2. Application des
techniques isotopiques
modernes pour la
caractérisation de produits alimentaires
et de boissons
THÈSE DE DOCTORAT
Discipline : Chimie analytique
Spécialité : Sciences Agro-alimentaires
présentée et soutenue publiquement par
Giovanni CALDERONE
Institute for Health
and Consumer Protection
EUROPEAN COMMISSION
Joint Research Centre
DIRECTORATE-GENERAL
Université de Nantes
Faculté des Sciences et des Techniques
École Doctorale - Chimie Biologie
Rapporteurs
M. ARNAUD Maurice, Nestlé SA Nutrition Vevey, Suisse
M. BERTRAND Alain, Professeur Université Bordeaux II
Examinateurs
M. GUILLOU Claude, Joint Research Centre Ispra, Italie
Mme. LEES Michèle, Eurofins Scientific SA Nantes
M. NAULET Norbert, Professeur Université de Nantes
M. REMAUD Gérald, Professeur Université de Nantes
Directeur de Thèse
M. NAULET Norbert
le 18 mars 2005, devant le jury ci-dessous
4. 3
Remerciements
Ce travail est le fruit de trois années de recherche menées au sein des laboratoires
du BEVABS/CCR à Ispra (Italie) en collaboration avec le Laboratoire d'Analyse
Isotopique et Electrochimique de Métabolismes de l'Université de Nantes.
Je tiens à remercier Monsieur le Professeur Norbert Naulet de l'Université de
Nantes pour avoir accepté de diriger ma thèse et pour sa disponibilité me permettant ainsi
de progresser professionnellement et humainement.
Je remercie également Messieurs Claude Guillou et Fabiano Reniero pour m’avoir
accueilli aux laboratoires du CCR, pour leurs toujours stimulants défis et précieux conseils
et surtout pour m’avoir laissé une complète autonomie de gestion de mes recherches.
Je suis très flatté que Monsieur Maurice Arnaud du Centre de Recherche de Nestlé
et Monsieur le Professeur Alain Bertrand de l’Université de Bordeaux aient accepté de
juger ma thèse. Je suis aussi très heureux de retrouver dans le jury Monsieur Gérald
Remaud de l’Université de Nantes et Madame Michèle Lees d’Eurofins qui, avec Eric
Jamin, m’ont introduit dans le monde des isotopes stables il y a quelques années.
Je suis redevable aussi envers Madame Margaret Holland et Messieurs Franco
Cazzaniga et Giuseppe Gilberti du BEVABS pour leur extraordinaire travail (ce n’est pas
facile d’aller en quête de centaines de vieilles bouteilles empoussiérées). Même
reconnaissance pour Madame Catherine Jouitteau, du LAIEM, qui a été, elle aussi, une de
mes « voix » françaises.
Un « muchas gracias » à Monsieur José-Joaquín Blasco-Muñoz pour avoir valorisé
et représenté graphiquement les contenus de mon travail.
Un remerciement particulier à Monsieur Umberto Traldi, technicien spécialisé de
Thermofinnigan-Milano qui grâce à sa promptitude et sa compétence a résolu tous les
problèmes techniques et par qui j’ai appris à maîtriser des appareils parfois non
« collaborant ».
5. 4
Je veux exprimer ma sympathie à tous mes collègues qui se sont alternés et avec
lesquels on a rigolé et on s’est confortés pendant les longues journées de travail au
laboratoire : Francesca, José Manuel « Chema », Veronica, Ana Isabel, Mauro, Agnieszka,
Rosa Maria et Andri et Fayçal pour leur compagnie. A Mesdames Adriana Ciceri et Eva
Åhs de l’administration de l’unité PCE qui, grâce à leur gentillesse et à leur énergie, m’ont
toujours simplifié les obstacles bureautiques.
Je remercie enfin toutes les personnes qui ont pu contribuer à la réalisation de ce
mémoire parce qu’un travail de recherche et de publication n’est jamais le travail d’une
seule personne.
Merci à Alain et Ivan pour m’avoir depuis longtemps accueilli chez eux en
devenant, de facto, ma famille en France.
Il mio più grande affetto va alla mia famiglia tutta, ai miei amici sparpagliati in giro
per l’Italia e il mondo e ad Alberto, per avermi mostrato fiducia e per avermi sostenuto
moralmente (e a volte anche fisicamente), sempre.
6. 5
Table des matières
Remerciements......................................................................................................................3
Table des matières ................................................................................................................5
Liste des tableaux ...............................................................................................................13
Liste des figures ..................................................................................................................16
Liste des abréviations et des sigles ....................................................................................20
Introduction .........................................................................................................................27
English abstract ....................................................................................................................29
Bibliographie .......................................................................................................................30
Chapitre I
Isotopes stables
1. Historique.........................................................................................................................33
1.1. Applications ..............................................................................................................34
1.1.1. Domaine alimentaire : « food » ...........................................................................34
1.2. Rapport isotopique et déviation..............................................................................35
1.3. Facteurs de variabilité .............................................................................................36
1.3.1. Effets isotopiques physiques................................................................................36
1.3.2. Effets isotopiques chimiques ...............................................................................38
1.3.3. Autres effets isotopiques......................................................................................40
2. Carbone : Indices sur l’origine botanique......................................................................41
3. L’azote et sa variabilité dans la nature...........................................................................47
4. Deutérium et oxygène : Origine géographique ..............................................................51
Bibliographie .......................................................................................................................58
7. 6
Chapitre II
Techniques et méthodes
1. Introduction..................................................................................................................... 71
1.1. Les différentes techniques de spectrométrie de masse isotopique....................... 71
2. Aspects généraux de la SMRI......................................................................................... 72
2.1. Quelques définitions................................................................................................. 73
2.2. La spectrométrie de masse...................................................................................... 74
2.2.1. Que sont les isotopomères ? ................................................................................ 75
2.3. Mesures SMRI des rapports isotopiques des éléments légers.............................. 77
2.3.1. Mesure du rapport 2
H/1
H..................................................................................... 77
2.3.2. Mesure du rapport 13
C/12
C................................................................................... 78
2.3.3. Mesure du rapport 15
N/14
N .................................................................................. 79
2.3.4. Mesure du rapport 18
O/16
O .................................................................................. 80
3. (CF-)GC-C-IRMS............................................................................................................ 81
3.1. Principes de la GC-C-IRMS ................................................................................... 81
3.1.1. Séparation et réactions......................................................................................... 82
3.1.2. Systèmes de piégeage .......................................................................................... 83
3.1.3. Vannes de déviation des gaz................................................................................ 83
3.2. Applications.............................................................................................................. 84
3.2.1. Applications en agroalimentaire.......................................................................... 84
3.2.2. Applications futures............................................................................................. 86
3.2.3. Nos études en GC-C-IRMS................................................................................. 86
3.3. Les limites ................................................................................................................. 87
4. EA-IRMS ......................................................................................................................... 88
4.1. Principes de l’EA-IRMS : réaction, systèmes de piégeage et séparation............ 89
4.2. Nos applications dans le domaine alimentaire ...................................................... 89
5. TC-EA IRMS................................................................................................................... 91
5.1. Principes du TC-EA-IRMS..................................................................................... 91
5.1.1. Nos conditions opératoires .................................................................................. 92
5.2. Interférences et limites ............................................................................................ 92
5.3. Applications.............................................................................................................. 93
6. RMN du deutérium.......................................................................................................... 94
8. 7
7. Notions statistiques..........................................................................................................94
7.1. Quelques définitions de statistique élémentaire ....................................................94
Bibliographie .......................................................................................................................96
Chapitre III
Caractérisation du glycérol des vins européens :
approche par l’isotope stable du carbone
(Characterization of European wines glycerol: stable carbon isotope
approach)
1. Introduction ...................................................................................................................104
1.1. Stable Isotope Ratio Methods in Food .................................................................105
1.2. EU Wine Data-Bank: BEVABS role ....................................................................106
2. Materials and methods ..................................................................................................107
2.1. Samples....................................................................................................................107
2.2. Sample preparation................................................................................................107
2.3. Continuous Flow GC-C-IRMS..............................................................................108
2.4. Determination of concentration of glycerol .........................................................111
3. Results ............................................................................................................................113
4. Conclusions....................................................................................................................114
Bibliographie .....................................................................................................................120
9. 8
Chapitre IV
Mesure de δ13
C de CO2 de boissons gazeuses par CG-C-
SMRI : mise au point de la méthode et applications
(Analysis of the 13
C natural abundance of CO2 gas from sparkling drinks by
GC-C-IRMS: validation of the method
Contribution of GC-C-IRMS technique to sparkling drinks authentication:
13
C/12
C ratio determination on CO2)
1. Background ................................................................................................................... 126
1.1. Carbon dioxide sources ......................................................................................... 127
2. Experimental ................................................................................................................. 127
2.1. Gas sampling .......................................................................................................... 127
2.2. GC analyses ............................................................................................................ 129
2.3. Continuous Flow GC-C-IRMS configuration and 13
C/12
C ratio measurement129
3. Results............................................................................................................................ 130
3.1. Correction of data.................................................................................................. 133
4. Conclusions: method..................................................................................................... 134
5. Introduction................................................................................................................... 136
5.1. Stable isotope ratio methods in food .................................................................... 136
5.2. Rapid measurement of the 13
C content of CO2 ................................................... 137
5.3. Fermented beverages............................................................................................. 137
5.3.1. Sparkling and semi-sparkling wines.................................................................. 137
5.3.2. Beers.................................................................................................................. 138
5.3.3. Fermented fruit juices and hydromel................................................................. 139
5.4. Sparkling waters .................................................................................................... 139
5.5. Soft-drinks .............................................................................................................. 140
6. Materials and methods.................................................................................................. 140
6.1. 13
C/12
C of ethanol ................................................................................................... 140
7. Results............................................................................................................................ 141
10. 9
7.1. Market samples ......................................................................................................141
7.1.1. Sparkling wines..................................................................................................141
7.1.2. Beers ..................................................................................................................142
7.1.3. Sparkling waters ................................................................................................143
7.1.4. Soft-drinks .........................................................................................................146
8. Conclusions: applications .............................................................................................147
Bibliographie .....................................................................................................................149
Chapitre V
Caractérisation multi-isotopique d’éthanols d’origine
diverse : mesures de δ 18
O et de δ 2
H par TC/EA
1. Introduction ...................................................................................................................153
1.1. Fermentation alcoolique ........................................................................................154
1.2. Sucres de céréales et miels.....................................................................................154
1.3. Boissons fermentées ...............................................................................................154
1.4. Boissons spiritueuses..............................................................................................157
2. δ 2
H et δ 18
O ...................................................................................................................157
2.1. Techniques de mesure............................................................................................157
3. Matériels et méthodes ....................................................................................................158
3.1. Echantillons ............................................................................................................158
3.2. Fermentation ..........................................................................................................158
3.3. Distillation d’alcool ................................................................................................159
3.4. Déshydratation .......................................................................................................159
3.5. Mesures de δ18
O et δ2
H par TC/EA......................................................................159
3.6. Autres mesures .......................................................................................................163
3.6.1. 13
C-SMRI...........................................................................................................163
3.6.2. 2
H-RMN.............................................................................................................163
3.6.3. 18
O-SMRI...........................................................................................................163
4. Résultats et discussion...................................................................................................164
11. 10
4.1. Miels ........................................................................................................................ 164
4.2. Sucres de céréales................................................................................................... 168
4.3. Boissons alcoolisées................................................................................................ 172
4.3.1. Whisky/Whiskey ............................................................................................... 172
4.3.2. Rhums et Tequilas ............................................................................................. 175
4.3.2.1. Cas de la fausse Tequila / Ethanols synthétiques........................................ 175
4.3.3. Sakés.................................................................................................................. 177
4.3.4. Vodkas, Gins, liqueurs....................................................................................... 178
4.3.5. Spiritueux de fruit.............................................................................................. 180
4.4. Vins.......................................................................................................................... 183
4.4.1. Oxygène de l’éthanol et oxygène de l’eau......................................................... 183
4.4.2. Influences géographiques : δ2
H et δ18
O............................................................. 183
4.4.3. Variations annuelles de 18
O et 2
H...................................................................... 186
4.4.4. Carbone-13 ........................................................................................................ 187
4.5. Bières....................................................................................................................... 192
5. Conclusions ................................................................................................................... 192
5.1. Technique................................................................................................................ 192
5.2. Interprétation......................................................................................................... 193
Bibliographie ..................................................................................................................... 194
Chapitre VI
Contribution à l’authentification de l’arôme de pomme :
13
C du butan-1-ol mesuré par GC-C-IRMS
1. Introduction................................................................................................................... 201
1.1. Réglementations pour la protection de la santé publique.................................. 202
1.2. Notre approche pour la caractérisation de l’arôme de pomme......................... 202
2. Matériel et méthodes ..................................................................................................... 202
2.1. Système CG-C-SMRI............................................................................................. 203
2.2. Autres mesures....................................................................................................... 203
3. Résultats......................................................................................................................... 205
12. 11
4. Discussion ......................................................................................................................205
4.1. Technique................................................................................................................205
4.2. Interprétation .........................................................................................................206
Bibliographie .....................................................................................................................208
Chapitre VII
Conclusions et perspectives
...................................................................................................................................213
Annexes
Annexe A
Les techniques isotopiques dans les règlements CE
Introduction .......................................................................................................................221
Annexe B
GC-C-IRMS : Calibration du CO2 comme gaz de référence
1. Standards .......................................................................................................................227
1.1. En pratique .............................................................................................................227
2. Elaboration des données ...............................................................................................228
13. 12
Annexe C
TC-EA : Nos conditions opératoires
1. L’appareil....................................................................................................................... 233
2. Carbone vitreux (Glassy Carbon)................................................................................. 233
3. Configurations............................................................................................................... 234
3.1. Echantillons solides................................................................................................ 234
3.2. Echantillons liquides.............................................................................................. 234
4. Température................................................................................................................... 237
5. Gaz de référence............................................................................................................ 237
6. Débit d’hélium............................................................................................................... 239
7. Remarques ..................................................................................................................... 239
Annexe D
Tableaux des vins soumis à l’analyse du glycérol (Chapitre III)
et de l’éthanol (Chapitre V)
.................................................................................................................................. 243
14. 13
Liste des Tableaux
Chapitre I
Tableau 1: Abondance naturelle moyenne, référence internationale utilisée et autres
données des principaux isotopes stables des éléments les plus utilisés dans
l’authenticité des aliments ............................................................................................37
Tableau 2: Fractionnement dans certaines réactions enzymatiques....................................41
Tableau 3 : Exemples des plantes les plus communes des trois groupes décrits ................44
Tableau 4: Processus à l’origine du fractionnement isotopique de l’azote .........................50
Chapitre II
Tableau 1 : Réactions mises en jeu et gaz obtenus pour utilisation en SMRI.....................73
Chapitre III
Table 1: EU wine-producer Countries and composition of our samples. Number of genuine
wines, expressed as white/red/rosé.............................................................................107
Table 2: Comparison of glycerol concentrations in five BIPEA wines ..........................113
Table 3: Comparison of glycerol δ13
C values by GC-C and EA-IRMS techniques..........115
Table 4: Concentration and 13
C content of glycerol in wines particularly rich in glycerol.....
………………………………………………………………………………………115
15. 14
Chapitre IV
Table 1: Injection of CO2 reference gases to validate the method .................................... 133
Table 2: 13
C content of headspace CO2 and ethanol of sparkling wine samples............... 142
Table 3: 13
C content of headspace CO2 and ethanol of beer samples................................ 144
Table 4: 13
C content of headspace CO2 from sparkling water samples............................. 145
Table 5: 13
C content of headspace CO2 from fizzy drink samples .................................... 146
Chapitre V
Tableau 1 : Définition et description de certaines boissons spiritueuses en accord avec le
règlement européen N°1576/89 (extrait).................................................................... 156
Tableau 2 : Analyses isotopiques d’un échantillon de tequila d’origine suspecte............ 176
Tableau 3 : Analyse multi-isotopique d’échantillons de saké........................................... 177
Tableau 4 : Variation des teneurs moyennes en 18
O et 2
H des vins des deux récoltes...... 187
Tableau 5 : Analyse multi-isotopique d’échantillons de bières ........................................ 191
Schéma 1 : Ethanol et origine des hydrogènes.................................................................. 166
Chapitre VI
Tableau 1 : Liste des échantillons et résultats des analyses isotopiques........................... 206
16. 15
Annexe B
Tableau 1 : Calibration de CO2 contre le « FID-mix » Varian..........................................229
Annexe D
Tableau 1 : Liste des vins de la récolte 1998 ....................................................................244
Tableau 2 : Liste des vins de la récolte 1999 ....................................................................247
17. 16
Liste des Figures
Chapitre I
Figure 1 : Variabilité isotopique du 13
C dans plusieurs formes du carbone en relation à son
cycle dans l’environnement.......................................................................................... 41
Figure 2 : Diagramme de composés et standards de référence contenant du carbone et leur
distribution au long de l’échelle δ13
C........................................................................... 42
Figure 3 : Différentes physiologies des tissus foliaires....................................................... 44
Figure 4 a et b : Schéma simplifié des cycles photosynthétiques C3 et C4........................ 45
Figure 5 : Modèle du fractionnement du 13
C des plantes et chez les mammifères herbivores
qui s’en nourrissent ...................................................................................................... 47
Figure 6 : Diagramme de composés et standards de référence contenant de l’azote et leur
distribution dans l’échelle δ15
N.................................................................................... 48
Figure 7 : Modèle du fractionnement de l’azote entre les plantes et les animaux .............. 49
Figure 8 : Carte des valeurs moyennes de δ18
O des précipitations des années 1992/93..... 52
Figure 9 : Effet de la température sur le fractionnement de l’oxygène dans une masse de
vapeur d’eau ................................................................................................................. 53
Figure 10 : Schématisation du fractionnement de l’hydrogène des eaux météoriques ....... 54
Figure 11 : Diagramme de composés et standards de référence contenant de l’hydrogène et
leur distribution dans l’échelle δ2
H.............................................................................. 56
Figure 12 : Diagramme de composés et standards de référence contenant de l’oxygène et
leur distribution dans l’échelle δ18
O............................................................................. 57
Chapitre II
Figure 1 : Schéma d’un système SMRI : exemple du CO2 ................................................. 76
18. 17
Figure 2 : Belemnitella americana dans un dessin et son rostre fossilisé : le carbonate
PDB. .............................................................................................................................79
Figure 3 : Configuration de notre chromatographe en phase gazeuse, couplé à un auto
sampler et à une interface de combustion.....................................................................82
Figure 4 : Schématisation des diverses parties d’un système couplé GC-C-IRMS, en
configuration double, carbone/azote.............................................................................85
Figure 5 : Schématisation du système couplé EA-IRMS, en configuration double, CO2/N2..
………………………………………………………………………………………..90
Figure 6 : Notre appareil de TC-EA, configuré pour l’analyse d’échantillons liquides ou
solides...........................................................................................................................92
Figure 7 : Schéma du système de pyrolyse TC-EA.............................................................93
Chapitre III
Figure 1: Structure of glycerol...........................................................................................104
Figure 2: Structure of 1,5-pentanediol (1,5-PD)................................................................104
Figure 3 : Temperature program set up to separate glycerol from the other wine
components.................................................................................................................109
Figure 4: Scheme of GC-C-IRMS configured for δ13
C analyses......................................110
Figure 5: IRMS-Chromatogram of 1,5-pentanediol and glycerol from wine....................112
Figure 6: δ13
C values of glycerol samples by GC- and EA-IRMS to test linearity...........115
Figure 7: δ13
C of glycerol vs. δ13
C of ethanol, for 1998 and 1999 wines of 4 EU
Countries.....................................................................................................................116
Figure 8: Correlations of glycerol concentration (g/L) versus ethanol content (% V/V) of
wines...........................................................................................................................118
Chapitre IV
Figure 1: Transfer of headspace gas into a crimped vial with cleaning of volume...........128
Figure 2: Scheme of GC-C-IRMS configured for δ13
C analyses of CO2..........................131
19. 18
Figure 3: Typical chromatogram of a CO2 sample analysis by IRMS. δ13
C is the mean
value over 5 repetitions in one run............................................................................. 132
Figure 4: δ13
C values trend of subsequent injections from the same vial containing CO2 134
Chapitre V
Figure 1 : Schématisation de la fermentation du glucose ................................................. 155
Figure 2 : Programme-type avec plusieurs injections d’un échantillon d’éthanol analysé en
TC-EA (logiciel Isodat 2.0)........................................................................................ 160
Figure 3 : Spectrogramme de la mesure du rapport 2
H/1
H de l’éthanol............................ 161
Figure 4 : Spectrogramme de la mesure du rapport 18
O/16
O de l’éthanol......................... 162
Figure 5 : δ18
O et δ2
H des éthanols issus de miels et classés par origine botanique......... 165
Figure 6 : δ18
O et δ2
H des éthanols issus de miels en fonction de leur origine géographique
………………………………………………………………………………………165
Figure 7 : δ18
O et δ13
C des éthanols issus de miels et classés par origine botanique........ 166
Figure 8 a et b : Combinaison des résultats (D/H)1 en fonction de δ18
O et distribution de
(D/H)2 des éthanols issus de miels et classés par origine botanique.......................... 167
Figure 9 : Combinaison des résultats δ18
O et δ2
H des éthanols issus de sucres de céréales
et classés par origine botanique.................................................................................. 168
Figure 10 : Combinaison des résultats δ13
C et δ2
H des éthanols issus de sucres de céréales
et classés par origine botanique.................................................................................. 170
Figure 11 : Combinaison des résultats δ18
O et δ13
C des éthanols issus de sucres de céréales
et classés par origine botanique.................................................................................. 170
Figure 12 a et b : Combinaison des résultats (D/H)1 en fonction des δ18
O et distribution de
(D/H)2 des éthanols issus de sucres de céréales et classés par origine botanique...... 171
Figure 13 a, b et c: Combinaison des résultats δ2
H, δ13
C et δ18
O des whiskys analysés.. 173
Figure 14 a et b : Combinaison des résultats δ2
H, 13
C et 18
O pour rhums et tequilas....... 174
Figure 15 : Combinaison des mesures de 18
O et 2
H confirmant l’origine suspecte d’une
tequila analysée par le laboratoire des Douanes de Paris........................................... 176
Figure 16 a, b et c: Combinaison des résultats δ2
H, δ13
C et δ18
O des spiritueux analysés179
Figure 17 : Combinaison de δ18
O et δ2
H de boissons alcoolisées dérivées de fruits........ 181
20. 19
Figure 18 a et b : Combinaison des mesures de 2
H, de 13
C et de 18
O sur boissons
alcoolisées dérivées de fruits......................................................................................182
Figure 19 a et b : Combinaison des δ18
O de l’éthanol et de l’eau des vins analysés ........184
Figure 20 a et b : Combinaison des δ18
O et δ2
H de l’éthanol des vins analysés...............185
Figure 21 : Variation de l’18
O et du 2
H des vins des deux récoltes ...................................188
Figure 22 a et b : Combinaison des δ18
O et δ13
C de l’éthanol des vins analysés..............189
Figure 23 a et b : Combinaison des δ13
C et δ2
H de l’éthanol des vins analysés...............190
Chapitre VI
Figure 1 : Chromatogramme de l’arôme de pomme..........................................................204
Annexe B
Figure 1 : Chromatogramme des alcanes du « FID-mix ».................................................228
Figure 2 : Répétitivité des mesures de calibration du CO2................................................229
Annexe C
Figure 1 : Configuration du système TC-EA pour échantillons solides............................235
Figure 2 : Configuration du système TC-EA pour échantillons liquides ..........................236
Figure 3 : Test de stabilité du TC-EA pour les mesures de δ18
O. .....................................238
21. 20
Liste des symboles et des sigles
AE-SMRI
Analyseur Elémentaire – Spectrométrie
de Masse des Rapports Isotopiques,
En anglais, voir EA-IRMS.
AOP
Appellation d'Origine Protégée. En
anglais, Protected Designation of
Origin (PDO).
BEVABS
Bureau Européen des Vins, Alcools et
Boissons Spiritueuses.
BIPEA
Bureau Interprofessionnel d’Etudes
Analytiques.
C3
Voie de photosynthèse de Calvin-
Bassham dit aussi C3.
C4
Voie de photosynthèse de Hatch-Slack
dit aussi C4.
CAM
Voie de photosynthèse dit du
Crassulacean Acid Metabolism.
CE
Communeauté Européenne.
CG-C-SMRI
Chromatographie en phase Gazeuse –
Combustion – Spectrométrie de
Masse des Rapports Isotopiques. En
anglais, voir GC-C-IRMS.
COFAWS
Acronyme du projet : « Confirmation of
the Origin of Farmed And Wild
Salmon and other fish ».
EA-IRMS
Elemental Analyzer – Isotope Ratio
Mass Spectrometry. En français,
voir AE-SMRI.
EEA
European Economic Area. En français
EEE, Espace Economique
Européen.
EU
European Union.
FID
Flame ionization detector. Détecteur à
ionisation de flamme (DIF).
22. 21
GC-C-IRMS
Gas Chromatography – Combustion –
Isotope Ratio Mass Spectrometry.
En français, voir CG-C-SMRI.
GISP
Greenland Ice Sheet Precipitation.
IAEA
International Atomic and Energy
Agency, Vienne.
IGP
Indication Géographique Protégée. En
anglais, Protected Geographical
Indication (PGI).
IRMS
Isotopic Ratio Mass Spectrometry.
En français, voir SMRI.
OIV
Organisation (ex Office) International
de la Vigne et du Vin.
PAC
Politique Agricole Commune.
PSI
Pound-force per Square Inch. Unité de
pression. 1 PSI = 6.894757 kPa
RMN-FINS ®
Résonance Magnétique Nucléaire -
Fractionnement Isotopique Naturel
Spécifique. En anglais, voir SNIF-
NMR.
SLAP
Standard Light Antarctic Precipitation.
SMRI
Spectrométrie de Masse des Rapports
Isotopiques. En anglais, voir SMRI
SNIF-NMR
Site-specific Natural Isotopic
Fractionation – Nuclear Magnetic
Resonance. En français, voir RMN-
FINS.
STG
Spécialité Traditionnelle Garantie. En
anglais, Traditional Speciality
Guaranteed (TSG).
TC-EA
Total Combustion-Elemental Analyzer,
Analyseur Elémentaire à Combustion
Totale, couplé à un spectromètre de
masse de rapport isotopique.
UE
Union Européenne.
V-CDT
Vienna-Cañon Diablo Troilite.
V-PDB
Vienna-Pee Dee Belemnite. Standard de
référence international pour le rapport
23. 22
13
C/12
C et, plus rarement, pour le
rapport 18
O/16
O.
V-SMOW
Vienna-Standard Mean Ocean Water,
Eau Océanique Moyenne Standard.
Standard de référence international
pour les rapports 2
H/1
H et 18
O/16
O.
1,5-PD
1,5-pentanediole.
‰
Pour mille.
28. Introduction
27
Introduction
a détection des fraudes et l’authenticité des produits agro-alimentaires a
toujours été, et continue à être, une question ouverte. Ces délits posent un
problème à la fois de santé publique et de pertes économiques aux dépens des producteurs
honnêtes. Il n’y a presque pas de produits (vin, fromage, boissons alcoolisées ou non, etc.)
qui ne soient pas de potentielles cibles de falsification.
Aujourd’hui encore cela peut déclencher de vraies guerres commerciales entre les
pays producteurs. Dans le passé chaque pays édictait ses propres règlements, à présent
l’harmonisation est imposée par le Communauté Européenne (CE) dans le marché unique.
D’ailleurs, c’est sur la base de « cahiers des charges de production », qui
définissent les propriétés physico-chimiques d’un produit, les procédures et les zones
géographiques de production délimitées, que certaines marques de qualité sont concédées à
un producteur. Un vin supérieur de qualité supérieur peut être caractérisé par une
Appellation d’Origine Contrôlée (A.O.C.) ou même une Appellation d’Origine Contrôlée
et Garantie (A.O.C.G.). Depuis 1992, de nouvelles marques et logos de qualité [1]
peuvent
être appliqués aux autres catégories de produits, afin d’en protéger la réputation et
sauvegarder le consommateur des imitations.
L
29. Introduction
28
Les dernières lignes guides de la Politique Agricole Commune (PAC), encouragent
l’agriculture et l’élevage biologiques [2, 3]
et définissent une marque et un logo de qualité
spécifiques (mars 2000).
Suite à différents scandales et aux dangers pour la santé des citoyens (notamment
question ESB, plus connue au grand publique sous le nom « vache folle »), le concept de
traçabilité des produits s’impose [4-6]
et s’ajoute aux recherches traditionnelles de fraudes
et falsification.
Un des outils analytiques de plus en plus utilisé dans les vingt dernières années, est
l’analyse des rapports entre isotopes stables de bioéléments – 2
H/1
H, 13
C/12
C, 15
N/14
N,
18
O/16
O, 34
S/32
S – contenus dans un produit ou dans un composant de ce même produit.
Depuis environ quinze ans, la Communauté Européenne et d’autres organismes
internationaux ont adopté l’analyse isotopique pour détecter des contrefaçons de produits
tels que vins, jus de fruits et miels [7]
et pour contrôler et garantir l’authenticité de ceux-ci.
En fait, la combinaison des mesures du fractionnement isotopique naturel
spécifique par résonance magnétique nucléaire (RMN-FINS, en anglais SNIF-NMR) du
proton, 2
H/1
H, du rapport 13
C/12
C par spectrométrie de masse de rapports isotopiques
(SMRI ou, en anglais, IRMS) sur l’éthanol distillé, et du rapport 18
O/16
O sur l’eau,
permettent de révéler la dilution avec de l’eau et les ajouts frauduleux de sucre dans les
moûts et dans les jus de fruits. De même, les ajouts de sucre dans le miel sont détectables.
Les mêmes techniques peuvent être utilisées pour la détermination de l’origine
géographique d’un produit.
∗∗∗
Mon travail de thèse, conduit dans les laboratoires du BEVABS (Bureau Européen
des Vins, Alcools et Boissons Spiritueuses) de la Commission Européenne à Ispra (Italie),
se situe dans ce cadre, comme contribution aux recherches qui visent à la possible
utilisation des analyses des rapports isotopiques là où l’authenticité, l’origine botanique et
géographique, deviennent un facteur économique et de santé publique.
Bien que la plupart de nos travaux s’inscrive dans des Projets Européens aux buts
bien fixés, une autre part importante est constituée de recherche originale, visant à la
caractérisation et à la détermination isotopique de plusieurs produits agroalimentaires, en
soutien à la politique européenne sur la qualité.
30. Introduction
29
Les matrices qui font l’objet de nos études sont nombreuses et diverses : le glycérol
dans le vin, pour l’utiliser comme sonde possible de qualité ; l’éthanol dans les boissons
spiritueuses ; l’anhydride carbonique dans les boissons pétillantes, etc..
Les isotopes considérés dans nos travaux, sont le deutérium, le carbone-13, l’azote-
15 et l’oxygène-18. Les techniques – et donc les appareillages – utilisées pour les mesures,
sont multiples : d’abord la Chromatographie Gazeuse - Combustion couplée à la
Spectrométrie de Masse des Rapports Isotopiques (CG-C-SMRI, GC-C-IRMS), pour
13
C/12
C et 15
N/14
N dans des molécules cibles.
Un Analyseur Elémentaire couplé à la SMRI (AE-SMRI, en anglais EA-IRMS), a
été utilisé pour les mesures de 13
C/12
C et 15
N/14
N sur produits bruts et un appareil RMN
pour les teneurs spécifiques en deutérium dans l’éthanol.
Finalement, une toute nouvelle technique a été testée et mise au point pour
déterminer les rapports 2
H/1
H et 18
O/16
O dans l’éthanol : l’Analyseur Elémentaire à
Combustion Totale (TC-EA) couplé à la SMRI.
∗∗∗
English abstract
The studies included in this PhD thesis are a contribution to isotopic
characterisation of different foodstuff matrices and to the setting up of new methods of
isotope ratio mass spectrometry (IRMS) techniques applied to food authentication and to
detection of frauds, in the frame of European Union quality policies.
Hyphenated techniques of gas chromatography, elemental analyser and total
combustion elemental analyser coupled to IRMS (respectively: GC-C-IRMS, EA-IRMS,
TC/EA-IRMS) – and deuterium nuclear magnetic resonance (2
H-NMR) in support – were
used to measure ratios 1
H/2
H, 13
C/12
C, 15
N/14
N and 18
O/16
O of raw food samples or of
target components, such as glycerol from wine, n-butanol from apple flavour, ethanol of
spirits and CO2 from sparkling wine.
Keywords: Food authentication, EU quality policy, traceability, stable isotope ratio, mass
spectrometry, deuterium, hydrogen-2, carbon-13, nitrogen-15, oxygen-18, δ2
H, δ13
C, δ15
N, δ18
O,
IRMS, GC-C-IRMS, TC/EA, EA-IRMS, 2
H-NMR, (D/H), glycerol, Botrytis cinerea, sparkling
drinks, carbon dioxide, CO2, wine, beer, cider, effervescent water, soft-drinks, spirits, ethanol,
sugars, cereals, honey, apple aroma, n-butanol
31. 30
Bibliographie
1 Pour les marques de qualité, AOP/IGP/STG : Règlements (CEE) n° 2081/92 et n°
2082/92 du 14 juillet 1992
2 Règlement (CEE) n° 2092/91 du 24 juin 1991 pour l’agriculture et règlement
CE n° 1804/1999 relatif au secteur animal. Documents sur la Réforme de la Politique
Agricole Commune (PAC) sur le site Internet de la Direction Générale de l’Agriculture
(DG-AGRI) : http://europa.eu.int/comm/agriculture/index.htm
3 S. Mann – Why organic food in Germany is a merit good, Food Policy, 2003, 28, 459–
469
4 Libro bianco sulla sicurezza alimentare – Bruxelles, 12.1.2000, COM (1999) 719 def.
5 Règlement (CE) n° 178/2002 du Parlement européen et du Conseil du 28 janvier 2002
6 H. Przyrembel – Food labelling legislation in the EU and consumers information, Trends
in Food Science & Technology, 2004, 15, 360–365
7 G. Calderone, C. Guillou, N. Naulet – Utilisation réglementaire des analyses isotopiques
des aliments - Dix ans d'expérience européenne, L’actualité chimique, 2003, 8-9, 20-22
(voir Annexe A de cette thèse)
34. Chapitre I
33
Isotopes stables
1. HISTORIQUE
a démonstration de l’existence des isotopes remonte à 1913, quand J.J.
Thompson [1]
, en expérimentant sur des tubes remplis de néon, met en évidence
deux des trois isotopes de ce gaz, ayant des masses atomiques de 20 et 22. F.W. Aston [2]
en
découvrant le troisième isotope, le 21
Ne, confirme les résultats de Thompson six ans après. La
même année (1913), F. Soddy [3]
et A. Fleck introduisent le terme isotope, du grec ισος isos,
même, et τοπος topos, lieu. Ce terme décrit bien la propriété des éléments qui, bien que de
masses différentes, se situent au même endroit dans le tableau périodique des éléments de
Mendeleïev, parce qu’ils possèdent la même structure électronique et le même nombre de
protons. Les isotopes sont donc des atomes d’un même élément qui diffèrent par le nombre de
neutrons dans le noyau. Ce que nous appelons la masse atomique d’un élément n’est autre que
la masse moyenne des isotopes mélangés dans les rapports présents dans la nature.
A partir des études d’Aston [4]
, la recherche sur les isotopes – et les moyens pour les
mesurer – commence. Nos spectromètres de masse sont basés sur les instruments conçus par
Aston et Dempster. En une dizaine d’années, entre 1925 et 1935, les isotopes des éléments
L
35. Chapitre I
34
légers ont tous été découverts. En 1950, Nier [5]
conduit ses études sur le premier spectromètre
de masse dédié aux mesures des rapports isotopiques du carbone, de l’azote et de l’oxygène.
∗∗∗
D’abord, ce sont les géochimistes et les paléo-océanographes qui se sont intéressés à
l’application des isotopes stables. L’étude de molécules simples de la surface du globe, eau et
dioxyde de carbone, a permis de mieux connaître les cycles globaux des éléments, les
systèmes hydrothermaux et les roches. H. Craig introduit la notion, fondamentale, de
référence isotopique [6, 7]
. Dans les mêmes années, l’azote devient aussi l’objet d’études [8]
.
Plus tard, biologistes et botanistes développent de nouvelles théories sur les processus
biochimiques dans la nature sur la base des mesures d’abondance naturelle des isotopes
stables contenus dans la matière organique des plantes. Trois différentes voies
photosynthétiques sont mises en évidence, la C3 (Calvin-Bassham), la C4 (Hatch-Slack) et
celle dite CAM (Crassulacean Acid Metabolism), dont on verra plus loin dans ce chapitre les
effets de fractionnement sur la variabilité naturelle.
1.1. Applications
De nos jours, les analyses isotopiques sont de plus en plus variées et trouvent des
applications dans de nombreux domaines : études de biologie végétale et animale à travers le
carbone [9-19]
, l’azote [20-25]
ou l’oxygène [26-28]
; géochimie [8, 29-32]
, archéologie et
anthropologie [31, 33-36]
; pharmacologie [37-39]
et sciences forensiques [40-45]
, y compris les
substances stupéfiantes [46-54]
. Les isotopes stables sont aussi de plus en plus utilisés dans les
études environnementales [55-64]
et d’écologie animale [40, 65, 66, beaucoup d’autres travaux]
.
1.1.1. Domaine alimentaire : « food »
Enfin, le sujet qui nous intéresse le plus est l’application des isotopes stables dans le
domaine des produits agro-alimentaires [31, 67]
, en anglais « food ».
De nombreuses matrices alimentaires sont l’objet d’investigations en terme de contenu
isotopique. La caractérisation par analyse isotopique de composants de différentes origines
biosynthétique ou géographique, a permis de détecter plusieurs types de fraudes alimentaires,
autrement difficilement contrôlables. Elle a, en outre, contribué à typifier des produits
36. Chapitre I
35
destinés à recevoir des marques de qualité – AOP (Appellation d'Origine Protégée), IGP
(Indication Géographique Protégée) et STG (Spécialité Traditionnelle Garantie).
Les études pionnières sur les boissons fermentées, concernent les vins [68,69]
, vinaigres
[70-72]
, boissons spiritueuses [73, 74]
et bières [75, 76]
. Par la suite, des études ont été conduites sur
les jus de fruit [77-80]
, miels [81-83]
, huiles [84-86]
, mais aussi sur les arômes [87-91]
, extraits de
plantes à infusion [92-95]
et sirop d’érable [96]
. Diverses références sur les règlements de la CE
et des organismes internationaux qui décrivent les méthodes isotopiques utilisées pour
l’authentification de vins, jus de fruit, miel, sont reportées dans l’Annexe A.
Dernièrement, les méthodes analytiques isotopiques ont trouvé des applications dans
des études de matrices bien plus complexes que les molécules simples, que sont l’éthanol ou
la vanilline. Des produits d’origine animale ont été analysés : lait [97,98]
, fromages [99-103]
,
viande [104-106]
et poisson [107, 108]
.
Andreas Rossman a publié, en 2001, une revue de synthèse [109]
qui couvre, pour les
vingt-cinq dernières années, les différentes utilisations et les résultats des mesures de teneurs
isotopiques des éléments légers afin de caractériser et d’authentifier une grande variété
d’aliments.
1.2. Rapport isotopique et déviation
Dans la matière organique, les principaux composants élémentaires sont H, C, N et O.
Ils se présentent sous forme d’isotopes stables – H, D (2
H) ; 12
C, 13
C ; 14
N, 15
N ; 16
O, 17
O, 18
O
– mais aussi instables – T (3
H), 14
C –. Pour ces éléments, dans la nature, c’est la forme légère
qui prédomine.
Les pourcentages des éléments les plus concernés dans le domaine alimentaire sont
reportés dans le Tableau 1. Le soufre et le strontium, bien qu’ils ne soient pas pris en
considération dans les travaux de cette thèse, peuvent offrir des informations importantes sur
l’origine d’un produit. Le strontium, qui ne fait pas partie des éléments dits légers, est de plus
en plus utilisé pour vérifier l’origine géographique [110-112]
de produits de l’agriculture.
Les différences de proportion entre l’isotope lourd et le plus abondant, le léger, sont
toujours faibles, ainsi le 13
C est toujours présent à environ 1.1 % du carbone total. En 1950
McKinney introduit [113]
une notation spéciale, qui permet de manipuler plus facilement les
rapports isotopiques.
37. Chapitre I
36
Il est introduit le δ13
C (delta), qui exprime en ‰, pour mille, la déviation du rapport
13
C/12
C d’un échantillon par rapport à celui d’un standard international pris comme référence :
Equation 1
échantillon13
standard
R
δ C = -1 1000
R
⎛ ⎞
⎜ ⎟
⎝ ⎠
i où
13
12
C
R=
C
Ainsi, au lieu de dire que le rapport 13
C/12
C est de 0.011158 pour le CO2
atmosphérique et de 0.011237 pour le PDB (la référence internationale) ou, ce qui serait la
même chose, que l’écart entre les deux est de 80 atomes de 13
C par million d’atomes de
carbone, on calcule que le δ13
C du CO2 atmosphérique par rapport au PDB est de -7 ‰.
1.3. Facteurs de variabilité
La variabilité naturelle des abondances isotopiques dans les molécules organiques est
due aux diverses propriétés physico-chimiques de l’isotope léger par rapport à l’isotope lourd
d’un élément.
Les effets isotopiques deviennent visibles dès lors qu’ils produisent un fractionnement,
c'est-à-dire un enrichissement ou un appauvrissement d’un isotope par rapport à l’autre. Ils
sont de plusieurs natures et origines : de ceux à plus simple rationalisation, classés comme
physiques et chimiques, à ceux moins prévisibles, présents surtout dans les réactions
biologiques.
1.3.1. Effets isotopiques physiques
Les grandeurs physiques liées à la masse sont, bien sûr, affectées par la différence de
masse entre les isotopes. Un isotope léger d’un élément se déplace plus rapidement que
l’isotope lourd. Selon la loi de Graham pour les gaz, la vitesse d’expansion d’un gaz est
inversement proportionnelle à la racine carrée de sa masse. Par exemple, dans le cas de
l’hydrogène cette différence est très marquée, puisque le deutérium a une masse double de
celle de l’hydrogène de masse 1. A cause de cela, la différence de vitesse sera plus grande
entre les molécules de H2, « légères », qu’avec celles contenant du deutérium, et un
fractionnement isotopique sera observé.
38. Chapitre I
37
Tableau 1: Abondance naturelle moyenne, référence internationale utilisée et autres données
des principaux isotopes stables des éléments les plus utilisés dans l’authenticité des aliments
(pourcentages et rapports d’après les références [114], [109] et [115])
Elément Isotope
Abondance
relative (%)
Référence internationale et
Rapport isotopique (R)
Molécule
1
H 99.9855
Hydrogène
2
H (D) 0.0145
V-SMOW (Vienna-Standard Mean Ocean
Water)
2
H/1
H = 1.5576 · 10-4
H2O
12
C 98.892
Carbone
13
C 1.108
V-PDB (*)
(Vienna-Pee Dee Belemnite)
13
C/12
C = 1.1237 · 10-2
CaCO3
14
N 99.6337
Azote
15
N 0.3663
AIR(Azote atmosphérique)
15
N/14
N = 3.6765 · 10-3
N2
16
O 99.7586
17
O 0.0375Oxygène
18
O 0.2039
V-SMOW (Vienna-Standard Mean Ocean
Water) ou V-PDB
18
O/16
O = 2.0052 · 10-3
- 2.0672 · 10-3
H2O ou
CaCO3
32
S 95.015
33
S 0.750
34
S 4.215
Soufre
36
S 0.02
V-CDT (#)
(Vienna-Cañon Diablo Troilite)
34
S/32
S = 4.41509 · 10-2
Ag2S
84
Sr 0.56
86
Sr 9.86
87
Sr 7.02
Strontium
88
Sr 82.56
NIST SRM 987 (National Institute of
Standards and Technology)
87
Sr/86
Sr = 0.710340 (§)
SrCO3
(*)
Le PDB n’est plus disponible et d’autres matériaux de référence internationaux sont utilisés. Ces
standards sont distribués par l’IAEA, International Atomic and Energy Agency ou le NIST.
(#)
Le CDT originel était le FeS obtenu d’un météorite de fer. Ce standard primaire a été substitué par le
V-CDT, Ag2S, à cause de son homogénéité insuffisante.
(§)
Pour le strontium, le rapport absolu est utilisé plus souvent que la notation δ87
Sr rapporté à un
certain standard.
39. Chapitre I
38
Les fractionnements isotopiques d’origine physique se rencontrent couramment lors
d’étapes de séparation ou de purification. La centrifugation, technique de séparation qui
fonctionne grâce à la différence de masse des composants en suspension, est le phénomène
fractionnant le plus souvent rencontré. Elle est, en fait, utilisée dans l’industrie afin d’enrichir
ou appauvrir isotopiquement un composé.
Un autre phénomène qui induit un fractionnement isotopique est la diffusion. Elle tend
à égaliser des concentrations dans un milieu liquide, des pressions dans un gaz, ou encore
intervient lors du passage à travers une membrane.
Bien sûr, les effets isotopiques peuvent jouer sur la volatilité d’un produit [116]
.
1.3.2. Effets isotopiques chimiques
Au cours d’une réaction quelconque, chimique, biochimique ou dans les changements
d’état, les différences de masse peuvent avoir une influence sur la vitesse de réaction (effet
cinétique) ou sur l’état énergétique du système (effet thermodynamique) [117]
.
Effets isotopiques cinétiques
On parle d’effets isotopiques cinétiques lorsque le fractionnement d’un élément est dû
à l’influence des différences de masse atomique des isotopes sur la vitesse d’une réaction.
Cela peut être dû à deux causes : la première parce que les molécules contenant les isotopes
plus légers sont plus mobiles que celles contenant les isotopes lourds.
Le deuxième facteur est dû aux liaisons chimiques qui sont plus fortes avec les atomes
lourds qu’avec les atomes légers correspondants. Ainsi, par exemple, la probabilité de rupture
de liaison est plus grande pour l’isotope 14
N que pour le même composé contenant 15
N. Donc,
si au cours d’une réaction chimique, il y a une étape de rupture d’une liaison X-N, très
probablement le produit final sera appauvri en 15
N par rapport au produit de départ.
Mathématiquement, cela se démontre par la relation qui combine ces deux facteurs,
masse et force de liaison (en forme d’énergie d’activation), avec les constantes de réaction,
dans l’Equation 2, où k est la constante de vitesse de la réaction, µ est la masse réduite, E est
l’énergie d’activation et l’astérisque se réfère à l’espèce la plus lourde. T est la température
absolue et R la constante des gaz parfaits.
40. Chapitre I
39
Equation 2
( )
RT
EE
e
k
k
∗
−
−
∗
∗
=
µ
µ
D’après cette équation, l’effet cinétique dépend de la différence d’énergie d’activation
entre les deux espèces isotopiques et n’est pas affecté par le type particulier de cinétique. Le
rapport des constantes cinétiques, dans la plupart des cas, est supérieur à l’unité (µ*
> µ et
E*
> E) et donc les produits de réaction seront enrichis en isotope léger (k > k*
).
En outre, on parlera d’effet isotopique cinétique primaire ou secondaire, selon que
l’effet de l’isotope affecte directement la vitesse de réaction à cause de la rupture d’une de ses
liaisons ou si l’influence sur la vitesse ne s’exprime pas directement avec une modification de
ses liaisons.
Effets isotopiques thermodynamiques
L’effet isotopique thermodynamique est lié à la différence d’énergie libre entre
espèces à composition isotopique différente : les espèces plus lourdes possèdent une énergie
libre inférieure, et cela rend le système plus stable. Ainsi, la constante d’équilibre pour les
espèces les plus lourdes est plus faible, ce qui explique leur plus grande inertie à réagir et
donc leur tendance à se concentrer dans les phases condensées.
La règle générale pour prévoir l’effet thermodynamique et ses conséquences sur le
fractionnement isotopique est que l’isotope lourd se retrouve préférentiellement dans le
composé chimique dans lequel il est le plus fortement lié. Un exemple, l’accumulation de
l’isotope 13
C dans l’ion bicarbonate [116]
:
13 12 - 12 13 -
2(g) 3(aq) 2(g) 3(aq)CO +H CO CO +H CO⎯⎯→←⎯ K=1.0092 (0 °C)
A 0 °C, donc, l’équilibre est en faveur de l’échange du 12
C de l’ion bicarbonate avec le
13
C du CO2 en phase gazeuse.
41. Chapitre I
40
Parallèlement, un autre équilibre se produit entre le CO2 et l’eau [118]
à température
ambiante :
18 18 16 16
2(g) 2 (l) (g) 2 (l)CO +H O C O O +H O⎯⎯→←⎯ K=1.041 (25 °C)
Dans ce cas, la réaction d’échange conduit l’18
O des molécules d’eau à s’accumuler
dans le CO2, notamment celui de l’atmosphère. Cette réaction d’échange est mise à profit
pour mesurer la teneur en 18
O de l’eau à partir du CO2 avec lequel elle a été préalablement
équilibrée.
Le même type d’équilibre et d’effet thermodynamique explique le fractionnement
isotopique entre eaux marines, eaux de surface et nuages, qui se forment par évaporation de
ces eaux. Ainsi, à 25 °C, la vapeur en équilibre avec le liquide est appauvrie en deutérium
d’environ un facteur 0.96 [119]
. On verra plus loin ce type de mécanisme, à propos du
fractionnement de l’oxygène et du deutérium dans la nature.
Le même effet isotopique de nature thermodynamique, analogue à celui des mers et
des nuages, est retrouvé : lors des distillations, la composition isotopique des différentes
fractions recueillies varie au fur et à mesure de l’avancement.
1.3.3. Autres effets isotopiques
Les effets isotopiques cinétiques et thermodynamiques rendent compte des
fractionnements produits au cours de chaque réaction, chimique ou biochimique, des
processus de diffusion, adsorption, évaporation et en général, d’un quelconque changement
d’état. Par contre, d’autres situations de fractionnement peuvent être provoquées par des
phénomènes qui altèrent l’équilibre d’une réaction, tels que le changement instantané de la
température ou le déplacement d’un réactif ou d’un produit de réaction. Ce type de
fractionnement de « non équilibre » n’est pas prévisible selon des règles prédéterminées.
Les réactions enzymatiques, processus irréversibles, provoquent des fractionnements
de ce type, souvent de grande importance. Ce sont, en fait, les réactions enzymatiques qui ont
lieu dans la nature qui nous intéressent le plus et que nous exploitons grâce à la variabilité
qu’elles induisent en terme de fractionnement de produits biochimiques. Dans le Tableau 2
quelques exemples de ces réactions sont reportés.
42. Chapitre I
41
Tableau 2: Fractionnement dans certaines réactions enzymatiques [120]
Réactions Degré de fractionnement (‰)
Photosynthèse 2 2 2 6 12 66 CO +6 H O 6 O +C H O 2
13 13
sucres COδ C - δ C -17 /-5
Réduction du sulfate
- +
2 4 2 2H SO +8 e +8 H H S+4 H O
4 2
34 34
SO H Sδ S - δ S +20/30
Méthanogènes - +
4 2 2CH +2 H O CO +8 e +8 H 4 2
13 13
CH COδ C - δ C -80
2. CARBONE : INDICES SUR L’ORIGINE BOTANIQUE
La nature nous offre une grande gamme de valeurs δ13
C, et donc du fractionnement
isotopique auquel le carbone est soumis. La Figure 1 indique comment le carbone est
concerné par le fractionnement isotopique pendant son cycle. La Figure 2 montre la
distribution de valeurs δ13
C de plusieurs composés et standards de référence.
Figure 1 : Variabilité isotopique du 13
C dans plusieurs formes du carbone en relation à son
cycle dans l’environnement [117]
δ13
C (‰)
43. Chapitre I
42
Les deux processus fondamentaux du cycle du carbone qui provoquent un
fractionnement isotopique, sont l’assimilation du carbone par les organismes vivants et les
changements entre l’atmosphère et l’hydrosphère. Tandis que le premier phénomène
Figure 2 : Diagramme [121]
de composés et standards de référence contenant du carbone et
leur distribution au long de l’échelle δ13
C
44. Chapitre I
43
provoque un appauvrissement en 13
C (dit effet isotopique biologique), l’autre produit un
enrichissement en 13
C.
Un troisième processus, qui se produit à plus petite échelle mais qui nous intéresse
beaucoup, est le fractionnement lié aux métabolismes des végétaux et des animaux.
Le premier processus, le plus important, est l’assimilation du carbone de l’anhydride
carbonique par les plantes lors de la photosynthèse. Le 13
C du CO2 fractionne principalement
lors de sa transformation à sucres :
Lors de la photosynthèse, la formation des liaisons C–C est favorisée si les atomes de
C sont plus légers et plus mobiles. Ainsi, on trouvera que les produits organiques, dérivés des
plantes (cellulose, sucres, métabolites secondaires) sont moins riches en 13
C et ils auront des
valeurs de δ13
C plus faibles que celle du CO2 atmosphérique, notamment
δ13
C plantes < -7 ‰ (vs PDB) (-7 ‰ est la valeur δ13
C du CO2 atmosphérique).
Trois cycles photosynthétiques principaux ont été identifiés et caractérisés, sur la base
de leurs différentes manières d’assimiler le CO2. Ces trois groupes de plantes se caractérisent
par des δ13
C bien différents.
Ces trois groupes (C3, C4 et CAM) se distinguent par des différences de conformation
des tissus foliaires (voir Figure 3), qui influencent la concentration du CO2 entrant. Ces voies
photosynthétiques différentes sont représentées de manière simplifiée dans les schémas de
Figure 4 a et b.
La principale voie d’assimilation est celle qui a lieu dans la plupart des plantes, décrite
par Calvin et Bassham [122]
, elle est aussi dite C3, parce que l’anhydride carbonique est fixé
d’abord pour donner un composé intermédiaire à trois atomes de carbone.
Le CO2 atmosphérique, une fois entré dans le cytoplasme, se combine au ribulose-
1,5diphosphate (RuBP), sous l’action de la ribulose-1,5diphosphatecarboxylase (ou Rubisco)
à la lumière, et donne deux molécules d’acide phosphoglycérique (premier produit stable
synthétisé). C’est ce composé à trois atomes de carbone qui a donné son nom au mécanisme
C3.
2 2 2 6 12 66 CO +6 H O 6 O +C H O 2
13 13
sucres COδ C - δ C -17 /-5 ‰
45. Chapitre I
44
Le cycle C3 est typique des espèces originaires des zones froides ou tempérées, des
exemples sont reportés dans le Tableau 3. Les composés des plantes C3 montrent une gamme
de variation de δ13
C à peu près comprise entre -22 et -32 ‰.
Un deuxième mécanisme de fixation du CO2 est celui dit «cycle de Hatch et Slack»,
qui l’ont étudié [124]
, ou C4 en analogie avec le cycle C3 : dans ce cas les premiers composés
intermédiaires synthétisés à partir du CO2 sont à quatre atomes de carbone. La fixation initiale
du CO2, sous l’action de la phosphoénolpyruvate (PEP) carboxylase, conduit à l’acide
oxaloacétique qui est immédiatement converti en acides malique et aspartique. Ces acides (à
quatre atomes de carbone) sont ensuite décarboxylés et le CO2, d’abord stocké dans les parois
cellulaires, est libéré et puis repris par la RuBP pour suivre le cycle de Calvin.
Figure 3 : Différentes physiologies des tissus foliaires
Les différences dans la
physiologie des tissus foliaires et
donc pour l’assimilation de la
CO2 atmosphérique, expliquent
la variation entre les valeurs des
rapports isotopiques des
métabolites des plantes C3, C4 et
CAM. (Image re-élaborée d’après
[123]
)
Tableau 3 : Exemples des plantes les plus communes des trois groupes décrits. Plus de 95%
des plantes appartiennent au groupe des plantes C3 ; moins d’1% sont des plantes C4
plantes C3 plantes C4 plantes CAM
Betterave, blé, cacahouètes,
noix de coco, orge, palm,
pommes de terre, prune,
raisin, riz, seigle, soja
haricots, tournesol
Canne, maïs, millet,
sorgho
Agaves, ananas, cactus,
vanille
46. Chapitre I
45
Figure 4 a et b : Schéma simplifié des cycles photosynthétiques C3 (haut) et C4
Cycle
C3
Acide
oxaloacéti
que (4C)
Phosphoénol
pyruvate
carboxylase
Acide
pyruvique
Acide
phosphoénol
pyruvique
Acides
malique et
aspartique
(4C)
Triose
phosphate
(3C)
Acide 3-
phosphogl
ycérique
(3C)
Ribulose–
5
phosphate
Ribulose-
1,5diphosp
hate (5C)
Transformations
successives des
sucres
phosphates
(2C, 3C, 4C,
5C, 6C, 7C)
Amidon, sucres
(δ13
C ~ -33/-22 ‰)
Hexose phosphate
(6C)
ATP
H2O, CO2
(δ13
C ~ -7 ‰)
ATP, NADPH
Stomate
dans la
feuille
CO2 atm.
Amidon, sucres
(δ13
C ~ -15/-10 ‰)
ATP
CO2 (δ13
C ~ -7 ‰)
CO2, H2O
Stomate
dans la
feuille
CO2 atm.
47. Chapitre I
46
Le cycle C4 est surtout celui des plantes d’origine tropicale. Bien qu’elles soient en
minorité (Tableau 3), elles sont parmi les espèces les plus intensivement cultivées par
l’homme. Les plantes C4 montrent des valeurs de δ13
C comprises entre -9 et -16 ‰, elles sont
donc bien plus riches en 13
C que les plantes C3.
Finalement, le troisième groupe de plantes est celui dit CAM (Crassulacean Acid
Metabolism), dont le cycle a été mis en évidence par Whelan, Sackett et Benedict [125, 126]
. Ces
plantes possèdent les deux mêmes enzymes que les plantes des groupes C3 et C4, mais elles
alternent ces mécanismes pendant le jour et la nuit. Le CO2 est initialement fixé par la PEP
carboxylase en acides C4, pendant la nuit. Le jour, le CO2 libéré se fixera au RuBP, selon le
cycle C3. Il existe des espèces CAM facultatives et d’autres obligées, c'est-à-dire qui peuvent
ou non passer d’un mécanisme à l’autre quand les conditions deviennent favorables.
Les plantes les plus connues appartenant au groupe des CAM, comme les cactus, les
agaves, sont originaires de lieux désertiques. D’autres plantes typiques sont l’ananas
(broméliacée) et l’orchidée de la vanilline (Vanilla planifolia). Comme on peut s’y attendre,
l’intervalle de valeurs de δ13
C est plus étendu et se superpose à celui des plantes C3 et C4
(voir en Figure 5), allant de -30 à -10 ‰.
Il faut ajouter que la composition isotopique du CO2 atmosphérique, à laquelle on
attribue une valeur moyenne de -7 ‰, peut sensiblement changer d’une zone à l’autre. Par
exemple, dans les forêts denses, la valeur de δ13
C peut descendre à -11 ‰ à cause de la
contribution de l’anhydride carbonique produit par décomposition de la matière organique.
Dans les endroits très habités, la valeur peut diminuer encore, de 2 à 8 ‰, parce que le CO2
technogénique, provenant de la combustion des combustibles fossiles (pétrole, charbon) est
plus pauvre en 13
C, et sa contribution abaisse donc la valeur totale de δ13
C du CO2 des villes
et centres industriels et donc influence la composition isotopique des plantes dans les environs
[127,128]
. La valeur moyenne de δ13
C du CO2 atmosphérique montre aussi des variations [129]
au
cours des années.
Les autres facteurs qui influencent la composition isotopique des plantes peuvent être
la disponibilité en eau, l’humidité relative, la température, dans la mesure où ils peuvent agir
sur l’ouverture des stomates. Une faible disponibilité en eau provoque, chez les plantes C3,
une fermeture des stomates, sous le stress hydrique, et cela conduit à un enrichissement
isotopique. Ce même effet pour les plantes C4 est de signe opposé.
48. Chapitre I
47
3. L’AZOTE ET SA VARIABILITE DANS LA NATURE
Le réservoir naturel de N2 est l’azote moléculaire de l’air, qui en contient presque
80%. Environ 0.4 % de cet N2 est composé de l’isotope 15
N. L’azote est transformé dans ses
nombreuses formes et états d’oxydation surtout par des processus physiques et par l’action de
microorganismes qui métabolisent les composés azotés en azote inorganique (nitrate et
ammoniaque) et azote organique (aminoacides et protéines).
Le composé standard de référence est l’azote moléculaire de l’air. Donc, presque tout
l’azote accessible à la surface de la planète a la valeur δ15
N = 0 ‰. La variabilité naturelle se
situe donc autour de cette valeur, comme le montre la Figure 6.
Figure 5 : Modèle du fractionnement du 13
C des plantes et chez les mammifères herbivores
qui s’en nourrissent (d’après une figure dans [130]
)
CAM
δ 13
C (‰)
13
C/12
C
C3 C4
49. Chapitre I
48
Figure 6 : Diagramme [121]
de composés et standards de référence contenant de l’azote et leur
distribution dans l’échelle δ15
N
Le Tableau 4 récapitule les différents processus qui donnent lieu au fractionnement de
l’azote dans la nature. Une première différentiation parmi les δ15
N des plantes est produite par
le fait qu’elles fixent ou non de l’azote atmosphérique. Comme le montre la Figure 7, tandis
que les légumineuses ont des valeurs très proches de zéro, les espèces souterraines (pommes
50. Chapitre I
49
de terre, carottes) montrent des valeurs plus élevées, car leur source d’azote provient du sol,
donc de formes azotées déjà fractionnées, telles les nitrates.
La même figure donne une idée du fractionnement de l’azote présent dans la chaîne
trophique, plus on monte dans cette chaîne, plus fort est l’enrichissement en 15
N (+3 ‰ à
chaque étape [131, 22]
). L’isotope le plus léger étant le plus facile à éliminer, l’15
N s’accumule
dans les tissus. Ainsi, les animaux carnivores ont des valeurs de δ15
N plus élevées que celles
des herbivores, dont ils se nourrissent. Ce genre de mécanisme, pourrait donner des indices
sur le régime alimentaire d’un animal, pour dépister, par exemple, si un bœuf a été élevé à
l’aide de farines d’origine animale ou plutôt avec un régime végétal, ou encore si un poisson
est sauvage ou d’élevage.
Le fractionnement isotopique de l’azote dépend aussi d’autres facteurs tels que la
profondeur et la pente du sol, ses perméabilité et salinité. En outre, la dégradation des
biomasses organiques apporte un fort enrichissement en 15
N (de +10 à +30 ‰).
Figure 7 : Modèle du fractionnement de l’azote entre les plantes et les animaux (d’après une
figure dans [130]
)
15
N/14
N
N2-fixateurs Non N2-fixateurs
δ 15
N (‰)
51. Chapitre I
50
Tableau 4: Processus à l’origine du fractionnement isotopique de l’azote (d’après une table
synoptique de [132]
)
Processus Description Degré de fractionnement
Fixation
Des réactions qui transforment l’azote
moléculaire de l’air en autres formes azotées :
o l’activité bactérienne, par exemple de
l’enzyme nitrogénase chez les plantes
légumineuses;
o processus physiques qui produisent des
températures élevées (décharges électriques,
incendies)
o activités humaines (production d’énergie,
d’engrais chimiques, agriculture)
–3/+1 ‰
(pour plantes légumineuses) [133]
Assimilation
Processus d’incorporation des composés azotés
(NOx, NH3) par les microorganismes ou les
plantes. D’abord les oxydes d’azote sont réduits
en ammonium et ensuite incorporés dans le
matériel organique.
L’assimilation favorise l’incorpo-
ration de 14
N par rapport à 15
N,
avec un fractionnement moyen de
–0.5 ‰
Ce fractionnement est néglige-
able dans les plantes.
Dissimilation
Réactions métaboliques qui exploitent l’azote
assimilé
Minéralisation
Réactions de transformation de l’azote organique
du sol en ammonium.
±1 ‰
Nitrification
Processus d’oxydation à plusieurs étapes qui
produit du nitrate à partir d’ammonium.
-12/-29 ‰
Volatilisation
Réaction de volatilisation de l’ammonium sous
forme de gaz du sol à l’atmosphère (plus
marquée dans les sols alcalins)
+20 ‰
Dénitrification Réaction de réduction des nitrates en N2. Enrichissement en 15
N
52. Chapitre I
51
Le facteur principal de fractionnement dans l’agriculture est la pratique de la
fertilisation. En fait, les engrais artificiels sont fabriqués à partir de l’N2 de l’air, par le
procédé Haber de production d’ammoniaque, mais aussi d’urée, de nitrate d’ammonium et de
nitrate de potassium. Ces produits de synthèse possèdent des teneurs en 15
N très faibles, entre
-0.2 et +2 ‰, d’après des mesures réalisées dans notre laboratoire sur plusieurs fertilisants du
commerce, alors que les engrais d’origine animale (fumiers) ont des valeurs de δ15
N
supérieures à +5/+8 ‰.
Les valeurs de δ15
N des plantes sont généralement corrélées aux valeurs des nitrates et
de l’ammonium présents dans le sol de culture, en tenant compte de la somme des
phénomènes de fractionnement vus précédemment, y compris le fractionnement lié aux
processus d’assimilation de l’azote des composés organiques [134]
pendant le métabolisme
végétal.
4. DEUTERIUM ET OXYGENE : ORIGINE GEOGRAPHIQUE
Les eaux, marines et météoriques, constituent le seul réservoir d’hydrogène et une
partie de celui d’oxygène sur la planète, ainsi ces deux éléments ont un destin commun et ce
sont les mêmes processus qui fractionnent leurs isotopes lourds stables, respectivement le
deutérium et l’oxygène-18.
Le fractionnement cinétique de ces isotopes lourds, 2
H ou D et 18
O, est exactement
similaire à celui du carbone, c'est-à-dire que l’on observe un fractionnement dû à la plus
grande vitesse de diffusion des molécules légères.
La cause majeure de fractionnement de l’eau, et de ses isotopes, est le changement
d’état physique, entre les phases liquide et vapeur, par évaporation et condensation. De
manière très simple : les isotopes plus lourds sont extraits plus difficilement, de la phase
liquide jusqu’à la phase gazeuse et, de plus, ils se condensent plus facilement. En outre, les
équilibres de phase sont influencés par la température.
Ainsi, la variabilité des valeurs δ18
O et δ2
H (ou δD) des eaux météoriques est liée aux
cycles d’évaporation des océans et des condensations successives qui engendrent les
précipitations. La composition isotopique de l’eau océanique (de -1 à 0.7 ‰ [120]
) est proche
de celle du standard de référence V-SMOW, pour lequel les valeurs δ2
H et δ18
O sont nulles
(voir Tableau 1).
53. Chapitre I
52
Figure 8 : Carte des valeurs moyennes de δ18
O des précipitations des années 1992/93 [135]
54. Chapitre I
53
La Figure 8 représente la distribution, au niveau mondial, des valeurs moyennes de
δ18
O des précipitations, pour les années 1992/93. Cette illustration montre une caractéristique
très importante : l’abondance isotopique de l’oxygène-18 (et du deutérium) dans les eaux est
corrélée à la situation géographique.
Provoqué par l’influence de la température, on peut constater un effet latitude sur le
fractionnement : plus on s’approche de pôles, plus les eaux météoriques sont pauvres en 18
O
et 2
H (valeurs de δ ‰ plus négatives : δ18
O -50 ‰ et δ2
H -495 ‰ en Antarctique). Bien sûr, il
y a des exceptions, des déviations, dues aux courants océaniques chauds, par exemple le long
de la côte orientale de l’Amérique du Sud à celle de l’Océan Atlantique, allant du Mexique à
la Scandinavie.
La Figure 9 montre l’effet direct de la température sur la variabilité des valeurs de
δ18
O dans les masses d’eau évaporées des mers.
Figure 9 : Effet de la température sur le fractionnement de l’oxygène dans une masse de
vapeur d’eau [120]
55. Chapitre I
54
Les déviations à l’effet latitude, sont provoquées par l’effet continental, comme le
montre la Figure 10 dans le cas du fractionnement de l’hydrogène des précipitations. Cet
effet intéresse les masses d’eau qui, en se déplaçant de la surface de la mer vers le continent,
subissent les effets topographiques et les caractéristiques spécifiques du climat.
Il en résulte que les précipitations, tout au long des côtes, sont enrichies en isotopes
lourds par rapport aux régions continentales, plus froides (appauvrissement moyen en 18
O
d’environ -2.8 ‰ tous les 1000 km de distance aux côtes [136]
).
Figure 10 : Schématisation du fractionnement de l’hydrogène des eaux météoriques
(adaptation sur d’un original fourni gracieusement par Thermo-Italia)
Une autre contribution géographique au fractionnement, est l’effet de l’altitude : une
fois à l’intérieur du continent, les masses d’eau s’appauvrissent encore, en δ18
O de -0.15 à
-0.5 ‰ pour chaque augmentation de 100 m d’altitude.
La variation de valeurs de δ2
H et δ18
O provoquée par l’alternance des saisons n’est pas
non plus négligeable. Pendant la période estivale, l’augmentation de température conduit à un
enrichissement en isotopes lourds, surtout sur les continents.
Les eaux des nappes phréatiques ont une composition isotopique comparable à celle de
la moyenne annuelle des précipitations, elles dépendent donc des facteurs géographiques
(latitude, altitude, distance des océans ou continentalité), mais pas des facteurs saisonniers.
OCEAN CONTINENT
-94 ‰
Vapeur
-110 ‰
Vapeur
-126 ‰
Vapeur
-14 ‰
Pluie
-30 ‰
Pluie
δ2
H = 0
56. Chapitre I
55
∗∗∗
Dans les végétaux, contrairement au carbone, la composition isotopique en 2
H et 18
O
de l’eau végétale n’est pas strictement liée à l’origine botanique. Pour le fractionnement chez
les plantes et leurs métabolites, il faut tenir compte des types de fractionnement vus
précédemment, surtout dans le cas de l’hydrogène dont l’eau est la seule source pour la
photosynthèse.
Apparemment la discrimination provoquée par les enzymes du métabolisme des
plantes peut être négligée [137]
et ce n’est que dans les feuilles que se produit un
fractionnement isotopique, causé par l’évapotranspiration. Cet effet est encore une fois
influencé par la température et l’humidité relative.
Ainsi, une plante « aérienne » comme la vigne présente une plus forte
évapotranspiration que la betterave à sucre, qui est une plante souterraine. Ceci se traduit par
un plus fort enrichissement en deutérium dans les sucres photosynthétisés par la vigne que
dans ceux issus de la betterave. Ceci est mis à profit par la méthode RMN-FINS qui mesure
l’enrichissement site par site de l’alcool de fermentation.
Les plantes utilisent les eaux de surface venant des précipitations, de rivières ou des
infiltrations dans le sol. En conséquence, on peut s’attendre à ce que les δ2
H et δ18
O de l’eau
du végétal soient une empreinte de l’origine géographique d’un produit agricole. Des
variations d’une année à l’autre, fonction de la pluviométrie et du climat sont prévisibles. Cela
reste valide s’il n’y a pas ajout d’eau d’autre origine ou élimination d’eau pendant le
processus de production, comme dans les jus de fruit, ou le fromage par exemple.
Il est bon de préciser que dans le cas de l’oxygène, les plantes utilisent aussi comme
source le CO2 et l’O2 de l’air. Comme ces deux sources ont des valeurs δ18
O presque
constantes au niveau planétaire – de +40.3 à +42.5 ‰ [138]
, selon la latitude et l’altitude, pour
CO2 et de +23.5 à +23.8 ‰ [139, 140]
pour O2 – la teneur en 18
O de l’eau dans les plantes n’est,
en première approximation, influencée que par celle des eaux absorbées.
Par contre, l’incorporation d’oxygène dans les composés organiques lors des différents
processus métaboliques est accompagnée d’un fort fractionnement isotopique. Par exemple, le
δ18
O de la cellulose est très bien corrélé avec celui de l’eau foliaire mais avec un
enrichissement d’environ +27 ‰, à cause des fractionnements isotopiques qui se produisent
lors du passage de l’oxygène aux groupes carboxyliques [26]
.
57. Chapitre I
56
Le diagramme de la Figure 11 montre la variabilité des valeurs de δ2
H de composés et
de standards de référence hydrogénés. On peut remarquer que la plupart des composés
possèdent des valeurs négatives sur l’échelle V-SMOW.
La Figure 12 montre la distribution des valeurs de δ18
O de plusieurs types de
composés et produits standards, par rapport aux deux échelles, V-SMOW et V-PDB.
Figure 11 : Diagramme [121]
de composés et standards de référence contenant de l’hydrogène
et leur distribution dans l’échelle δ2
H
58. Chapitre I
57
Figure 12 : Diagramme [121]
de composés et standards de référence contenant de l’oxygène et
leur distribution dans l’échelle δ18
O
59. 58
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