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Calderone_G_PhD_Thesis_Distribuibile

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Calderone_G_PhD_Thesis_Distribuibile
Application des
techniques isotopiques
modernes pour la
caractérisation de produits alimentaires
et de boissons
THÈSE DE DOCTORAT
Discipline : Chimie analytique
Spécialité : Sciences Agro-alimentaires
présentée et soutenue publiquement par
Giovanni CALDERONE
Institute for Health
and Consumer Protection
EUROPEAN COMMISSION
Joint Research Centre
DIRECTORATE-GENERAL
Université de Nantes
Faculté des Sciences et des Techniques
École Doctorale - Chimie Biologie
Rapporteurs
M. ARNAUD Maurice, Nestlé SA Nutrition Vevey, Suisse
M. BERTRAND Alain, Professeur Université Bordeaux II
Examinateurs
M. GUILLOU Claude, Joint Research Centre Ispra, Italie
Mme. LEES Michèle, Eurofins Scientific SA Nantes
M. NAULET Norbert, Professeur Université de Nantes
M. REMAUD Gérald, Professeur Université de Nantes
Directeur de Thèse
M. NAULET Norbert
le 18 mars 2005, devant le jury ci-dessous
Commission Européenne
Centre Commun de Recherche (DG JRC)
Institut de Santé et Protection des Consommateurs (IHCP)
Unité Exposition Physique et Chimique (PCE) / BEVABS
Via Enrico Fermi, TP 740
I-21020 Ispra (VA), Italie
Tel.: +0039 0332 78 5668
Fax: +0039 0332 78 9303
Email: ihcp@jrc.it
Webs: http://ihcp.jrc.cec.eu.int/
http://hosting.jrc.cec.eu.int/pce/
Éditeur: Giovanni Calderone
Photo: The Natural History Museum (London), JRC (Ispra)
Cover: José-Joaquín Blasco
Legal Notice
Neither the European Commission nor any person acting on behalf of the Commission
is responsible for the use that might be made of the information contained in this production.
SPI nº 04.216
Version revisée
© European Communities, 2004
Reproduction authorisée si la source est mentionnée
Imprimée en Italie
MISSION DU CCR
Le Centre commun de recherche a pour mission de fournir une aide scientifique et
technique adaptée au client pour la conception, l’élaboration, la mise en oeuvre et le
suivi des politiques de l'Union européenne. En tant que service de la Commission
européenne, il agit comme centre de référence scientifique et technologique pour
l'Union. Proche du processus d'élaboration des politiques, il sert l'intérêt commun des
États membres tout en étant indépendant des intérêts particuliers, privés ou nationaux.
3
Remerciements
Ce travail est le fruit de trois années de recherche menées au sein des laboratoires
du BEVABS/CCR à Ispra (Italie) en collaboration avec le Laboratoire d'Analyse
Isotopique et Electrochimique de Métabolismes de l'Université de Nantes.
Je tiens à remercier Monsieur le Professeur Norbert Naulet de l'Université de
Nantes pour avoir accepté de diriger ma thèse et pour sa disponibilité me permettant ainsi
de progresser professionnellement et humainement.
Je remercie également Messieurs Claude Guillou et Fabiano Reniero pour m’avoir
accueilli aux laboratoires du CCR, pour leurs toujours stimulants défis et précieux conseils
et surtout pour m’avoir laissé une complète autonomie de gestion de mes recherches.
Je suis très flatté que Monsieur Maurice Arnaud du Centre de Recherche de Nestlé
et Monsieur le Professeur Alain Bertrand de l’Université de Bordeaux aient accepté de
juger ma thèse. Je suis aussi très heureux de retrouver dans le jury Monsieur Gérald
Remaud de l’Université de Nantes et Madame Michèle Lees d’Eurofins qui, avec Eric
Jamin, m’ont introduit dans le monde des isotopes stables il y a quelques années.
Je suis redevable aussi envers Madame Margaret Holland et Messieurs Franco
Cazzaniga et Giuseppe Gilberti du BEVABS pour leur extraordinaire travail (ce n’est pas
facile d’aller en quête de centaines de vieilles bouteilles empoussiérées). Même
reconnaissance pour Madame Catherine Jouitteau, du LAIEM, qui a été, elle aussi, une de
mes « voix » françaises.
Un « muchas gracias » à Monsieur José-Joaquín Blasco-Muñoz pour avoir valorisé
et représenté graphiquement les contenus de mon travail.
Un remerciement particulier à Monsieur Umberto Traldi, technicien spécialisé de
Thermofinnigan-Milano qui grâce à sa promptitude et sa compétence a résolu tous les
problèmes techniques et par qui j’ai appris à maîtriser des appareils parfois non
« collaborant ».
4
Je veux exprimer ma sympathie à tous mes collègues qui se sont alternés et avec
lesquels on a rigolé et on s’est confortés pendant les longues journées de travail au
laboratoire : Francesca, José Manuel « Chema », Veronica, Ana Isabel, Mauro, Agnieszka,
Rosa Maria et Andri et Fayçal pour leur compagnie. A Mesdames Adriana Ciceri et Eva
Åhs de l’administration de l’unité PCE qui, grâce à leur gentillesse et à leur énergie, m’ont
toujours simplifié les obstacles bureautiques.
Je remercie enfin toutes les personnes qui ont pu contribuer à la réalisation de ce
mémoire parce qu’un travail de recherche et de publication n’est jamais le travail d’une
seule personne.
Merci à Alain et Ivan pour m’avoir depuis longtemps accueilli chez eux en
devenant, de facto, ma famille en France.
Il mio più grande affetto va alla mia famiglia tutta, ai miei amici sparpagliati in giro
per l’Italia e il mondo e ad Alberto, per avermi mostrato fiducia e per avermi sostenuto
moralmente (e a volte anche fisicamente), sempre.
5
Table des matières
Remerciements......................................................................................................................3
Table des matières ................................................................................................................5
Liste des tableaux ...............................................................................................................13
Liste des figures ..................................................................................................................16
Liste des abréviations et des sigles ....................................................................................20
Introduction .........................................................................................................................27
English abstract ....................................................................................................................29
Bibliographie .......................................................................................................................30
Chapitre I
Isotopes stables
1. Historique.........................................................................................................................33
1.1. Applications ..............................................................................................................34
1.1.1. Domaine alimentaire : « food » ...........................................................................34
1.2. Rapport isotopique et déviation..............................................................................35
1.3. Facteurs de variabilité .............................................................................................36
1.3.1. Effets isotopiques physiques................................................................................36
1.3.2. Effets isotopiques chimiques ...............................................................................38
1.3.3. Autres effets isotopiques......................................................................................40
2. Carbone : Indices sur l’origine botanique......................................................................41
3. L’azote et sa variabilité dans la nature...........................................................................47
4. Deutérium et oxygène : Origine géographique ..............................................................51
Bibliographie .......................................................................................................................58

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  • 2. Application des techniques isotopiques modernes pour la caractérisation de produits alimentaires et de boissons THÈSE DE DOCTORAT Discipline : Chimie analytique Spécialité : Sciences Agro-alimentaires présentée et soutenue publiquement par Giovanni CALDERONE Institute for Health and Consumer Protection EUROPEAN COMMISSION Joint Research Centre DIRECTORATE-GENERAL Université de Nantes Faculté des Sciences et des Techniques École Doctorale - Chimie Biologie Rapporteurs M. ARNAUD Maurice, Nestlé SA Nutrition Vevey, Suisse M. BERTRAND Alain, Professeur Université Bordeaux II Examinateurs M. GUILLOU Claude, Joint Research Centre Ispra, Italie Mme. LEES Michèle, Eurofins Scientific SA Nantes M. NAULET Norbert, Professeur Université de Nantes M. REMAUD Gérald, Professeur Université de Nantes Directeur de Thèse M. NAULET Norbert le 18 mars 2005, devant le jury ci-dessous
  • 3. Commission Européenne Centre Commun de Recherche (DG JRC) Institut de Santé et Protection des Consommateurs (IHCP) Unité Exposition Physique et Chimique (PCE) / BEVABS Via Enrico Fermi, TP 740 I-21020 Ispra (VA), Italie Tel.: +0039 0332 78 5668 Fax: +0039 0332 78 9303 Email: ihcp@jrc.it Webs: http://ihcp.jrc.cec.eu.int/ http://hosting.jrc.cec.eu.int/pce/ Éditeur: Giovanni Calderone Photo: The Natural History Museum (London), JRC (Ispra) Cover: José-Joaquín Blasco Legal Notice Neither the European Commission nor any person acting on behalf of the Commission is responsible for the use that might be made of the information contained in this production. SPI nº 04.216 Version revisée © European Communities, 2004 Reproduction authorisée si la source est mentionnée Imprimée en Italie MISSION DU CCR Le Centre commun de recherche a pour mission de fournir une aide scientifique et technique adaptée au client pour la conception, l’élaboration, la mise en oeuvre et le suivi des politiques de l'Union européenne. En tant que service de la Commission européenne, il agit comme centre de référence scientifique et technologique pour l'Union. Proche du processus d'élaboration des politiques, il sert l'intérêt commun des États membres tout en étant indépendant des intérêts particuliers, privés ou nationaux.
  • 4. 3 Remerciements Ce travail est le fruit de trois années de recherche menées au sein des laboratoires du BEVABS/CCR à Ispra (Italie) en collaboration avec le Laboratoire d'Analyse Isotopique et Electrochimique de Métabolismes de l'Université de Nantes. Je tiens à remercier Monsieur le Professeur Norbert Naulet de l'Université de Nantes pour avoir accepté de diriger ma thèse et pour sa disponibilité me permettant ainsi de progresser professionnellement et humainement. Je remercie également Messieurs Claude Guillou et Fabiano Reniero pour m’avoir accueilli aux laboratoires du CCR, pour leurs toujours stimulants défis et précieux conseils et surtout pour m’avoir laissé une complète autonomie de gestion de mes recherches. Je suis très flatté que Monsieur Maurice Arnaud du Centre de Recherche de Nestlé et Monsieur le Professeur Alain Bertrand de l’Université de Bordeaux aient accepté de juger ma thèse. Je suis aussi très heureux de retrouver dans le jury Monsieur Gérald Remaud de l’Université de Nantes et Madame Michèle Lees d’Eurofins qui, avec Eric Jamin, m’ont introduit dans le monde des isotopes stables il y a quelques années. Je suis redevable aussi envers Madame Margaret Holland et Messieurs Franco Cazzaniga et Giuseppe Gilberti du BEVABS pour leur extraordinaire travail (ce n’est pas facile d’aller en quête de centaines de vieilles bouteilles empoussiérées). Même reconnaissance pour Madame Catherine Jouitteau, du LAIEM, qui a été, elle aussi, une de mes « voix » françaises. Un « muchas gracias » à Monsieur José-Joaquín Blasco-Muñoz pour avoir valorisé et représenté graphiquement les contenus de mon travail. Un remerciement particulier à Monsieur Umberto Traldi, technicien spécialisé de Thermofinnigan-Milano qui grâce à sa promptitude et sa compétence a résolu tous les problèmes techniques et par qui j’ai appris à maîtriser des appareils parfois non « collaborant ».
  • 5. 4 Je veux exprimer ma sympathie à tous mes collègues qui se sont alternés et avec lesquels on a rigolé et on s’est confortés pendant les longues journées de travail au laboratoire : Francesca, José Manuel « Chema », Veronica, Ana Isabel, Mauro, Agnieszka, Rosa Maria et Andri et Fayçal pour leur compagnie. A Mesdames Adriana Ciceri et Eva Åhs de l’administration de l’unité PCE qui, grâce à leur gentillesse et à leur énergie, m’ont toujours simplifié les obstacles bureautiques. Je remercie enfin toutes les personnes qui ont pu contribuer à la réalisation de ce mémoire parce qu’un travail de recherche et de publication n’est jamais le travail d’une seule personne. Merci à Alain et Ivan pour m’avoir depuis longtemps accueilli chez eux en devenant, de facto, ma famille en France. Il mio più grande affetto va alla mia famiglia tutta, ai miei amici sparpagliati in giro per l’Italia e il mondo e ad Alberto, per avermi mostrato fiducia e per avermi sostenuto moralmente (e a volte anche fisicamente), sempre.
  • 6. 5 Table des matières Remerciements......................................................................................................................3 Table des matières ................................................................................................................5 Liste des tableaux ...............................................................................................................13 Liste des figures ..................................................................................................................16 Liste des abréviations et des sigles ....................................................................................20 Introduction .........................................................................................................................27 English abstract ....................................................................................................................29 Bibliographie .......................................................................................................................30 Chapitre I Isotopes stables 1. Historique.........................................................................................................................33 1.1. Applications ..............................................................................................................34 1.1.1. Domaine alimentaire : « food » ...........................................................................34 1.2. Rapport isotopique et déviation..............................................................................35 1.3. Facteurs de variabilité .............................................................................................36 1.3.1. Effets isotopiques physiques................................................................................36 1.3.2. Effets isotopiques chimiques ...............................................................................38 1.3.3. Autres effets isotopiques......................................................................................40 2. Carbone : Indices sur l’origine botanique......................................................................41 3. L’azote et sa variabilité dans la nature...........................................................................47 4. Deutérium et oxygène : Origine géographique ..............................................................51 Bibliographie .......................................................................................................................58
  • 7. 6 Chapitre II Techniques et méthodes 1. Introduction..................................................................................................................... 71 1.1. Les différentes techniques de spectrométrie de masse isotopique....................... 71 2. Aspects généraux de la SMRI......................................................................................... 72 2.1. Quelques définitions................................................................................................. 73 2.2. La spectrométrie de masse...................................................................................... 74 2.2.1. Que sont les isotopomères ? ................................................................................ 75 2.3. Mesures SMRI des rapports isotopiques des éléments légers.............................. 77 2.3.1. Mesure du rapport 2 H/1 H..................................................................................... 77 2.3.2. Mesure du rapport 13 C/12 C................................................................................... 78 2.3.3. Mesure du rapport 15 N/14 N .................................................................................. 79 2.3.4. Mesure du rapport 18 O/16 O .................................................................................. 80 3. (CF-)GC-C-IRMS............................................................................................................ 81 3.1. Principes de la GC-C-IRMS ................................................................................... 81 3.1.1. Séparation et réactions......................................................................................... 82 3.1.2. Systèmes de piégeage .......................................................................................... 83 3.1.3. Vannes de déviation des gaz................................................................................ 83 3.2. Applications.............................................................................................................. 84 3.2.1. Applications en agroalimentaire.......................................................................... 84 3.2.2. Applications futures............................................................................................. 86 3.2.3. Nos études en GC-C-IRMS................................................................................. 86 3.3. Les limites ................................................................................................................. 87 4. EA-IRMS ......................................................................................................................... 88 4.1. Principes de l’EA-IRMS : réaction, systèmes de piégeage et séparation............ 89 4.2. Nos applications dans le domaine alimentaire ...................................................... 89 5. TC-EA IRMS................................................................................................................... 91 5.1. Principes du TC-EA-IRMS..................................................................................... 91 5.1.1. Nos conditions opératoires .................................................................................. 92 5.2. Interférences et limites ............................................................................................ 92 5.3. Applications.............................................................................................................. 93 6. RMN du deutérium.......................................................................................................... 94
  • 8. 7 7. Notions statistiques..........................................................................................................94 7.1. Quelques définitions de statistique élémentaire ....................................................94 Bibliographie .......................................................................................................................96 Chapitre III Caractérisation du glycérol des vins européens : approche par l’isotope stable du carbone (Characterization of European wines glycerol: stable carbon isotope approach) 1. Introduction ...................................................................................................................104 1.1. Stable Isotope Ratio Methods in Food .................................................................105 1.2. EU Wine Data-Bank: BEVABS role ....................................................................106 2. Materials and methods ..................................................................................................107 2.1. Samples....................................................................................................................107 2.2. Sample preparation................................................................................................107 2.3. Continuous Flow GC-C-IRMS..............................................................................108 2.4. Determination of concentration of glycerol .........................................................111 3. Results ............................................................................................................................113 4. Conclusions....................................................................................................................114 Bibliographie .....................................................................................................................120
  • 9. 8 Chapitre IV Mesure de δ13 C de CO2 de boissons gazeuses par CG-C- SMRI : mise au point de la méthode et applications (Analysis of the 13 C natural abundance of CO2 gas from sparkling drinks by GC-C-IRMS: validation of the method Contribution of GC-C-IRMS technique to sparkling drinks authentication: 13 C/12 C ratio determination on CO2) 1. Background ................................................................................................................... 126 1.1. Carbon dioxide sources ......................................................................................... 127 2. Experimental ................................................................................................................. 127 2.1. Gas sampling .......................................................................................................... 127 2.2. GC analyses ............................................................................................................ 129 2.3. Continuous Flow GC-C-IRMS configuration and 13 C/12 C ratio measurement129 3. Results............................................................................................................................ 130 3.1. Correction of data.................................................................................................. 133 4. Conclusions: method..................................................................................................... 134 5. Introduction................................................................................................................... 136 5.1. Stable isotope ratio methods in food .................................................................... 136 5.2. Rapid measurement of the 13 C content of CO2 ................................................... 137 5.3. Fermented beverages............................................................................................. 137 5.3.1. Sparkling and semi-sparkling wines.................................................................. 137 5.3.2. Beers.................................................................................................................. 138 5.3.3. Fermented fruit juices and hydromel................................................................. 139 5.4. Sparkling waters .................................................................................................... 139 5.5. Soft-drinks .............................................................................................................. 140 6. Materials and methods.................................................................................................. 140 6.1. 13 C/12 C of ethanol ................................................................................................... 140 7. Results............................................................................................................................ 141
  • 10. 9 7.1. Market samples ......................................................................................................141 7.1.1. Sparkling wines..................................................................................................141 7.1.2. Beers ..................................................................................................................142 7.1.3. Sparkling waters ................................................................................................143 7.1.4. Soft-drinks .........................................................................................................146 8. Conclusions: applications .............................................................................................147 Bibliographie .....................................................................................................................149 Chapitre V Caractérisation multi-isotopique d’éthanols d’origine diverse : mesures de δ 18 O et de δ 2 H par TC/EA 1. Introduction ...................................................................................................................153 1.1. Fermentation alcoolique ........................................................................................154 1.2. Sucres de céréales et miels.....................................................................................154 1.3. Boissons fermentées ...............................................................................................154 1.4. Boissons spiritueuses..............................................................................................157 2. δ 2 H et δ 18 O ...................................................................................................................157 2.1. Techniques de mesure............................................................................................157 3. Matériels et méthodes ....................................................................................................158 3.1. Echantillons ............................................................................................................158 3.2. Fermentation ..........................................................................................................158 3.3. Distillation d’alcool ................................................................................................159 3.4. Déshydratation .......................................................................................................159 3.5. Mesures de δ18 O et δ2 H par TC/EA......................................................................159 3.6. Autres mesures .......................................................................................................163 3.6.1. 13 C-SMRI...........................................................................................................163 3.6.2. 2 H-RMN.............................................................................................................163 3.6.3. 18 O-SMRI...........................................................................................................163 4. Résultats et discussion...................................................................................................164
  • 11. 10 4.1. Miels ........................................................................................................................ 164 4.2. Sucres de céréales................................................................................................... 168 4.3. Boissons alcoolisées................................................................................................ 172 4.3.1. Whisky/Whiskey ............................................................................................... 172 4.3.2. Rhums et Tequilas ............................................................................................. 175 4.3.2.1. Cas de la fausse Tequila / Ethanols synthétiques........................................ 175 4.3.3. Sakés.................................................................................................................. 177 4.3.4. Vodkas, Gins, liqueurs....................................................................................... 178 4.3.5. Spiritueux de fruit.............................................................................................. 180 4.4. Vins.......................................................................................................................... 183 4.4.1. Oxygène de l’éthanol et oxygène de l’eau......................................................... 183 4.4.2. Influences géographiques : δ2 H et δ18 O............................................................. 183 4.4.3. Variations annuelles de 18 O et 2 H...................................................................... 186 4.4.4. Carbone-13 ........................................................................................................ 187 4.5. Bières....................................................................................................................... 192 5. Conclusions ................................................................................................................... 192 5.1. Technique................................................................................................................ 192 5.2. Interprétation......................................................................................................... 193 Bibliographie ..................................................................................................................... 194 Chapitre VI Contribution à l’authentification de l’arôme de pomme : 13 C du butan-1-ol mesuré par GC-C-IRMS 1. Introduction................................................................................................................... 201 1.1. Réglementations pour la protection de la santé publique.................................. 202 1.2. Notre approche pour la caractérisation de l’arôme de pomme......................... 202 2. Matériel et méthodes ..................................................................................................... 202 2.1. Système CG-C-SMRI............................................................................................. 203 2.2. Autres mesures....................................................................................................... 203 3. Résultats......................................................................................................................... 205
  • 12. 11 4. Discussion ......................................................................................................................205 4.1. Technique................................................................................................................205 4.2. Interprétation .........................................................................................................206 Bibliographie .....................................................................................................................208 Chapitre VII Conclusions et perspectives ...................................................................................................................................213 Annexes Annexe A Les techniques isotopiques dans les règlements CE Introduction .......................................................................................................................221 Annexe B GC-C-IRMS : Calibration du CO2 comme gaz de référence 1. Standards .......................................................................................................................227 1.1. En pratique .............................................................................................................227 2. Elaboration des données ...............................................................................................228
  • 13. 12 Annexe C TC-EA : Nos conditions opératoires 1. L’appareil....................................................................................................................... 233 2. Carbone vitreux (Glassy Carbon)................................................................................. 233 3. Configurations............................................................................................................... 234 3.1. Echantillons solides................................................................................................ 234 3.2. Echantillons liquides.............................................................................................. 234 4. Température................................................................................................................... 237 5. Gaz de référence............................................................................................................ 237 6. Débit d’hélium............................................................................................................... 239 7. Remarques ..................................................................................................................... 239 Annexe D Tableaux des vins soumis à l’analyse du glycérol (Chapitre III) et de l’éthanol (Chapitre V) .................................................................................................................................. 243
  • 14. 13 Liste des Tableaux Chapitre I Tableau 1: Abondance naturelle moyenne, référence internationale utilisée et autres données des principaux isotopes stables des éléments les plus utilisés dans l’authenticité des aliments ............................................................................................37 Tableau 2: Fractionnement dans certaines réactions enzymatiques....................................41 Tableau 3 : Exemples des plantes les plus communes des trois groupes décrits ................44 Tableau 4: Processus à l’origine du fractionnement isotopique de l’azote .........................50 Chapitre II Tableau 1 : Réactions mises en jeu et gaz obtenus pour utilisation en SMRI.....................73 Chapitre III Table 1: EU wine-producer Countries and composition of our samples. Number of genuine wines, expressed as white/red/rosé.............................................................................107 Table 2: Comparison of glycerol concentrations in five BIPEA wines ..........................113 Table 3: Comparison of glycerol δ13 C values by GC-C and EA-IRMS techniques..........115 Table 4: Concentration and 13 C content of glycerol in wines particularly rich in glycerol..... ………………………………………………………………………………………115
  • 15. 14 Chapitre IV Table 1: Injection of CO2 reference gases to validate the method .................................... 133 Table 2: 13 C content of headspace CO2 and ethanol of sparkling wine samples............... 142 Table 3: 13 C content of headspace CO2 and ethanol of beer samples................................ 144 Table 4: 13 C content of headspace CO2 from sparkling water samples............................. 145 Table 5: 13 C content of headspace CO2 from fizzy drink samples .................................... 146 Chapitre V Tableau 1 : Définition et description de certaines boissons spiritueuses en accord avec le règlement européen N°1576/89 (extrait).................................................................... 156 Tableau 2 : Analyses isotopiques d’un échantillon de tequila d’origine suspecte............ 176 Tableau 3 : Analyse multi-isotopique d’échantillons de saké........................................... 177 Tableau 4 : Variation des teneurs moyennes en 18 O et 2 H des vins des deux récoltes...... 187 Tableau 5 : Analyse multi-isotopique d’échantillons de bières ........................................ 191 Schéma 1 : Ethanol et origine des hydrogènes.................................................................. 166 Chapitre VI Tableau 1 : Liste des échantillons et résultats des analyses isotopiques........................... 206
  • 16. 15 Annexe B Tableau 1 : Calibration de CO2 contre le « FID-mix » Varian..........................................229 Annexe D Tableau 1 : Liste des vins de la récolte 1998 ....................................................................244 Tableau 2 : Liste des vins de la récolte 1999 ....................................................................247
  • 17. 16 Liste des Figures Chapitre I Figure 1 : Variabilité isotopique du 13 C dans plusieurs formes du carbone en relation à son cycle dans l’environnement.......................................................................................... 41 Figure 2 : Diagramme de composés et standards de référence contenant du carbone et leur distribution au long de l’échelle δ13 C........................................................................... 42 Figure 3 : Différentes physiologies des tissus foliaires....................................................... 44 Figure 4 a et b : Schéma simplifié des cycles photosynthétiques C3 et C4........................ 45 Figure 5 : Modèle du fractionnement du 13 C des plantes et chez les mammifères herbivores qui s’en nourrissent ...................................................................................................... 47 Figure 6 : Diagramme de composés et standards de référence contenant de l’azote et leur distribution dans l’échelle δ15 N.................................................................................... 48 Figure 7 : Modèle du fractionnement de l’azote entre les plantes et les animaux .............. 49 Figure 8 : Carte des valeurs moyennes de δ18 O des précipitations des années 1992/93..... 52 Figure 9 : Effet de la température sur le fractionnement de l’oxygène dans une masse de vapeur d’eau ................................................................................................................. 53 Figure 10 : Schématisation du fractionnement de l’hydrogène des eaux météoriques ....... 54 Figure 11 : Diagramme de composés et standards de référence contenant de l’hydrogène et leur distribution dans l’échelle δ2 H.............................................................................. 56 Figure 12 : Diagramme de composés et standards de référence contenant de l’oxygène et leur distribution dans l’échelle δ18 O............................................................................. 57 Chapitre II Figure 1 : Schéma d’un système SMRI : exemple du CO2 ................................................. 76
  • 18. 17 Figure 2 : Belemnitella americana dans un dessin et son rostre fossilisé : le carbonate PDB. .............................................................................................................................79 Figure 3 : Configuration de notre chromatographe en phase gazeuse, couplé à un auto sampler et à une interface de combustion.....................................................................82 Figure 4 : Schématisation des diverses parties d’un système couplé GC-C-IRMS, en configuration double, carbone/azote.............................................................................85 Figure 5 : Schématisation du système couplé EA-IRMS, en configuration double, CO2/N2.. ………………………………………………………………………………………..90 Figure 6 : Notre appareil de TC-EA, configuré pour l’analyse d’échantillons liquides ou solides...........................................................................................................................92 Figure 7 : Schéma du système de pyrolyse TC-EA.............................................................93 Chapitre III Figure 1: Structure of glycerol...........................................................................................104 Figure 2: Structure of 1,5-pentanediol (1,5-PD)................................................................104 Figure 3 : Temperature program set up to separate glycerol from the other wine components.................................................................................................................109 Figure 4: Scheme of GC-C-IRMS configured for δ13 C analyses......................................110 Figure 5: IRMS-Chromatogram of 1,5-pentanediol and glycerol from wine....................112 Figure 6: δ13 C values of glycerol samples by GC- and EA-IRMS to test linearity...........115 Figure 7: δ13 C of glycerol vs. δ13 C of ethanol, for 1998 and 1999 wines of 4 EU Countries.....................................................................................................................116 Figure 8: Correlations of glycerol concentration (g/L) versus ethanol content (% V/V) of wines...........................................................................................................................118 Chapitre IV Figure 1: Transfer of headspace gas into a crimped vial with cleaning of volume...........128 Figure 2: Scheme of GC-C-IRMS configured for δ13 C analyses of CO2..........................131
  • 19. 18 Figure 3: Typical chromatogram of a CO2 sample analysis by IRMS. δ13 C is the mean value over 5 repetitions in one run............................................................................. 132 Figure 4: δ13 C values trend of subsequent injections from the same vial containing CO2 134 Chapitre V Figure 1 : Schématisation de la fermentation du glucose ................................................. 155 Figure 2 : Programme-type avec plusieurs injections d’un échantillon d’éthanol analysé en TC-EA (logiciel Isodat 2.0)........................................................................................ 160 Figure 3 : Spectrogramme de la mesure du rapport 2 H/1 H de l’éthanol............................ 161 Figure 4 : Spectrogramme de la mesure du rapport 18 O/16 O de l’éthanol......................... 162 Figure 5 : δ18 O et δ2 H des éthanols issus de miels et classés par origine botanique......... 165 Figure 6 : δ18 O et δ2 H des éthanols issus de miels en fonction de leur origine géographique ………………………………………………………………………………………165 Figure 7 : δ18 O et δ13 C des éthanols issus de miels et classés par origine botanique........ 166 Figure 8 a et b : Combinaison des résultats (D/H)1 en fonction de δ18 O et distribution de (D/H)2 des éthanols issus de miels et classés par origine botanique.......................... 167 Figure 9 : Combinaison des résultats δ18 O et δ2 H des éthanols issus de sucres de céréales et classés par origine botanique.................................................................................. 168 Figure 10 : Combinaison des résultats δ13 C et δ2 H des éthanols issus de sucres de céréales et classés par origine botanique.................................................................................. 170 Figure 11 : Combinaison des résultats δ18 O et δ13 C des éthanols issus de sucres de céréales et classés par origine botanique.................................................................................. 170 Figure 12 a et b : Combinaison des résultats (D/H)1 en fonction des δ18 O et distribution de (D/H)2 des éthanols issus de sucres de céréales et classés par origine botanique...... 171 Figure 13 a, b et c: Combinaison des résultats δ2 H, δ13 C et δ18 O des whiskys analysés.. 173 Figure 14 a et b : Combinaison des résultats δ2 H, 13 C et 18 O pour rhums et tequilas....... 174 Figure 15 : Combinaison des mesures de 18 O et 2 H confirmant l’origine suspecte d’une tequila analysée par le laboratoire des Douanes de Paris........................................... 176 Figure 16 a, b et c: Combinaison des résultats δ2 H, δ13 C et δ18 O des spiritueux analysés179 Figure 17 : Combinaison de δ18 O et δ2 H de boissons alcoolisées dérivées de fruits........ 181
  • 20. 19 Figure 18 a et b : Combinaison des mesures de 2 H, de 13 C et de 18 O sur boissons alcoolisées dérivées de fruits......................................................................................182 Figure 19 a et b : Combinaison des δ18 O de l’éthanol et de l’eau des vins analysés ........184 Figure 20 a et b : Combinaison des δ18 O et δ2 H de l’éthanol des vins analysés...............185 Figure 21 : Variation de l’18 O et du 2 H des vins des deux récoltes ...................................188 Figure 22 a et b : Combinaison des δ18 O et δ13 C de l’éthanol des vins analysés..............189 Figure 23 a et b : Combinaison des δ13 C et δ2 H de l’éthanol des vins analysés...............190 Chapitre VI Figure 1 : Chromatogramme de l’arôme de pomme..........................................................204 Annexe B Figure 1 : Chromatogramme des alcanes du « FID-mix ».................................................228 Figure 2 : Répétitivité des mesures de calibration du CO2................................................229 Annexe C Figure 1 : Configuration du système TC-EA pour échantillons solides............................235 Figure 2 : Configuration du système TC-EA pour échantillons liquides ..........................236 Figure 3 : Test de stabilité du TC-EA pour les mesures de δ18 O. .....................................238
  • 21. 20 Liste des symboles et des sigles AE-SMRI Analyseur Elémentaire – Spectrométrie de Masse des Rapports Isotopiques, En anglais, voir EA-IRMS. AOP Appellation d'Origine Protégée. En anglais, Protected Designation of Origin (PDO). BEVABS Bureau Européen des Vins, Alcools et Boissons Spiritueuses. BIPEA Bureau Interprofessionnel d’Etudes Analytiques. C3 Voie de photosynthèse de Calvin- Bassham dit aussi C3. C4 Voie de photosynthèse de Hatch-Slack dit aussi C4. CAM Voie de photosynthèse dit du Crassulacean Acid Metabolism. CE Communeauté Européenne. CG-C-SMRI Chromatographie en phase Gazeuse – Combustion – Spectrométrie de Masse des Rapports Isotopiques. En anglais, voir GC-C-IRMS. COFAWS Acronyme du projet : « Confirmation of the Origin of Farmed And Wild Salmon and other fish ». EA-IRMS Elemental Analyzer – Isotope Ratio Mass Spectrometry. En français, voir AE-SMRI. EEA European Economic Area. En français EEE, Espace Economique Européen. EU European Union. FID Flame ionization detector. Détecteur à ionisation de flamme (DIF).
  • 22. 21 GC-C-IRMS Gas Chromatography – Combustion – Isotope Ratio Mass Spectrometry. En français, voir CG-C-SMRI. GISP Greenland Ice Sheet Precipitation. IAEA International Atomic and Energy Agency, Vienne. IGP Indication Géographique Protégée. En anglais, Protected Geographical Indication (PGI). IRMS Isotopic Ratio Mass Spectrometry. En français, voir SMRI. OIV Organisation (ex Office) International de la Vigne et du Vin. PAC Politique Agricole Commune. PSI Pound-force per Square Inch. Unité de pression. 1 PSI = 6.894757 kPa RMN-FINS ® Résonance Magnétique Nucléaire - Fractionnement Isotopique Naturel Spécifique. En anglais, voir SNIF- NMR. SLAP Standard Light Antarctic Precipitation. SMRI Spectrométrie de Masse des Rapports Isotopiques. En anglais, voir SMRI SNIF-NMR Site-specific Natural Isotopic Fractionation – Nuclear Magnetic Resonance. En français, voir RMN- FINS. STG Spécialité Traditionnelle Garantie. En anglais, Traditional Speciality Guaranteed (TSG). TC-EA Total Combustion-Elemental Analyzer, Analyseur Elémentaire à Combustion Totale, couplé à un spectromètre de masse de rapport isotopique. UE Union Européenne. V-CDT Vienna-Cañon Diablo Troilite. V-PDB Vienna-Pee Dee Belemnite. Standard de référence international pour le rapport
  • 23. 22 13 C/12 C et, plus rarement, pour le rapport 18 O/16 O. V-SMOW Vienna-Standard Mean Ocean Water, Eau Océanique Moyenne Standard. Standard de référence international pour les rapports 2 H/1 H et 18 O/16 O. 1,5-PD 1,5-pentanediole. ‰ Pour mille.
  • 28. Introduction 27 Introduction a détection des fraudes et l’authenticité des produits agro-alimentaires a toujours été, et continue à être, une question ouverte. Ces délits posent un problème à la fois de santé publique et de pertes économiques aux dépens des producteurs honnêtes. Il n’y a presque pas de produits (vin, fromage, boissons alcoolisées ou non, etc.) qui ne soient pas de potentielles cibles de falsification. Aujourd’hui encore cela peut déclencher de vraies guerres commerciales entre les pays producteurs. Dans le passé chaque pays édictait ses propres règlements, à présent l’harmonisation est imposée par le Communauté Européenne (CE) dans le marché unique. D’ailleurs, c’est sur la base de « cahiers des charges de production », qui définissent les propriétés physico-chimiques d’un produit, les procédures et les zones géographiques de production délimitées, que certaines marques de qualité sont concédées à un producteur. Un vin supérieur de qualité supérieur peut être caractérisé par une Appellation d’Origine Contrôlée (A.O.C.) ou même une Appellation d’Origine Contrôlée et Garantie (A.O.C.G.). Depuis 1992, de nouvelles marques et logos de qualité [1] peuvent être appliqués aux autres catégories de produits, afin d’en protéger la réputation et sauvegarder le consommateur des imitations. L
  • 29. Introduction 28 Les dernières lignes guides de la Politique Agricole Commune (PAC), encouragent l’agriculture et l’élevage biologiques [2, 3] et définissent une marque et un logo de qualité spécifiques (mars 2000). Suite à différents scandales et aux dangers pour la santé des citoyens (notamment question ESB, plus connue au grand publique sous le nom « vache folle »), le concept de traçabilité des produits s’impose [4-6] et s’ajoute aux recherches traditionnelles de fraudes et falsification. Un des outils analytiques de plus en plus utilisé dans les vingt dernières années, est l’analyse des rapports entre isotopes stables de bioéléments – 2 H/1 H, 13 C/12 C, 15 N/14 N, 18 O/16 O, 34 S/32 S – contenus dans un produit ou dans un composant de ce même produit. Depuis environ quinze ans, la Communauté Européenne et d’autres organismes internationaux ont adopté l’analyse isotopique pour détecter des contrefaçons de produits tels que vins, jus de fruits et miels [7] et pour contrôler et garantir l’authenticité de ceux-ci. En fait, la combinaison des mesures du fractionnement isotopique naturel spécifique par résonance magnétique nucléaire (RMN-FINS, en anglais SNIF-NMR) du proton, 2 H/1 H, du rapport 13 C/12 C par spectrométrie de masse de rapports isotopiques (SMRI ou, en anglais, IRMS) sur l’éthanol distillé, et du rapport 18 O/16 O sur l’eau, permettent de révéler la dilution avec de l’eau et les ajouts frauduleux de sucre dans les moûts et dans les jus de fruits. De même, les ajouts de sucre dans le miel sont détectables. Les mêmes techniques peuvent être utilisées pour la détermination de l’origine géographique d’un produit. ∗∗∗ Mon travail de thèse, conduit dans les laboratoires du BEVABS (Bureau Européen des Vins, Alcools et Boissons Spiritueuses) de la Commission Européenne à Ispra (Italie), se situe dans ce cadre, comme contribution aux recherches qui visent à la possible utilisation des analyses des rapports isotopiques là où l’authenticité, l’origine botanique et géographique, deviennent un facteur économique et de santé publique. Bien que la plupart de nos travaux s’inscrive dans des Projets Européens aux buts bien fixés, une autre part importante est constituée de recherche originale, visant à la caractérisation et à la détermination isotopique de plusieurs produits agroalimentaires, en soutien à la politique européenne sur la qualité.
  • 30. Introduction 29 Les matrices qui font l’objet de nos études sont nombreuses et diverses : le glycérol dans le vin, pour l’utiliser comme sonde possible de qualité ; l’éthanol dans les boissons spiritueuses ; l’anhydride carbonique dans les boissons pétillantes, etc.. Les isotopes considérés dans nos travaux, sont le deutérium, le carbone-13, l’azote- 15 et l’oxygène-18. Les techniques – et donc les appareillages – utilisées pour les mesures, sont multiples : d’abord la Chromatographie Gazeuse - Combustion couplée à la Spectrométrie de Masse des Rapports Isotopiques (CG-C-SMRI, GC-C-IRMS), pour 13 C/12 C et 15 N/14 N dans des molécules cibles. Un Analyseur Elémentaire couplé à la SMRI (AE-SMRI, en anglais EA-IRMS), a été utilisé pour les mesures de 13 C/12 C et 15 N/14 N sur produits bruts et un appareil RMN pour les teneurs spécifiques en deutérium dans l’éthanol. Finalement, une toute nouvelle technique a été testée et mise au point pour déterminer les rapports 2 H/1 H et 18 O/16 O dans l’éthanol : l’Analyseur Elémentaire à Combustion Totale (TC-EA) couplé à la SMRI. ∗∗∗ English abstract The studies included in this PhD thesis are a contribution to isotopic characterisation of different foodstuff matrices and to the setting up of new methods of isotope ratio mass spectrometry (IRMS) techniques applied to food authentication and to detection of frauds, in the frame of European Union quality policies. Hyphenated techniques of gas chromatography, elemental analyser and total combustion elemental analyser coupled to IRMS (respectively: GC-C-IRMS, EA-IRMS, TC/EA-IRMS) – and deuterium nuclear magnetic resonance (2 H-NMR) in support – were used to measure ratios 1 H/2 H, 13 C/12 C, 15 N/14 N and 18 O/16 O of raw food samples or of target components, such as glycerol from wine, n-butanol from apple flavour, ethanol of spirits and CO2 from sparkling wine. Keywords: Food authentication, EU quality policy, traceability, stable isotope ratio, mass spectrometry, deuterium, hydrogen-2, carbon-13, nitrogen-15, oxygen-18, δ2 H, δ13 C, δ15 N, δ18 O, IRMS, GC-C-IRMS, TC/EA, EA-IRMS, 2 H-NMR, (D/H), glycerol, Botrytis cinerea, sparkling drinks, carbon dioxide, CO2, wine, beer, cider, effervescent water, soft-drinks, spirits, ethanol, sugars, cereals, honey, apple aroma, n-butanol
  • 31. 30 Bibliographie 1 Pour les marques de qualité, AOP/IGP/STG : Règlements (CEE) n° 2081/92 et n° 2082/92 du 14 juillet 1992 2 Règlement (CEE) n° 2092/91 du 24 juin 1991 pour l’agriculture et règlement CE n° 1804/1999 relatif au secteur animal. Documents sur la Réforme de la Politique Agricole Commune (PAC) sur le site Internet de la Direction Générale de l’Agriculture (DG-AGRI) : http://europa.eu.int/comm/agriculture/index.htm 3 S. Mann – Why organic food in Germany is a merit good, Food Policy, 2003, 28, 459– 469 4 Libro bianco sulla sicurezza alimentare – Bruxelles, 12.1.2000, COM (1999) 719 def. 5 Règlement (CE) n° 178/2002 du Parlement européen et du Conseil du 28 janvier 2002 6 H. Przyrembel – Food labelling legislation in the EU and consumers information, Trends in Food Science & Technology, 2004, 15, 360–365 7 G. Calderone, C. Guillou, N. Naulet – Utilisation réglementaire des analyses isotopiques des aliments - Dix ans d'expérience européenne, L’actualité chimique, 2003, 8-9, 20-22 (voir Annexe A de cette thèse)
  • 34. Chapitre I 33 Isotopes stables 1. HISTORIQUE a démonstration de l’existence des isotopes remonte à 1913, quand J.J. Thompson [1] , en expérimentant sur des tubes remplis de néon, met en évidence deux des trois isotopes de ce gaz, ayant des masses atomiques de 20 et 22. F.W. Aston [2] en découvrant le troisième isotope, le 21 Ne, confirme les résultats de Thompson six ans après. La même année (1913), F. Soddy [3] et A. Fleck introduisent le terme isotope, du grec ισος isos, même, et τοπος topos, lieu. Ce terme décrit bien la propriété des éléments qui, bien que de masses différentes, se situent au même endroit dans le tableau périodique des éléments de Mendeleïev, parce qu’ils possèdent la même structure électronique et le même nombre de protons. Les isotopes sont donc des atomes d’un même élément qui diffèrent par le nombre de neutrons dans le noyau. Ce que nous appelons la masse atomique d’un élément n’est autre que la masse moyenne des isotopes mélangés dans les rapports présents dans la nature. A partir des études d’Aston [4] , la recherche sur les isotopes – et les moyens pour les mesurer – commence. Nos spectromètres de masse sont basés sur les instruments conçus par Aston et Dempster. En une dizaine d’années, entre 1925 et 1935, les isotopes des éléments L
  • 35. Chapitre I 34 légers ont tous été découverts. En 1950, Nier [5] conduit ses études sur le premier spectromètre de masse dédié aux mesures des rapports isotopiques du carbone, de l’azote et de l’oxygène. ∗∗∗ D’abord, ce sont les géochimistes et les paléo-océanographes qui se sont intéressés à l’application des isotopes stables. L’étude de molécules simples de la surface du globe, eau et dioxyde de carbone, a permis de mieux connaître les cycles globaux des éléments, les systèmes hydrothermaux et les roches. H. Craig introduit la notion, fondamentale, de référence isotopique [6, 7] . Dans les mêmes années, l’azote devient aussi l’objet d’études [8] . Plus tard, biologistes et botanistes développent de nouvelles théories sur les processus biochimiques dans la nature sur la base des mesures d’abondance naturelle des isotopes stables contenus dans la matière organique des plantes. Trois différentes voies photosynthétiques sont mises en évidence, la C3 (Calvin-Bassham), la C4 (Hatch-Slack) et celle dite CAM (Crassulacean Acid Metabolism), dont on verra plus loin dans ce chapitre les effets de fractionnement sur la variabilité naturelle. 1.1. Applications De nos jours, les analyses isotopiques sont de plus en plus variées et trouvent des applications dans de nombreux domaines : études de biologie végétale et animale à travers le carbone [9-19] , l’azote [20-25] ou l’oxygène [26-28] ; géochimie [8, 29-32] , archéologie et anthropologie [31, 33-36] ; pharmacologie [37-39] et sciences forensiques [40-45] , y compris les substances stupéfiantes [46-54] . Les isotopes stables sont aussi de plus en plus utilisés dans les études environnementales [55-64] et d’écologie animale [40, 65, 66, beaucoup d’autres travaux] . 1.1.1. Domaine alimentaire : « food » Enfin, le sujet qui nous intéresse le plus est l’application des isotopes stables dans le domaine des produits agro-alimentaires [31, 67] , en anglais « food ». De nombreuses matrices alimentaires sont l’objet d’investigations en terme de contenu isotopique. La caractérisation par analyse isotopique de composants de différentes origines biosynthétique ou géographique, a permis de détecter plusieurs types de fraudes alimentaires, autrement difficilement contrôlables. Elle a, en outre, contribué à typifier des produits
  • 36. Chapitre I 35 destinés à recevoir des marques de qualité – AOP (Appellation d'Origine Protégée), IGP (Indication Géographique Protégée) et STG (Spécialité Traditionnelle Garantie). Les études pionnières sur les boissons fermentées, concernent les vins [68,69] , vinaigres [70-72] , boissons spiritueuses [73, 74] et bières [75, 76] . Par la suite, des études ont été conduites sur les jus de fruit [77-80] , miels [81-83] , huiles [84-86] , mais aussi sur les arômes [87-91] , extraits de plantes à infusion [92-95] et sirop d’érable [96] . Diverses références sur les règlements de la CE et des organismes internationaux qui décrivent les méthodes isotopiques utilisées pour l’authentification de vins, jus de fruit, miel, sont reportées dans l’Annexe A. Dernièrement, les méthodes analytiques isotopiques ont trouvé des applications dans des études de matrices bien plus complexes que les molécules simples, que sont l’éthanol ou la vanilline. Des produits d’origine animale ont été analysés : lait [97,98] , fromages [99-103] , viande [104-106] et poisson [107, 108] . Andreas Rossman a publié, en 2001, une revue de synthèse [109] qui couvre, pour les vingt-cinq dernières années, les différentes utilisations et les résultats des mesures de teneurs isotopiques des éléments légers afin de caractériser et d’authentifier une grande variété d’aliments. 1.2. Rapport isotopique et déviation Dans la matière organique, les principaux composants élémentaires sont H, C, N et O. Ils se présentent sous forme d’isotopes stables – H, D (2 H) ; 12 C, 13 C ; 14 N, 15 N ; 16 O, 17 O, 18 O – mais aussi instables – T (3 H), 14 C –. Pour ces éléments, dans la nature, c’est la forme légère qui prédomine. Les pourcentages des éléments les plus concernés dans le domaine alimentaire sont reportés dans le Tableau 1. Le soufre et le strontium, bien qu’ils ne soient pas pris en considération dans les travaux de cette thèse, peuvent offrir des informations importantes sur l’origine d’un produit. Le strontium, qui ne fait pas partie des éléments dits légers, est de plus en plus utilisé pour vérifier l’origine géographique [110-112] de produits de l’agriculture. Les différences de proportion entre l’isotope lourd et le plus abondant, le léger, sont toujours faibles, ainsi le 13 C est toujours présent à environ 1.1 % du carbone total. En 1950 McKinney introduit [113] une notation spéciale, qui permet de manipuler plus facilement les rapports isotopiques.
  • 37. Chapitre I 36 Il est introduit le δ13 C (delta), qui exprime en ‰, pour mille, la déviation du rapport 13 C/12 C d’un échantillon par rapport à celui d’un standard international pris comme référence : Equation 1 échantillon13 standard R δ C = -1 1000 R ⎛ ⎞ ⎜ ⎟ ⎝ ⎠ i où 13 12 C R= C Ainsi, au lieu de dire que le rapport 13 C/12 C est de 0.011158 pour le CO2 atmosphérique et de 0.011237 pour le PDB (la référence internationale) ou, ce qui serait la même chose, que l’écart entre les deux est de 80 atomes de 13 C par million d’atomes de carbone, on calcule que le δ13 C du CO2 atmosphérique par rapport au PDB est de -7 ‰. 1.3. Facteurs de variabilité La variabilité naturelle des abondances isotopiques dans les molécules organiques est due aux diverses propriétés physico-chimiques de l’isotope léger par rapport à l’isotope lourd d’un élément. Les effets isotopiques deviennent visibles dès lors qu’ils produisent un fractionnement, c'est-à-dire un enrichissement ou un appauvrissement d’un isotope par rapport à l’autre. Ils sont de plusieurs natures et origines : de ceux à plus simple rationalisation, classés comme physiques et chimiques, à ceux moins prévisibles, présents surtout dans les réactions biologiques. 1.3.1. Effets isotopiques physiques Les grandeurs physiques liées à la masse sont, bien sûr, affectées par la différence de masse entre les isotopes. Un isotope léger d’un élément se déplace plus rapidement que l’isotope lourd. Selon la loi de Graham pour les gaz, la vitesse d’expansion d’un gaz est inversement proportionnelle à la racine carrée de sa masse. Par exemple, dans le cas de l’hydrogène cette différence est très marquée, puisque le deutérium a une masse double de celle de l’hydrogène de masse 1. A cause de cela, la différence de vitesse sera plus grande entre les molécules de H2, « légères », qu’avec celles contenant du deutérium, et un fractionnement isotopique sera observé.
  • 38. Chapitre I 37 Tableau 1: Abondance naturelle moyenne, référence internationale utilisée et autres données des principaux isotopes stables des éléments les plus utilisés dans l’authenticité des aliments (pourcentages et rapports d’après les références [114], [109] et [115]) Elément Isotope Abondance relative (%) Référence internationale et Rapport isotopique (R) Molécule 1 H 99.9855 Hydrogène 2 H (D) 0.0145 V-SMOW (Vienna-Standard Mean Ocean Water) 2 H/1 H = 1.5576 · 10-4 H2O 12 C 98.892 Carbone 13 C 1.108 V-PDB (*) (Vienna-Pee Dee Belemnite) 13 C/12 C = 1.1237 · 10-2 CaCO3 14 N 99.6337 Azote 15 N 0.3663 AIR(Azote atmosphérique) 15 N/14 N = 3.6765 · 10-3 N2 16 O 99.7586 17 O 0.0375Oxygène 18 O 0.2039 V-SMOW (Vienna-Standard Mean Ocean Water) ou V-PDB 18 O/16 O = 2.0052 · 10-3 - 2.0672 · 10-3 H2O ou CaCO3 32 S 95.015 33 S 0.750 34 S 4.215 Soufre 36 S 0.02 V-CDT (#) (Vienna-Cañon Diablo Troilite) 34 S/32 S = 4.41509 · 10-2 Ag2S 84 Sr 0.56 86 Sr 9.86 87 Sr 7.02 Strontium 88 Sr 82.56 NIST SRM 987 (National Institute of Standards and Technology) 87 Sr/86 Sr = 0.710340 (§) SrCO3 (*) Le PDB n’est plus disponible et d’autres matériaux de référence internationaux sont utilisés. Ces standards sont distribués par l’IAEA, International Atomic and Energy Agency ou le NIST. (#) Le CDT originel était le FeS obtenu d’un météorite de fer. Ce standard primaire a été substitué par le V-CDT, Ag2S, à cause de son homogénéité insuffisante. (§) Pour le strontium, le rapport absolu est utilisé plus souvent que la notation δ87 Sr rapporté à un certain standard.
  • 39. Chapitre I 38 Les fractionnements isotopiques d’origine physique se rencontrent couramment lors d’étapes de séparation ou de purification. La centrifugation, technique de séparation qui fonctionne grâce à la différence de masse des composants en suspension, est le phénomène fractionnant le plus souvent rencontré. Elle est, en fait, utilisée dans l’industrie afin d’enrichir ou appauvrir isotopiquement un composé. Un autre phénomène qui induit un fractionnement isotopique est la diffusion. Elle tend à égaliser des concentrations dans un milieu liquide, des pressions dans un gaz, ou encore intervient lors du passage à travers une membrane. Bien sûr, les effets isotopiques peuvent jouer sur la volatilité d’un produit [116] . 1.3.2. Effets isotopiques chimiques Au cours d’une réaction quelconque, chimique, biochimique ou dans les changements d’état, les différences de masse peuvent avoir une influence sur la vitesse de réaction (effet cinétique) ou sur l’état énergétique du système (effet thermodynamique) [117] . Effets isotopiques cinétiques On parle d’effets isotopiques cinétiques lorsque le fractionnement d’un élément est dû à l’influence des différences de masse atomique des isotopes sur la vitesse d’une réaction. Cela peut être dû à deux causes : la première parce que les molécules contenant les isotopes plus légers sont plus mobiles que celles contenant les isotopes lourds. Le deuxième facteur est dû aux liaisons chimiques qui sont plus fortes avec les atomes lourds qu’avec les atomes légers correspondants. Ainsi, par exemple, la probabilité de rupture de liaison est plus grande pour l’isotope 14 N que pour le même composé contenant 15 N. Donc, si au cours d’une réaction chimique, il y a une étape de rupture d’une liaison X-N, très probablement le produit final sera appauvri en 15 N par rapport au produit de départ. Mathématiquement, cela se démontre par la relation qui combine ces deux facteurs, masse et force de liaison (en forme d’énergie d’activation), avec les constantes de réaction, dans l’Equation 2, où k est la constante de vitesse de la réaction, µ est la masse réduite, E est l’énergie d’activation et l’astérisque se réfère à l’espèce la plus lourde. T est la température absolue et R la constante des gaz parfaits.
  • 40. Chapitre I 39 Equation 2 ( ) RT EE e k k ∗ − − ∗ ∗ = µ µ D’après cette équation, l’effet cinétique dépend de la différence d’énergie d’activation entre les deux espèces isotopiques et n’est pas affecté par le type particulier de cinétique. Le rapport des constantes cinétiques, dans la plupart des cas, est supérieur à l’unité (µ* > µ et E* > E) et donc les produits de réaction seront enrichis en isotope léger (k > k* ). En outre, on parlera d’effet isotopique cinétique primaire ou secondaire, selon que l’effet de l’isotope affecte directement la vitesse de réaction à cause de la rupture d’une de ses liaisons ou si l’influence sur la vitesse ne s’exprime pas directement avec une modification de ses liaisons. Effets isotopiques thermodynamiques L’effet isotopique thermodynamique est lié à la différence d’énergie libre entre espèces à composition isotopique différente : les espèces plus lourdes possèdent une énergie libre inférieure, et cela rend le système plus stable. Ainsi, la constante d’équilibre pour les espèces les plus lourdes est plus faible, ce qui explique leur plus grande inertie à réagir et donc leur tendance à se concentrer dans les phases condensées. La règle générale pour prévoir l’effet thermodynamique et ses conséquences sur le fractionnement isotopique est que l’isotope lourd se retrouve préférentiellement dans le composé chimique dans lequel il est le plus fortement lié. Un exemple, l’accumulation de l’isotope 13 C dans l’ion bicarbonate [116] : 13 12 - 12 13 - 2(g) 3(aq) 2(g) 3(aq)CO +H CO CO +H CO⎯⎯→←⎯ K=1.0092 (0 °C) A 0 °C, donc, l’équilibre est en faveur de l’échange du 12 C de l’ion bicarbonate avec le 13 C du CO2 en phase gazeuse.
  • 41. Chapitre I 40 Parallèlement, un autre équilibre se produit entre le CO2 et l’eau [118] à température ambiante : 18 18 16 16 2(g) 2 (l) (g) 2 (l)CO +H O C O O +H O⎯⎯→←⎯ K=1.041 (25 °C) Dans ce cas, la réaction d’échange conduit l’18 O des molécules d’eau à s’accumuler dans le CO2, notamment celui de l’atmosphère. Cette réaction d’échange est mise à profit pour mesurer la teneur en 18 O de l’eau à partir du CO2 avec lequel elle a été préalablement équilibrée. Le même type d’équilibre et d’effet thermodynamique explique le fractionnement isotopique entre eaux marines, eaux de surface et nuages, qui se forment par évaporation de ces eaux. Ainsi, à 25 °C, la vapeur en équilibre avec le liquide est appauvrie en deutérium d’environ un facteur 0.96 [119] . On verra plus loin ce type de mécanisme, à propos du fractionnement de l’oxygène et du deutérium dans la nature. Le même effet isotopique de nature thermodynamique, analogue à celui des mers et des nuages, est retrouvé : lors des distillations, la composition isotopique des différentes fractions recueillies varie au fur et à mesure de l’avancement. 1.3.3. Autres effets isotopiques Les effets isotopiques cinétiques et thermodynamiques rendent compte des fractionnements produits au cours de chaque réaction, chimique ou biochimique, des processus de diffusion, adsorption, évaporation et en général, d’un quelconque changement d’état. Par contre, d’autres situations de fractionnement peuvent être provoquées par des phénomènes qui altèrent l’équilibre d’une réaction, tels que le changement instantané de la température ou le déplacement d’un réactif ou d’un produit de réaction. Ce type de fractionnement de « non équilibre » n’est pas prévisible selon des règles prédéterminées. Les réactions enzymatiques, processus irréversibles, provoquent des fractionnements de ce type, souvent de grande importance. Ce sont, en fait, les réactions enzymatiques qui ont lieu dans la nature qui nous intéressent le plus et que nous exploitons grâce à la variabilité qu’elles induisent en terme de fractionnement de produits biochimiques. Dans le Tableau 2 quelques exemples de ces réactions sont reportés.
  • 42. Chapitre I 41 Tableau 2: Fractionnement dans certaines réactions enzymatiques [120] Réactions Degré de fractionnement (‰) Photosynthèse 2 2 2 6 12 66 CO +6 H O 6 O +C H O 2 13 13 sucres COδ C - δ C -17 /-5 Réduction du sulfate - + 2 4 2 2H SO +8 e +8 H H S+4 H O 4 2 34 34 SO H Sδ S - δ S +20/30 Méthanogènes - + 4 2 2CH +2 H O CO +8 e +8 H 4 2 13 13 CH COδ C - δ C -80 2. CARBONE : INDICES SUR L’ORIGINE BOTANIQUE La nature nous offre une grande gamme de valeurs δ13 C, et donc du fractionnement isotopique auquel le carbone est soumis. La Figure 1 indique comment le carbone est concerné par le fractionnement isotopique pendant son cycle. La Figure 2 montre la distribution de valeurs δ13 C de plusieurs composés et standards de référence. Figure 1 : Variabilité isotopique du 13 C dans plusieurs formes du carbone en relation à son cycle dans l’environnement [117] δ13 C (‰)
  • 43. Chapitre I 42 Les deux processus fondamentaux du cycle du carbone qui provoquent un fractionnement isotopique, sont l’assimilation du carbone par les organismes vivants et les changements entre l’atmosphère et l’hydrosphère. Tandis que le premier phénomène Figure 2 : Diagramme [121] de composés et standards de référence contenant du carbone et leur distribution au long de l’échelle δ13 C
  • 44. Chapitre I 43 provoque un appauvrissement en 13 C (dit effet isotopique biologique), l’autre produit un enrichissement en 13 C. Un troisième processus, qui se produit à plus petite échelle mais qui nous intéresse beaucoup, est le fractionnement lié aux métabolismes des végétaux et des animaux. Le premier processus, le plus important, est l’assimilation du carbone de l’anhydride carbonique par les plantes lors de la photosynthèse. Le 13 C du CO2 fractionne principalement lors de sa transformation à sucres : Lors de la photosynthèse, la formation des liaisons C–C est favorisée si les atomes de C sont plus légers et plus mobiles. Ainsi, on trouvera que les produits organiques, dérivés des plantes (cellulose, sucres, métabolites secondaires) sont moins riches en 13 C et ils auront des valeurs de δ13 C plus faibles que celle du CO2 atmosphérique, notamment δ13 C plantes < -7 ‰ (vs PDB) (-7 ‰ est la valeur δ13 C du CO2 atmosphérique). Trois cycles photosynthétiques principaux ont été identifiés et caractérisés, sur la base de leurs différentes manières d’assimiler le CO2. Ces trois groupes de plantes se caractérisent par des δ13 C bien différents. Ces trois groupes (C3, C4 et CAM) se distinguent par des différences de conformation des tissus foliaires (voir Figure 3), qui influencent la concentration du CO2 entrant. Ces voies photosynthétiques différentes sont représentées de manière simplifiée dans les schémas de Figure 4 a et b. La principale voie d’assimilation est celle qui a lieu dans la plupart des plantes, décrite par Calvin et Bassham [122] , elle est aussi dite C3, parce que l’anhydride carbonique est fixé d’abord pour donner un composé intermédiaire à trois atomes de carbone. Le CO2 atmosphérique, une fois entré dans le cytoplasme, se combine au ribulose- 1,5diphosphate (RuBP), sous l’action de la ribulose-1,5diphosphatecarboxylase (ou Rubisco) à la lumière, et donne deux molécules d’acide phosphoglycérique (premier produit stable synthétisé). C’est ce composé à trois atomes de carbone qui a donné son nom au mécanisme C3. 2 2 2 6 12 66 CO +6 H O 6 O +C H O 2 13 13 sucres COδ C - δ C -17 /-5 ‰
  • 45. Chapitre I 44 Le cycle C3 est typique des espèces originaires des zones froides ou tempérées, des exemples sont reportés dans le Tableau 3. Les composés des plantes C3 montrent une gamme de variation de δ13 C à peu près comprise entre -22 et -32 ‰. Un deuxième mécanisme de fixation du CO2 est celui dit «cycle de Hatch et Slack», qui l’ont étudié [124] , ou C4 en analogie avec le cycle C3 : dans ce cas les premiers composés intermédiaires synthétisés à partir du CO2 sont à quatre atomes de carbone. La fixation initiale du CO2, sous l’action de la phosphoénolpyruvate (PEP) carboxylase, conduit à l’acide oxaloacétique qui est immédiatement converti en acides malique et aspartique. Ces acides (à quatre atomes de carbone) sont ensuite décarboxylés et le CO2, d’abord stocké dans les parois cellulaires, est libéré et puis repris par la RuBP pour suivre le cycle de Calvin. Figure 3 : Différentes physiologies des tissus foliaires Les différences dans la physiologie des tissus foliaires et donc pour l’assimilation de la CO2 atmosphérique, expliquent la variation entre les valeurs des rapports isotopiques des métabolites des plantes C3, C4 et CAM. (Image re-élaborée d’après [123] ) Tableau 3 : Exemples des plantes les plus communes des trois groupes décrits. Plus de 95% des plantes appartiennent au groupe des plantes C3 ; moins d’1% sont des plantes C4 plantes C3 plantes C4 plantes CAM Betterave, blé, cacahouètes, noix de coco, orge, palm, pommes de terre, prune, raisin, riz, seigle, soja haricots, tournesol Canne, maïs, millet, sorgho Agaves, ananas, cactus, vanille
  • 46. Chapitre I 45 Figure 4 a et b : Schéma simplifié des cycles photosynthétiques C3 (haut) et C4 Cycle C3 Acide oxaloacéti que (4C) Phosphoénol pyruvate carboxylase Acide pyruvique Acide phosphoénol pyruvique Acides malique et aspartique (4C) Triose phosphate (3C) Acide 3- phosphogl ycérique (3C) Ribulose– 5 phosphate Ribulose- 1,5diphosp hate (5C) Transformations successives des sucres phosphates (2C, 3C, 4C, 5C, 6C, 7C) Amidon, sucres (δ13 C ~ -33/-22 ‰) Hexose phosphate (6C) ATP H2O, CO2  (δ13 C ~ -7 ‰) ATP, NADPH Stomate dans la feuille CO2 atm. Amidon, sucres (δ13 C ~ -15/-10 ‰) ATP CO2 (δ13 C ~ -7 ‰) CO2, H2O Stomate dans la feuille CO2 atm.
  • 47. Chapitre I 46 Le cycle C4 est surtout celui des plantes d’origine tropicale. Bien qu’elles soient en minorité (Tableau 3), elles sont parmi les espèces les plus intensivement cultivées par l’homme. Les plantes C4 montrent des valeurs de δ13 C comprises entre -9 et -16 ‰, elles sont donc bien plus riches en 13 C que les plantes C3. Finalement, le troisième groupe de plantes est celui dit CAM (Crassulacean Acid Metabolism), dont le cycle a été mis en évidence par Whelan, Sackett et Benedict [125, 126] . Ces plantes possèdent les deux mêmes enzymes que les plantes des groupes C3 et C4, mais elles alternent ces mécanismes pendant le jour et la nuit. Le CO2 est initialement fixé par la PEP carboxylase en acides C4, pendant la nuit. Le jour, le CO2 libéré se fixera au RuBP, selon le cycle C3. Il existe des espèces CAM facultatives et d’autres obligées, c'est-à-dire qui peuvent ou non passer d’un mécanisme à l’autre quand les conditions deviennent favorables. Les plantes les plus connues appartenant au groupe des CAM, comme les cactus, les agaves, sont originaires de lieux désertiques. D’autres plantes typiques sont l’ananas (broméliacée) et l’orchidée de la vanilline (Vanilla planifolia). Comme on peut s’y attendre, l’intervalle de valeurs de δ13 C est plus étendu et se superpose à celui des plantes C3 et C4 (voir en Figure 5), allant de -30 à -10 ‰. Il faut ajouter que la composition isotopique du CO2 atmosphérique, à laquelle on attribue une valeur moyenne de -7 ‰, peut sensiblement changer d’une zone à l’autre. Par exemple, dans les forêts denses, la valeur de δ13 C peut descendre à -11 ‰ à cause de la contribution de l’anhydride carbonique produit par décomposition de la matière organique. Dans les endroits très habités, la valeur peut diminuer encore, de 2 à 8 ‰, parce que le CO2 technogénique, provenant de la combustion des combustibles fossiles (pétrole, charbon) est plus pauvre en 13 C, et sa contribution abaisse donc la valeur totale de δ13 C du CO2 des villes et centres industriels et donc influence la composition isotopique des plantes dans les environs [127,128] . La valeur moyenne de δ13 C du CO2 atmosphérique montre aussi des variations [129] au cours des années. Les autres facteurs qui influencent la composition isotopique des plantes peuvent être la disponibilité en eau, l’humidité relative, la température, dans la mesure où ils peuvent agir sur l’ouverture des stomates. Une faible disponibilité en eau provoque, chez les plantes C3, une fermeture des stomates, sous le stress hydrique, et cela conduit à un enrichissement isotopique. Ce même effet pour les plantes C4 est de signe opposé.
  • 48. Chapitre I 47 3. L’AZOTE ET SA VARIABILITE DANS LA NATURE Le réservoir naturel de N2 est l’azote moléculaire de l’air, qui en contient presque 80%. Environ 0.4 % de cet N2 est composé de l’isotope 15 N. L’azote est transformé dans ses nombreuses formes et états d’oxydation surtout par des processus physiques et par l’action de microorganismes qui métabolisent les composés azotés en azote inorganique (nitrate et ammoniaque) et azote organique (aminoacides et protéines). Le composé standard de référence est l’azote moléculaire de l’air. Donc, presque tout l’azote accessible à la surface de la planète a la valeur δ15 N = 0 ‰. La variabilité naturelle se situe donc autour de cette valeur, comme le montre la Figure 6. Figure 5 : Modèle du fractionnement du 13 C des plantes et chez les mammifères herbivores qui s’en nourrissent (d’après une figure dans [130] ) CAM δ 13 C (‰) 13 C/12 C C3 C4
  • 49. Chapitre I 48 Figure 6 : Diagramme [121] de composés et standards de référence contenant de l’azote et leur distribution dans l’échelle δ15 N Le Tableau 4 récapitule les différents processus qui donnent lieu au fractionnement de l’azote dans la nature. Une première différentiation parmi les δ15 N des plantes est produite par le fait qu’elles fixent ou non de l’azote atmosphérique. Comme le montre la Figure 7, tandis que les légumineuses ont des valeurs très proches de zéro, les espèces souterraines (pommes
  • 50. Chapitre I 49 de terre, carottes) montrent des valeurs plus élevées, car leur source d’azote provient du sol, donc de formes azotées déjà fractionnées, telles les nitrates. La même figure donne une idée du fractionnement de l’azote présent dans la chaîne trophique, plus on monte dans cette chaîne, plus fort est l’enrichissement en 15 N (+3 ‰ à chaque étape [131, 22] ). L’isotope le plus léger étant le plus facile à éliminer, l’15 N s’accumule dans les tissus. Ainsi, les animaux carnivores ont des valeurs de δ15 N plus élevées que celles des herbivores, dont ils se nourrissent. Ce genre de mécanisme, pourrait donner des indices sur le régime alimentaire d’un animal, pour dépister, par exemple, si un bœuf a été élevé à l’aide de farines d’origine animale ou plutôt avec un régime végétal, ou encore si un poisson est sauvage ou d’élevage. Le fractionnement isotopique de l’azote dépend aussi d’autres facteurs tels que la profondeur et la pente du sol, ses perméabilité et salinité. En outre, la dégradation des biomasses organiques apporte un fort enrichissement en 15 N (de +10 à +30 ‰). Figure 7 : Modèle du fractionnement de l’azote entre les plantes et les animaux (d’après une figure dans [130] ) 15 N/14 N N2-fixateurs Non N2-fixateurs δ 15 N (‰)
  • 51. Chapitre I 50 Tableau 4: Processus à l’origine du fractionnement isotopique de l’azote (d’après une table synoptique de [132] ) Processus Description Degré de fractionnement Fixation Des réactions qui transforment l’azote moléculaire de l’air en autres formes azotées : o l’activité bactérienne, par exemple de l’enzyme nitrogénase chez les plantes légumineuses; o processus physiques qui produisent des températures élevées (décharges électriques, incendies) o activités humaines (production d’énergie, d’engrais chimiques, agriculture) –3/+1 ‰ (pour plantes légumineuses) [133] Assimilation Processus d’incorporation des composés azotés (NOx, NH3) par les microorganismes ou les plantes. D’abord les oxydes d’azote sont réduits en ammonium et ensuite incorporés dans le matériel organique. L’assimilation favorise l’incorpo- ration de 14 N par rapport à 15 N, avec un fractionnement moyen de –0.5 ‰ Ce fractionnement est néglige- able dans les plantes. Dissimilation Réactions métaboliques qui exploitent l’azote assimilé Minéralisation Réactions de transformation de l’azote organique du sol en ammonium. ±1 ‰ Nitrification Processus d’oxydation à plusieurs étapes qui produit du nitrate à partir d’ammonium. -12/-29 ‰ Volatilisation Réaction de volatilisation de l’ammonium sous forme de gaz du sol à l’atmosphère (plus marquée dans les sols alcalins) +20 ‰ Dénitrification Réaction de réduction des nitrates en N2. Enrichissement en 15 N
  • 52. Chapitre I 51 Le facteur principal de fractionnement dans l’agriculture est la pratique de la fertilisation. En fait, les engrais artificiels sont fabriqués à partir de l’N2 de l’air, par le procédé Haber de production d’ammoniaque, mais aussi d’urée, de nitrate d’ammonium et de nitrate de potassium. Ces produits de synthèse possèdent des teneurs en 15 N très faibles, entre -0.2 et +2 ‰, d’après des mesures réalisées dans notre laboratoire sur plusieurs fertilisants du commerce, alors que les engrais d’origine animale (fumiers) ont des valeurs de δ15 N supérieures à +5/+8 ‰. Les valeurs de δ15 N des plantes sont généralement corrélées aux valeurs des nitrates et de l’ammonium présents dans le sol de culture, en tenant compte de la somme des phénomènes de fractionnement vus précédemment, y compris le fractionnement lié aux processus d’assimilation de l’azote des composés organiques [134] pendant le métabolisme végétal. 4. DEUTERIUM ET OXYGENE : ORIGINE GEOGRAPHIQUE Les eaux, marines et météoriques, constituent le seul réservoir d’hydrogène et une partie de celui d’oxygène sur la planète, ainsi ces deux éléments ont un destin commun et ce sont les mêmes processus qui fractionnent leurs isotopes lourds stables, respectivement le deutérium et l’oxygène-18. Le fractionnement cinétique de ces isotopes lourds, 2 H ou D et 18 O, est exactement similaire à celui du carbone, c'est-à-dire que l’on observe un fractionnement dû à la plus grande vitesse de diffusion des molécules légères. La cause majeure de fractionnement de l’eau, et de ses isotopes, est le changement d’état physique, entre les phases liquide et vapeur, par évaporation et condensation. De manière très simple : les isotopes plus lourds sont extraits plus difficilement, de la phase liquide jusqu’à la phase gazeuse et, de plus, ils se condensent plus facilement. En outre, les équilibres de phase sont influencés par la température. Ainsi, la variabilité des valeurs δ18 O et δ2 H (ou δD) des eaux météoriques est liée aux cycles d’évaporation des océans et des condensations successives qui engendrent les précipitations. La composition isotopique de l’eau océanique (de -1 à 0.7 ‰ [120] ) est proche de celle du standard de référence V-SMOW, pour lequel les valeurs δ2 H et δ18 O sont nulles (voir Tableau 1).
  • 53. Chapitre I 52 Figure 8 : Carte des valeurs moyennes de δ18 O des précipitations des années 1992/93 [135]
  • 54. Chapitre I 53 La Figure 8 représente la distribution, au niveau mondial, des valeurs moyennes de δ18 O des précipitations, pour les années 1992/93. Cette illustration montre une caractéristique très importante : l’abondance isotopique de l’oxygène-18 (et du deutérium) dans les eaux est corrélée à la situation géographique. Provoqué par l’influence de la température, on peut constater un effet latitude sur le fractionnement : plus on s’approche de pôles, plus les eaux météoriques sont pauvres en 18 O et 2 H (valeurs de δ ‰ plus négatives : δ18 O -50 ‰ et δ2 H -495 ‰ en Antarctique). Bien sûr, il y a des exceptions, des déviations, dues aux courants océaniques chauds, par exemple le long de la côte orientale de l’Amérique du Sud à celle de l’Océan Atlantique, allant du Mexique à la Scandinavie. La Figure 9 montre l’effet direct de la température sur la variabilité des valeurs de δ18 O dans les masses d’eau évaporées des mers. Figure 9 : Effet de la température sur le fractionnement de l’oxygène dans une masse de vapeur d’eau [120]
  • 55. Chapitre I 54 Les déviations à l’effet latitude, sont provoquées par l’effet continental, comme le montre la Figure 10 dans le cas du fractionnement de l’hydrogène des précipitations. Cet effet intéresse les masses d’eau qui, en se déplaçant de la surface de la mer vers le continent, subissent les effets topographiques et les caractéristiques spécifiques du climat. Il en résulte que les précipitations, tout au long des côtes, sont enrichies en isotopes lourds par rapport aux régions continentales, plus froides (appauvrissement moyen en 18 O d’environ -2.8 ‰ tous les 1000 km de distance aux côtes [136] ). Figure 10 : Schématisation du fractionnement de l’hydrogène des eaux météoriques (adaptation sur d’un original fourni gracieusement par Thermo-Italia) Une autre contribution géographique au fractionnement, est l’effet de l’altitude : une fois à l’intérieur du continent, les masses d’eau s’appauvrissent encore, en δ18 O de -0.15 à -0.5 ‰ pour chaque augmentation de 100 m d’altitude. La variation de valeurs de δ2 H et δ18 O provoquée par l’alternance des saisons n’est pas non plus négligeable. Pendant la période estivale, l’augmentation de température conduit à un enrichissement en isotopes lourds, surtout sur les continents. Les eaux des nappes phréatiques ont une composition isotopique comparable à celle de la moyenne annuelle des précipitations, elles dépendent donc des facteurs géographiques (latitude, altitude, distance des océans ou continentalité), mais pas des facteurs saisonniers. OCEAN CONTINENT -94 ‰ Vapeur -110 ‰ Vapeur -126 ‰ Vapeur -14 ‰ Pluie -30 ‰ Pluie δ2 H = 0
  • 56. Chapitre I 55 ∗∗∗ Dans les végétaux, contrairement au carbone, la composition isotopique en 2 H et 18 O de l’eau végétale n’est pas strictement liée à l’origine botanique. Pour le fractionnement chez les plantes et leurs métabolites, il faut tenir compte des types de fractionnement vus précédemment, surtout dans le cas de l’hydrogène dont l’eau est la seule source pour la photosynthèse. Apparemment la discrimination provoquée par les enzymes du métabolisme des plantes peut être négligée [137] et ce n’est que dans les feuilles que se produit un fractionnement isotopique, causé par l’évapotranspiration. Cet effet est encore une fois influencé par la température et l’humidité relative. Ainsi, une plante « aérienne » comme la vigne présente une plus forte évapotranspiration que la betterave à sucre, qui est une plante souterraine. Ceci se traduit par un plus fort enrichissement en deutérium dans les sucres photosynthétisés par la vigne que dans ceux issus de la betterave. Ceci est mis à profit par la méthode RMN-FINS qui mesure l’enrichissement site par site de l’alcool de fermentation. Les plantes utilisent les eaux de surface venant des précipitations, de rivières ou des infiltrations dans le sol. En conséquence, on peut s’attendre à ce que les δ2 H et δ18 O de l’eau du végétal soient une empreinte de l’origine géographique d’un produit agricole. Des variations d’une année à l’autre, fonction de la pluviométrie et du climat sont prévisibles. Cela reste valide s’il n’y a pas ajout d’eau d’autre origine ou élimination d’eau pendant le processus de production, comme dans les jus de fruit, ou le fromage par exemple. Il est bon de préciser que dans le cas de l’oxygène, les plantes utilisent aussi comme source le CO2 et l’O2 de l’air. Comme ces deux sources ont des valeurs δ18 O presque constantes au niveau planétaire – de +40.3 à +42.5 ‰ [138] , selon la latitude et l’altitude, pour CO2 et de +23.5 à +23.8 ‰ [139, 140] pour O2 – la teneur en 18 O de l’eau dans les plantes n’est, en première approximation, influencée que par celle des eaux absorbées. Par contre, l’incorporation d’oxygène dans les composés organiques lors des différents processus métaboliques est accompagnée d’un fort fractionnement isotopique. Par exemple, le δ18 O de la cellulose est très bien corrélé avec celui de l’eau foliaire mais avec un enrichissement d’environ +27 ‰, à cause des fractionnements isotopiques qui se produisent lors du passage de l’oxygène aux groupes carboxyliques [26] .
  • 57. Chapitre I 56 Le diagramme de la Figure 11 montre la variabilité des valeurs de δ2 H de composés et de standards de référence hydrogénés. On peut remarquer que la plupart des composés possèdent des valeurs négatives sur l’échelle V-SMOW. La Figure 12 montre la distribution des valeurs de δ18 O de plusieurs types de composés et produits standards, par rapport aux deux échelles, V-SMOW et V-PDB. Figure 11 : Diagramme [121] de composés et standards de référence contenant de l’hydrogène et leur distribution dans l’échelle δ2 H
  • 58. Chapitre I 57 Figure 12 : Diagramme [121] de composés et standards de référence contenant de l’oxygène et leur distribution dans l’échelle δ18 O
  • 59. 58 Bibliographie 1 J.J. Thompson – Rays of positive electricity, Proceedings of the Royal Society A, 1913, 89, 1-20 2 F.W. Aston – The Constitution of the Elements, Nature, 1919, 104, 393 3 F. Soddy - Intra-atomic Charge, Nature, 1913, 92, 399-400 4 F.W. Aston – Isotopes. Edward Arnold and Co., London 1922 5 A.O. Nier – A redetermination of the relative abundances of the isotopes of carbon, nitrogen, oxygen, argon and potassium, Physiological Reviews, 1950, 77 789-793 6 H. Craig – The geochemistry of the stable carbon isotopes, Geochimica et Cosmochimica Acta, 1953, 3, 53-92 7 H. Craig – Isotopic standards for carbon and oxygen and correction factors for mass- spectrometric analysis of carbon dioxide, Geochimica et Cosmochimica Acta, 1957, 12,133- 149 8 G. Junk, H. J. Svec – The absolute abundance of the nitrogen isotopes in the atmosphere and compressed gas from various sources, Geochimica et Cosmochimica Acta, 1958, 14, 234- 243 9 R. Park, S. Epstein – Carbon isotope fractionation during photosynthesis, Geochimica et Cosmochimica Acta, 1960, 21, 110-126 10 R. Park, S. Epstein – Metabolic fractionation of 13 C and 12 C in plants, Plant Physiology, 1961, 36, 2, 133-138 11 M.M. Bender – Variations in the 13 C/12 C ratios of plants in relation to the pathway of carbon dioxide fixation, Phytochemistry, 1971, 10, 1239-1244 12 E. Deléens, J.C. Lerman, A. Nato, A. Moyse – Carbon isotope discrimination by the carboxylating reactions in C3, C4 and CAM plants, Proceedings of the Third International Congress On Photosynthesis, 1974 - Israel 13 M.J. De Niro, S. Epstein – Influence of diet on the distribution of carbon isotopes in animals, Geochimica et Cosmochimica Acta, 1978, 42, 495-506 14 M. O'Leary – Carbon isotope fractionation in plants, Phytochemistry, 1981, 20, 4, 553-567 15 G. D. Farquhar – On the nature of carbon isotope discrimination in C4 species, Australian Journal of Plant Physiology, 1983, 10, 205-226
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  • 61. Chapitre I 60 31 W. Meier-Augenstein. Applied gas chromatography coupled to isotope ratio mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 1999, 842, 351-371 32 G. Giuliani, M. Chaussidon, C. France-Lanord et al. – Application de l'analyse isotopique par spectrometrie de masse et sonde ionique de l'oxygène des émeraudes naturelles, Analusis, 1999, 27, 3, 203-206 33 M.J. De Niro, C. Hastorf – Alteration of 15 N/14 N and 13 C/12 C ratios of plant matter during the initial stages of diagenesis: studies using archaeological specimens from Peru, Geochimica et Cosmochimica Acta, 1985, 49, 97-115 34 S.H. Ambrose – Preparation and characterization of bone and tooth collagen for isotopic analysis, Journal of Archaeological Science, 1990, 17, 431-451 35 J. Fernàndez, H.O. Panarello, J. Schobinger – The Inka Mummy from Mount Aconcagua: decoding the geographic origin of the “messenger to the deities” by means of stable carbon, nitrogen and sulfur isotope analysis, Geoarchaeology: an international Journal, 1999, 14, 1, 27-46 36 H.R. Mottram, S.N. Dudd, G.J. Lawrence et al. – New chromatographic, mass spectrometric and stable isotope approaches to the classification of degraded animal fats preserved in archaeological pottery, Journal of Chromatography A, 1999, 833, 209–221 37 X. de la Torre, J.C. González, S. Pichini, J.A. Pascual, J. Segura – 13 C/12 C Isotope ratio MS analysis of testosterone, in chemicals and pharmaceutical preparations, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2001, 24, 645–650 38 M. Lees, F. Bensaid, G. Martin – The contribution of stable isotope analysis to detect counterfeit pharmaceuticals and identify cases of patent infringement. 2nd Conference of European Customs Chemists, Prague, 2003 39 J.P. Jasper, B.J. Westenberger, J.A. Spencer, L.F. Buhse, M. Nasr – Stable isotopic characterization of active pharmaceutical ingredients, Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2004, 35, 21–30 40 M.A. Stelling, G.J.Q. van der Peijl – Inventory of forensic methods for criminal investigations related to endangered species for CITES, 2001 41 C. Belanger – Application of EA-C-CF-IRMS in the analysis of explosives, in Proceedings of Network developing forensic applications of stable isotope ratio mass spectrometry Conference, 2002 – Science&Justice, 2003, 43, 3, 153-160 42 Z.D. Sharp, V. Atudorei, H.O. Panarello, J. Fernàndez, C. Douthitt – Hydrogen isotope systematics of hair: archaeological and forensic applications, Journal of Archaeological Science, 2003, 30, 1709-1716
  • 62. Chapitre I 61 43 Proceedings of NITECRIME (Natural Isotopes in Criminalistics and Environmental Forensics) Workshop, 3rd European Academy of Forensic Sciences Conference, Istanbul, Turkey, 2003 44 A.T. Cawleya, E.R. Hineb, G.J. Troutc, A.V. Georged, R. Kazlauskas – Searching for new markers of endogenous steroid administration in athletes: “looking outside the metabolic box”, Forensic Science International, 2004, 143, 103–114 45 C. Saudan, N. Baume, P. Mangin, M. Saugy-Urinary analysis of 16(5α)-androsten-3α-ol by gas chromatography/combustion/isotope ratio mass spectrometry: implications in anti- doping analysis, Journal of Chromatography B, 2004, 810 157–164 46 J.H. Liu, W.F. Lin, M.P. Fitzgerald, S.C. Saxena, Y.N. Shieh – Possible characterization of samples of Cannabis Sativa L. by their carbon isotopic distributions, Journal of Forensic Sciences, 1979, 24, 814-816 47 F. Mas, B. Beemsterboer, A.C. Veltkamp, A.M.A. Verweij – Determination of "common- batch" in a set of confiscated 3,4-(methylenedioxy)-methylamphetamine samples by measuring the natural isotope abundances: a preliminary study, Forensic Science International, 1995, 71, 225-231 48 E. Ihle, H.L. Schmidt – Multielement isotope analysis on drugs of abuse possibility for their origin assignment, Isotopes in Environmental Health Studies, 1996, 32, 226-228 49 S. Dautraix, R. Guilluy, H. Chaudron-Thozet, J.L. Brazier, A. Lamotte – 13 C isotopic analysis of an acetaminophen and diacetylmorphine mixture, Journal of Chromatography A, 1996, 756, 203-210 50 F. Besacier, R. Guilluy, J.L. Brazier, H. Chaudron-Thozet, J. Girard, A. Lamotte – Isotopic analysis of 13 C as a tool for comparison and origin assignment of seized heroin samples, Journal of Forensic Sciences, 1997, 42, 3, 429-433 51 F. Besacier, H. Chaudron-Thozet, F. Lascaux; M. Rousseau-Tsangaris – Application du couplage chromatographie gazeuse-spectrométrie de masse isotopique de l'azote à l'analyse d'échantillons de drogues, Analusis, 1999, 27, 3, 213-217 52 J.R. Ehleringer, J.F. Casale, M.J. Lott, V.L. Ford – Tracing the geographical origin of cocaine, Nature, 2000, 408, 311-312 53 T.M. Denton, S. Schmidt, C. Critchley, G.R. Stewart – Natural abundance of stable carbon and nitrogen isotopes in Cannabis sativa reflects growth conditions, Australian Journal of Plant Physiology, 2001, 28, 1005-1012 54 F. Palhol, C. Lamoureux, N. Naulet – 15 N isotopic analyses: a powerful tool to establish links between seized 3,4-methylenedioxymethamphetamine (MDMA) tablets, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2003, 376, 486–490
  • 63. Chapitre I 62 55 C.W. Kreitler – Determining the source of nitrate in ground water by nitrogen isotope studies, Report of investigation 83, 1975, Bureau of Economic Geology, University of Texas, Austin 56 D. Broman, C. Naf, C. Rolff, Y. Zebuhr, B. Fry, J. Hobbie – Using ratios of stable nitrogen isotopes to estimate bioaccumulation and flux of polychlorinated dibenzo-p-dioxins (PCDDs) and dibenzofurans (PCDF) in two food chains from the North Baltic, Environmental Toxicology and Chemistry, 1992, 11, 331-345 57 K. Lajtha, R.H. Michener - Editors – Stable isotopes in ecology and environmental science, Blackwell Scientific, 1994, London 58 D.A. Merrit, J.M. Hayes, D.J. Des Marais – Carbon isotopic analysis of atmospheric methane by isotope-ratio-monitoring gas chromatography-mass spectrometry, Journal of geophysical research, 1995, 100, 1317-1326 59 C.C.Y. Chang, C. Kendall, S.R. Silva, W.A. Battaglin, D.H. Campbell – Nitrate stable isotopes: tools for determining nitrate sources among different land uses in the Mississippi River Basin, Canadian Journal of Fisheries and Aquatic Sciences, 2002, 59, 1874-1885 60 K.Yamada, Y. Ozaki, F. Nakagawa, M.Tanaka, N. Yoshida – An improved method for measurement of the hydrogen isotope ratio of atmospheric methane and its application to a Japanese urban atmosphere, Atmospheric Environment, 2003, 37, 1975–1982 61 K.M. Rogers, M.M. Savard – Detection of petroleum contamination in river sediments from Quebec City region using GC-IRMS, Organic Geochemistry, 1999, 30, 1559-1569 62 J.C. North, R.D. Frew, B. M. Peake – The use of carbon and nitrogen isotope ratios to identify landfill leachate contamination: Green Island Landfill, Dunedin, New Zealand, Environment International, 2004, 30, 631– 637 63 G.C. Bugna, J.P. Chanton, C.A. Kelley, T.B. Stauffer, W.G. MacIntyre, E.L. Libelo – A field test of δ13 C as a tracer of aerobic hydrocarbon degradation, Organic Geochemistry, 2004, 35,123–135 64 A. Schimmelmann, A. L.Sessions, C.J. Boreham, D.S. Edwards, G.A. Logan, R.E. Summons – D/H ratios in terrestrially sourced petroleum systems, Organic Geochemistry, 2004, 35, 1169–1195 65 A.G. Abend, T.D. Smith – Differences in stable isotope ratios of carbon and nitrogen between long-finned pilot whales (Globicephalus melas) and their primary prey in the western North Atlantic, ICES Journal of Marine Science, 1997, 54, 500-503 66 J.F. Kelly, D.M. Finch – Tracking migrant songbirds with stable isotopes, Trends in Ecology and Evolution, 1998, 13, 48-49.