𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒𝑡
𝑥 100%
37,008
61,85
𝑥 100% = 59,835 %
Kadar parasetamol dalam tablet parasetamol (Metode One Point)
Diambil konsentrasi 60 ppm
Sampel Uji Tablet 1
𝐶𝑢 =
𝐿𝑢
𝐿𝑠
𝑥 𝐶𝑠
𝐶𝑢 =
29233045
45449769
𝑥 60
𝐶𝑢 = 38,591 𝑝𝑝𝑚
Sampel Uji Tablet 2
𝐶𝑢 =
𝐿𝑢
𝐿𝑠
𝑥 𝐶𝑠
𝐶𝑢 =
27961467
45449769
𝑥 60
𝐶𝑢 = 36,913 𝑝𝑝𝑚
y = 718628x + 1E+06
R² = 0.9675
0
10000000
20000000
30000000
40000000
50000000
0 20 40 60 80
AxisTitle
Axis Title
Kurva Kalibrasi Sampel Uji Tablet Prasetamol
Series1
Linear (Series1)

13. % konsentrasi
𝑥
𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑡𝑖𝑚𝑏𝑎𝑛𝑔 𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒𝑡
𝑥 100%
38,591
62,025
𝑥 100% = 62,218 %
% konsentrasi
𝑥
𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑡𝑖𝑚𝑏𝑎𝑛𝑔 𝑡𝑎𝑏𝑙𝑒𝑡
𝑥 100%
36,913
61,85
𝑥 100% = 59,681 %
VII.Pembahasan
Pada percobaan kali ini dilakukan analisis kualitatif dan kuantitatif
terhadap tablet parasetamol dengan menggunakan Kromatografi Cair Kinerja
Tinggi. Analisis ini bertujuan untuk mengetahui mutu sediaan dari tablet
parasetamol. Prinsip kerja dari KCKT adalah pemisahan suatu senyawa
berdasarkan sifat kepolarannya. Sistem kromatografi yang digunakan pada
percobaan ini yaitu fase balik, dimana fase diam yang digunakan bersifat non
polar sedangkan fase geraknya bersifat polar. Fase diam yang digunakan
adalah ODS atau Okta Desil Silica. ODS merupakan kolom berisi silika yang
bersifat polar yang kemudian ditambahkan 18 atom C sehingga ODS bersifat
non polar. ODS banyak digunakan karena mampu memisahkan senyawa dari
tingkat kepolaran terendah hingga tertinggi. ODS digunakan karena
parasetamol bersifat polar sehingga senyawa parasetamol tidak akan tertahan
pada fase diam tetapi ikut keluar bersama fase gerak yaitu metanol : air.
Pengujian tablet parasetamol diawali dengan penginjeksian sampel uji
yang telah disaring dengan membran filter PTFE, penyaringan ini dilakukan
agar tidak terjadi penyumbatan didalam kolom. Dengan bantuan pompa
bertekanan tinggi, sampel masuk ke dalam kolom. Di dalam kolom,
komponen-komponen sampel dipisahkan berdasarkan kepolarannya.
Parasetamol yang bersifat polar akan keluar lebih dulu bersama fase gerak,
dan eksipien lain yang bersifat non polar akan tertahan di dalam kolom.
Pada pengujian ini detektor yang digunakan adalah detektor UV 243 nm
karena parasetamol memiliki gugus kromofor yang dapat terbaca oleh
detektor UV. Panjang gelombang yang digunakan 243 nm karena merupakan
panjang gelombang maksimal dari parasetamol, dimana pada panjang

14. gelombang maksimal, kepekaannya juga maksimal dan memenuhi hukum
Lambert-Beer, selain itu jika dilakukan pengulangan maka kesalahannya akan
kecil.
Dari hasil pengamatan, nilai SBR pada uji kesesuaian sistem telah
memenuhi syarat yaitu <2 %. Pada SBR luas area didapat nilai 0,982 % dan
pada waktu retensi 1,069 %. Hal ini menunjukkan bahwa sistem kromatografi
telah siap digunakan. Dari hasil perhitungan kadar dengan menggunakan
kurva kalibrasi yang dilakukan secara duplo, didapat kadar sampel sebesar
62,…. % dan 59,….% sedangkan dengan cara One Point didapat kadar
sampel sebesar 62,…. % dan 59,….%. Berdasarkan Farmakope Indonesia IV,
kadar parasetamol dalam tablet tidak boleh < 90% dan >110%, hal ini berarti
kadar parasetamol dalam tablet parasetamol tidak memenuhi syarat. Hal ini
disebabkan :
- Kondisi alat yang digunakan yang telah digunakan berulang kali.
- Kemungkinan tablet parasetamol yang sudah kadaluarsa.
- Kemungkinan penyimpanan tablet yang tidak baik sehingga, kadar
parasetamol terdegradasi dan teroksidasi karena paparan cahaya.
- Adanya kontaminasi selama pengerjaan.
Dilihat dari kromatogram yang terbentuk, terdapat tailing factor dari setiap
konsentrasi. Tailing factor ini disebabkan oleh beberapa faktor antara lain:
1. Guard column yang sudah mulai rusak.
2. Fase gerak yang sudah mulai rusak.
3. Partikel silika yang dipakai di dalam bahan pendukung bukanlah partikel
silika yang baik.
4. Adanya komponen lain yang keluar tepat setelah peak.
5. Sampel bereaksi dengan gugus silanol pada partikel silika.
6. pH fase gerak yang tidak tepat.
7. Pemilihan kolom yang tidak teapat dengan senyawa yang menjadi target
analisa.
8. Pelarut yang digunakan untuk melarutkan sampel tidak kompatibel dengan
fase gerak.

15. ONE POINT SAMA KALIBRASI
KELEBIHAN KEKUKRANGAN UV SAMA HPLC