Ce diaporama a bien été signalé.
Nous utilisons votre profil LinkedIn et vos données d’activité pour vous proposer des publicités personnalisées et pertinentes. Vous pouvez changer vos préférences de publicités à tout moment.
Εφαρμογή της νέας τεχνολογίας στα ανοσολογικά εργαστήρια Μοριακές τεχνικές Βασιλική Κίτσιου Τμήμα Ανοσολογίας-Ιστοσυμβατότ...
<ul><li>δεοξυριβονουκλεικό οξύ ( DNA ) αποτελεί  ένα τεράστιο σε μέγεθος μόριο  </li></ul><ul><li>βρίσκεται στον πυρήνα τω...
Μέθοδοι απομόνωσης γονιδιακού  DNA <ul><li>ηλεκτροφόρηση εναλ λ ασσόμενου ηλεκτρικού πεδίου (ενιαίο μόριο ) </li></ul><ul>...
Δείγματα   για απομόνωση  DNA <ul><li>ολικό αίμα  </li></ul><ul><li>buffy coat </li></ul><ul><li>ιστός </li></ul><ul><li>κ...
Μέθοδοι απομόνωσης γονιδιακού  DNA <ul><li>γενικά η απομόνωση  DNA  από τα κύτταρα μπορεί να διακριθεί σε τέσσερα στάδια: ...
Μέθοδοι απομόνωσης γονιδιακού  DNA <ul><li>Η απομόνωση περιλαμβάνει:  </li></ul><ul><li>τη  διάσπαση των πρωτεϊνών  με πρω...
Η επιλογή της μεθόδου γίνεται με βάση: <ul><li>την ποσότητα του  DNA </li></ul><ul><li>το μοριακό βάρος και μέγεθος του  D...
A πομόνωση γονιδιακού  DNA  από περιφερικό αίμα  (με φαινόλη και χλωροφόρμιο) <ul><li>η απομόνωση του  DNA  με διαδοχικές ...
Απομόνωση γονιδιακού  DNA  (με ισοθειοκυανική γουανιδίνη) <ul><li>Η  αρχή της μεθόδου  βασίζεται :   </li></ul><ul><li>κατ...
Απομόνωση γονιδιακού  DNA  από περιφερικό αίμα  (με χρήση κεκορεσμένου διαλύματος  NaCl) <ul><li>οσμωτική λύση των ερυθροκ...
Απομόνωση γονιδιακού  DNA  ( gDNA )   από περιφερικό αίμα με τη χρήση σφαιριδίων ( SiO 2 ): μαγνήτη σε αναλογία 1 : 1 <ul>...
ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ ( Polymerase Chain Reaction - PCR ) <ul><li>DNA  πολυμεράση </li></ul><ul><li>μικρά ποσά  ...
1983  Karry Mullis 1993 Nobel  Χημείας
ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ ( Polymerase Chain Reaction - PCR ) <ul><li>μικροποσότητες  DNA  μπορούν γρήγορα και επανα...
τι περιλαμβάνει μια  PCR; <ul><li>DNA template </li></ul><ul><li>primers </li></ul><ul><li>dNTPs </li></ul><ul><li>Taq pol...
<ul><li>DNA template </li></ul><ul><li>primers </li></ul><ul><li>dNTPs </li></ul><ul><li>Taq polymerase </li></ul><ul><li>...
<ul><li>DNA template </li></ul><ul><li>primers </li></ul><ul><li>dNTPs </li></ul><ul><li>Taq polymerase </li></ul><ul><li>...
τι περιλαμβάνει μια  PCR; <ul><li>DNA template </li></ul><ul><li>primers </li></ul><ul><li>dNTPs </li></ul><ul><li>Taq pol...
τι περιλαμβάνει μια  PCR; <ul><li>DNA template </li></ul><ul><li>primers </li></ul><ul><li>dNTPs </li></ul><ul><li>Taq pol...
τι περιλαμβάνει μια  PCR; <ul><li>DNA template </li></ul><ul><li>primers </li></ul><ul><li>dNTPs </li></ul><ul><li>Taq pol...
τι περιλαμβάνει μια  PCR; <ul><li>DNA template </li></ul><ul><li>primers </li></ul><ul><li>dNTPs </li></ul><ul><li>Taq pol...
στόχος πολλαπλασιασμού ( DNA template ) <ul><li>DNA </li></ul><ul><li>RNA   DNA </li></ul><ul><li>50-1500 βάσεις </li></ul>
εκκινητές ( primers) <ul><li>o λιγονουκλεοτίδια μονής έλικας συμπληρωματικά του 5΄ ή 3΄άκρου της αλληλουχίας που θέλουμε ν...
δεοξυνουκλεοτίδια ( dNTPs) <ul><li>20-200 μΜ </li></ul><ul><li>dATP ,  dTTP , </li></ul><ul><li>dGTP ,  dCTP </li></ul><ul...
DNA polymerase <ul><li>Taq p ο lymerase </li></ul><ul><li>θερμοάντοχο ένζυμο </li></ul><ul><li>Thermus aquarius </li></ul>...
ρυθμιστικό διάλυμα   (buffer solution) <ul><li>παρέχει το κατάλληλο περιβάλλον   </li></ul><ul><li>(pH 8 , 3  έως 8,9) </l...
ιόντα μαγνησίου ( Mg2+ ) <ul><li>η παρουσία   τους επιδρά  </li></ul><ul><li>-στην σύνδεση των εκκινητών  </li></ul><ul><l...
Polymerase Chain Reaction <ul><li>25-40   θερμικοί κύκλοι </li></ul><ul><li>denaturation step </li></ul><ul><li>στάδιο απο...
PCR - SSOP (Polymerase Chain Reaction-Sequence   Specific   Oligonucleotide   Probes ) <ul><li>Η τεχνική αυτή βασίζεται : ...
Τεχνικές υβριδισμού <ul><li>1.  Κλασικός υβριδισμός  ( forward SSOP)  </li></ul><ul><li>T ο  προϊόν  της  PCR   ακινητοποι...
reverse-PCR-SSOP <ul><li>είναι μία διαδικασία  ανάστροφου υβριδισμού  ( reverse hybridization)   με γραμμικούς ανιχνευτές ...
reverse-PCR-SSOP <ul><li>Το προιόν της  PCR   αποδιατάσσεται  με χημικό τρόπο,ακολουθεί  υβριδοποίηση  ( blotting)  των μο...
reverse-PCR-SSOP <ul><li>Η αξιολόγηση γίνεται με βάση το  υπόδειγμα  ( pattern )  των ανιχνευτών που έδωσαν θετική αντίδρα...
PCR - SSOP (Polymerase Chain Reaction-Sequence   Specific   Oligonucleotide   Probes ) <ul><li>Εφαρμογές </li></ul><ul><li...
τυποποίηση  PCR - SSOP  με  τεχνολογία  BEADS   ARRAY  και χρήση ΑΝΑΛΥΤΗ ΡΟΗΣ  ( LUMINEX ) <ul><li>Είναι μία  αυτοματοποιη...
μικροσφαιρίδια πολυστυρενίου επικαλυμένα με δύο φθοριοχρώματα   φλουρεσκεϊνης
τεχνική <ul><li>Πολλαπλασιασμός με  βιοτυλιωμένα   primers   ειδικά για κάθε αλληλόμορφο. </li></ul><ul><li>Αποδιάταξη  γι...
 
<ul><li>Εφαρμογές :   </li></ul><ul><li>τυποποίηση των  HLA  αλληλίων  </li></ul><ul><li>μέτρηση ϊικού φορτίου  </li></ul>...
PCR-SSP (specific sequence primers) <ul><li>Αρχή   της   μεθόδου </li></ul><ul><li>ένας εκκινητής με πλήρως συμπληρωματική...
PCR-SSP (specific sequence primers) <ul><li>Διαδικασία της μεθόδου (ΙΙ) </li></ul><ul><li>τα πολλαπλασιασμένα τμήματα του ...
PCR-SSP (specific sequence primers) <ul><li>αξιολόγηση  </li></ul><ul><li>λαμβάνονται υπόψη οι θετικές αντιδράσεις (παρουσ...
PCR-SSP (specific sequence primers) <ul><li>εφαρμογές:   </li></ul><ul><li>τυποποίηση HLA τάξης Ι και ΙΙ γονιδίων </li></u...
n ested - PCR <ul><li>τα υπό εξέταση νουκλεϊνικά οξέα  </li></ul><ul><li>βρίσκονται σε μικρή ποσότητα στο δείγμα  </li></u...
n ested - PCR <ul><li>Αρχή της μεθόδου </li></ul><ul><li>συνίσταται σε δύο διαδοχικές αντιδράσεις PCR, όπου το προϊόν της ...
n ested - PCR <ul><li>Εφαρμογές:   </li></ul><ul><li>σε περιπτώσεις όπου το υπό εξέταση υλικό είναι πολύ λίγο ή αυτό που α...
reverse transcriptase-PCR  ή  RT-PCR <ul><li>με την κλασική τεχνική της PCR μπορεί κανείς να μελετήσει το DNA, αλλά όχι το...
quantitative PCR  ( Q - PCR ) <ul><li>αναπτύχθηκε με σκοπό να ξεπεραστεί η βασική αδυναμία της παραδοσιακής  PCR , η οποία...
quantitative PCR  ( Q - PCR ) <ul><li>competitive PCR </li></ul><ul><li>real time PCR </li></ul>
a νταγωνιστική  PCR (competitive) <ul><li>προτύπο ποσοτικοποίησης ( QS ) </li></ul><ul><li>δεύτερη αλληλουχία  DNA  ή  RNA...
a νταγωνιστική  PCR (competitive) <ul><li>το πρότυπο ποσοτικοποίησης ενσωματώνεται σε κάθε δείγμα σε ένα γνωστό αριθμό αντ...
real time   PCR (qRT-PCR) <ul><li>η πιο ακριβής μεθολογία   </li></ul><ul><li>το κύριο χαρακτηριστικό αυτής της μεθόδου εί...
real time   PCR (qRT-PCR) <ul><li>επιτρέπει τον  ποσοτικό προσδιορισμό  του DNA ή του RNA  σε ένα δείγμα, είτε από έναν πλ...
a νίχνευση του προϊόντος ( qRT) 1 .  Μη ειδικές :  οι οποίες περιλαμβάνουν  DNA  δεσμευτικές βαφές   και μπορούν να χωριστ...
quantitative PCR <ul><li>εφαρμογές:   </li></ul><ul><li>ποσοτικοποίηση της έκφρασης γονιδίων </li></ul><ul><li>microarray ...
τεχνική ανάλυσης την νουκλεοτιδικής αλληλουχίας ( DNA Sequencing ) <ul><li>η πληρέστερη ανάλυση ενός κλωνοποιημένου κομματ...
DNA sequencing Μέθοδος κατά  MAXAM  &  GILBERT  (Χημική) <ul><li>διαδικασία της μεθόδου (Ι) </li></ul><ul><li>το τμήμα του...
DNA sequencing Μέθοδος κατά  MAXAM  &  GILBERT  (Χημική) <ul><li>διαδικασία της μεθόδου (ΙΙ) </li></ul><ul><li>ως αποτέλεσ...
DNA sequencing μέθοδος κατά  Sanger  (Ενζυμική) <ul><li>η  μέθοδος εκλογής  γιατί χρησιμοποιεί λιγότερα χημικά τοξικά και ...
DNA sequencing μέθοδος κατά  Sanger  (Ενζυμική) <ul><li>διαδικασία (Ι) </li></ul><ul><li>πραγματοποιούνται παράλληλα τέσσε...
DNA sequencing μέθοδος κατά  Sanger  (Ενζυμική) <ul><li>διαδικασία (ΙΙ) </li></ul><ul><li>καθώς αρχίζει ο πολυμερισμός του...
automated DNA sequencing <ul><li>σήμερα χρησιμοποιούνται ευρέως συστήματα αυτόματης ανάλυσης της νουκλεοτιδικής αλληλουχία...
automated DNA sequencing <ul><li>χρησιμοποιούνται 4 διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές, μια για κάθε βάση </li></ul><ul><l...
DNA sequencing <ul><li>εφαρμογές: </li></ul>τυποποίηση των  HLA  αντιγόνων ( Sequence Based Typing-SBT)
 
automated DNA sequencing <ul><li>χρησιμοποιούνται 4 διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές, μια για κάθε βάση </li></ul><ul><l...
PCR-SSP (specific sequence primers) <ul><li>Διαδικασία της μεθόδου (Ι) </li></ul><ul><li>a πομόνωση του χρωμοσωμιακού DNA ...
<ul><li>Taq polymerase </li></ul><ul><li>καταλύουν τη σύνθεση δίκλωνου  DNA  από μονόκλωνο </li></ul><ul><li>δεν μπορούν ν...
Prochain SlideShare
Chargement dans…5
×

Εφαρμογή της νέας τεχνολογίας στα ανοσολογικά εργαστήρια

6 196 vues

Publié le

Εφαρμογή της νέας τεχνολογίας στα ανοσολογικά εργαστήρια

Publié dans : Santé & Médecine
  • Dating direct: ♥♥♥ http://bit.ly/2F7hN3u ♥♥♥
       Répondre 
    Voulez-vous vraiment ?  Oui  Non
    Votre message apparaîtra ici
  • Sex in your area is here: ❶❶❶ http://bit.ly/2F7hN3u ❶❶❶
       Répondre 
    Voulez-vous vraiment ?  Oui  Non
    Votre message apparaîtra ici

Εφαρμογή της νέας τεχνολογίας στα ανοσολογικά εργαστήρια

  1. 1. Εφαρμογή της νέας τεχνολογίας στα ανοσολογικά εργαστήρια Μοριακές τεχνικές Βασιλική Κίτσιου Τμήμα Ανοσολογίας-Ιστοσυμβατότητας ΓΝΑ «Ο Ευαγγελισμός»
  2. 2. <ul><li>δεοξυριβονουκλεικό οξύ ( DNA ) αποτελεί ένα τεράστιο σε μέγεθος μόριο </li></ul><ul><li>βρίσκεται στον πυρήνα των κυττάρων </li></ul><ul><li>γενετικές πληροφορίες για την ανάπτυξη και τη λειτουργία όλων των γνωστών οργανισμών. </li></ul><ul><li>δυσκολία στην απομόνωση </li></ul><ul><li>μέθοδοι έκλουσης </li></ul><ul><li>τεχνικές πολλαπλασιασμού </li></ul>
  3. 3. Μέθοδοι απομόνωσης γονιδιακού DNA <ul><li>ηλεκτροφόρηση εναλ λ ασσόμενου ηλεκτρικού πεδίου (ενιαίο μόριο ) </li></ul><ul><li>για χρήση PCR ( μήκος < 1 kb) </li></ul>ανάλογα με το μέγεθος του DNA που θέλουμε να προκύψει από την απομόνωση
  4. 4. Δείγματα για απομόνωση DNA <ul><li>ολικό αίμα </li></ul><ul><li>buffy coat </li></ul><ul><li>ιστός </li></ul><ul><li>κύτταρα </li></ul><ul><li>εγκληματολογικό υλικό : </li></ul><ul><li>κηλίδα αίματος , </li></ul><ul><li>επίχρισμα βλεννογόνου, </li></ul><ul><li>δείγματα σάρωσης, </li></ul><ul><li>τρίχα, νύχι, </li></ul><ul><li>τσίχλα , αποτσίγαρα κτλ </li></ul>
  5. 5. Μέθοδοι απομόνωσης γονιδιακού DNA <ul><li>γενικά η απομόνωση DNA από τα κύτταρα μπορεί να διακριθεί σε τέσσερα στάδια: </li></ul><ul><li>απομόνωση των εμπύρηνων κυττάρων </li></ul><ul><li>λύση του κυττάρου </li></ul><ul><li>αφαίρεση των πρωτεϊνών και των μολυσματικών παραγόντων </li></ul><ul><li>ανάκτηση του DNA </li></ul>
  6. 6. Μέθοδοι απομόνωσης γονιδιακού DNA <ul><li>Η απομόνωση περιλαμβάνει: </li></ul><ul><li>τη διάσπαση των πρωτεϊνών με πρωτεολυτικά ένζυμα (πρωτεϊνάση Κ) </li></ul><ul><li>εκχύλισή τους με οργανικούς διαλύτες (φαινόλη και χλωροφόρμιο) ή με διαλύματα υψηλής ιοντικής ισχύος (μεγάλη συγκέντρωση NaCl ) </li></ul><ul><li>κατακρήμνιση του DNA σε διαλύματα αλκοόλης (70%) παρουσία άλατος </li></ul>
  7. 7. Η επιλογή της μεθόδου γίνεται με βάση: <ul><li>την ποσότητα του DNA </li></ul><ul><li>το μοριακό βάρος και μέγεθος του DNA </li></ul><ul><li>την καθαρότητα του DNA </li></ul><ul><li>τον διαθέσιμο χρόνο </li></ul><ul><li>την ευκολία της τεχνικής ή της μεθόδου απομόνωσης του DNA </li></ul><ul><li>το κόστος απομόνωσης </li></ul>
  8. 8. A πομόνωση γονιδιακού DNA από περιφερικό αίμα (με φαινόλη και χλωροφόρμιο) <ul><li>η απομόνωση του DNA με διαδοχικές εκχυλίσεις με οργανικούς διαλύτες (φαινόλη και χλωροφόρμιο) αποτελεί την κλασσική μέθοδο απομάκρυνσης των πρωτεϊνών από το DNA </li></ul><ul><li>με τη μέθοδο αυτή προκύπτει DNA μεγάλου μοριακού μεγέθους (100-150 Kb ) κατάλληλο για υβριδισμό κατά Southern blot αλλά και για PCR </li></ul><ul><li>το DNA που απομονώνεται είναι σταθερό στους 4 ˚ C για μεγάλο χρονικό διάστημα </li></ul>
  9. 9. Απομόνωση γονιδιακού DNA (με ισοθειοκυανική γουανιδίνη) <ul><li>Η αρχή της μεθόδου βασίζεται : </li></ul><ul><li>κατεργασία των δειγμάτων με ισοθειοκυανική γουανιδίνη για απομάκρυνση του DNA και πρόσδεσή του, σε προσροφητικό υλικό Celite </li></ul><ul><li>το σύμπλοκο DNA - Celite διαχωρίζεται από τις πρωτεΐνες του δείγματος με επανειλημμένες πλύσεις </li></ul><ul><li>τ o DNA εκλούεται από τον Celite μετά από επώαση με ρυθμιστικό διάλυμα Tris , στους 56 ˚ C </li></ul><ul><li>Κύρια πλεονεκτήματα της μεθόδου αποτελούν η αξιοπιστία και η επαναληψιμότητα </li></ul>
  10. 10. Απομόνωση γονιδιακού DNA από περιφερικό αίμα (με χρήση κεκορεσμένου διαλύματος NaCl) <ul><li>οσμωτική λύση των ερυθροκυττάρων και συλλογή των εμπύρηνων λευκών </li></ul><ul><li>επώαση με διάλυμα SDS 10% και πρωτεϊνάσης Κ στους 56 ˚ C </li></ul><ul><li>απομάκρυνση των πρωτεϊνών και της πρωτεϊνάσης Κ παρουσία κεκορεσμένου διαλύματος NaCl </li></ul><ul><li>κατακρήμνιση του ευρισκόμενου στο υψηλής συγκέντρωσης σε άλας διάλυμα DNA , με την προσθήκη αλκοόλης </li></ul>
  11. 11. Απομόνωση γονιδιακού DNA ( gDNA ) από περιφερικό αίμα με τη χρήση σφαιριδίων ( SiO 2 ): μαγνήτη σε αναλογία 1 : 1 <ul><li>η απομόνωση των νουκλεϊνικών οξέων επιτυγχάνεται με τη βοήθεια των μαγνητικών σφαιριδίων ( Magne Sil Paramagnetic Particles - PMPs ) </li></ul><ul><li>στάδια της μεθόδου </li></ul><ul><li>στο πρώτο βήμα της διαδικασίας γίνεται η λύση των κυττάρων ώστε να ελευθερωθεί το gDNA </li></ul><ul><li>στη συνέχεια προσδένεται στα PMPs </li></ul><ul><li>τ o σύμπλοκο gDNA - PMPs , περνά από διαδοχικά ξεπλύματα ώστε να γίνει η έκλουση του gDNA </li></ul>
  12. 12. ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ ( Polymerase Chain Reaction - PCR ) <ul><li>DNA πολυμεράση </li></ul><ul><li>μικρά ποσά DNA μπορούν να αντιγραφούν και να πολλαπλασιαστούν ώστε να μπορούν εύκολα να ανιχνευτούν , να μελετηθούν και να χρησιμοποιηθούν σε κάθε επιθυμητή εφαρμογή </li></ul>
  13. 13. 1983 Karry Mullis 1993 Nobel Χημείας
  14. 14. ΑΛΥΣΙΔΩΤΗ ΑΝΤΙΔΡΑΣΗ ΠΟΛΥΜΕΡΑΣΗΣ ( Polymerase Chain Reaction - PCR ) <ul><li>μικροποσότητες DNA μπορούν γρήγορα και επαναλαμβανόμενα να αντιγραφούν αποδίδοντας μια ποσότητα DNA ικανή να ελεγχθεί με τις συμβατικές εργαστηριακές μεθόδους </li></ul><ul><li>ο πολλαπλασιασμός επιτελείται σε διαδοχικούς κύκλους DNA σύνθεσης που ονομάζονται θερμικοί κύκλοι </li></ul><ul><li>από ένα επιλεγμένο DNA τμήμα παράγονται δύο αντίγραφα, στη συνέχεια τέσσερα, οκτώ κλπ </li></ul>
  15. 15. τι περιλαμβάνει μια PCR; <ul><li>DNA template </li></ul><ul><li>primers </li></ul><ul><li>dNTPs </li></ul><ul><li>Taq polymerase </li></ul><ul><li>buffer solution </li></ul><ul><li>Mg2+ </li></ul>
  16. 16. <ul><li>DNA template </li></ul><ul><li>primers </li></ul><ul><li>dNTPs </li></ul><ul><li>Taq polymerase </li></ul><ul><li>buffer solution </li></ul><ul><li>Mg2+ </li></ul>τι περιλαμβάνει μια PCR;
  17. 17. <ul><li>DNA template </li></ul><ul><li>primers </li></ul><ul><li>dNTPs </li></ul><ul><li>Taq polymerase </li></ul><ul><li>buffer solution </li></ul><ul><li>Mg2+ </li></ul>τι περιλαμβάνει μια PCR;
  18. 18. τι περιλαμβάνει μια PCR; <ul><li>DNA template </li></ul><ul><li>primers </li></ul><ul><li>dNTPs </li></ul><ul><li>Taq polymerase </li></ul><ul><li>buffer solution </li></ul><ul><li>Mg2+ </li></ul>
  19. 19. τι περιλαμβάνει μια PCR; <ul><li>DNA template </li></ul><ul><li>primers </li></ul><ul><li>dNTPs </li></ul><ul><li>Taq polymerase </li></ul><ul><li>buffer solution </li></ul><ul><li>Mg2+ </li></ul>
  20. 20. τι περιλαμβάνει μια PCR; <ul><li>DNA template </li></ul><ul><li>primers </li></ul><ul><li>dNTPs </li></ul><ul><li>Taq polymerase </li></ul><ul><li>buffer solution </li></ul><ul><li>Mg2+ </li></ul>
  21. 21. τι περιλαμβάνει μια PCR; <ul><li>DNA template </li></ul><ul><li>primers </li></ul><ul><li>dNTPs </li></ul><ul><li>Taq polymerase </li></ul><ul><li>buffer solution </li></ul><ul><li>Mg2+ </li></ul>
  22. 22. στόχος πολλαπλασιασμού ( DNA template ) <ul><li>DNA </li></ul><ul><li>RNA DNA </li></ul><ul><li>50-1500 βάσεις </li></ul>
  23. 23. εκκινητές ( primers) <ul><li>o λιγονουκλεοτίδια μονής έλικας συμπληρωματικά του 5΄ ή 3΄άκρου της αλληλουχίας που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε </li></ul><ul><li>πολύπλοκη η επιλογή των εκκινητών </li></ul><ul><li>15-40 νουκλεοτίδια </li></ul><ul><li>θερμοκρασία σύνδεσης 50 ο έως 74 ο C </li></ul><ul><li>software </li></ul><ul><li>επαναλαμβανόμενες δοκιμές </li></ul>
  24. 24. δεοξυνουκλεοτίδια ( dNTPs) <ul><li>20-200 μΜ </li></ul><ul><li>dATP , dTTP , </li></ul><ul><li>dGTP , dCTP </li></ul><ul><li>ισοδύναμες </li></ul><ul><li>συγκεντρώσεις </li></ul>
  25. 25. DNA polymerase <ul><li>Taq p ο lymerase </li></ul><ul><li>θερμοάντοχο ένζυμο </li></ul><ul><li>Thermus aquarius </li></ul><ul><li>ενώνεται στους εκκινητές και να φέρει κοντά και να συνδέει μια σειρά νουκλεοτιδίων συμπληρωματικών του αρχικού μορίου DNA . </li></ul>
  26. 26. ρυθμιστικό διάλυμα (buffer solution) <ul><li>παρέχει το κατάλληλο περιβάλλον </li></ul><ul><li>(pH 8 , 3 έως 8,9) </li></ul><ul><li>10 έως 50 mM Tris . HCl </li></ul><ul><li>προσθήκη μέχρι και 50 mM KCl </li></ul>
  27. 27. ιόντα μαγνησίου ( Mg2+ ) <ul><li>η παρουσία τους επιδρά </li></ul><ul><li>-στην σύνδεση των εκκινητών </li></ul><ul><li>-στις θερμοκρασίες αποδιάταξης του DNA </li></ul><ul><li>-στη δράση των ενζύμων </li></ul><ul><li>0,5 έως 2,5 mM μαγνησίου </li></ul>
  28. 28. Polymerase Chain Reaction <ul><li>25-40 θερμικοί κύκλοι </li></ul><ul><li>denaturation step </li></ul><ul><li>στάδιο αποδιάταξης </li></ul><ul><li>annealing step </li></ul><ul><li>στάδιο πρόσδεσης εκκινητών </li></ul><ul><li>elogation step </li></ul><ul><li>στάδιο επιμήκυνσης του DNA </li></ul>
  29. 29. PCR - SSOP (Polymerase Chain Reaction-Sequence Specific Oligonucleotide Probes ) <ul><li>Η τεχνική αυτή βασίζεται : </li></ul><ul><li>στον πολλαπλασιασμό συγκεκριμένων τμημάτων των γονιδίων που θέλουμε να μελετήσουμε με PCR και εν συνεχεία </li></ul><ul><li>για την ανίχνευση του προιόντος </li></ul><ul><li>της PCR στον υβριδισμό του με </li></ul><ul><li>ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές </li></ul><ul><li>( oligonucleotide probes) </li></ul>
  30. 30. Τεχνικές υβριδισμού <ul><li>1. Κλασικός υβριδισμός ( forward SSOP) </li></ul><ul><li>T ο προϊόν της PCR ακινητοποιείται σε μεμβράνη και ο κάθε ανιχνευτής που έχει προηγουμένως σημανθεί ισοτοπικά ( 32 P ) ή ενζυμικά (διγοξιγενίνη, αλκαλική φωσφατάση) προστίθεται χωριστά. </li></ul><ul><li>2. Ανάστροφος υβριδισμός ( reverse SSOP) </li></ul><ul><li>Σε ειδικές ταινίες βρίσκονται ακινητοποιημένοι οι ολιγονουκλεοτιδικοί ανιχνευτές και προστίθεται σε αυτούς το προϊόν της PCR . Ακολουθεί υβριδισμός και ανίχνευση του υβριδικού προϊόντος, συνήθως με χρήση χρωμογόνων υποστρωμάτων. </li></ul>
  31. 31. reverse-PCR-SSOP <ul><li>είναι μία διαδικασία ανάστροφου υβριδισμού ( reverse hybridization) με γραμμικούς ανιχνευτές ( line probes) </li></ul><ul><li>τ o δείγμα DNA αναμιγνύεται με διάλυμα που περιέχει περίσσεια dNTPs , εκκινητές σημασμένους με βιοτίνη και θερμοανθεκτική Taq DNA polymerase . </li></ul><ul><li>a κολουθεί ενίσχυση του DNA- στόχου με PCR </li></ul>
  32. 32. reverse-PCR-SSOP <ul><li>Το προιόν της PCR αποδιατάσσεται με χημικό τρόπο,ακολουθεί υβριδοποίηση ( blotting) των μονόκλωνων τμημάτων με </li></ul><ul><li>ειδικούς ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές ( probes) , οι οποίοι βρίσκονται ακινητοποιημένοι πάνω σε ταινίες νιτροκυτταρίνης (strips), υπό μορφή παραλλήλων γραμμών. </li></ul><ul><li>Προσθήκη στρεπταβιδίνης σημασμένη με αλκαλική φωσφατάση , η οποία συνδέεται με τα βιοτινυλιωμένα δίκλωνα υβριδικά μόρια. </li></ul><ul><li>Επώαση με χρωμογόνο , το οποίο με την επίδραση της αλκαλικής φωσφατάσης δίνει χαρακτηριστικό χρώμα μωβ/καφέ. </li></ul><ul><li>Έκπλυση για διακοπή της αντίδρασης </li></ul>
  33. 33. reverse-PCR-SSOP <ul><li>Η αξιολόγηση γίνεται με βάση το υπόδειγμα ( pattern ) των ανιχνευτών που έδωσαν θετική αντίδραση. </li></ul><ul><li>Επιτυγχάνεται δε, είτε με τη βοήθεια ειδικών πινάκων αξιολόγησης , είτε με τη βοήθεια ειδικού προγράμματος στον ηλεκτρονικό υπολογιστή ( software - Expert genotyping program ). </li></ul>
  34. 34. PCR - SSOP (Polymerase Chain Reaction-Sequence Specific Oligonucleotide Probes ) <ul><li>Εφαρμογές </li></ul><ul><li>τυποποίηση των HLA τάξης Ι και ΙΙ αλληλίων </li></ul><ul><li>γονοτυπική ανάλυση ιών π.χ. HCV, HIV </li></ul><ul><li>SNPs γονοτύπωση πχ. Α poE </li></ul>
  35. 35. τυποποίηση PCR - SSOP με τεχνολογία BEADS ARRAY και χρήση ΑΝΑΛΥΤΗ ΡΟΗΣ ( LUMINEX ) <ul><li>Είναι μία αυτοματοποιημένη τεχνική ανάστροφου υβριδισμού ( reverse hybridization ) </li></ul><ul><li>Η τεχνολογία αυτή χρησιμοποιεί ολιγονουκλεοτιδικούς ανιχνευτές ( probes ), προσδεμένους σε μικροσφαιρίδια ( beads ) , για την αναγνώριση αλληλομόρφων στο υπό εξέταση δείγμα DNA . </li></ul>
  36. 36. μικροσφαιρίδια πολυστυρενίου επικαλυμένα με δύο φθοριοχρώματα φλουρεσκεϊνης
  37. 37. τεχνική <ul><li>Πολλαπλασιασμός με βιοτυλιωμένα primers ειδικά για κάθε αλληλόμορφο. </li></ul><ul><li>Αποδιάταξη για 10 min . </li></ul><ul><li>Εξουδετέρωση </li></ul><ul><li>Προσθήκη των σημασμένων με probes σφαιριδίων . </li></ul><ul><li>Επώαση ( υβριδισμός ) στους 60 0 C για 15 min σε θερμικό κυκλοποιητή. </li></ul><ul><li>Πλύσιμο 3 φορές. </li></ul><ul><li>Προσθήκη SAPE (στρεπταβιδίνης συζευγμένης με R- φυκοερυθρίνη) και επώαση στους 60 0 C για 5 min. </li></ul><ul><li>Πλύσιμο 1 φορά. </li></ul>
  38. 39. <ul><li>Εφαρμογές : </li></ul><ul><li>τυποποίηση των HLA αλληλίων </li></ul><ul><li>μέτρηση ϊικού φορτίου </li></ul><ul><li>ανίχνευση ογκογονίδιων </li></ul><ul><li>προσδιορισμό αντισωμάτων </li></ul>
  39. 40. PCR-SSP (specific sequence primers) <ul><li>Αρχή της μεθόδου </li></ul><ul><li>ένας εκκινητής με πλήρως συμπληρωματική αλληλουχία με το ένα από τα δύο τα άκρα της ειδικής περιοχής που θέλουμε να πολλαπλασιάσουμε χρησιμοποιείται πιο αποτελεσματικά σε μια PCR αντίδραση από άλλους εκκινητές που έχουν μία ή περισσότερες διαφορές (mismatches) στο 3΄άκρο τους </li></ul><ul><li>οι δύο εκκινητές που χρησιμοποιούνται σε κάθε PCR αντίδραση έχουν σχεδιασθεί με τέτοιο τρόπο ώστε να «ταιριάζουν» απόλυτα με τα 3΄άκρα ενός μόνο αλληλίου ή ομάδας αλληλίων που θέλουμε να προσδιορίσουμε </li></ul>
  40. 41. PCR-SSP (specific sequence primers) <ul><li>Διαδικασία της μεθόδου (ΙΙ) </li></ul><ul><li>τα πολλαπλασιασμένα τμήματα του DNA, που προκύπτουν μετά την PCR αντίδραση, διαχωρίζονται με βάση την ηλεκτροφορητική τους κινητικότητα σε πήκτωμα αγαρόζης </li></ul><ul><li>το προιόν της ηλεκτροφόρησης γίνεται ορατό ύστερα από έκθεση σε υπεριώδη ακτινοβολία με την προσθήκη χρωστικής Ethidium Bromide και αποτυπώνεται σε φωτογραφικό χαρτί. </li></ul>
  41. 42. PCR-SSP (specific sequence primers) <ul><li>αξιολόγηση </li></ul><ul><li>λαμβάνονται υπόψη οι θετικές αντιδράσεις (παρουσία ειδικού προϊόντος) και με βάση ειδικούς πίνακες ανάγνωσης ή προγράμματα Η/Υ ( software ) εξάγεται το τελικό αποτέλεσμα </li></ul>
  42. 43. PCR-SSP (specific sequence primers) <ul><li>εφαρμογές: </li></ul><ul><li>τυποποίηση HLA τάξης Ι και ΙΙ γονιδίων </li></ul><ul><li>προσδιορισμός αλληλομόρφων διαφόρων γονιδίων </li></ul>
  43. 44. n ested - PCR <ul><li>τα υπό εξέταση νουκλεϊνικά οξέα </li></ul><ul><li>βρίσκονται σε μικρή ποσότητα στο δείγμα </li></ul><ul><li>είναι μερικώς αποικοδομημένα </li></ul><ul><li>κακής ποιότητος </li></ul><ul><li>το τελικό προϊόν θα είναι κάτω από τα όρια της ανίχνευσης </li></ul><ul><li>η εφαρμογή της φωλιασμένης (nested) PCR μπορεί να αυξήσει την ευαισθησία (έως και 1000 φορές) αλλά και την εξειδίκευση μιας κλασικής PCR. </li></ul>
  44. 45. n ested - PCR <ul><li>Αρχή της μεθόδου </li></ul><ul><li>συνίσταται σε δύο διαδοχικές αντιδράσεις PCR, όπου το προϊόν της πρώτης PCR (το οποίο δεν είναι ανιχνεύσιμο) χρησιμοποιείται ως στόχος (μήτρα) για τη δεύτερη αντίδραση PCR </li></ul><ul><li>Φωλιασμένη : οι εκκινητές, που χρησιμοποιούνται στη 2η PCR συνδέονται στο DNA-στόχο εσωτερικά (φωλιασμένα) σε σχέση με τους εκκινητές της πρώτης αντίδρασης </li></ul><ul><li>το προϊόν της δεύτερης PCR θα έχει πάντα μικρότερο μέγεθος απ’αυτό της πρώτης PCR </li></ul>
  45. 46. n ested - PCR <ul><li>Εφαρμογές: </li></ul><ul><li>σε περιπτώσεις όπου το υπό εξέταση υλικό είναι πολύ λίγο ή αυτό που αναζητούμε βρίσκεται σε πολύ λίγα αντίγραφα μέσα στο γονιδίωμα πχ. </li></ul><ul><li>έλεγχος της κλωνικότητας του BcR υποδοχέα και συγκεκριμένα της βαριάς αλυσίδας των ανοσοσφαιρινών ( IgH ) </li></ul>
  46. 47. reverse transcriptase-PCR ή RT-PCR <ul><li>με την κλασική τεχνική της PCR μπορεί κανείς να μελετήσει το DNA, αλλά όχι το RNA. </li></ul><ul><li>το ολικό RNA ή mRNA των υπό εξέταση κυττάρων ή ιστών μετατρέπεται με τη βοήθεια του ενζύμου ανάστροφη τρανσκριπτάση ( r everse transcriptase) σε cDNA ( complementary DNA ) </li></ul><ul><li>E φαρμογές: στη μελέτη RNA ιών όπως ο HIV και ο HCV </li></ul>
  47. 48. quantitative PCR ( Q - PCR ) <ul><li>αναπτύχθηκε με σκοπό να ξεπεραστεί η βασική αδυναμία της παραδοσιακής PCR , η οποία ανιχνεύει την παρουσία ή απουσία του DNA -στόχου μην μπορώντας να δώσει ποσοτικά αποτελέσματα. </li></ul><ul><li>με την ποσοτική PCR ελέγχεται αν μια συγκεκριμένη DNA αλληλουχία είναι παρούσα σε ένα δείγμα που μελετάται καθώς επίσης υπολογίζει και τον αριθμό των αντιγράφων ( copies ) που υπάρχουν στο δείγμα αυτό. </li></ul>
  48. 49. quantitative PCR ( Q - PCR ) <ul><li>competitive PCR </li></ul><ul><li>real time PCR </li></ul>
  49. 50. a νταγωνιστική PCR (competitive) <ul><li>προτύπο ποσοτικοποίησης ( QS ) </li></ul><ul><li>δεύτερη αλληλουχία DNA ή RNA , που προστίθεται σε κάθε δείγμα σε γνωστή συγκέντρωση </li></ul><ul><li>μη μολυσματικό μόριο, DNA ή RNA in vitro μετάγραφο, που περιέχει τις ίδιες ακριβώς περιοχές δέσμευσης εκκινητή με τον DNA ή RNA στόχο και δημιουργεί ένα προϊόν ενίσχυσης με την ίδια σύνθεση βάσεων με το DNA ή RNA στόχο </li></ul><ul><li>περιέχει και μια μοναδική θέση δέσμευσης ιχνηθέτη ( probes ) που επιτρέπει το διαχωρισμό του κλώνου ( amplicon ) του προτύπου ποσοτικοποίησης από τον κλώνο ( amplicon ) του DNA ή RNA στόχου </li></ul>
  50. 51. a νταγωνιστική PCR (competitive) <ul><li>το πρότυπο ποσοτικοποίησης ενσωματώνεται σε κάθε δείγμα σε ένα γνωστό αριθμό αντιγράφων, και μεταφέρεται μέσω της προετοιμασίας του δείγματος, της PCR ενίσχυσης, του υβριδισμού και της ανίχνευσης μαζί με την αλληλουχία στόχο </li></ul><ul><li>τα επίπεδα DNA ή RNA στα δείγματα εξέτασης υπολογίζονται συγκρίνοντας το σήμα του ενισχυμένου DNA ή RNA στόχου με το σήμα του προτύπου ποσοτικοποίησης για κάθε δείγμα </li></ul><ul><li>στηρίζεται στο σχηματισμό ενός έγχρωμου συμπλόκου, η απορρόφηση του οποίου μετράται σε μήκος κύματος 660 nm από τον αναλυτή COBAS AMPLICOR </li></ul>
  51. 52. real time PCR (qRT-PCR) <ul><li>η πιο ακριβής μεθολογία </li></ul><ul><li>το κύριο χαρακτηριστικό αυτής της μεθόδου είναι ότι το πολλαπλασιαζόμενο DNA προσδιορίζεται κατά τη διάρκεια της αντίδρασης σε πραγματικό χρόνο , μια νέα προσέγγιση σε σχέση με την κλασική PCR , όπου το προϊόν της αντίδρασης ανιχνεύεται στο τέλος. </li></ul>
  52. 53. real time PCR (qRT-PCR) <ul><li>επιτρέπει τον ποσοτικό προσδιορισμό του DNA ή του RNA σε ένα δείγμα, είτε από έναν πληθυσμό κυττάρων (ιστός ή κυτταροκαλλιέργεια), είτε πρόσφατα ακόμη και από ένα μονό κύτταρο. </li></ul><ul><li>σ τηρίζεται στην ανίχνευση του φθορισμού που παράγεται από ένα μόριο, ο οποίος φθορισμός αυξάνει, καθώς προχωρά η αντίδραση. </li></ul><ul><li>a υτό το μόριο, το οποίο είναι σημασμένο με μια φθορίζουσα χρωστική, μετά από διέγερση, εκπέμπει ένα φωτεινό σήμα το οποίο αυξάνει σε ένταση σε άμεση αναλογία προς το ποσό του ενισχυμένου προϊόντος PCR και ως εκ τούτου, ποσοτικοποιεί το DNA στόχο. </li></ul>
  53. 54. a νίχνευση του προϊόντος ( qRT) 1 . Μη ειδικές : οι οποίες περιλαμβάνουν DNA δεσμευτικές βαφές και μπορούν να χωριστούν σε δύο κατηγορίες: α. Intercalators ( Et/Br) β. Minor-groove binders (SYBR Green I) 2. Ειδικέ ς : οι οποίες περιλαμβάνουν ειδικούς ανιχνευτές ( probes) 1.TaqMan® Probes 2. Molecular Beacons 3. FRET Hybridization Probes 4. Eclipse Probes 5. Amplifluor Assays 6. Scorpions Primers 7. LUX Primers 8. QZyme Primers
  54. 55. quantitative PCR <ul><li>εφαρμογές: </li></ul><ul><li>ποσοτικοποίηση της έκφρασης γονιδίων </li></ul><ul><li>microarray επιβεβαίωση </li></ul><ul><li>μέτρηση ιικού φορτίου </li></ul><ul><li>SNP γονοτύπωση </li></ul>
  55. 56. τεχνική ανάλυσης την νουκλεοτιδικής αλληλουχίας ( DNA Sequencing ) <ul><li>η πληρέστερη ανάλυση ενός κλωνοποιημένου κομματιού DNA επιτυγχάνεται με προσδιορισμό της πρωτοδιάταξής του </li></ul><ul><li>η τεχνική της ανάλυσης της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας ( sequencing ) μας επιτρέπει να διαβάσουμε βάση προς βάση τη νουκλεοτιδική αλληλουχία ενός τμήματος DNA </li></ul><ul><li>στο τέλος της δεκαετίας του 1970 αναπτύχθηκαν δύο μέθοδοι που επιτρέπουν τον προσδιορισμό τμήματος DNA το οποίο είτε έχει παραχθεί με κλωνοποίηση είτε έχει πολλαπλασιαστεί με PCR </li></ul>
  56. 57. DNA sequencing Μέθοδος κατά MAXAM & GILBERT (Χημική) <ul><li>διαδικασία της μεθόδου (Ι) </li></ul><ul><li>το τμήμα του DNA , του οποίου την πρωτοδιάταξη θέλουμε να προσδιορίσουμε, αποδιατάσσεται και σημαίνεται με ραδιενεργό ουσία (συνήθως με 32 P ) στο ένα άκρο του </li></ul><ul><li>το σεσημασμένο DNA μοιράζεται σε τέσσερα δείγματα και το κάθε δείγμα υποβάλλεται σε χημική αντίδραση που τροποποιεί ειδικά μια από τις τέσσερις βάσεις του DNA ( A , T , C , G ) </li></ul><ul><li>ακολουθεί αντίδραση με πιπεριδίνη οπότε το DNA σπάει στις θέσεις που έχει τροποποιηθεί. </li></ul>
  57. 58. DNA sequencing Μέθοδος κατά MAXAM & GILBERT (Χημική) <ul><li>διαδικασία της μεθόδου (ΙΙ) </li></ul><ul><li>ως αποτέλεσμα σε κάθε ένα από τα τέσσερα δείγματα δημιουργείται ένας πληθυσμός σεσημασμένων DNA θραυσμάτων των οποίων το μήκος εξαρτάται από την απόσταση της τροποποιημένης βάσης από το σεσημασμένο άκρο του μορίου </li></ul><ul><li>τα τέσσερα δείγματα ηλεκτροφορούνται το ένα δίπλα στο άλλο σε πήκτωμα πολυακρυλαμίδης, τα κομμάτια του DNA διαχωρίζονται ανάλογα με το μέγεθος τους και γίνονται ορατά με αυτοραδιογραφία </li></ul><ul><li>με βάση τέλος τις ζώνες αμαύρωσης ( bands ) που προκύπτουν από την αυτοραδιογραφία γίνεται ο προσδιορισμός της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας </li></ul>
  58. 59. DNA sequencing μέθοδος κατά Sanger (Ενζυμική) <ul><li>η μέθοδος εκλογής γιατί χρησιμοποιεί λιγότερα χημικά τοξικά και μικρότερα ποσά ραδιενεργούς ουσίας </li></ul><ul><li>το προς ανάλυση τμήμα του DNA χρησιμεύει ως εκμαγείο για τη σύνθεση αντιγράφων τα οποία έχουν το ίδιο σημείο έναρξης αλλά διακόπτονται σε διαφορετικά σημεία </li></ul><ul><li>η αρχή της βασίζεται στην εισαγωγή τροποποιημένων δεσοξυνουκλεοτιδίων που ονομάζονται διδεσοξυνουκλεοτίδια ( ddNTP ) </li></ul><ul><li>υδρογόνο αντί υδροξυλίου στη θέση 3΄ της δεσοξυριβόζης και η ενσωμάτωσή τους στη νεοσυντιθέμενη αλυσίδα εμποδίζει την περαιτέρω επιμήκυνσή της καθώς δεν είναι εφικτός ο σχηματισμός φωσφοδιεστερικού δεσμού </li></ul>
  59. 60. DNA sequencing μέθοδος κατά Sanger (Ενζυμική) <ul><li>διαδικασία (Ι) </li></ul><ul><li>πραγματοποιούνται παράλληλα τέσσερις διαφορετικές αντιδράσεις αντιγραφής της αλληλουχίας που χρησιμοποιείται ως εκμαγείο από την DNA πολυμεράση </li></ul><ul><li>την κατάλληλη αναλογία dNTP / ddNTP </li></ul><ul><li>απαιτείται συνθετικό ολιγονουκλεοτίδιο, συμπληρωματικό του αρχικού τμήματος που χρησιμεύει ως εκκινητής ( primer ) </li></ul><ul><li>κάθε μια από τις τέσσερις αντιδράσεις περιέχει ένα διαφορετικό ddNTP αλλά όλα τα dNTP , ένα εκ των οποίων οφείλει να είναι ραδιοσημασμένο </li></ul>
  60. 61. DNA sequencing μέθοδος κατά Sanger (Ενζυμική) <ul><li>διαδικασία (ΙΙ) </li></ul><ul><li>καθώς αρχίζει ο πολυμερισμός του εκκινητή οι θέσεις πχ της κυτοσίνης καταλαμβάνονται από το φυσιολογικό dC , οπότε εξακολουθεί ο πολυμερισμός, αλλά που και που γίνεται ενσωμάτωση ddC , οπότε έχουμε λήξη του πολυμερισμού </li></ul><ul><li>παρόμοιες επωάσεις γίνονται παρουσία του καθενός από τα υπόλοιπα διδεοξυριβουνοκλεοτίδια με αποτέλεσμα τη λήξη του πολυμερισμού στις θέσεις G , A ή Τ </li></ul><ul><li>θα προκύψει ένα μίγμα από σεσημασμένες αλυσίδες, που τελειώνουν με ένα ddNTP στο 3΄άκρο </li></ul><ul><li>τα μήκη των οποίων εξαρτώνται από τη σχετική θέση της συγκεκριμένης βάσης από το άκρο του DNA </li></ul><ul><li>διαχωρισμός με ηλεκτροφόρηση σε πήκτωμα πολυακριλαμίδης </li></ul><ul><li>λήψη αποτυπώματος σε φίλμ </li></ul>
  61. 62. automated DNA sequencing <ul><li>σήμερα χρησιμοποιούνται ευρέως συστήματα αυτόματης ανάλυσης της νουκλεοτιδικής αλληλουχίας όπου εφαρμόζεται η μέθοδος κατά Sanger αλλά στην πρώτη φάση γίνεται εκθετικός πολλαπλασιασμός του DNA -στόχου με PCR </li></ul>
  62. 63. automated DNA sequencing <ul><li>χρησιμοποιούνται 4 διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές, μια για κάθε βάση </li></ul><ul><li>laser για τη διέγερση των φθοριοχρωμάτων </li></ul><ul><li>ανιχνευτές για τη συλλογή των εκπομπών </li></ul><ul><li>τα τελικά προϊόντα ηλεκτροφορούνται όλα μαζί για να μειώνονται τα προβλήματα που οφείλονται στη διαφορετική ηλεκτροφορητική κινητικότητα από σειρά σε σειρά του πηκτώματος </li></ul><ul><li>τα συστήματα αυτά διαθέτουν ειδικά software , τα οποία δίδουν σε σύντομο χρονικό διάστημα το αποτέλεσμα </li></ul>
  63. 64. DNA sequencing <ul><li>εφαρμογές: </li></ul>τυποποίηση των HLA αντιγόνων ( Sequence Based Typing-SBT)
  64. 66. automated DNA sequencing <ul><li>χρησιμοποιούνται 4 διαφορετικές φθορίζουσες χρωστικές, μια για κάθε βάση </li></ul><ul><li>laser για τη διέγερση των φθοριοχρωμάτων </li></ul><ul><li>ανιχνευτές για τη συλλογή των εκπομπών </li></ul><ul><li>τα τελικά προϊόντα ηλεκτροφορούνται όλα μαζί για να μειώνονται τα προβλήματα που οφείλονται στη διαφορετική ηλεκτροφορητική κινητικότητα από σειρά σε σειρά του πηκτώματος </li></ul><ul><li>τα συστήματα αυτά διαθέτουν ειδικά software , τα οποία δίδουν σε σύντομο χρονικό διάστημα το αποτέλεσμα </li></ul>
  65. 67. PCR-SSP (specific sequence primers) <ul><li>Διαδικασία της μεθόδου (Ι) </li></ul><ul><li>a πομόνωση του χρωμοσωμιακού DNA </li></ul><ul><li>πολλαπλασιασμός του DNA επιτυγχάνεται με PCR χρησιμοποιώντας πολλά ζεύγη εκκινητών τα οποία είναι απολύτως ειδικά για τα προς ταυτοποίηση αλληλόμορφα γονίδια </li></ul>
  66. 68. <ul><li>Taq polymerase </li></ul><ul><li>καταλύουν τη σύνθεση δίκλωνου DNA από μονόκλωνο </li></ul><ul><li>δεν μπορούν να ξεκινήσουν τη σύνθεση της νέας αλυσίδας de novo </li></ul><ul><li>προσθέτουν δεοξυριβονουκλεοτίδια (dNTPs) ως επέκταση του εκκινητή που βρίσκεται συνδεδεμένος στην αλληλουχία-στόχο </li></ul><ul><li>οδηγώντας στην παραγωγή ενός DNA αντιγράφου </li></ul>για την έναρξη του πολλαπλασιασμού χρησιμοποιείται ζεύγος εκκινητών ( primers ) συνθετικών ολιγονουκλεοτιδίων που έχουν συμπληρωματική αλληλουχία με τα άκρα 3΄ του DNA στόχου.

×