Chromacim est le distributeur exclusif en France de la marque CAMAG.
Depuis 20 ans, l'entreprise est spécialiste de la technique analytique HPTLC.
L'HPTLC est une technique utilisée pour identifier et caractériser des composés organiques dans des mélanges complexes.
2. La chromatographie (du grec ancien χρῶμα / khrôma, « couleur » et γράφειν /
graphein, « écrire ») est une méthode physico-chimique utilisée afin de séparer
différentes substances présentes dans un mélange
La Chromatographie sur Couche Mince (CCM) (ou Thin Layer Chromatography
(TLC) en anglais) est une composante de la Chromatographie Liquide
Le terme HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography) est apparu avec le
développement d’équipements analytiques spécifiques de la CCM
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC 2
3. Chromatographie Liquide
o La technique a été développée par le botaniste russe Mikhaïl Tswett en 1906
o En 1931, Le biochimiste français Edgar Lederer promeut la chromatographie comme une
technique analytique et préparative
Chromatographie sur Couche Mince
o J. G. Kirchner et son équipe mettent au point, en 1947, la TLC en tant que méthode séparative,
reproductible et standardisable
o En 1955, avec l’amélioration de la TLC et l’évolution technologique, Rudolf E. Kaiser invente la
terminologie HPTLC et théorise cette branche de la chromatographie liquide
o CAMAG est fondée en 1958 par Dieter Jänchen. Elle deviendra, au fil des années, l’ entreprise
leader mondiale de la technique {HP}TLC
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC 3
4. Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC 4
Technique de séparation de plusieurs composants présents dans un mélange
Basée sur la différence d’affinité entre deux phases non miscibles
1. Soit un composé X mis en solution dans une phase A
2. Si on ajoute à A, une phase B non miscible avec A mais dans laquelle X est
soluble, on observe que X se répartit entre A et B jusqu'à atteindre un
certain équilibre : la phase A s'appauvrit en X pendant que la phase B
s'enrichit en X
3. Si on sépare les 2 phases A et B puis qu'on remet de la phase B propre
dans la nouvelle phase A; après un certain temps, l'équilibre est à
nouveau atteint et si on renouvelle un certain nombre de fois l'opération,
on arrive à extraire le composé X de A
5. Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC 5
Une des deux phases sera immobilisée sur un support tandis que la seconde sera
mise en mouvement :
o Phase stationnaire > immobile
o Phase mobile > en mouvement
La séparation dépend de l’affinité des composés pour la phase stationnaire ou pour
la phase mobile
Remarque :
Les molécules ayant une plus grande affinité pour la phase stationnaire
seront retenues plus longtemps que celles qui en ont moins
6. Quel que soit le type de chromatographie, le principe de séparation reste identique
Le soluté est soumis à :
o un effet d'entrainement par la phase mobile
o un effet de rétention par la phase stationnaire
Pour chacune des substances, la répartition entre les deux phases s'effectue selon un
rapport K appelé coefficient de partage (ou coefficient d’adsorption), défini par
l'équation suivante :
Cs : concentration du composé dans la phase stationnaire
Cm : concentration du composé dans la phase mobile
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Cs
Cm
K2 = 2
K1 = 0,2
1 10
K =
Cs
Cm
Phase stationnaire
Cs
Cm
Phase mobile fraîche
K2 K1
7. 7
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Le gel de silice est un polymère d'acide silicique : hydroxyde de silicium Si(OH)4
Sa surface présente des groupes Silanol (Si-OH) très polaire
8. Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC 8
L’amélioration des paramètres et des caractéristiques de la CCM permet d’atteindre la
version à haute performance :
o HPTLC (High Performance Thin Layer Chromatography)
Grâce à l’HPTLC
o La CCM n’est plus uniquement une méthode d’identification
o Elle devient également une méthode analytique
Quantitative
Sensible
Rapide
Comparative
Économique
9. 9
HPLC
Temps de rétention (tR) : le composé prend un
certain temps pour traverser la colonne
Facteur de capacité (k’) : exprime la rétention
Temps mort (tm) : spécifique de la colonne, temps de
transit d'un composé non retenu par celle-ci
Le débit de la phase mobile est constant et est contrôlé
par une pompe.
{HP}TLC
Distance de migration (MD) : le composé prend un
certain temps pour migrer sur la plaque CCM
Rapport frontal (Rf) : exprime la rétention relative
Zf’ : distance parcourue par le front du solvant depuis
la zone de dépôt de l'échantillon
La phase mobile se déplace sur la plaque par
capillarité.
Une phase gazeuse participe également à la
séparation.
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
10. Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC 10
La Chromatographie sur Couche Mince (CCM) est une méthode séparative de
chromatographie liquide, travaillant majoritairement en phase normale
C’est une technique analytique polyvalente qui est utilisée :
o En complément (ou en substitut) de l’analyse HPLC qui, elle, travaille en phase inverse
o Pour le suivi de synthèses organiques
o Pour analyser des composés colorés
o Lorsque les substances recherchées n’absorbent pas dans le spectre UV
o Lorsque la matrice est trop complexe pour être injectée en HPLC
o Pour réduire le temps d’analyse dans le cas de nombreux échantillons
o Pour s’affranchir de problèmes de saturation si les échantillons sont très concentrés
11. 11
En HPLC En CCM
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Impuretés coéluées
12. 12
Les composés n’absorbent pas dans le spectre UV
o Révélations chimiques
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
13. 13
Matrice au dépôt Matrice au front
Matrice
huileuse
Pré-migration au
Dichlorométhane
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Matrices complexes
o L’utilisation de plaques jetables économise l’étape de pré-traitement des échantillons
o Deux possibilités :
15. 15
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Composition des plaques CCM
o Chaque plaque est constituée de trois éléments :
Le support (verre ou aluminium)
La phase (silice, silice modifiée, cellulose, etc.)
Le liant (permettant de maintenir la phase sur son support)
o Un additif fluorescent peut être ajouté à la phase stationnaire afin de permettre la
visualisation des substances absorbant, dans le spectre UV, à 254 nm
o La porosité de la phase à base de silice est toujours de 60 Å
o La qualité des plaques {HP}TLC varie selon :
l’épaisseur du dépôt de silice
le diamètre et la répartition des billes de silice
le liant utilisé par le fabriquant
16. 16
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Caractéristiques des plaques {HP}TLC
TLC
Dim. : 20x20 ou 10x20 cm
Migration : 120-150 mm
Granulométrie : 10-12 μm
Répartition de silice : large
Épaisseur : 250 μm
Support : aluminium
Sensibilité : faible
Quantification : NON
HPTLC
Dim. : 10x10 ou 20x10 cm
Migration : 50-60 mm
Granulométrie : 5-7 μm
Répartition de silice : étroite
Épaisseur : 200 μm
Support : verre
Sensibilité : grande
Quantification : OUI
17. Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC 17
Lire une plaque {HP}TLC – Exemple d’une plaque Si60
Front de solvant
Molécule moins polaire
Coélution de deux composés
Molécule plus polaire
Dépôt
h
H
Molécule(s) au dépôt
Molécule(s) au front
Rf =
Hauteur de migration (h)
Hauteur du front de solvant (H)
Remarques :
Les molécules au dépôt n’ont pas été
entrainées par la phase mobile
Les molécules au front n’ont pas été
retenues par la phase stationnaire
!
!
!
18. 18
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Les différentes phases greffées
o Silice
o Diol
o NH2
o CN
o RP-2
o RP-8
o RP-18w
o RP-18
La phase ‘Chirale’ est utilisée
spécifiquement pour séparer des
énantiomères
19. 19
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Polarité des différentes phases
o Silice
Phase extrêmement polaire, sensible à l’humidité
C’est la plus utilisée en CCM
o Diol
Phase fortement polaire, résistante à l’humidité
Moins de trainées des pics lors de la migration qu’avec une phase de Silice
o NH2
Phase très polaire
Phase échangeuse de cations permettant l’analyse de molécule(s) chargée(s) ou de carbohydrates
o CN
Phase de polarité intermédiaire
Analyse CCM en phase normale ou en phase inverse selon la phase mobile sélectionnée
o RP-n
Phase apolaire, dû au greffage de chaines alkyles à n carbones (n = 2 / 8 / 18)
Analyse CCM en phase inverse
Polarité
de
la
phase
stationnaire
20. 20
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Plaques Dépôt Migration Révélation Détection
21. 21
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Deux types de dépôt
o Par capillarité (Spot)
Déposé par l’automate
Déposé à la main
o Par vaporisation (Spray)
Déposé par l’automate
En bande En rectangle
En spot
22. 22
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Comparaison des types de dépôt
o Le dépôt en spot peut entrainer à une
mauvaise séparation dû à la largeur du dépôt
et à la quantité d’échantillon déposé
o Le dépôt par spray permet d’obtenir des
bandes fines et de contrôler la quantité
d’échantillon, permettant de facto une
meilleure résolution
23. 23
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Dépôt par vaporisation
1. L’échantillon est vaporisé sur la plaque par un gaz de N2
2. Le solvant de dissolution de celui-ci va s’évaporer au cours du
processus permettant l’obtention d’un dépôt très fin
3. Il est important de régler la vitesse de dépôt pour qu’elle soit
inférieure à la vitesse d’évaporation afin de limiter la
diffusion de l’échantillon
1
2
3
24. 24
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Déposeurs automatiques CAMAG
o Déposeur automatique ATS 4
Programmation de la séquence des
dépôts grâce au logiciel visionCATS
Dépôt automatique par spray ou en spot
Remplissage et rinçage de la seringue en
automatique
Déposeurs automatiques CAMAG
o Déposeur semi-automatique Linomat 5
Programmation de la séquence des dépôts
manuellement ou avec le logiciel visionCATS
Dépôt automatique par spray ou en spot
Remplissage et rinçage de la seringue en
manuel
25. 25
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Plaques Dépôt Migration Révélation Détection
26. 26
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
L’étape de migration est primordiale en CCM
o Plusieurs équilibres et plusieurs intéractions interviennent dans le résultat
o En plus d’une phase mobile, une phase vapeur est présente dans la cuve de développement
o Modifier cette phase vapeur permet d’améliorer la séparation
o La géométrie de la cuve joue également un rôle sur :
La quantité de solvant à utiliser
Le volume et la composition de la phase vapeur
Le préconditionnement de la cuve
o Des essais peuvent être réalisés pour valider le choix de la cuve
27. 27
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
La CCM est une chromatographie d’adsorption
o Elle met en jeu un mécanisme d'adsorption du soluté sur la phase stationnaire solide et un
mécanisme d'élution (ou de désorption) par la phase mobile liquide (éluant)
o Schéma de principe :
Adsorption
du soluté sur
l’adsorbant
Dissolution
du soluté
dans l’éluant
Adsorption
de l’éluant sur
l’adsorbant
Force de rétention Force d’entrainement
soluté
éluant
adsorbant
Remarque :
En CCM, l’adsorbant est un gel de silice
sélectionné pour son fort pouvoir d’adsorbance
et sa très grande polarité, grâce à ses groupes
« silanol » : Si-OH
28. 28
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
La force éluante
o La phase mobile est un mélange de solvants de
polarité voisine de celles des solutés à séparer
o Les différents solvants sont classés selon leur
force éluante (ε0) qui transcrit leur polarité
Série éluotropique de la silice pour certains solvants
Remarque :
Quand la force éluante de la phase mobile
augmente, la rétention du soluté sur la phase
stationnaire diminue et le Rf augmente
29. 29
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Exemple de modification de la force éluante de la phase mobile
Phase mobile sélectionnée :
n-Hexane + x% AcOEt
A partir de 40% d’acétate d’éthyle
au sein de la phase mobile,
l’éluant perd sa sélectivité
Question :
Selon vous, quel est le pourcentage
optimal d’AcOEt à ajouter à l’éluant
pour assurer une bonne séparation?
La résolution maximale est atteinte lorsque le Rf ~ 0,3
30. 30
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
La sélectivité
o La sélectivité d’un solvant est déterminée
par sa propriété à donner des protons (Xe)
ou à accepter des protons (Xd), en fonction
des interactions dipolaires (Xn)
II
IV
VIII
V
III
VI
VII
I
Accepteur de proton
Interaction dipolaire
Donneur de proton
Xe
Xd
Xn
31. 31
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
L’éluant est choisi en fonction de la sélectivité et de
la force éluante de chaque solvant qui le compose
o La sélectivité permet de séparer les molécules
présentes dans le soluté
o La force éluante détermine la position des composés
sur la plaque
Remarque :
Pour réaliser une bonne migration, il faut que l’éluant
possède une polarité voisine de celle des solutés à
séparer (car ceux-ci doivent être solubles dans l'éluant !)
32. 32
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Optimisation de l’éluant
o Sélectivité
o Force éluante
o Modificateur de pH
Réduire ou
augmenter la
force éluante
Addition de
modificateur
de pH
Choix du
« meilleur »
éluant
Sélectivité
avec solvants
purs
Remarque :
L’ajout d’un acide ou d’une base
permet, en stabilisant le pH, d’obtenir
des résultats reproductibles
33. 33
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Types de cuves
Verticales Horizontales Automatiques
34. 34
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Cuves verticales
o La plaque doit être positionnée le plus
verticalement possible, le support verre contre la
paroi, la silice exposée aux vapeurs de solvant
o Saturation et préconditionnement :
recommandés lors de l’utilisation de mélanges
complexes
o Type de cuve le plus usité (en manuel ou en
automatique)
Sans saturation Avec saturation
Avec préconditionnement
Remarque :
La migration dans une cuve saturée permet des
chromatographies plus reproductibles, cependant les bandes
peuvent être plus diffuses
35. 35
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Cuves horizontales
o La migration, avec seulement 4 mL de solvant, est réalisée sur deux fois plus
d’échantillons qu’une cuve verticale classique
o La phase vapeur est facilement contrôlable avec la cuve horizontale
o Une saturation est également faisable
1. Plaque avec gel vers le bas
2. Contre plaque en verre pour sandwich
3. Augettes pour le solvent de migration
4. Lamelle de capillarité pour la migration
5. Couvercle de fermeture en verre
36. 36
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Cuve automatique ADC 2
o Migration en mode isocratique pilotée par le logiciel visionCATS
o Utilisation d’une cuve horizontale à double bac spécifique
o Réalisation possible d’un préconditionnement ou d’une saturation
o La hauteur du solvant est contrôlée par une barrette de diodes
o La plaque est retirée et séchée en fin d’élution
o Vérification et gestion du taux d’humidité
Remarque :
Grâce au contrôleur d’humidité, la phase de migration
en CCM devient une étape stable, sans variabilité des Rf;
la rendant transposable et reproductible
37. 37
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Influence de l’humidité
o La silice étant sensible à
l’humidité, la variation du taux
d’humidité dans l’atmosphère
entraine une modification de
positions des bandes
o Contrôler l’humidité est donc
très important pour comparer
des plaques ou pour assurer
une bonne séparation
38. 38
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Cuve automatique AMD 2
o Migrations en mode gradient pilotées par le logiciel visionCATS
o La plaque est insérée dans une chambre hermétique
o Succession de migrations de quelques millimètres
o Modification de l’éluant pour être de moins en moins polaire
o Entre chaque migration a lieu un séchage sous vide afin
d’éviter la diffusion des composés sur la plaque
Remarque :
L’AMD2 (Automated Multiple Development) est
principalement utilisé pour analyser des mélanges de lipides
car les familles lipidiques possèdent une polarité variée
39. 39
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Plaques Dépôt Migration Révélation Détection
40. 40
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Observation des taches
o Couleur intrinsèque
Pas de révélation
Taches observables à l’œil nu
o Absorbance en UV
Pas de révélation
Extinction de la fluorescence
de l’indicateur
Taches observables en noir
sous UV (254 nm)
Les différentes possibilités
o Fluorescence en UV
Pas de révélation
Irradiation par rayonnement UV
Taches observables en clair sur fond
sombre sous UV (366 nm)
o Révélations {bio}chimiques
En l’absence de chromophores ou de
pigmentation, une révélation
biologique ou chimique peut s’avérer
nécessaire
Taches observables dans le spectre
visible ou sous UV
Permet de quantifier les composés
41. 41
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Révélations post-chromatographiques
o Par pulvérisation (manuelle ou automatique)
o Par immersion (manuelle ou automatique)
Système manuel Systèmes automatiques
42. 42
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Catégorie de réactifs
o Réactifs universels
Acide sulfurique
Sulfate de cuivre (Fig. 1)
Acide phosphomolybdique
Iode
…
o Réactifs spécifiques
Réactif de Neu (NP/PEG)
Anisaldéhyde sulfurique (Fig. 2)
Ninhydrine
Réactif de Dragendorff
…
Catégorie de réactifs
o La détection biologique (EDA)
Activité antibactérienne
Activité antifongique
Activité antioxydante
Inhibition enzymatique
Perturbateur endocrinien
…
Figure 1 – Analyse de lipides cutanés Figure 2 – Analyse de Centella Asiatica
43. 43
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Plaques Dépôt Migration Révélation Détection
44. 44
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Système photo Visualizer 2
o Module équipé d’une caméra HD et de trois types de lampes
o Les plaques CCM sont photographiées dans le spectre :
Visible
UV à 254 nm
UV à 366 nm
o Avec les options adéquates du logiciel visionCATS,
les photos peuvent être retraitées pour :
Interprétation
Comparaison
Quantification
Remarque :
Pour une quantification très fine, il est recommandé d’y associer un densitomètre
45. 45
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Principe de la densitométrie
o Tout faisceau lumineux arrivant sur la plaque voit une partie de
son énergie absorbée dans l’épaisseur de silice
o Seule la lumière réfléchie par la plaque est analysée
o L’intensité du rayon lumineux réfléchi est proportionnelle à la
quantité de substance adsorbée sur la plaque
o Deux modes de mesure sont possibles :
l’absorbance
La fluorescence
46. 46
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Absorbance
o Emission d’une longueur d’onde d’excitation i
o Le composé absorbe à la longueur d’onde i
o Emission d’une longueur d’onde r d’intensité inférieure à celle
d’excitation i
o Visualisation d’un pic chromatographique
• Si i = r : Observation du bruit de fond – le produit n’absorbe pas
• Si i > r : Observation d’un signal – le produit absorbe
i
r
47. 47
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Fluorescence
o Emission d’une longueur d’onde d’excitation i à 366 nm
o Le composé fluoresce à la longueur d’onde i
o Emission d’une longueur d’onde r d’intensité supérieure à celle
d’excitation i
o Un filtre passe-haut à 400 nm (f) est utilisé pour stopper la longueur
d’onde d’excitation i afin de mesurer exclusivement la longueur
d’onde de fluorescence
o Visualisation d’un pic chromatographique
• Si r ≤ f : Observation du bruit de fond – le produit ne fluoresce pas
• Si r > f : Observation d’un signal – le produit fluoresce
i
r
f
48. 48
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Densitomètre Scanner 4
o Module équipé de trois types de lampes, équivalent à un détecteur UV à barrette de diodes
o Largeur du spectre électromagnétique : 190 – 900 nm
o Très sensible, il permet de quantifier jusqu’à quelques picogrammes de produit
o Visualisation du spectre UV-Visible des composés
49. 49
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Interface TLC-MS 2
o Couplage direct à la source du Spectromètre de Masse
o Collecte d’échantillon dans un vial pour les autres couplages
o Débit de la pompe : 0,1 – 0,2 mL/min
o Pression : 5 bars
o Air comprimé ou N2
1. Interrupteur Laser
2. Montée/Descente du piston
3. Interrupteur de nettoyage
4. Vis de serrage de la fenêtre de protection
5. Piston avec sa tête d’élution
6. Table de positionnement de la plaque
7. Levier de positions Bypass/Elution
8. Réglage de la pression
9. Vanne à 6 voies pour connexions à la pompe et au MS
10. Cale
50. 50
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Domaines d’activités
o Dermo-cosmétiques
o Pharmaceutiques
o Biotechnologies
o Nutrition humaine ou animale
o Pétrochimie
o Chimie de l’eau
o Forensique
o Recherche scientifique
o Etc.
51. 51
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Dermo-cosmétiques
Fingerprint
Matières premières
Quantification d’actifs
Test d’activités biologiques
Dosage de traceurs
Industries pharmaceutiques
Matières premières
Contrôle de nettoyage
Stabilité
Suivi de synthèse
Dosage d’impuretés
Contrefaçons
Nutraceutique
Screening
Stabilité
Dosage des métabolites
Contrefaçons
Agroalimentaire
Matières premières
Caractérisation
Dosage des lipides
Dosage des glucides
Stabilité
Chimie de l’eau
Pesticides
Perturbateurs endocriniens
Autres contaminants
Pétrochimie
Bitumes
Hydrocarbures
Biocarburants
Forensique
Explosifs
Stupéfiants
Encres
Contrefaçons
Biotechnologies
Test d’activités biologiques
Dosage d’impuretés
Suivi de synthèse
52. 52
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Identification d’impuretés
Problématique
o Suivi de synthèse organique
o Observation d’une impureté
o Produit coloré non conforme
o Absence de chromophores
o Indétectable en HPLC
Solution
o Réaliser des révélations chimiques
o Détection des impuretés en HPTLC
Produits non conformes
1ère plaque
53. 53
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
2nde plaque
Optimisation
o Primuline
o Ac. Phosphomolybdique
54. 54
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Impuretés
3ème plaque
Résultats finaux
Impuretés
55. 55
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Dosage de filtres solaires
Problématique
o Réduire le temps d’analyse (une méthode par analyse en HPLC)
Solution
o Utilisation de l’HPTLC (une seule méthode pour identifier 4 molécules)
56. 56
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Pourquoi choisir l’HPTLC?
o Pour sa polyvalence
o Pour sa simplicité
o Pour sa rapidité
o Pour son efficacité
o Pour séparer des composés polaires
o Pour analyser des produits colorés
o Pour réaliser des tests d’activités
o Lorsque les matrices sont complexes
o Lorsque les composés ne possèdent pas de chromophores
o …
57. 57
Xavier ANNE - CHROMACIM La technique HPTLC
Xavier ANNE
CHROMACIM
Ingénieur technico-commercial Nord & IDF
06 22 58 63 74
xa@chromacim.com
Notes de l'éditeur
Tous les solutés peuvent s’adsorber sur la surface d'un solide micro-poreux ou se partager entre deux solvants non miscibles : il est donc toujours possible de les séparer.
La séparation s'effectue par la différence de distribution de chaque composant entre la phase stationnaire et la phase mobile. Si, pour 2 composés, cette distribution est différente, la progression de chacun sur la plaque se fera à des vitesses différentes : le composé ayant le plus d'affinité avec la phase stationnaire sera le plus retenu.
Dans l'exemple ci-dessus, pour le composé 1, la concentration dans la phase mobile est plus importante que dans la phase stationnaire il s'ensuit une migration plus rapide car le composé est moins retenu mais aussi une diffusion plus importante car il y a moins de résistance au transfert de masse dans la phase mobile.
K est le coefficient de distribution (appelé aussi coefficient dʼadsorption, de partage ou de tout autre phénomène jouant sur les mécanismes de la rétention). Il est constant pour un produit et des phases données.
Des interactions spécifiques des groupement fonctionnels à la surface de la phase stationnaire solide entrent en jeu avec les groupements fonctionnels du composé. De cette adsorption il en résulte une diminution de l'énergie de surface de l'adsorbant et par là une diminution de la rétention : le composé est "relâché" et peut ainsi continuer son parcours dans la phase mobile pour être retenu un peu plus loin.
Le degré de rétention du composé est donc basé sur le type et le nombre de ses groupements fonctionnels et sur sa structure stérique.
En chromatographie d'adsorption ou phase normale, les molécules de la phase mobile sont elles aussi adsorbées sur la phase stationnaire et donc en compétition avec les molécules de l'échantillon.
Les 2 principales approches mathématiques (*) sont basés sur :
- le déplacement des molécules de solvant adsorbées sur les sites actifs de la phase
stationnaire par les molécules de l'échantillon.
- le processus d'adsorption du couple de molécules solvant/échantillon en interaction.
Selon la composition de la phase mobile, les 2 processus peuvent prendre place
alternativement.
En CCM d'adsorption, le terme activité est utilisé pour décrire une certaine propriété de l'adsorbant affectant la rétention.
(*) " Snyder LR : Principles of Adsorption Chromatography, 1968
" Poole CF, Poole SK, Chromatography Today, 1991
La Chromatographie sur Couche Mince (CCM) ou Thin Layer Chromatographie (TLC) est une
technique de la Chromatographie en phase Liquide (LC).
Elles sont similaires par bien des points : elles sont utilisées pour séparer les mêmes types
d'échantillons et ont des performances comparables.
Elles diffèrent par l'expression de la rétention :
En LC, la distance parcourue par le composé est fixe et définie par la longueur de la colonne.
Le composé met un certain temps pour parcourir cette distance.
On parle de facteur de capacité (k'), grandeur sans unité, pour caractériser la rétention du
composé par la colonne de séparation. Il permet de comparer les chromatogrammes de
séparations obtenues sur des colonnes différentes avec des conditions d'élution différentes et
ainsi de s'affranchir des paramètres géométriques de la colonne.
En CCM, la distance parcourue dépend du temps que l'on laisse au composé pour migrer sur
la plaque. On utilise le terme Rf (rapport frontal) pour exprimer la rétention.
Mais aussi, par la différence associée à la phase mobile :
En LC, la phase mobile est forcée à travers la colonne à une vitesse optimale.
En CCM, c'est la force capillaire qui entraîne le liquide vers le haut de la plaque. On note
aussi la présence d'une phase gazeuse qui intervient dans la séparation.
Réactif de Neu (NP/PEG) > Flavonoïdes & Carbohydrates
Anisaldéhyde sulfurique > Terpènoïdes
Ninhydrine > Acides aminés
Réactif de Dragendorff > Alcaloïdes