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UNIVERSITE PARIS XI
FACULTE DE MEDECINE PARIS-SUD
Année 2008/2009
N° attribué par la bibliothèque
THESE
Pour obtenir le grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE PARIS XI
Champ disciplinaire : Biochimie, Biologie Cellulaire et Moléculaire
École Doctorale de rattachement : « Cancérologie : Biologie, Médecine, Santé » (0418)
Présentée et soutenue publiquement
par
Ophélie PHILIPOT
Le 21 Octobre 2009
Titre :
Coopération entre le facteur de transcription CBF (Runx1-CBFβ) et le facteur myogénique MyoD dans la
régulation de l’équilibre prolifération-différenciation musculaire
Directeur de Thèse : AIT-SI-ALI Slimane
JURY
Président : Pr AUCLAIR Christian
Rapporteur : Dr VANDEL Laurence
Rapporteur : Dr DELVA Laurent
Examinateur : Pr WEITZMAN Jonathan
Directeur de thèse : Dr AIT-SI-ALI Slimane
A Patrick et Annie,
Table des matières
REMERCIEMENTS i
LISTE DES FIGURES iii
LISTE DES ABREVIATIONS iv
AVANT-PROPOS 1
CHAPITRE I 2
LE MUSCLE SQUELETTIQUE 2
I. INTRODUCTION: PRESENTATION DU MODELE D’ETUDE, LE MUSCLE STRIE 2
I.1 Les types cellulaires qui composent le muscle strié 2
I.1.1 Les cellules extra fusales, ou cellules musculaires striées 2
I.1.2 Les cellules satellites 3
I.1.3 Les cellules du fuseau neuromusculaire 4
II. MISE EN PLACE DES FIBRES MUSCULAIRES STRIEES 4
II.1 Mise en évidence des MRFs 4
II.2 Détermination et différenciation des cellules musculaires au cours de la myogenèse embryonnaire
5
II.3 Les protéines Mef2, co-facteurs des MRFs 6
II.4 Relation structure/ fonction des MRFs 8
II.4.1 Le domaine bHLH est impliqué dans la fixation sur l’ADN et dans la dimérisation avec les
protéines E 8
II.4.2 Les domaines de transactivation (TAD) N-terminal et C-terminal régulent l’activité des MRFs 9
II.5 La différenciation terminale se décompose en deux étapes discrètes 10
II.5.1 La sortie du cycle prolifératif 11
II.5.2 L’activation des gènes spécifiques du muscle 11
III. L’EQUILIBRE PROLIFERATION-DIFFERENCIATION DANS LE MUSCLE 12
III.1 Régulation négative de l’activité de MyoD dans les myoblastes proliférants 12
III.1.1 MyoD et ses cofacteurs sont régulés négativement au cours du cycle cellulaire 12
III.1.2 Les protéines bHLH inhibitrices séquestrent MyoD et ses co-facteurs 14
III.1.4 Dans les myoblastes en prolifération, MyoD contribue à la répression épigénétique de ses gènes
cibles 15
III.2 MyoD orchestre la différenciation musculaire terminale 18
III.2.1 MyoD promeut la sortie du cycle cellulaire en stimulant l’expression de Rb, p21 et la cycline
D3 18
III.2.2 MyoD interagit avec des facteurs régulant de manière positive sa fixation à l’ADN 20
III.2.3 Plusieurs voies de signalisation régulent positivement la différenciation musculaire 20
III.2.3 MyoD recrute des enzymes de remodelage de la chromatine sur ses gènes cibles 21
IV. LE MAINTIEN DU MUSCLE ET SA REGENERATION DEPENDENT DE SON
INNERVATION 25
IV.1 Le maintien de muscle adulte par les cellules satellites 25
IV.2 Le muscle adulte est régulé par son innervation 26
CHAPITRE II 29
LE FACTEUR DE TRANSCRIPTION RUNX1/CBFβ 29
I. INTRODUCTION : DECOUVERTE DE LA FAMILLE DE PROTEINES A DOMAINE
RUNT ET CBFβ 29
II. EXPRESSION ET FONCTION DE RUNX1 ET CBFβ 31
II.1 Fonctions biologiques de Runx1 et de la sous-unité CBFβ chez les mammifères 31
II.2 Organisation génomique de Runx1 et CBFβ 34
II.2.1 Les deux promoteurs de Runx1 et l’épissage alternatif de son ARNm sont à l’origine de ses
nombreuses isoformes 34
II.2.2 La protéine CBFβ et ses isoformes 36
II.3 Relation Structure/ Fonction 37
II.3.1 La sous-unité protéique Runx1 37
II.3.2 La sous-unité protéique CBFβ 40
III. REGULATION DE L’ACTIVITE DU FACTEUR DE TRANSCRIPTION CBF 41
III.1 Régulation positive de l’activité de transactivation de Runx1 42
III.2.1 Phosphorylation, acétylation et méthylation de Runx1 42
III.2.2 Modulation de l’activité de Runx1 par la MAP kinase ERK 43
III.2 Régulation négative de l’activité de Runx1 44
III.2.1 Groucho/TLE 44
III.2.2 mSin3A et les HDACs 45
III.2.3 HMTs 46
III.3 Régulation de la formation du dimère fonctionnel CBF par la localisation subcellulaire des sous-
unités Runx1 et CBFβ 46
IV. CBF DANS LE CONTROLE DE L’EQUILIBRE PROLIFERATION-
DIFFERENCIATION 47
IV.1 Régulation croisée entre CBF et les régulateurs du cycle cellulaire 47
IV.1.1 CBF accélère la phase G1 et stimule l’entrée en phase S 47
IV.1.2 Régulations croisées entre les régulateurs du cycle cellulaire et Runx1 48
IV.2 CBF et l’équilibre prolifération-différenciation 50
PRESENTATION DU PROJET DE RECHERCHE 53
CONTEXTE 53
PROBLEMATIQUE 54
ARTICLE DE RECHERCHE 55
DISCUSSION DES RESULTATS 77
Validation de la stratégie d’approche 77
Identification de Runx1-CBFβ au sein du complexe MyoD 77
MyoD interagit avec CBF via la sous-unité Runx1 78
MyoD et CBF interagissent ensemble dans les myoblastes murins, préférentiellement en prolifération
79
CBF est recruté sur les gènes cibles de MyoD préférentiellement dans les cellules musculaires en
prolifération, et non en différenciation 79
Le facteur CBF régule négativement la différenciation musculaire, au profit de la prolifération
cellulaire 80
Dans les myoblastes en prolifération, CBFβ est associé à des répresseurs et inhibe le remodelage de
chromatine sur les gènes cibles de MyoD après induction de la différenciation 82
Conclusion et Modèle 83
DISCUSSION GENERALE & PERSPECTIVES 84
I. Régulation de la translocation de CBFβ dans le noyau des myoblastes 84
II. CBFβ dans le cytoplasme : un rôle de senseur ? 87
III. Runx1, CBFβ et MyoD : un rôle dans la différenciation ostéoblastique ! 87
IV. Les variants d’épissage de Runx1 pourraient être à l’origine d’une double fonction : le contrôle de
la prolifération et de la différenciation musculaire 90
MODELISATION & CONCLUSION 93
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 95
ANNEXE 1 117
Article de revue 1 118
ANNEXE 2 130
Article 2 131
ANNEXE 3 141
Article 3 142
ANNEXE 4 151
Curriculum Vitae 152
i
Remerciements
Je tiens vivement à remercier le Pr Christian Auclair d’avoir accepté d’être le président du Jury de
ma thèse. Également merci aux Drs Laurence Vandel et Laurent Delva d’avoir été rapporteurs de
ma thèse et de m’avoir aider à améliorer ce manuscrit. Enfin, un grand merci au Pr Jonathan
Weitzman, mon directeur d’unité, qui me fait l’honneur d’être examinateur de ma thèse.
Ma dernière année de thèse a été ponctuée par l’installation de mon équipe sur le campus de
l’université Paris-Diderot, au sein de l’unité « Epigénétique et Destin Cellulaire » dirigé par le Pr
Jonathan Weitzman. Jonathan, j’admire ta manière de créer cette cohésion et cette dynamique dans
notre unité. Malgré ton busy schedule, tu trouves toujours le temps d’écouter et de conseiller.
Un merci tout particulier à Pierre-Antoine Defossez, aka Mr Management. Merci pour tes livres, pour
ton temps précieux, tes conseils et tes astuces. Grâce à tout ça, je ne me suis fait que partiellement
ensevelir par la préparation de ma thèse. Ouf !
Ensuite, un grand merci à mon laboratoire d’accueil, littéralement ma deuxième maison pendant ma
thèse. Slimane, je tiens à te remercier pour tous nos échanges. Lancer ma thèse en même temps que
l’installation de ton labo était un pari risqué. Aujourd’hui c’est un pari gagné et je ne suis pas peu
fière d’avoir survécu à l’aventure ! Plus qu’un enseignement scientifique, c’est une leçon de vie que
j’ai apprise dans ton équipe. Alors, du fond du cœur : « Merci ! ». Mes manips ont largement profité
du savoir-faire de nos deux « experts » au laboratoire, Lolo et Phiphi ! Merci pour tous vos conseils
techniques et votre temps. Je tiens également à remercier Véronique, pourtant à peine arrivée dans
l’équipe. Sa bonne humeur contagieuse m’a permis de positiver jusqu’au bout de l’aventure. Et puis
il y a Aurélie avec qui ce n’était franchement pas gagné, mais qui finalement s’est révélée
indispensable pour ma santé mentale sur la dernière ligne droite. Merci un million de fois : parce
que tu sais râler avec classe, pour « l’escalator » , pour les fous rires, et pour ta playlist bien moisie.
Enfin, je n’oublie pas ma petite Céline, la meilleure stagiaire du monde entier : ma petite
padawanette, je sais que tu iras loin ! Tu as fait un boulot fantastique sur le projet. Merci pour ton
investissement, tes lumières, ton soutien, ta sagesse, tes sourires et ta bonne humeur quotidienne.
ii
Je n’oublie pas mon premier labo dirigé par le Dr Annick Harel-Bellan, où s’est déroulée la majeure
partie de ma thèse! Merci à tous ceux qui ont pris le temps de résoudre mes problèmes techniques
et qui m’ont wisely conseillé, je pense notamment à Jacques, Sylvain, Anna…
Un merci tout particulier aux « nénettes », Corinne et Cathy, pour les ragots, les imitations et les
fous rires ! Et à ma Nora, celle qui a suivi de très près mes péripéties au lab et qui a toujours été là
sans que je ne lui demande rien. Merci à mon rital préféré, Néri, toujours là prêt à sauter du Pont
Neuf avec moi quand la qPCR a foirée! Merci à Sélim, mon coach sportif et détente: entre la piscine
à l’aube les samedi mat’, les cours de salsa, les randos rollers et les après-midi bronzette, que de
bons souvenirs! Je sais que tu es entre de bonnes mains avec Anna et il me tarde d’assister à ta
soutenance de thèse !
Merci à ma nouvelle famille sur le campus de Paris-Diderot. Alors, à mes coacheuses shopping :
Sandra, Mélanie et Fabienne. Merci pour vos tips pour ne pas me perdre dans Manhattan et profiter
des bonnes affaires !! Après il y a mes fans, enfin, mon unique fan : merci Andrew de soutenir avec
autant d’enthousiasme ma carrière cinématographique. Tu peux prendre rendez-vous avec mon
attachée de presse A. Marchand pour une interview. Thank you Guillaume pour ton optimisme et tes
blagounettes ; si t’es sage, je te léguerai mon collier de Stone-Age. Ensuite, un petit mot gentil pour
Mika : n’oublie pas de m’inviter à ta crémaillère ! J’ai encore oublié de remercier Damien : merci de
me prévenir avant d’aller manger, c’est mieux qu’après ! Merci Florent pour la bonne ambiance et tes
communiqués de choc. Au fait, ya Heidi qui veut que je lui rende sa veste en poil de renard
synthétique, merci de m’avoir balancé ! Enfin, ma chère Ryma, je te remercie pour nos petites
discussions privées et aussi pour tes superbes compliments (je rigole encore pour le coup des
Oscars !). Et pour finir, je lance un énorme merci à tous ceux que je n’ai pas cités mais qui ont été là
à un moment ou à un autre et qui contribuent à la bonne ambiance de notre unité.
Je remercie aussi ceux qui n’ont rien à voir avec le lab, mais sans qui j’aurai pris le premier TGV
pour rentrer à la maison. Et bien ça y est, vous pouvez enfin me demander : alors cette thèse, tu la
finis quand ? Mais il te reste encore combien d’années ? C’est normal que ce soit si long ? Et bien,
« Guess what everybody ?! I did it!… and please, call me Doc’ ! »
Enfin, merci à « toi, toi, mon toi ». Merci pour cette patience dont je n’ai jamais entrevu les limites.
Tu as contribué à faire de cette année la meilleure des quatre… et de loin ! J’admire ton optimisme,
ton énergie, ta bonne humeur, tes beaux yeux bleus… et tout le reste!
iii
Liste des figures
Figure 1 : Les trois grandes étapes de la formation du muscle squelettique 3
Figure 2 : Structure du muscle strié (ou squelettique) 4
Figure 3 : Mise en place du muscle strié 5
Table 1 : Inactivations géniques chez la souris et phénotypes observés 6
Figure 4 : Boucles d’auto-amplification des MRFs et des protéines Mef2 8
Figure 5 : Domaines fonctionnels de MyoD 9
Figure 6 : La différenciation musculaire terminale se décompose en deux étapes discrètes 11
Figure 7 : Régulation de l’activité de Rb au cours du cycle cellulaire 13
Figure 8 : Modifications post-traductionnelles de MyoD 14
Figure 9 : Expression de MyoD au cours du cycle cellulaire 14
Figure 10 : MyoD participe au remodelage de la chromatine sur ses gènes cibles 15
Figure 11 : Dualité entre les régulateurs du cycle cellulaire et l’engagement dans la voie de
différenciation terminale 18
Figure 12 : MyoD participe au remodelage de la chromatine sur ses gènes cibles 21
Figure 13 : Réponse des cellules satellites suite à une lésion ou un traumatisme 25
Figure 14 : Organisation des différents lignages hématopoïétiques 32
Figure 15 : Organisation du gène RUNX1 humain 34
Figure 16 : Structure génomique et variants d’épissage de CBFβ 36
Figure 17 : Structure du complexe formé du domaine runt de Runx1, CBFβ et l’ADN 37
Figure 18 : Domaines fonctionnels de la protéine Runx1 38
Figure 19 : Interaction particulière entre Runx1 (humain) et Ets-1 sur le site composite PBS
(PEBP2 binding site) et les site EBS (Ets binding site) 39
Figure 20 : Changement de conformation de Runx1 après dimérisation avec CBFβ 40
Figure 21 : Runx1 associé à ses coactivateurs et ses corépresseurs 42
Figure 22 : Cascade de phosphorylation initiée par Runx1/p300 43
Figure 23 : Modélisation des résultats 83
Figure 24 : Représentation des rôles possibles pour MyoD, Runx1 et CBFβ dans le muscle
présentés dans la discussion 93
Figure 25 : Diagramme du projet de recherche proposé par le Dr Slimane AIT-SI-ALI 94
iv
Liste des abréviation
ACh : acétylcholine
Ala : alanine
ALP : phosphatase alcaline
AML : acute myeloid leukemia
ARNi : ARN interférence
APC : anaphase promoting complex
Asp : asparagine
bHLH : basic helix loop helix
Bgb : Big brother
BMP : bone morphogenetic protein
BSP : bone sialo protein
Bro : Brother
CamK : Ca2+/calmodulin-dependent protein
kinase
CARM1 : coactivator-associated arginine
methyltransferase 1
CBF : core binding factor
CBP : creb binding protein
Cdk : cycline dependent kinase
ChIP : chromatin immunoprecipitation
CKI : cyclin-dependent kinase inhibitor
CREB : cAMP-responsive element binding
protein
EC : mouse embryonal carcinoma cells
EGF : epithelium growth factor
ERK : extracellular signal-regulated kinases
FAB : French-American-British classification
FGF : fibroblast growth factor
GRIP1 : glucocorticoid receptor interacting
protein 1
HA : Hemaglutinine
HAT : histone acétyltransférase
HDAC : histone désacétylase
HGH : hepatocyte growth factor
HIPK : homeodomain-interacting protein
kinase
HLH : helix loop helix
HMT : histone méthyltransférase
HP1 : heterochromatin protein 1
IGF1 : insulin-like growth factor 1
IL-3 : interleukine-3
IRES : internal ribosomal entry site
Jak : kinase Janus
MAPK : mitogen-activated protein kinase
MCK : muscle creatine kinase
Mef2 : myogenic enhancer factor 2
MHC : myosin heavy chain
MPC : muscle precursor cells
MRF : myogenic regulatory factor
NAD : Aldehyde dehydrogenase
NCAM : Neural Cell Adhesion Molecule
N-CoR : nuclear receptor corepressor
NLS : nuclear localisation signal
NMTS : nuclear matrix targeting sequence
v
NRDBn/c : negative regulatory region for
DNA binding N/C-terminal to the runt
domain
NRHn/c : negative regulatory region for
heterodimerisation N/C-terminal to the runt
domain
OCN : ostéocalcine
ORN : olfactory receptor neurons
Osx : osterix
PCAF : p300/CBP associated factor
PE : Py enhancer
PEBP2 : Py Enhancer Binding Protein 2
PRMT : protein-arginine N-methyltransferase
Py : polyomavirus
RD : runt domain
SMMHC : smooth muscle myosin heavy chain
SMRT : silencing mediator of retinoic acid and
thyroid hormone receptor
SRA : steroid receptor RNA activator
STAT : signal transducer and activator of
transcription
SWI/SNF : switch/sucrose non fermentable
TAD : transactivation domain
TCR : T-cell receptor
TGFβ : tumor growth factor beta
TLE1 : transducin-like enhancer of split
Thr : thréonine
1
Avant-propos
Une cellule peut être dans divers états physiologiques comme la prolifération, la
différenciation, l’apoptose, la sénescence ou la quiescence. L’orientation d’une cellule vers
l’une ou l’autre de ces voies doit être minutieusement contrôlée. En particulier, l’équilibre
prolifération-différenciation de la cellule est fondamental pour maintenir l’intégrité des tissus.
Il existe d’ailleurs de nombreuses pathologies graves associées à une dérégulation de cet
équilibre. L’objectif principal de mon projet de thèse est de mieux comprendre comment
l’équilibre prolifération-différenciation est régulé dans la cellule et pour cela nous avons utilisé
comme modèle d’étude le muscle strié, où la différenciation terminale est bien caractérisée.
Dans le muscle strié, la prolifération et la différenciation sont mutuellement exclusives : l’arrêt
de la prolifération est requis pour permettre aux cellules de s’engager dans le processus de
différenciation terminale. Ainsi, les régulateurs positifs de la différenciation terminale sont
généralement des répresseurs de la prolifération.
Dans le premier chapitre de ce manuscrit, je présente les caractéristiques du muscle
squelettique. J’y décris sa structure, la manière dont il se met en place au cours du
développement embryonnaire, les facteurs de transcription majeurs impliqués, l’équilibre
prolifération-différenciation régulé par le facteur myogénique MyoD et, enfin, la régénération
du muscle adulte et sa régulation par innervation.
Dans un deuxième chapitre, je présente un facteur de transcription connu pour son rôle au
cours du développement : le facteur CBF (formé du dimère Runx1 et CBFβ). Comme il sera
décrit plus tard dans mes résultats, pour la première fois, je montre que ce facteur de
transcription, initialement non-apparenté au muscle strié, joue de fait un rôle clé dans la
régulation de l’équilibre prolifération-différenciation du muscle squelettique.
INTRODUCTION
2
Chapitre I
Le Muscle Squelettique
I. INTRODUCTION: PRESENTATION DU MODELE D’ETUDE, LE
MUSCLE STRIE
I.1 Les types cellulaires qui composent le muscle strié
Il existe trois types de cellules constituant le muscle strié (ou « muscle squelettique ») : les
cellules extra fusales, majoritaires et également appelées cellules musculaires striées, les cellules
satellites, et les cellules du fuseau neuromusculaire.
I.1.1 Les cellules extra fusales, ou cellules musculaires striées
Le muscle squelettique fait partie des muscles à contraction volontaire, contrairement aux
muscles lisse et cardiaque, et il ne se contracte normalement qu’en présence de stimulation
nerveuse. Il y a deux types de cellules musculaires striées en proportion variable chez
l’Homme : les muscles de type I qui sont les muscles à contraction lente mais durable et les
muscles de type II qui sont les muscles à contraction rapide mais courte. La différenciation
du muscle en type I ou II dépend du motoneurone qui les innerve. Dans les gros muscles des
membres, les petites unités lentes sont les premières recrutées dans la plupart des
mouvements ; elles résistent bien à la fatigue et sont les plus fréquemment utilisées. Les
unités rapides se fatiguent plus vite et sont généralement sollicitées pour les mouvements plus
rigoureux.
Les myotubes qui constituent les cellules musculaires fonctionnelles, dérivent des cellules
progénitrices du muscle, également appelées MPCs (Muscle Progenitor Cells). Pour donner
naissance aux myotubes, ces MPCs subissent d’abord une étape de détermination qui les
convertit en myoblastes (figure 1). Contrairement aux myotubes, les myoblastes ont encore la
Figure 1. Les trois grandes étapes de la formation du muscle squelettique.
Après l’induction de MyoD et/ou Myf5, les cellules progénitrices du muscle (MPCs) sont
engagées dans le lignage musculaire (myoblastes). Plus tard, l'activation des MRFs secondaires
(myogénine et MRF4) induit la différenciation musculaire terminale des myoblastes, qui
expriment alors les protéines spécifiques du muscle et fusionnent en myotubes multinucléés.
Les myotubes subissent finalement une dernière étape de maturation, avec notamment leur
innervation par les motoneurones, pour donner les myofibres striées.
Figure adaptée de Chargé et Rundnicki, 2004.
Progéniteur
musculaire
(MPC)
Myofibre
mature
Myotube
précoce
Myoblaste
Détermination MaturationDifférenciation
3
possibilité de se diviser, en revanche, ils ne sont plus multipotents, c’est-à-dire qu’ils sont
déterminés à se différencier en muscle. Sous l’influence de signaux extérieurs, les myoblastes
se différencient, c’est-à-dire qu’ils sortent du cycle prolifératif, expriment des protéines
spécifiques du muscle comme la créatine kinase musculaire (MCK) ou la chaîne lourde de la
myosine (MHC), et fusionnent entre eux, donnant ainsi naissance aux myotubes (figure 1).
Les myotubes subissent finalement une étape de maturation pour donner les fibres
musculaires striées.
Chaque fibre musculaire striée résulte donc de la fusion de plusieurs dizaines de cellules
musculaires appelées myoblastes. La cellule musculaire striée est une cellule très spécialisée,
très allongée (jusqu’à 50 cm de longueur) et de forme cyclindrique (10 à 50 µm de diamètre) :
c’est pourquoi on parle également de fibre musculaire. Chaque fibre individuelle qui forme le
muscle squelettique représente une unité de base du système musculaire. Elle possède une
centaine de noyaux situés en périphérie. La plus grande partie du cytoplasme de ces cellules
(appelé également sarcoplasme ou myoplasme) est constituée de milliers de myofibrilles
organisées en faisceaux. Une myofibrille est constituée de petits cylindres allongés dans le
sens de la cellule et qui donne son aspect strié à la cellule musculaire squelettique : ce sont les
sarcomères, véritables unités contractiles de la cellule musculaire striée (figure 2). Le
sarcomère est constitué de myofilaments fins d’actine et de myofilaments épais de myosine
orientés selon le grand axe de la myofibrille. Dans le cytoplasme restant, se trouvent
notamment du glycogène, des mitochondries, le réticulum endoplasmique lisse et l’appareil de
Golgi. La fibre musculaire est limitée par une membrane plasmique, appelée sarcolemme,
entourée par une membrane basale.
Afin d’étudier les mécanismes impliqués dans la différenciation musculaire terminale sans être
gêné par des cellules non-musculaires dans l’interprétation des résultats, la lignée de
myoblastes murins C2C12 a été isolée et caractérisée (Blau et al, 1985; Yaffe & Saxel, 1977).
Les myoblastes C2C12 sont devenus un outil de prédilection pour l’étude de la différenciation
musculaire ex vivo et ont permis de mieux caractériser la différenciation musculaire et
d’étudier notamment l’équilibre prolifération-différenciation du muscle squelettique. Cette
lignée a la capacité à se différencier rapidement et à produire des myotubes contractiles
exprimant des protéines caractéristiques du muscle.
I.1.2 Les cellules satellites
Les cellules satellites sont une population de cellules mononucléées et indifférenciées. Elles
s’attachent à la surface de chaque fibre musculaire au niveau du sarcolemme, avant que la
Figure 2. Structure du muscle strié (ou squelettique).
Le muscle squelettique est formé de plusieurs faisceaux de fibres musculaires. Chaque faisceau
comprend plusieurs milliers de fibres musculaires. Une fibre musculaire résulte de la fusion de
plusieurs centaines de cellules musculaires appelées myoblastes. En fusion, les myoblastes
forment d’abord des myotubes qui sont des cellules multinucléées. Après une étape de
maturation, les myotubes deviennent des myofibres. Les myofibres (ou fibres musculaires) sont
caractérisées par leur aspect strié. La striation est due à l’alternance des myofilaments d’actine et
de myosine à l'intérieur de la fibre. La zone où les myofilaments fins d’actine d’un sarcomère se
chevauchent avec les filaments d’actine du sarcomère suivant se trouvent les stries Z. Le
sarcomère, véritable unité contractile de la fibre musculaire, est délimité par deux stries Z.
Image adaptée de http://t.verson.free.fr/PHYSIOLOGIE/PHYSIOLOGIE_EXERCICE
Faisceaux de fibres
musculaires
Fibre musculaire
(cellule
musculaire)
composée de
myofibrilles
Vaisseaux
sanguins
Noyau de
la cellule
musculaire
Myofibrille
composée de
filaments d’actine et
de myosine
Filament d’actine
Filament de myosine
Stries Z
Stries Z
Sarcomère
4
lame basale n’entoure à la fois la cellule satellite et la fibre musculaire. Il y a environ une à
cinq cellules satellites pour cent noyaux d’une fibre musculaire. Dans le muscle adulte, les
cellules satellites interviennent durant l’hypertrophie musculaire liée à l’exercice et au cours de
la régénération suite à une blessure, une dénervation ou l’absence de fonctionnement. En
effet, bien que les cellules satellites soient mitotiquement quiescentes chez l’adulte, elles
peuvent retrouver leur capacité à proliférer lors d’un stress ou d’un traumatisme, permettant
la croissance et la régénération du muscle. L’équilibre entre la quiescence, l’activation des
cellules satellites et l’induction de leur différenciation pour former de novo une fibre musculaire
sera développé dans la dernière section de ce chapitre.
I.1.3 Les cellules du fuseau neuromusculaire
L’innervation du muscle est importante pour sa mise en place et son maintien dans le muscle
adulte. L’absence d’innervation du muscle conduit d’ailleurs à la destruction progressive de la
fibre musculaire. L’importance de l’innervation du muscle pour le maintien de son intégrité
sera présentée dans la dernière section de ce chapitre.
Les fuseaux neuromusculaires comportent des cellules intra fusales (cellules striées modifiées,
spécialisées), des fibres nerveuses et des vaisseaux sanguins. Ce sont des formations allongées
dans le même sens que les cellules musculaires striées et sont répartis à l’intérieur de la partie
charnue du muscle. Chacun est délimité par une capsule conjonctive. Les cellules musculaires
intra-fusales constituent des mécanorécepteurs qui renseignent sur le degré d’étirement ou de
contraction du muscle. Elles sont de deux types : cellules musculaires à sac (qui renseignent
sur la vitesse de variation de la longueur du muscle) et cellules musculaires à chaîne (qui
codent en plus pour la longueur instantanée du muscle). Dans les deux cas, la partie
contractile de ces fibres se situe à leurs deux extrémités et la partie centrale reçoit
l’innervation afférente. L’allongement de la partie centrale des fibres est à l’origine d’une
déformation mécanique des terminaisons sensorielles qui s’enroulent dans cette région. Cela
entraîne un potentiel de récepteur qui remonte vers la moelle épinière et le cortex pariétal.
II. MISE EN PLACE DES FIBRES MUSCULAIRES STRIEES
II.1 Mise en évidence des MRFs
Les “Myogenic Regulatory Factors”, ou MRFs, ont été mis en évidence pour la première fois
grâce à des expériences de traitement des fibroblastes par un agent déméthylant de l’ADN, la
5-azacytidine. En effet, le traitement à la 5-azacytidine des fibroblastes induisait
Figure 3. Mise en place du muscle strié.
Pendant le développement, les cellules souches mésodermiques s’engagent dans un des
multiples lignages cellulaires possibles, notamment dans le lignage musculaire. L’expression de
Pax3 dans les cellules progénitrices contribue à l’expansion myogénique. Après l’induction de
MyoD et/ou Myf5, les cellules progénitrices mésodermiques sont engagées dans le lignage
musculaire (myoblastes). Plus tard, l'activation des MRFs secondaires (myogénine et MRF4)
induit la différenciation musculaire terminale des myoblastes en myocytes. Finalement, la
fusion des myocytes donne naissance aux myotubes multinucléés qui subiront une dernière
étape de maturation avec notamment leur innervation par les motoneurone, pour donner les
myofibres striées. Pendant la phase plus tardive de de la myogenèse embryonnaire, une
population cellulaire distincte des myoblastes et dérivée des cellules satellites du muscle,
fusionne avec la fibre musculaire existante permettant ainsi à la fibre musculaire de s'accroitre.
Certaiens cellules satellites restent associées aux myofibres, sous une forme quiescentes et dans
un état indifférencié. L’origine embryonnaire des cellules satellites n’est pas bien connue à ce
jour. Cependant, l’expression de Pax7 est nécessaire pour la spécification et l’expansion de la
population de cellules satellites. FC : facteurs de croissance.
Figure adaptée de Chargé et Rundnicki, 2004.
Progéniteur
mésodermique
Myogénine,
p21, Rb, Mef2
Cyline D1
Rb-P
Myofibre
mature
Myotube
précoce
Myoblaste
Détermination
myogénique
Evénements plus
tardifs de la
différenciation
(« innervation »)
Myogénine,
MRF4
FC
Id, Pax3
MyoD
Myf5
MyocytesCellule
somitique
mésoder-
mique
Sortie du cycle
prolifératif
Expression des
gènes spécifiques
du muscle
BMP4
Wnts
Shh
Noggin
5
spontanément leur conversion en myoblastes, qui pouvaient alors entrer en pseudo-
différenciation musculaire terminale en absence de signaux mitogènes. Un criblage
différentiel entre les fibroblastes traités ou non-traités à la 5-azacytidine a permis d’isoler le
gène MyoD (Davis et al, 1987). MyoD est un facteur de transcription myogénique puissant
qui, lorsqu’il est exprimé ectopiquement dans des cellules non-musculaires (neurones,
adipocytes, mélanocytes, chondrocytes), est capable de les convertir en myotubes (Choi et al,
1990; Weintraub et al, 1989) ; Davis et al, 1987). Sur la base de ces résultats, le gène MyoD a
été proposé comme un des acteurs principaux dans le développement musculaire. Cette
démarche a permis l’identification de trois autres gènes, myogénine (Edmondson & Olson,
1989; Wright et al, 1989), Myf5 (Braun et al, 1989) et MRF4 (Rhodes & Konieczny, 1989), qui
interviennent aussi dans le développement musculaire. La famille des MRFs est ainsi
composée de quatre membres : MyoD, Myf5, MRF4 et myogénine. Cette famille de facteurs de
transcription est exclusivement exprimée dans la lignée myogénique.
II.2 Détermination et différenciation des cellules musculaires au
cours de la myogenèse embryonnaire
Pendant le développement de l’embryon de souris, l’expression de Myf5 est induite dans les
somites dorsaux-médiants (qui donnent plus tard les muscles du tronc et intercostaux), elle
est suivie par l’expression de MyoD dans les somites dorso-latéraux (qui donnent naissance
par la suite aux muscles des membres et de l’enveloppe corporelle). Les voies Wnts, Sonic
hedgehog (Shh) et d’autres voies de signalisation contribuent à la détermination du muscle, en
induisant les expressions de Myf5 et MyoD (pour revue voir (Buckingham, 2001)) (figure 3).
L’expression de MyoD et Myf5 est une étape clé qui marque l’engagement des cellules
somitiques multipotentes dans le lignage myogénique. L’activation de MyoD est retardée dans
les embryons où le gène Myf5 est inactivé, montrant que l’expression de MyoD est initialement
sous le contrôle de Myf5 (Tajbakhsh et al, 1997). Cependant, par la suite MyoD est activé
indépendamment et la myogenèse se déroule normalement avec une localisation correcte des
cellules (Kassar-Duchossoy et al, 2004) (table 1). De même, en absence de MyoD, la
myogenèse se déroule apparemment normalement aussi, bien que les muscles des membres
se forment plus tardivement, certainement en raison du niveau initial insuffisant de Myf5
pour déclencher la différenciation (Rudnicki et al, 1992). Après induction de MyoD,
normalement le niveau de Myf5 diminue. Ainsi, chez les souris dont le gène MyoD est
inactivé, le niveau de Myf5 reste relativement élevé probablement pour pallier l’absence de
MyoD. Dans les doubles mutants Myf5:MyoD (Rudnicki et al, 1993), la myogenèse n’a pas lieu
Pas de
différenciation
terminale.
Létalité.
Myogénine
Musculature
normale
MRF4
Pas de muscle
squelettique
MyoD:Myf5
Musculature
normale
MyoD
Musculature
normale
Myf5
Phénotype
observé
Inactivation
génique
Table 1. Inactivations géniques chez la souris et phénotypes observés.
6
et les cellules myogéniques sont absentes (Braun & Arnold, 1996); Petrovick et al, 1998). Ces
expériences mettent en avant le rôle important de MyoD et Myf5 dans la myogenèse.
Le rôle joué par MRF4 pendant la myogenèse est plus compliqué. En effet, MRF4 est
exprimé de manière transitoire dans le myotome de souris au jour E9, en suivant de près
l’expression de Myf5. Son expression disparaît au jour E11,5 et est réinitiée au jour E16 dans
les fibres musculaires en différenciation. MRF4 a donc un rôle à la fois dans la spécification
des somites en progéniteurs myogéniques, mais également au cours de la différenciation
terminale (table 1).
Enfin, la myogénine joue un rôle critique au cours de la différenciation musculaire terminale.
En effet, chez les souris dont le gène myogénine a été inactivé, la deuxième phase d’expression
de MRF4 et la formation des fibres secondaires (Ontell & Kozeka, 1984a; Ontell & Kozeka,
1984b) sont sévèrement compromis (table 1). Chez ces souris, les myoblastes sont présents,
montrant que la myogénine n’est pas requise pour acquisition de l’identité de myoblastes,
cependant la différenciation terminale est fortement compromise (Venuti et al, 1995).
En résumé, ces études d’inactivation montrent que Myf5 et MyoD sont requis pour
l’engagement dans le lignage myogénique, alors que la myogénine joue un rôle critique dans
l’expression du phénotype musculaire final. Enfin, MRF4 participe à ces deux fonctions.
Ainsi, MyoD, Myf5, et dans une certaine mesure MRF4, sont considérés comme des facteurs
d’engagement ou de « détermination», alors que la myogénine est perçue comme un facteur
de « différenciation » uniquement (figure 3).
II.3 Les protéines Mef2, co-facteurs des MRFs
Parallèlement aux MRFs, une autre famille de facteurs de transcription joue un rôle clé dans
la différenciation musculaire : les protéines de la famille des Myocyte Enhancer Factor 2 (Mef2).
Les protéines Mef2 appartiennent à la famille de facteurs de transcription à domaine MADS
(MCM1, agamous, deficiens, serum response factor) (Yu et al, 1992) et sont induites quand les
myoblastes entrent dans le programme de différenciation terminale (Gossett et al, 1989).
L’inactivation de l’unique gène Mef2 chez la drosophile entraîne une létalité embryonnaire,
ainsi qu’une perte complète de différenciation musculaire dans les trois lignages musculaires
(squelettique, lisse et cardiaque). Cependant, dans ce cas, les myoblastes sont présents et
correctement localisés, ce qui indique que c’est le processus de différenciation terminale et
non de détermination qui est affecté (Bour et al, 1995; Lilly et al, 1995).
7
Chez les mammifères, la famille Mef2 comprend quatre membres, Mef2 A à D, chacun codé
par un gène séparé. Alors que l’expression des MRFs est strictement cantonnée au muscle, les
gènes Mef2 sont exprimés dans une grande variété de tissus et de lignées cellulaires et sous la
forme de nombreux transcrits différents, en raison de leur épissage alternatif. Cependant, les
protéines elles-mêmes et leur activité de liaison à l’ADN semblent limitées aux cellules
musculaires différenciées et aux neurones. Les protéines Mef2 se fixent ainsi sur un site riche
en A/T retrouvé dans les promoteurs et les enhancers de nombreux gènes spécifiques du
muscle : CTA(A/T)4TAG (Gossett et al, 1989).
L’expression ectopique de Mef2 ne permet pas d’induire le programme de différenciation
myogénique in vitro. En revanche, plusieurs éléments permettent de dire que les protéines
Mef2 assistent les MRFs. Ainsi, MyoD et Mef2 interagissent directement in vitro et activent de
manière synergique des gènes rapporteurs contenant des boîtes E et des sites de liaison Mef2
(Molkentin et al, 1995). Les boîtes E sont situées dans la région régulatrice des gènes
spécifiques du muscle, tels que MCK (créatine kinase musculaire), Desmine, Troponine I, et sont
des sites de fixation reconnus par les MRFs. Dans les promoteurs et enhancers des gènes
spécifiques du muscle, les boîtes E sont souvent situées à proximité des sites Mef2, appuyant
encore une fois le rôle coopératif de Mef2 et MyoD pour activer la transcription (Wasserman
& Fickett, 1998). Par exemple, les protéines Mef2 se fixent sur l’enhancer du gène codant pour
MCK et leur présence est nécessaire pour l’activité maximale de cet enhancer (Gossett et al,
1989). Des sites de fixation fonctionnels pour les protéines Mef2 ont également été identifiés
dans les promoteurs de nombreux gènes structuraux des muscles cardiaques et squelettiques.
Certaines études in vitro ont montré que l’activation de certains promoteurs par MyoD
nécessite la présence de deux boîtes E sur lesquelles MyoD se fixe de manière coopérative
(Thomson et al, 1999). Sur les promoteurs cibles de MyoD ne possédant qu’une seule boîte
E, il est possible que la présence d’une boîte Mef2 compense fonctionnellement l’absence
d’une seconde boîte E, facilitant ainsi la fixation de MyoD.
De manière intéressante, Mef2 peut se fixer sur le promoteur de la myogénine et son site de
fixation est nécessaire pour l’activité complète du promoteur (Edmondson et al, 1992). La
capacité de la myogénine à induire l’expression de Mef2, qui en retour régule l’expression de la
myogénine, fournit un mécanisme par lequel ces facteurs s’amplifient et se maintiennent
mutuellement quand les myoblastes entrent en différenciation. Finalement, les protéines Mef2
sont capables de transactiver les gènes MyoD (Leibham et al, 1994; Wong et al, 1994),
myogénine (Cheng et al, 1993; Edmondson et al, 1992) et MRF4 (Black et al, 1995; Naidu et al,
1995). La surexpression de Mef2A peut en effet activer l’expression de MyoD et de la
Figure 4. Boucles d’auto-amplification des MRFs et des protéines Mef2.
Au cours de la différenciation musculaire, MyoD déjà exprimé dans les myoblastes active
l’expression de la myogénine, MRF4 et Mef2. En retour, la myogénine et Mef2 stimulent
l’expression de MyoD. MRF4 stimule également l’expression de la myogénine et Mef2.
Ensemble, ces boucles d’activation permettent l'amplification efficace des MRFs et des facteurs
Mef2 au cours de la différenciation terminale.
Signaux
Externes
Facteurs de
croissance
MyoD
Myf5
Détermination Différenciation
Myog
Activation
Inhibition
Myf5
MRF4
Mef2
Myog MRF4
8
myogénine, et réciproquement l’expression des MRFs dans des cellules non-musculaires induit
l’activité des protéines Mef2 (Cserjesi & Olson, 1991). Ceci tend à montrer que les membres
de la famille Mef2 interviennent dans le maintien et l’amplification de l’expression des MRFs
(figure 4). Il a été précédemment montré qu’une boucle d’autorégulation des MRFs existe et
qu’elle repose en partie sur les MRFs eux-mêmes. Notamment, l’expression ectopique de
MyoD active l’expression de la myogénine de manière directe (Hollenberg et al, 1993; Thayer et
al, 1989). MyoD est également capable de se fixer sur des séquences en 5’ de son propre gène
et de s’autoactiver (Hollenberg et al, 1993). Réciproquement, la myogénine est capable
d’activer MyoD, notamment lorsque les cellules entrent en différenciation. Mais il existe un
rétrocontrôle positif de MyoD indépendamment de la myogénine, ce qui suggère fortement
l’intervention d’autres facteurs tels que les facteurs Mef2 (Hollenberg et al, 1993; Thayer et al,
1989).
II.4 Relation structure/ fonction des MRFs
Les quatre protéines MyoD, Myf5, myogénine, et MRF4 appartiennent à la famille des
facteurs de transcription de type bHLH (basic helix loop helix). Les MRFs présentent une
homologie de séquence à 80% sur un fragment de 70 acides aminés qui regroupe une région
basique et un domaine hydrophobe hélice-boucle-hélice (HLH). Ils contiennent également
des domaines de transactivation dans leur parties amino- et carboxy- terminales, qui sont
importants pour l’activation efficace de la transcription des gènes spécifiques du muscle
(figure 5) (Edmondson & Olson, 1993).
II.4.1 Le domaine bHLH est impliqué dans la fixation sur l’ADN et dans la dimérisation
avec les protéines E
Le motif bHLH définit une superfamille de protéines, dont font partie les bHLH
myogéniques : MyoD, Myf5, MRF4 et myogénine. Près du centre de ces protéines se trouve
une région basique (b), voisine du domaine hydrophobe hélice-boucle-hélice (HLH). La
région basique des bHLH myogéniques joue un double rôle dans le contrôle de la
transcription des gènes spécifiques du muscle en permettant la liaison à l’ADN des MRFs et
en conférant une spécificité de transcription. Les bHLH myogéniques diffèrent des autres
bHLH du fait qu’ils contiennent un motif de reconnaissance conservé au sein du domaine
basique. Ce « code myogénique » comprend les résidus conservés « Ala86, Thr87, Asp109,
Ala114 et Thr115 » et leur confère la capacité à activer les gènes spécifiques du muscle
(Brennan et al, 1991; Davis et al, 1990; Huang et al, 1998a). La mutation de la région basique
empêche la liaison à l’ADN mais pas la dimérisation (Brennan et al, 1991; Davis et al, 1990).
Figure 5. Domaines fonctionnels de MyoD.
Les différentes régions fonctionnelles de MyoD sont représentées par des rectangles : en bleu
pour le domaine d’activation, en gris clair pour le domaine C/H, en orange pour le domaine
basique, en jaune pour le domaine HLH et en gris foncé pour le domaine C-terminal. Les chiffres
indiquent la position des acides aminés aux bornes de chaque domaine.
Figure adaptée d’après « Puri and Sartorelli, Journal of cellular physiology, 2000 ».
1 53 108 125 137 146 166 319
Activité de
remodelage de
la chromatine
Activité de
remodelage de
la chromatine
DimérisationFixation sur
l’ADN
9
Des expériences de mutagenèse montrent que ce motif HLH sert d’interface à la
dimérisation, ce qui permet de former un domaine composite de liaison à l’ADN après
dimérisation de deux protéines bHLH (Davis et al, 1990; Voronova & Baltimore, 1990).
Le motif bHLH est également trouvé dans une classe de protéines ubiquitaires connues sous
le nom de protéines E, qui inclut HEB/HTF4, E2-2/ITF-2 et l’epissage alternatif du produit
du gène E2A : E12/E47. Ainsi, les bHLH myogéniques peuvent soit s’homodimériser, soit
s’hétérodimériser avec les facteurs de transcription bHLH de classe I, que sont les protéines
E.
Les dimères formés par dimérisation de protéines bHLH diffèrent par leur affinité de liaison
pour l’ADN. Par exemple, le dimère MyoD-E47 se forme efficacement et se fixe fortement
sur l’ADN, alors que l’homodimère MyoD se fixe à l’ADN faiblement (Murre et al, 1989).
Les hétérodimères MRF-protéine E se fixent sur la séquence consensus “CANNTG”,
appelée boîte E. Des préférences de liaison à l’ADN dépendantes des séquences adjacentes et
des séquences internes à la boîte E ont été identifiées pour les homodimères et les
hétérodimères MRF-protéine E in vitro (Blackwell & Weintraub, 1990). Les boîtes E sont
fréquemment représentées dans le génome et pas seulement dans les régions régulatrices des
gènes du muscle. Ainsi, des interactions intramoléculaires sont indispensables pour que
MyoD puisse activer spécifiquement la transcription des gènes du muscle. Par exemple, la
présence d’un site de liaison pour le facteur Mef2, augmente de manière coopérative la
transcription. Par ailleurs, Mef2C interagit directement avec le dimère MyoD-E12, mais pas
avec ces protéines individuellement (Molkentin et al, 1995; Molkentin & Olson, 1996; Olson
et al, 1995).
II.4.2 Les domaines de transactivation (TAD) N-terminal et C-terminal régulent l’activité
des MRFs
En plus du domaine bHLH, des analyses de mutation et de délétion ont identifié trois
domaines de MyoD ayant des fonctions importantes dans la régulation des gènes spécifiques
du muscle : le domaine acide N-terminal, le domaine riche en histidine et cystéine (H/C) et
l’hélice III.
Le domaine N-terminal, qui comprend les résidus 1 à 53, est très acide et permet l’activation
d’un promoteur hétérologue (Weintraub et al, 1991). Le domaine acide N-terminal de MyoD
est requis pour l’activation d’un plasmide rapporteur dirigé par plusieurs boîtes E, suggérant
qu’il fonctionne comme un domaine de transactivation (TAD) et qu’il est nécessaire pour la
fixation de MyoD sur les boîtes E (Weintraub et al, 1990).
10
En plus du domaine de transactivation N-terminal, deux autres motifs conservés ont été
identifiés : du côté N-terminal du domaine bHLH, il y a le domaine riche en H/C et du côté
C-terminal, il y a une structure en hélice α, également appelée hélice III. Ces deux domaines
de MyoD sont nécessaires pour le remodelage de la chromatine, au niveau du promoteur de
la myogénine (Gerber et al, 1997), en coopérant avec Pbx et Meis. Les facteurs Pbx et Meis font
partie de la famille de facteurs de transcription à homéodomaine, initialement identifiés pour
leur rôle au cours de l’embryogenèse (Berkes et al, 2004). Les complexes Pbx-Meis
interagissent de manière coopérative avec les bHLH myogéniques in vitro sur un ADN
synthétique contenant les sites consensus de fixation de Pbx et Meis et une boîte E. Cette
liaison coopérative requiert la présence d’un résidu tryptophane conservé au sein du domaine
riche en H/C des bHLH (Knoepfler et al, 1999). Les mutants de MyoD pour la région riche
en H/C sont incapables d’initier le remodelage de la chromatine sur le locus de la myogénine
(Gerber et al, 1997), probablement car le mutant ne peut plus interagir avec le complexe
Pbx/Meis. L’hélice III a été montrée comme nécessaire pour initier l’activation de la
myogénine au niveau endogène (Bergstrom & Tapscott, 2001). Par ailleurs, un exemple qui
montre que chaque MRF a sa propre spécificité est le fait que MyoD et la myogénine
possèdent leur propre hélice III. Cette hélice permettrait à MyoD d’activer certains gènes
cibles spécifiquement, car si on remplace l’hélice III de la myogénine par celle de MyoD, la
protéine chimère devient à son tour capable d’activer certains gènes cibles de MyoD
(Bergstrom & Tapscott, 2001).
II.5 La différenciation terminale se décompose en deux étapes
discrètes
La différenciation des myoblastes en myotubes implique une cascade d’événements modifiant
profondément la cellule à la fois au niveau morphologique et moléculaire. Ceci implique une
reprogrammation importante du profil d’expression des gènes des cellules en question,
aboutissant à l’inhibition de certains gènes et à l’activation d’autres gènes. Lorsqu’il est
exprimé de manière ectopique dans certains types cellulaires, MyoD est capable d’induire la
conversion de ces cellules en cellules myoblastiques, ce qui montre que MyoD est capable
d’induire cette reprogrammation génique. De fait, l’ensemble des études effectuées à ce jour
sur MyoD montre que c’est un facteur de transcription capable de transactiver un nombre
important de gènes qui interviennent à toutes les étapes du processus de différenciation
musculaire. Notamment, MyoD est capable d’orchestrer les deux étapes discrètes de la
différenciation terminale : la sortie du cycle prolifératif et l’expression des gènes spécifiques
Myotube
précoce
Myoblaste
Myocytes
alignés
Sortie du cycle
prolifératif
Expression des
gènes spécifiques
du muscle & fusion
Figure 6. La différenciation musculaire terminale se décompose en deux étapes discrètes.
Les myoblastes exprimant MyoD prolifèrent sous l’influence des facteurs de croissance. Sous
l’influence de stimuli extérieurs (ex vivo, les signaux mitogènes sont diminués artificiellement),
les myoblastes vont sortir définitivement du cycle cellulaire grâce à l’action concertée de MyoD,
Rb hypophosphorylé, et p21. L’action de Mef2 entretient les boucles d’amplification des MRFs et
va induire l’expression de myogénine de concert avec MyoD et MRF4. Les myocytes fusionnent
enfin pour former les myotubes multinucléés et expriment les gènes spécifiques du muscle.
MyoD, Rb, p21 Myogénine, MyoD,
Mef2, MRF4
11
de la différenciation musculaire. MyoD fonctionne ainsi comme un interrupteur moléculaire,
en « éteignant » la prolifération et en « allumant » la différenciation terminale, et permet ainsi
la séparation de ces deux processus (figure 6).
II.5.1 La sortie du cycle prolifératif
Pendant le processus de différenciation musculaire, les facteurs myogéniques ne sont pas
seulement impliqués dans l’induction des gènes spécifiques du muscle, mais également dans la
régulation de la transition entre l’état prolifératif (quand MyoD et Myf5 sont déjà exprimés) et
la sortie ordonnée du cycle de division cellulaire. L’arrêt du cycle prolifératif est un pré-requis
pour que la différenciation musculaire terminale puisse avoir lieu. Cette étape clé de la
différenciation musculaire squelettique implique la diminution des activateurs du cycle
cellulaire, tels que les cyclines et les kinases dépendantes des cyclines (Cdks), et
l’augmentation des inhibiteurs du cycle cellulaire, tels que Rb, p21, p27 et p57. Ainsi, MyoD
intervient tout d’abord au niveau de la sortie du cycle cellulaire en activant notamment les
gènes p21 (Halevy et al, 1995), la cycline D3 (Cenciarelli et al, 1999) , et Rb (Bergstrom et al,
2002). En particulier, Rb et p21 jouent un rôle très important dans l’arrêt de la croissance des
myoblastes. Leur niveau d’expression et leur activité, bien que régulés négativement par les
facteurs de croissance, sont régulés positivement par MyoD, qui joue un rôle coopératif dans
l’induction de l’arrêt du cycle cellulaire. D’ailleurs, MyoD peut bloquer la prolifération
indépendamment de son activité transcriptionnelle. En effet, exprimé ectopiquement dans
des cellules non musculaires, MyoD inhibe le cycle cellulaire avant la phase S,
indépendamment de son activité de liaison à l’ADN et de l’induction de la différenciation
myogénique (Crescenzi et al, 1990; Sorrentino et al, 1990).
II.5.2 L’activation des gènes spécifiques du muscle
Pour induire la différenciation terminale ex vivo, les signaux mitogènes sont diminués
artificiellement en cultivant les cellules dans un milieu à faible teneur en sérum et en laissant
les cellules à confluence. Ce n’est qu’après l’arrêt permanent de la prolifération que les
myoblastes vont exprimer les protéines spécifiques du muscle et fusionner entre eux pour
former des cellules multinucléées appelées myotubes. Plusieurs études indépendantes ont
permis d’identifier certains gènes cibles de MyoD. En particulier, une étude utilisant comme
modèle la conversion myogénique de fibroblastes, a permis d’étudier le transcriptome de ces
cellules lorsque la différenciation musculaire est induite par MyoD (Bergstrom et al, 2002).
Simultanément à l’arrêt du cycle, MyoD active l’expression d’autres acteurs importants de la
différenciation comme la myogénine et Mef2 (Black & Olson, 1998; Cheng et al, 1993;
Edmondson et al, 1992). Comme il a été mentionné précédemment, la myogénine intervient
12
en aval de MyoD dans le processus de différenciation. Elle peut elle aussi assurer l’activation
des gènes de la famille Mef2 (Cserjesi & Olson, 1991). L’activation de la famille Mef2 et de la
myogénine permettrait de prendre le relais de MyoD et/ou de contribuer à la reprogrammation
transcriptionnelle des noyaux des myoblastes en cours de différenciation. Plus tard au cours
de la différenciation, MyoD participe à l’activation de gènes codant des protéines
fonctionnelles du muscle, comme la créatine kinase musculaire (MCK), la troponine I et la
chaîne lourde de la myosine (MHC), qui sont indispensables à la fois à la structure et au
fonctionnement des myotubes (Bergstrom et al, 2002; Lassar et al, 1989). MyoD semble
également intervenir dans l’expression de gènes codant des protéines d’adhérence, et de
certains intermédiaires des voies de transduction des signaux comme le gène codant le
récepteur à l’acétylcholine (Bergstrom et al, 2002; Gilmour et al, 1991).
III. L’EQUILIBRE PROLIFERATION-DIFFERENCIATION DANS LE
MUSCLE
III.1 Régulation négative de l’activité de MyoD dans les
myoblastes proliférants
MyoD est exprimé dans les myoblastes en prolifération, alors que les gènes cibles principaux
de MyoD ne sont pas activés. Cela implique une inhibition active de l’activité de MyoD. On
comprend donc aisément que les cellules assurent une régulation de l’activité de MyoD à
plusieurs niveaux. Comme cela va maintenant être décrit, l’activité de MyoD dépend
beaucoup des partenaires protéiques avec lesquels il interagit. Ainsi, ses partenaires influent
sur la fixation de MyoD à l’ADN, son intensité de transactivation, sa stabilité protéique, sa
spécificité sur ses promoteurs cibles, ainsi que le contexte chromatinien qui rend possible ou
non la transcription.
III.1.1 MyoD et ses cofacteurs sont régulés négativement au cours du cycle cellulaire
La décision cellulaire de progresser vers un nouveau cycle de division cellulaire a lieu à la
transition G1/S. Au niveau moléculaire, plusieurs régulateurs positifs et négatifs du cycle
cellulaire ont été identifiés. Parmi les régulateurs positifs du cycle se trouvent les complexes
cycline/Cdks (Nurse, 1994; Sherr, 1994). Les régulateurs négatifs du cycle, qui sont aussi des
coactivateurs de la différenciation musculaire, comprennent entre autres les inhibiteurs de
Cdks (CKIs) (Sherr & Roberts, 1995; Sherr & Roberts, 1999) et la famille des protéines à
Figure 7. Régulation de l’activité de Rb au cours du cycle cellulaire.
Durant le début la phase G1, la transcription des gènes de la phase S dépendante de E2F, est
réprimée par la fixation de Rb à E2F. Au point de restriction R, des complexes cyclines/CDKs
phosphorylent Rb, qui se décroche alors de E2F, permettant à celui-ci d’activer la
transcription de ces gènes cible et le passage en S. La sortie du cycle précédant la
différenciation cellulaire se fait au cours de la phase G1 lorsque l’inhibition de E2F par Rb est
toujours active.
Figure extraite de Giacinti and Giordano, Oncogene 2006.
R
13
poche : la protéine Rb, le produit du gène de susceptibilité au rétinoblastome, et deux
protéines apparentées à Rb : p107 et p130 (Mulligan & Jacks, 1998).
III.1.1.1 Phosphorylation de Rb par les complexes cycline/cdk
Le passage de la phase G1 vers la phase S est contrôlé par les cyclines D (associées aux Cdk4
et Cdk6), la cycline E et la cycline A (associées à Cdk2). Une des cibles les plus étudiées pour
les cyclines A ou E/Cdk2 pendant la transition G1/S est la protéine Rb. Dans sa forme
hypophosphorylée, Rb régule négativement la progression du cycle cellulaire au niveau de la
progression de la phase G1 vers la phase S. Rb hypophosphorylé agit au niveau
transcriptionnel en interagissant et en modulant l’activité de nombreux facteurs de
transcription (Kouzarides, 1995; Taya, 1997), réprimant ainsi l’expression des gènes requis
pour l’entrée en phase S. Trois facteurs de transcription de la famille E2F (E2F1, E2F2 et
E2F3) régulent notamment les gènes associés à la prolifération. Les facteurs E2F sont les
cibles de Rb les plus étudiées pendant la phase G1 (Chellappan et al, 1991; Helin, 1998).
Dans sa forme active (hypophosphorylée), Rb interagit avec E2F et réprime ainsi son activité.
Au cours de la phase G1, la phosphorylation progressive et massive de Rb par les complexes
cycline/Cdk, induit sa dissociation de E2F et ce qui permet l’entrée des cellules en phase S
(Mittnacht, 1998). La protéine Rb reste ainsi hyperphosphorylée jusqu’à l’entrée en mitose, ce
qui conduit à sa dégradation. Ainsi, la progression du cycle cellulaire est largement sous le
contrôle de la régulation génique dépendante de Rb-E2F (figure 7).
L’expression de la cycline D1 est induite par les facteurs de croissance tels que le FGF
(fibroblast growth factor) et le TGF-β (tumor growth factor), et son niveau est maximal pendant la
phase G1 (Sherr, 1994). La surexpression de la cycline D1 accélère la progression G1/S
(Quelle et al, 1993) et inhibe la transactivation des gènes spécifiques du muscle en partie par
la voie Rb/E2F (Guo & Walsh, 1997; Rao et al, 1994; Skapek et al, 1995). Des expériences de
transdifférenciation musculaire de fibroblastes en culture cellulaire montrent que les cyclines
A et E bloquent la différenciation. La présence d’une protéine Rb mutante non-
phosphorylable abolit l’effet négatif des cyclines A et E sur la différenciation musculaire
(Skapek et al, 1996). En revanche, l’expression de la cycline D1 réussit quand même à inhiber
la différenciation musculaire même en présence de ce mutant de Rb. Ceci indique que
l’activité des cyclines/cdk bloque la différenciation musculaire à la fois par un mécanisme
dépendant de la phosphorylation de Rb, et par un second mécanisme indépendant de la
phosphorylation de Rb (Skapek et al, 1996).
Myoblastes (prolifération)
?
Myotubes (différenciation)
Figure 8. Modifications post-traductionelles de MyoD.
Les cercles rouges entourant un «  P  » représentent un résidu phosphorylé, les cercles jaunes
indiquant «  Ub  » représente un acide aminé ubiquitinylé et un cercle bleu indiquant « Ac »
représente un résidu acétylé. Les modifications post-traductionnelles retrouvées dans les
myoblastes en prolifération sont placées au dessus et celles apparaissant en condition de
différenciation sont illustrées en bas.
Figure adaptée d’après « Puri and Sartorelli, Journal of cellular physiology, 2000  ».
Figure 9 : Expression de MyoD au cours du cycle cellulaire.
Le niveau de MyoD augmente au cours de la phase G1 et atteint son niveau maximum en
milieu de phase G1 au niveau d’un point de restriction noté « R ». En présence de signaux
mitogènes, Cdk2 phosphoryle alors MyoD sur la sérine 200 ce qui entraîne sa dégradation.
Le niveau de MyoD augmente à nouveau durant la phase G2. La phosphorylation de MyoD
par CDK1 au niveau des sérines 5 et 200 entraîne sa dégradation avant l’entrée en mitose.
14
III.1.1.2 Modifications post-traductionnelles de MyoD conduisant à sa dégradation
La protéine MyoD comporte plusieurs sites de modifications post-traductionnelles (figure 8).
Ces modifications vont réguler l’activité de MyoD et/ou provoquer sa dégradation par le
protéasome (Breitschopf et al, 1998; Floyd et al, 2001). Ainsi, MyoD est phosphorylé dans les
myoblastes en prolifération et cette phosphorylation diminue lorsque les myoblastes se
différencient en myotubes (Kitzmann et al, 1999). MyoD est phosphorylé sur la sérine 200
dans les myoblastes en prolifération et cette phosphorylation est induite par cdk1 ou cdk2
(Tintignac et al, 2000). La phosphorylation de MyoD sur la sérine 200 est impliquée dans la
dégradation de MyoD, puisque les mutants de MyoD ayant une alanine 200 non-
phosphorylable ont une demie-vie augmentée trois à quatre fois par rapport à la protéine
sauvage (Song et al, 1998). La phosphorylation de MyoD par le complexe cycline E/cdk2 est
impliquée dans sa dégradation dépendante de l’ubiquitine pendant la phase G1-S (Tintignac
et al, 2000). Parce que la cycline D1 est essentielle pour l’induction de la cycline E (Nurse,
1994; Sherr, 1994), le rôle du complexe cycline E/cdk2 dans la phosphorylation de MyoD et
sa dégradation consécutive, fournit une explication supplémentaire pour le rôle inhibiteur de
la cycline D1 dans la myogenèse. En particulier, la surexpression de la cycline D1 induit
l’accumulation de Cdk4 dans le noyau, qui se lie alors à l’extrémité N-terminale de MyoD et
empêche sa liaison à l’ADN (Zhang et al, 1999a). Finalement, MyoD atteint son plus haut
niveau d’expression en début de phase G1, et si les stimuli extérieurs sont favorables, c’est
pendant cette fenêtre de temps que les myoblastes sortent du cycle cellulaire pour s’engager
dans le processus de différenciation terminale, sinon, MyoD est dégradé. Le point du cycle
matérialisant le moment auquel se fait le choix entre la sortie et la poursuite du cycle cellulaire
est nommé point de restriction. Après la phase S, le niveau de MyoD commence à augmenter
à nouveau (figure 9). Cependant, à l’enclenchement de la mitose, MyoD est à nouveau
phosphorylé sur les sérines 5 et 200 par les complexes cycline/cdk, puis ubiquitinylé et
dégradé (pour revue voir (Kitzmann & Fernandez, 2001)).
III.1.2 Les protéines bHLH inhibitrices séquestrent MyoD et ses co-facteurs
L’activité de MyoD et celle de ses co-facteurs, les protéines E et les facteurs MEF2, sont
hautement régulées par des interations protéine-protéine. Toutes les protéines à domaine
HLH ne possèdent pas de propriétés activatrices, au contraire, la plupart fonctionnent
comme des régulateurs négatifs de la transcription. Un cas bien illustré est celui des protéines
Id, qui possèdent un motif HLH mais pas de domaine basique. Id est donc capable de former
des hétérodimères avec les protéines bHLH, mais empêche leur liaison à l’ADN (Benezra et
al, 1990a; Benezra et al, 1990b). Id se lie à MyoD, et plus préférentiellement aux protéines E
Figure 10. MyoD participe au remodelage de la chromatine sur ses gènes cibles.
Sur les gènes spécifiques du muscle, la chromatine et les protéines interagissant au niveau de
la chromatine sont dans un état réprimé dans les myoblastes en prolifération. MyoD, Mef2 et
YY1 recrutent des complexes co-répresseurs contenant des histones désacétylases (HDACs) et
des histones méthylases (par exemple Ezh2), qui empêchent l’hyperacétylation et induisent la
di- ou tri-méthylation de résidus lysine spécifiques (comme K27 et K9) pour donner une
conformation répressive à la chromatine au niveau des gènes spécifiques du muscle. La voie
CaMK activée pendant la différenciation et les niveaux de Rb hypophosphorylé (suite à la
baisse des signaux mitogènes) déplacent les HDACs de la chromatine et permettent
l’hyperacétylation des histones par les acétyltransférases.
Figure adaptée de Forcales and Puri, Cell and Developmental Biology, 2005.
YY1
Ezh2
Rb
HDAC
classe I
Rb
Histone
méthyl-
transférases
Mef2 MyoD
HDAC
classe 2
CaMK
PP
Pol II
Enhancer /Promoteur musculaire
HDAC
classe I
cytoplasme
K27
Me Me Me
K9
Me Me
Boîte Mef2 Boîte E
15
(Benezra et al, 1990a), empêchant ainsi la formation d’un dimère actif MyoD-protéine E (Jen
et al, 1992). À l’enclenchement de la différenciation musculaire, la localisation de Id devient
cytoplasmique et il ne peut plus interagir avec MyoD. De plus, alors que son taux de
dégradation par le protéasome reste inchangé, les niveaux d’ARNm et protéique de Id sont
diminués lorsque les signaux mitogènes sont diminués et pendant la myogenèse (Norton et al,
1998; Sun et al, 2005; Trausch-Azar et al, 2004).
Une autre classe d’inhibiteurs à domaine HLH sont les protéines HES qui répriment l’activité
transcriptionnelle via leur liaison à une boîte N (apparentée aux boîtes E) sur l’ADN (Sasai et
al, 1992). De la même manière, la protéine bHLH Twist altère l’activité de MyoD en bloquant
sa liaison à l’ADN, à la fois en titrant les protéines E, mais aussi en interagissant directement
avec Mef2 (Hamamori et al, 1997; Spicer et al, 1996). D’autres protéines bHLH qui régulent
négativement l’activité de MyoD et bloquent la différenciation musculaire, sont les protéines
MyoR et Mist1. Ces facteurs contiennent des régions basiques et forment des dimères avec
les MRFs. MRF/MyoR et MRF/Mist1 sont des hétérodimères inactifs, capables de se fixer
sur les boîtes E, mais sans activer la transcription (Lemercier et al, 1998; Lu et al, 1999). La
protéine bHLH Mist1 peut aussi occuper les boîtes E en formant un homodimère Mist1-
Mist1 (Lemercier et al, 1998). Enfin, il a été démontré qu’une autre bHLH, Dermo-1, est
capable d’inhiber l’activité transactivatrice de MyoD d’une manière plus efficace que Id
(Gong & Li, 2002). Contrairement à l’inhibition liée à Id qui peut être levée par compétition
en co-transfectant la protéine E12, l’inhibition par Dermo-1 n’est apparemment pas ou peu
dépendante de E12. Dermo-1 induit la répression de la transcription des gènes cibles de
MyoD par son interaction directe avec la protéine Mef2C, mettant en jeu ses domaines N- et
C-terminaux (Gong & Li, 2002).
III.1.4 Dans les myoblastes en prolifération, MyoD contribue à la répression
épigénétique de ses gènes cibles
Si MyoD est titré hors de l’ADN et ses cofacteurs séquestrés ou dégradés, une fraction de
MyoD est malgré tout retrouvée sur la chromatine. Dans ce cas, MyoD est associé à la
répression de ses gènes cibles car il interagit avec différents facteurs de modification ou de
remodelage de la chromatine (figure 10), agissant ainsi au niveau épigénétique. En effet, de
nombreuses études ont permis d’établir une relation entre la structure chromatinienne et la
régulation de la transcription. L’induction de la transcription s’accompagne d’une altération
de la structure des nucléosomes positionnés sur les séquences régulatrices. La structure de la
chromatine est affectée par différents complexes de remodelage, dont les complexes
dépendants de l’ATP et les complexes d’acétylation ou de désacétylation des histones. Les
16
histones peuvent subir de multiples modifications post-traductionnelles comme la
phosphorylation, la méthylation, l’ubiquitinylation et l’acétylation. Ces modifications
interviennent essentiellement au niveau des queues N-terminales, qui sont à l’extérieur du
nucléosome. Elles constituent autant de signaux de reconnaissance pour des facteurs
impliqués dans les processus de transcription, de réparation, de condensation des
chromosomes, de dégradation. En 2000, Strahl et Allis font ainsi référence à « code des
histones », dans lequel chaque modification aurait son propre rôle dans l’activation de la
transcription, mais également un effet combinatoire avec les autres modifications (Strahl &
Allis, 2000).
III.1.4.1 Les histones désacétylases
Les histones désacétylases régulent négativement l’expression des gènes spécifiques du
muscle via leur interaction avec les protéines MyoD et Mef2. De ce fait, dans les myoblastes
en prolifération, MyoD est associé à la répression de ses propres gènes cibles. En effet, les
histones désacetylases (HDACs) de classes I et II sont exprimées dans les myoblastes,
fournissant un autre fragment d’explication pour l’incapacité de MyoD et Mef2 à activer leurs
gènes cibles avant leur entrée en différenciation. Dans les myoblastes en prolifération, MyoD
est en fait associé aux HDACs de classe I, via son domaine bHLH. Cette interaction réprime
l’activité transcriptionelle de MyoD à deux niveaux : (i) en désacétylant MyoD lui-même, (ii)
en désacétylant les histones sur ses promoteurs cibles. Par exemple, HDAC1 s’associe avec
MyoD et est capable de le désacétyler in vitro (Mal et al, 2001). De plus, MyoD est trouvé
complexé à HDAC1 dans les myoblastes en prolifération, mais pas dans les myotubes en
différenciation (Mal et al, 2001). Le recrutement de HDAC1 sur les gènes cibles de MyoD se
fait probablement par le co-répresseur N-CoR/SMRT, qui interagit directement avec MyoD
et qui est connu pour recruter HDAC1 sur l’ADN. L’histone désacétylase de classe II, Sir2,
une HDAC dépendante du NAD+, inhibe également la myogenèse en formant un complexe
avec l’histone acétyltransférase PCAF (p300/CBP associated factor) et MyoD, et lorsque Sir2 est
surexprimée, elle retarde la différenciation musculaire. Inversement, la diminution de Sir2
accélère la différenciation musculaire (Fulco et al, 2003).
L’activité de Mef2 est elle aussi réprimée par son association avec les HDACs de classe II
(telles que les HDACs 4 et 5), provoquant la désacétylation et la répression des gènes
contenant les sites de fixation de Mef2 (Lu et al, 2000). HDAC7 inhibe également
spécifiquement Mef2 (-A, -C, -D) et n’affecte pas MyoD et la myogénine (Dressel et al, 2001).
Les HDACs de classe II n’interagissent pas directement avec MyoD, mais répriment
17
l’expression de ses gènes cibles lorsqu’ils contiennent un site Mef2 en supplément de la boîte
E, en s’associant aux facteurs Mef2 (Lu et al, 2000).
III.1.4.2 Les histones méthyl-transférases
Il a été montré que le recrutement de complexes HDACs pour désacétyler les histones sur les
promoteurs du muscle avant la différenciation, contribue à la méthylation de l’histone H3 sur
sa lysine 9 (H3K9) par des histones méthyl-transférases (HMTs), sur ces mêmes promoteurs
(Zhang et al, 2002). À ce propos, Mal et Harter montrent que dans les myoblastes en
prolifération, MyoD est associé à HDAC1 sur le promoteur de la myogénine et que ce
promoteur présente alors une désacétylation ainsi qu’une méthylation de l’histone H3 sur la
lysine 9 (H3K9), ce qui correspond à des marques épigénétiques répressives (Mal & Harter,
2003). Par ailleurs, l’histone méthyltransférase Suv39h, qui méthyle H3K9, interagit avec
MyoD dans les cellules en prolifération et ce complexe est détecté sur le promoteur de la
myogénine qui est un gène cible de MyoD réprimé en prolifération. La présence de Suv39h1
sur ce promoteur est corrélée à la méthylation de H3K9 (Mal, 2006). La méthylation de
H3K9 est une marque épigénétique reconnue par la protéine de l’hétérochromatine HP1, qui
va contribuer à former une structure hétérochromatinienne compacte non-permissive à la
transcription. J’ai d’ailleurs participé à une étude montrant que la protéine HP1 est impliquée
dans la répression de la différenciation musculaire et qu’elle interagit directement avec MyoD
(Yahi et al, 2008) (Annexe 3).
D’autres méthyltransférases d’histones régulent négativement la différenciation musculaire.
Notamment Ezh2, une protéine polycomb avec une activité spécifique de méthylation de
H3K27, est recrutée spécifiquement sur les gènes spécifiques du muscle dans les myoblastes
en prolifération (Caretti et al, 2004). Ezh2 est retrouvée dans un complexe protéique
contenant HDAC1. Les promoteurs du muscle sont hyperméthylés sur H3K27 et donc
réprimés. L’enclenchement de la différenciation est couplé à la disparition de ce complexe sur
ces mêmes loci. H3K27 devient donc hypométhylé et MyoD et Mef2 sont recrutés,
permettant la transcription de leurs gènes cibles. La diminution de Ezh2 est corrélée avec une
activation de l’expression des gènes du muscle et sa surexpression inhibe la différenciation
musculaire (Caretti et al, 2004).
Figure 11. Dualité entre les régulateurs du cycle cellulaire et l’engagement dans la voie de
différenciation terminale.
MyoD et Myf5 sont exprimés dans les myoblastes en prolifération, où leur activité est inhibée
par les complexes Cdk4/Cycline D. Les complexes cycline/Cdk sont activés par les signaux
mitogènes. En absence de facteurs de croissance, MyoD induit l’expression de p21 et de Rb ce
qui résulte en l’arrêt du cycle cellulaire. Notamment, p21 inhibe les complexes cycline/Cdk,
qui ne peuvent alors plus phosphoryler Rb. En effet, en condition de prolifération cellulaire, Rb
est normalement hyperphosphorylé par les complexes cycline/cdks, ce qui rend la protéine Rb
inactive et l’empêche de s’associer avec le facteur E2F. E2F est donc libre d’aller transcrire les
gènes nécessaire à la prolifération cellulaire. En absence de signaux mitogènes, Rb
hypophosphorylé séquestre E2F et contribue à l’arrêt du cycle cellulaire. La myogénine est
activée dans les myoblastes ayant arrêté de proliférer et c’est un élément intermédiaire
important dans la différenciation terminale des myoblastes.
Figure adaptée d’après Molkentin and Olson, Current Opinion in Genetics and Development,
1996).
MyoD/Myf5 Myogénine p21 Arrêt de la
prolifération
Différenciation
musculaire
Rb-E2F
cyclineD/Cdk4 E2F Prolifération
Rb- P
inactif
Facteurs de
croissance
18
III.2 MyoD orchestre la différenciation musculaire terminale
III.2.1 MyoD promeut la sortie du cycle cellulaire en stimulant l’expression de Rb, p21
et la cycline D3
Un point de contrôle de l’entrée en différenciation a été mis en évidence (Puri et al, 2002). Ce
point de contrôle semble permettre aux myoblastes d’interrompre leur prolifération,
notamment lors d’un traitement des cellules par des agents génotoxiques. MyoD coopère
avec les régulateurs du cycle cellulaire, notamment les complexes cycline/cdk, les CKIs et Rb,
dans la voie de signalisation qui mène à l’arrêt du cycle en phase G1 et l’engagement dans la
voie de différenciation (Guo et al, 1995; Halevy et al, 1995; Novitch et al, 1996; Parker et al,
1995; Schneider et al, 1994) et pour revue voir (De Falco et al, 2006) (figure 11).
III.2.1.1 Régulation des complexes cycline/cdk
Globalement, l’expression et l’activité des régulateurs positifs du cycle cellulaire sont
diminuées pendant la différenciation terminale. Si l’expression de cdk4 et cdk2 reste
inchangée pendant la différenciation musculaire squelettique, celle de cdk1, des cyclines D, E
et A décline. Cependant, une catégorie de cycline et Cdk échappe à cette règle, les cyclines T
et Cdk9 sont augmentées dans les myotubes en différenciation et aideraient même MyoD à
activer ses gènes cibles (Giacinti et al, 2006; Simone & Giordano, 2001; Simone et al, 2002b).
Dans les myoblastes, la protéine Rb interagirait également avec cycline T2/cdk9 (Simone et
al, 2002a). La cycline D3 est également une cycline dont l’expression est augmentée au cours
de la différenciation musculaire (Kiess et al, 1995; Rao & Kohtz, 1995). MyoD stimule lui-
même l’expression de la cycline D3, par un mécanisme qui requiert l’acétyltransférase p300
(Cenciarelli et al, 1999). La cycline D3 contribue à la sortie du cycle cellulaire et elle est
associée à cdk4 et Rb dans les myotubes différenciés (Cenciarelli et al, 1999).
III.2.1.2 Régulation des CKIs
L’expression des inhibiteurs de cdks (CKIs), en particulier p21 (Guo et al, 1995; Halevy et al,
1995; Parker et al, 1995; Skapek et al, 1995), mais également p27 (Zabludoff et al, 1998) et p18
(Franklin & Xiong, 1996), est renforcée pendant la myogenèse embryonnaire et pendant la
différenciation myogénique de myoblastes en culture. Dans les myoblastes, la majorité des
CKIs sont capables d’améliorer la capacité de transactivation de MyoD. L’augmentation des
CKIs à l’enclenchement du processus de différenciation terminale, explique la diminution
drastique de l’activité des complexes cycline/cdk au cours de la différenciation. Par exemple,
le complexe cdk2/ cycline E est inhibé par p57 (Reynaud et al, 2000). La sortie du cycle
cellulaire est essentiellement contrôlée par l’expression de deux inhibiteurs de cdk, p21 et p57
19
(Zhang et al, 1999b). MyoD induit directement l’expression de p21 au cours de la myogenèse
(Guo et al, 1995; Halevy et al, 1995; Parker et al, 1995). L’importance du rôle joué par p21
dans la sortie du cycle prolifératif est illustrée par le fait que l’expression forcée de p21 dans
les myoblastes est suffisante pour enclencher le programme de différenciation terminale,
même en présence de facteurs de croissance (Guo et al, 1995). L’expression de p21 et p57 est
indispensable à la différenciation musculaire comme le montre la double inactivation génique
p57:p21, qui donne le même phénotype que les souris inactivées pour la myogénine (Zhang et al,
1999b).
III.2.1.3 Régulation de Rb
En plus de réguler l’expression de la cycline D3 et p21, MyoD active directement l’expression
de Rb. Le mécanisme par lequel MyoD active Rb est distinct de sa fonction myogénique
(Martelli et al, 1994). L’activation de l’expression de Rb passe par le recrutement du facteur de
transcription CREB (cAMP-responsive element binding protein) qui reconnaît un site CRE sur le
promoteur du gène codant pour Rb. De manière intéressante, les auteurs montrent que
MyoD s’associe à CREB dans un complexe comprenant également les protéines à activité
acétyl-transférase, p300 et PCAF. Cependant les auteurs montrent que l’acivité acétyl-
transférase de p300 n’est pas requise pour augmenter l’activité transcriptionnelle de MyoD,
en revanche celle de PCAF est indispensable. Les auteurs notent également que MyoD se fixe
sur le promoteur de Rb uniquement en présence de CREB (Magenta et al, 2003).
À l’enclenchement de la différenciation terminale, la baisse massive des régulateurs du cycle
permet à la protéine Rb de rester dans une forme hypophosphorylée. Rb hypophosphorylé
peut alors interagir directement avec le domaine d’activation des facteurs E2Fs, les
empêchant ainsi d’agir pour stimuler la progression vers la phase S. Par ailleurs, le facteur
E2F voit également son expression diminuer et les myocytes surexprimant E2F1 n’arrivent
pas à sortir du cycle cellulaire, même dans des conditions favorables à la différenciation
(Wang et al, 1995). De plus, l’interaction de la protéine Rb dans sa forme hypophosphorylée
avec MyoD et les autres bHLH myogéniques est nécessaire à la différenciation musculaire.
Rb coopère notamment avec MyoD pour stimuler l’activité transcriptionnelle de Mef2 dans
les myoblastes en différenciation (Novitch et al, 1999). Rb va subir des modifications post-
traductionnelles comme sa phosphorylation par la cycline T2/Cdk9, mais aussi une
acétylation par p300 et PCAF sur sa région N-terminale. Ces modifications sont
indispensables pour la sortie du cycle cellulaire et l’induction de la transcription des gènes
spécifiques du muscle (Chan et al, 2001; Nguyen et al, 2004). Notamment, Rb va stimuler
20
l’expression de gènes tardifs de la différenciation comme MCK et MHC, en augmentant
significativement l’activité transcriptionnelle de MyoD (Gu et al, 1993).
III.2.2 MyoD interagit avec des facteurs régulant de manière positive sa fixation à
l’ADN
La protéine musculaire LIM interagit avec le dimère E12-MRF, augmente son activité de
liaison à l’ADN et stimule la myogenèse (Arber et al, 1994). Des expériences ont montré que
son inhibition dans les myoblastes empêche leur différenciation terminale, alors que sa
surexpression favorise ce processus (Kong et al, 1997).
La protéine Pbx est une homéoprotéine exprimée de manière ubiquitaire et qui peut se fixer
de manière constitutive à certains promoteurs. En particulier, Pbx1 peut se fixer sur le
promoteur de la myogénine avant la fixation de MyoD, alors même que la structure de la
chromatine est défavorable à la transcription. Par ailleurs, MyoD forme un complexe avec
Pbx1 sur ce même promoteur, suggérant que Pbx1 pourrait aider à la fixation de MyoD sur
son gène cible (Berkes et al, 2004).
MyoD peut être phosphorylé par d’autres kinases que les Cdks et notamment par la kinase
Mos. L’inhibition de Mos dans les myoblastes diminue leur potentiel de différenciation alors
que sa surexpression augmente l’activité de MyoD. Ceci montre que Mos est un régulateur
positif de la différenciation musculaire. Mos phosphoryle MyoD directement sur la sérine 237
et favorise ainsi la dimérisation de MyoD avec la protéine E12 (Aurade et al, 1994;
Lenormand et al, 1997; Solhonne et al, 1999).
III.2.3 Plusieurs voies de signalisation régulent positivement la différenciation
musculaire
III.2.2.1 La voie Jak/STAT
La protéine STAT3 est un facteur de transcription activé par la kinase Janus (Jak) en réponse
à des stimuli extracellulaires tels que certains facteurs de croissance. Sa phosphorylation par
Jak2 permet l’homodimérisation et la relocalisation de STAT3 dans le noyau, où STAT3 se
fixe sur ses gènes cibles. Deux études montrent clairement que l’expression de STAT3 est
augmentée au cours de la différenciation musculaire et que la diminution de STAT3 par
ARN-interférence inhibe la différenciation. De plus, les auteurs montrent que MyoD et
STAT3 interagissent et proposent un rôle positif pour STAT3 au cours de la différenciation
musculaire (Wang et al, 2008; Yang et al, 2009a).
Figure 12. MyoD participe au remodelage de la chromatine sur ses gènes cibles.
Les signaux induits par la différenciation aboutissant au déplacement de YY1 et des
méthyltransférases, ainsi que la déméthylation des résidus lysine des histones ne sont pas bien
connus. Après, (ou au même moment) que le déplacement des complexes corépresseurs et des
marques épigénétiques de la chromatine, l’assemblage du transcriptosome myogénique induit
le recrutement de plusieurs complexes dotés de différentes activités enzymatiques (comme les
acétyltransférases, les complexes de remodelage dépendants de l’ATP ou les arginine
méthyltransférases). La kinases p38 activée pendant la différenciation régule plusieurs étapes
de l’assemblement du transcriptosome, en ciblant et en phosphorylant les facteurs de
transcriptions (Mef2), les partenaires d’hétérodimérisation des MRFs (E47) et les composants
du complexe SWI/SNF (BAF60). p38 peut également réguler la stabilité de l’ARN naissant. Le
recrutement d’acétyltransférases sur les régions régulatrices des gènes du muscle n’est
apparemment pas dépendant de la voie p38 et est probablement régulé par une cascade
parallèle activée pendant la différenciation. Chacun des composants recrutés dans le
transcriptosome myogénique est essentiel pour conférer la capacité à activer la transcription.
Figure adaptée de Forcales and Puri, Cell and Developmental Biology, 2005.
Enhancer /Promoteur musculaire
R
Me
R
Me
p300
GRIP1
Mef2 MyoDE12/47
P P
P/CAF
SWI/SNF
Brg1
Brm
P
CARM1
Acétylation
Remodelage de
la chromatine
p38
ARNm
Pol II
Boîte Mef2 Boîte E
21
III.2.2.2 La voie p38 MAPK
La kinase p38 a un rôle particulièrement important dans l’expression des gènes spécifiques du
muscle, et le mécanisme par lequel p38 affecte les voies de régulation des gènes musculaires a
été abondamment décrit. L’activité de la kinase p38 augmente progressivement au fur et à
mesure du processus de différenciation et son activité est surtout nécessaire pour la
différenciation terminale (Wu et al, 2000). p38 est responsable de la phosphorylation du
domaine de transactivation de Mef2 (Cox et al, 2003; Zetser et al, 1999; Zhao et al, 1999).
L’inhibition de p38 atténue le potentiel d’activation de Mef2 et inversement l’expression d’un
mutant de p38 actif constitutivement promeut la différenciation musculaire (Puri et al, 2000;
Wu et al, 2000; Zhao et al, 1999). La kinase p38 jouerait également un rôle dans le
recrutement du complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF sur les gènes cibles de
MyoD (Simone et al, 2004) et dans la phosphorylation des histones, comme cela a été montré
sur certains gènes précoces de la différenciation musculaire (Clayton et al, 2000; Thomson et
al, 1999). Notamment, la voie p38 MAPK, de concert avec deux autres voies de signalisation,
agirait pour stimuler la liaison de MyoD, Mef2 et des protéines Six sur le promoteur proximal
de la myogénine pour activer son expression (Xu et al, 2002).
III.2.3 MyoD recrute des enzymes de remodelage de la chromatine sur ses gènes cibles
Principalement deux classes de co-activateurs coopèrent avec les facteurs de transcription
pour permettre l’expression spécifique des gènes : les protéines modifiant les histones (telles
que les acétyltransférases ou les méthyltransférases) et les facteurs de remodelage de la
chromatine dépendants de l’ATP (tels que les protéines de la famille SWI/SNF) (figure 12).
III.2.3.1 Les histones acétyl-transférases
Les histone-acétyltransférases (HATs) fonctionnent en transférant des groupements acétyl de
l’acétyl-coA sur les résidus lysine des protéines histones, ainsi que des protéines non-histones.
L’acétylation des histones provoque le transfert des histones H2A/H2B de l’ADN vers des
protéines chaperonnes (Ito et al, 2000), augmentant ainsi l’accessibilité des facteurs de
transcription à l’ADN. Les HATs et les HDACs interagissent toutes deux avec MyoD et ont
des activités opposées qui sont critiques pour faire basculer MyoD d’un état répresseur à un
état activateur sur certains loci.
Par exemple, la protéine Rb peut déplacer HDAC1 de MyoD (Puri et al, 2001), laissant
MyoD libre d’activer la transcription. D’ailleurs, la libération de MyoD de HDAC1 est un
préalable à l’association de MyoD avec la HAT PCAF (Mal et al, 2001). Une régulation de la
transition des interactions HATs et HDACs est également contrôlée pour Mef2. Le complexe
22
Mef2/HDAC de classe II est sensible à la kinase CamK dépendante du calcium, qui médie
l’effet stimulant de IGF1 (insulin-like growth factor 1) sur la différenciation musculaire. CamK
phosphoryle HDAC5 sur deux résidus sérine, ce qui stimule sa liaison à la protéine
chaperonne 14-3-3. L’interaction de HDAC5 avec la protéine 14-3-3 provoque l’exposition
d’un signal d’export nucléaire de HDAC5 et sa sortie du noyau (McKinsey et al, 2000;
McKinsey et al, 2001).
Les coactivateurs transcriptionnels tels que p300, c-AMP response element-binding protein (CREB)-
binding protein (CBP) et p300/CBP-associated factor (PCAF) possèdent une activité acétyl-
transférase sur les lysines. L’activité acétyl-transférase (AT) générale augmente au cours de la
différenciation myogénique (Polesskaya et al, 2001b) et l’activité de MyoD est augmentée par
l’acétylation de ses résidus lysines par CBP, p300 et PCAF in vitro (Duquet et al, 2006;
Polesskaya et al, 2000; Polesskaya & Harel-Bellan, 2001; Sartorelli et al, 1999). Il y a une
association préférentielle entre MyoD acétylé (en comparaison avec MyoD non-acétylé ou
non-acétylable) et le bromodomaine de CBP et p300 (Polesskaya et al, 2001a). Dans la même
étude, les auteurs montrent avec un système rapporteur que l’acétylation de MyoD augmente
significativement sa capacité à activer la transcription. Une étude très récente montre que
l’acétylation de la lysine 99 de MyoD est indispensable pour son interaction avec le
bromodomaine de CBP et que la double acétylation des lysines 99 et 102 est requise pour
l’interaction de MyoD avec p300 (Wei et al, 2008). De nombreux groupes qui ont étudié le
rôle de CBP et p300 dans la différenciation musculaire n’ont pas toujours discriminé la
présence de CBP et p300 dans les complexes HATs où est retrouvé MyoD. Cependant,
puisque le motif de reconnaissance de CBP et p300 se situe au niveau de la lysine 99, ceci
génère certainement un encombrement stérique prévenant la formation d’un complexe
contenant à la fois CBP et p300. Il est donc fort à parier que les complexes HAT dans
lesquels MyoD est retrouvé pour activer le programme myogénique contiennent soit p300,
soit CBP selon les gènes cibles de MyoD à activer.
Bien que p300 ait été identifié comme un coactivateur de MyoD et accroisse l’activité
transcriptionnelle de ce dernier (Sartorelli et al, 1997; Yuan et al, 1996), l’activité AT de p300
est dispensable pour l’activation des gènes cibles précoces de MyoD (Polesskaya et al, 2001b;
Puri et al, 1997). La protéine p300 agirait comme un pont moléculaire et permettrait le
recrutement de PCAF. Dans les myotubes différenciés, MyoD est en effet complexé avec
p300 (ou CBP) et PCAF. Ce complexe trimérique est capable de se lier à une boîte E in vitro,
suggérant que MyoD recrute p300 (ou CBP) et PCAF sur les promoteurs spécifiques du
muscle (Puri et al, 1997). Le démantèlement de ce complexe en neutralisant PCAF inhibe la
23
différenciation musculaire, indiquant que le recrutement de PCAF par MyoD, via p300/CBP,
est indispensable pour l’activation du programme myogénique. D’après une étude utilisant un
système rapporteur, il est proposé que l’acétylation des histones soit effectué par p300 et que
l’acétylation de MyoD soit effectué par PCAF (Dilworth et al, 2004). La liaison de MyoD à
certains promoteurs spécifiques est concomitante avec l’acétylation des histones (Bergstrom
et al, 2002). Cette acétylation favoriserait le recrutement du complexe de remodelage
SWI/SNF sur ces gènes cibles (de la Serna et al, 2005).
III.2.3.2 Les histones méthyl-transférases
L’arginine méthyl-transférase CARM1 a été impliquée positivement dans la myogenèse.
CARM1 (également appelée PRMT4) est un membre de la famille des PRMT (protein-arginine
N-methyltransferase) et catalyse la méthylation des résidus arginine sur une large série de
substrats. Par exemple, CARM1 peut méthyler l’histone H3 in vitro et est impliquée dans la
différenciation de différents types cellulaires. CARM1 stimule la myogenèse en étant associée
directement avec GRIP1 (le coactivateur du récepteur aux stéroïdes) et Mef2C dans un
complexe (Chen et al, 2002). De plus, Mef2 et CARM1 sont recrutés sur le promoteur de
MCK en condition de différenciation et l’inhibition de CARM1 inhibe la différenciation
musculaire en abolissant l’expression de facteurs de transcription clés de la différenciation
terminale, tels que Mef2 et la myogénine (Chen et al, 2002). Paradoxalement, CARM1 a
également été montré comme modifiant les arginines des histones H3R17 et H3R26 de la
région promotrice de la cycline E1, stimulant l’expression de la cycline E1 et de ce fait stimulant
la prolifération dans ces cellules (El Messaoudi et al, 2006). Cette étude n’a pas été réalisée
dans des cellules musculaires et la stimulation de l’expression de la cycline E1 reste à montrer
dans les myoblastes. Par ailleurs, il n’est pas exclu que CARM1 ait un double rôle, mais que
son rôle prédominant dans les myoblastes soit de stimuler la différenciation terminale.
Une autre protéine de la même famille, PRMT5, a également été montrée comme stimulant la
myogenèse. En effet, l’arginine diméthylée en position 8 de l’histone H3 (H3R8) et PRMT5
sont retrouvées au cours de la différenciation sur un promoteur cible de MyoD activé
précocement : le promoteur de la myogénine (Dacwag et al, 2007). Les auteurs montrent que
PRMT5 est nécessaire pour la diméthylation de H3R8 et la diminution de PRMT5 prévient la
fixation de Brg1, la sous-unités ATPasique du complexe SWI/SNF et de MyoD lui-même.
III.2.3.3 Le complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF
Les membres de la famille du complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF jouent
des rôles critiques dans le contrôle de la transcription. Les protéines SWI/SNF sont les
24
composants d’un complexe multimérique qui modifie la structure de la chromatine en altérant
les contacts entre ADN et histones au sein d’un nucléosome, d’une manière dépendante de
l’ATP (pour revue voir (Martens & Winston, 2003) et (Racki & Narlikar, 2008)). La sous-
unité ATPasique, Brm ou Brg1, du complexe SWI/SNF possède un motif appelé
bromodomaine, qui est capable de lier les résidus lysine acétylés dans la queue N-terminale
des histones in vitro. Plusieurs travaux ont mis en évidence un rôle essentiel de SWI/SNF
dans la transactivation des promoteurs musculaires médiée par MyoD. Il a tout d’abord été
montré que la conversion myogénique de fibroblastes par MyoD est inhibée par la
surexpression d’un mutant dominant négatif de Brm ou de Brg1 et au plan moléculaire, cela
se traduit par l’inhibition de la transcription de certains gènes cibles de MyoD, comme par
exemple la myogénine et MHC (de la Serna et al, 2001a). Par ailleurs, une autre étude montre
que la fixation du complexe SWI/SNF sur le promoteur de la myogénine nécessite la présence
de MyoD (de la Serna et al, 2005). De manière intéressante, une étude complémentaire
montre que les gènes cibles de MyoD impliqués dans la sortie du cycle cellulaire (p21, Rb,
Cycline D3) ne sont pas affectés par les mutants de Brm ou de Brg1 ; SWI/SNF interviendrait
donc au niveau de l’étape de différenciation elle-même, mais pas dans la sortie du cycle
cellulaire (de la Serna et al, 2001b).
Les sous-unités ATPasiques, Brm et Brg1, sont nécessaires pour la myogenèse dans les
cellules exprimant MyoD (de la Serna et al, 2001a; Roy et al, 2002). MyoD et Mef2
recruteraient le complexe SWI/SNF sur les gènes spécifiques du muscle pour activer leur
transcription pendant la différenciation musculaire. MyoD co-précipite ainsi avec p300,
PCAF et Brg1 dans l’extrait nucléaire de myoblastes en différenciation (Simone et al, 2004) et
ces protéines sont retrouvées (de pair avec MyoD) sur les promoteurs de la myogénine et de
MCK.
Une étude intéressante par Giacinti et ses collègues montre une relation entre le complexe
cdk9/cyclin T2 qui, de concert avec p300 et PCAF et le complexe de remodelage SWI/SNF,
est recruté par MyoD sur les promoteurs et les enhancers des gènes spécifiques du muscle. Ce
recrutement aboutit au final à l’acétylation des queues N-terminales des histones, au
remodelage de la chromatine et à la phosphorylation de l’ARN polymérase II sur ces sites,
permettant l’activation de la transcription des gènes cibles de MyoD (Giacinti et al, 2006).
Récemment et pour la première fois, SRA (steroid receptor RNA activator), un ARN non-codant,
a été montré associé à MyoD et à deux protéines ARN hélicases, p68 et p72. Comme le
suggèrent leurs expériences d’immunoprécipitation de la chromatine, cette association serait
retrouvée sur certains loci. De plus, in vitro les auteurs montrent que la présence concomitante
Figure 13. Réponse des cellules satellites suite à une lésion ou un traumatisme.
En réponse à une lésion, les cellules satellites sont activées et prolifèrent (a). Une partie des
cellules satellites réapprovisionnent le stock de cellules satellites quiescentes présentes sur la
myofibre grâce à un processus d’auto-renouvellement. Les cellules satellites vont migrer au
niveau de la région endommagée (b), et en fonction de la gravité de la lésion, vont fusionner
à la fibre existante (c) ou vont s’aligner et fusionner entre elles pour produire une nouvelle
fibre musculaire (d). Dans la myofibre régénérée, les noyaux des cellules qui viennent de
fusionner sont initialement centraux (e), mais migreront plus tard vers la périphérie de la
myofibre.
Figure adaptée de Hawke and Garry, Journal of Applied Physiology, 2001.
a. Activation et prolifération des
cellules satellites
b. Attraction par
chimiotactisme des cellules
satellites vers la fibre
endommagée
c. Fusion avec la fibre
endommagée (hypertrophie)
d. Alignement et fusion pour produire une
nouvelle myofibrille (hyperplasie)
e. Myofibrille régénérée avec un noyau
central
25
de p68, p72 et SRA augmente significativement l’activité de MyoD dans un système
rapporteur. Par ailleurs, la présence de p68 et p72 faciliterait le remodelage de la chromatine
initié par Brg1 sur certains gènes cibles de MyoD (Caretti et al, 2006).
IV. LE MAINTIEN DU MUSCLE ET SA REGENERATION DEPENDENT
DE SON INNERVATION
IV.1 Le maintien de muscle adulte par les cellules satellites
Le muscle squelettique des mammifères est capable de réaliser une régénération massive et
rapide en cas de dommage sévère. La régénération musculaire est caractérisée par une phase
dégénérative et une phase régénérative (Lecker et al, 2004). Dans un premier temps, les sites
lésés sont envahis par les cellules inflammatoires, notamment les neutrophiles et les
macrophages. La dégénération est suivie par la régénération et la réparation du muscle. La
phase de régénération est caractérisée par la prolifération des cellules myogéniques appelées
cellules satellites, situées le long de chaque fibre musculaire. La prolifération de ces cellules
permet de former un réservoir suffisant de cellules musculaires qui pourront alors fusionner
et remplacer les fibres musculaires lésées. En absence de stimuli, les cellules satellites sont
quiescentes et transcriptionnellement moins actives que les noyaux des myofibres.
L’activation des cellules satellites n’est pas restreinte à la zone lésée. Un dommage causé à
l’extrémité de la fibre musculaire peut activer les cellules satellites situées tout le long de la
fibre, conduisant à une prolifération et à une migration des cellules satellites vers le site de
régénération (Schultz et al, 1985). La particularité des cellules satellites est leur division
asymétrique qui permet de restaurer la réserve de cellules satellites au tour de la fibre
musculaire néo-formée. Après l’activation de leur prolifération, une partie des cellules
satellites fusionne pour régénérer le muscle et une autre partie retourne à l’état de quiescence
pour reconstituer la réserve de cellules satellites (Kuang et al, 2008) (figure 13).
Les processus d’activation et de différenciation des cellules satellites pendant la régénération
sont similaires à ceux observés durant la mise en place de la musculature embryonnaire. Les
cellules satellites sont caractérisées par l’expression du facteur de transcription Pax7 (Kuang
et al, 2006; Seale et al, 2000), et dans plusieurs muscles également Pax3 (Buckingham, 2007).
D’ailleurs les souris dont le gène Pax7 est inactivé ne possèdent (pratiquement) pas de
cellules satellites (Seale et al, 2000). Outre la mise en place des cellules satellites avant la
naissance, Pax7 aurait lui-même un rôle au cours de la régénération musculaire. Les cellules
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  • 1. UNIVERSITE PARIS XI FACULTE DE MEDECINE PARIS-SUD Année 2008/2009 N° attribué par la bibliothèque THESE Pour obtenir le grade de DOCTEUR DE L’UNIVERSITE DE PARIS XI Champ disciplinaire : Biochimie, Biologie Cellulaire et Moléculaire École Doctorale de rattachement : « Cancérologie : Biologie, Médecine, Santé » (0418) Présentée et soutenue publiquement par Ophélie PHILIPOT Le 21 Octobre 2009 Titre : Coopération entre le facteur de transcription CBF (Runx1-CBFβ) et le facteur myogénique MyoD dans la régulation de l’équilibre prolifération-différenciation musculaire Directeur de Thèse : AIT-SI-ALI Slimane JURY Président : Pr AUCLAIR Christian Rapporteur : Dr VANDEL Laurence Rapporteur : Dr DELVA Laurent Examinateur : Pr WEITZMAN Jonathan Directeur de thèse : Dr AIT-SI-ALI Slimane
  • 2. A Patrick et Annie,
  • 3. Table des matières REMERCIEMENTS i LISTE DES FIGURES iii LISTE DES ABREVIATIONS iv AVANT-PROPOS 1 CHAPITRE I 2 LE MUSCLE SQUELETTIQUE 2 I. INTRODUCTION: PRESENTATION DU MODELE D’ETUDE, LE MUSCLE STRIE 2 I.1 Les types cellulaires qui composent le muscle strié 2 I.1.1 Les cellules extra fusales, ou cellules musculaires striées 2 I.1.2 Les cellules satellites 3 I.1.3 Les cellules du fuseau neuromusculaire 4 II. MISE EN PLACE DES FIBRES MUSCULAIRES STRIEES 4 II.1 Mise en évidence des MRFs 4 II.2 Détermination et différenciation des cellules musculaires au cours de la myogenèse embryonnaire 5 II.3 Les protéines Mef2, co-facteurs des MRFs 6 II.4 Relation structure/ fonction des MRFs 8 II.4.1 Le domaine bHLH est impliqué dans la fixation sur l’ADN et dans la dimérisation avec les protéines E 8 II.4.2 Les domaines de transactivation (TAD) N-terminal et C-terminal régulent l’activité des MRFs 9 II.5 La différenciation terminale se décompose en deux étapes discrètes 10 II.5.1 La sortie du cycle prolifératif 11 II.5.2 L’activation des gènes spécifiques du muscle 11 III. L’EQUILIBRE PROLIFERATION-DIFFERENCIATION DANS LE MUSCLE 12 III.1 Régulation négative de l’activité de MyoD dans les myoblastes proliférants 12 III.1.1 MyoD et ses cofacteurs sont régulés négativement au cours du cycle cellulaire 12 III.1.2 Les protéines bHLH inhibitrices séquestrent MyoD et ses co-facteurs 14 III.1.4 Dans les myoblastes en prolifération, MyoD contribue à la répression épigénétique de ses gènes cibles 15 III.2 MyoD orchestre la différenciation musculaire terminale 18 III.2.1 MyoD promeut la sortie du cycle cellulaire en stimulant l’expression de Rb, p21 et la cycline D3 18 III.2.2 MyoD interagit avec des facteurs régulant de manière positive sa fixation à l’ADN 20 III.2.3 Plusieurs voies de signalisation régulent positivement la différenciation musculaire 20 III.2.3 MyoD recrute des enzymes de remodelage de la chromatine sur ses gènes cibles 21
  • 4. IV. LE MAINTIEN DU MUSCLE ET SA REGENERATION DEPENDENT DE SON INNERVATION 25 IV.1 Le maintien de muscle adulte par les cellules satellites 25 IV.2 Le muscle adulte est régulé par son innervation 26 CHAPITRE II 29 LE FACTEUR DE TRANSCRIPTION RUNX1/CBFβ 29 I. INTRODUCTION : DECOUVERTE DE LA FAMILLE DE PROTEINES A DOMAINE RUNT ET CBFβ 29 II. EXPRESSION ET FONCTION DE RUNX1 ET CBFβ 31 II.1 Fonctions biologiques de Runx1 et de la sous-unité CBFβ chez les mammifères 31 II.2 Organisation génomique de Runx1 et CBFβ 34 II.2.1 Les deux promoteurs de Runx1 et l’épissage alternatif de son ARNm sont à l’origine de ses nombreuses isoformes 34 II.2.2 La protéine CBFβ et ses isoformes 36 II.3 Relation Structure/ Fonction 37 II.3.1 La sous-unité protéique Runx1 37 II.3.2 La sous-unité protéique CBFβ 40 III. REGULATION DE L’ACTIVITE DU FACTEUR DE TRANSCRIPTION CBF 41 III.1 Régulation positive de l’activité de transactivation de Runx1 42 III.2.1 Phosphorylation, acétylation et méthylation de Runx1 42 III.2.2 Modulation de l’activité de Runx1 par la MAP kinase ERK 43 III.2 Régulation négative de l’activité de Runx1 44 III.2.1 Groucho/TLE 44 III.2.2 mSin3A et les HDACs 45 III.2.3 HMTs 46 III.3 Régulation de la formation du dimère fonctionnel CBF par la localisation subcellulaire des sous- unités Runx1 et CBFβ 46 IV. CBF DANS LE CONTROLE DE L’EQUILIBRE PROLIFERATION- DIFFERENCIATION 47 IV.1 Régulation croisée entre CBF et les régulateurs du cycle cellulaire 47 IV.1.1 CBF accélère la phase G1 et stimule l’entrée en phase S 47 IV.1.2 Régulations croisées entre les régulateurs du cycle cellulaire et Runx1 48 IV.2 CBF et l’équilibre prolifération-différenciation 50 PRESENTATION DU PROJET DE RECHERCHE 53 CONTEXTE 53 PROBLEMATIQUE 54 ARTICLE DE RECHERCHE 55 DISCUSSION DES RESULTATS 77 Validation de la stratégie d’approche 77
  • 5. Identification de Runx1-CBFβ au sein du complexe MyoD 77 MyoD interagit avec CBF via la sous-unité Runx1 78 MyoD et CBF interagissent ensemble dans les myoblastes murins, préférentiellement en prolifération 79 CBF est recruté sur les gènes cibles de MyoD préférentiellement dans les cellules musculaires en prolifération, et non en différenciation 79 Le facteur CBF régule négativement la différenciation musculaire, au profit de la prolifération cellulaire 80 Dans les myoblastes en prolifération, CBFβ est associé à des répresseurs et inhibe le remodelage de chromatine sur les gènes cibles de MyoD après induction de la différenciation 82 Conclusion et Modèle 83 DISCUSSION GENERALE & PERSPECTIVES 84 I. Régulation de la translocation de CBFβ dans le noyau des myoblastes 84 II. CBFβ dans le cytoplasme : un rôle de senseur ? 87 III. Runx1, CBFβ et MyoD : un rôle dans la différenciation ostéoblastique ! 87 IV. Les variants d’épissage de Runx1 pourraient être à l’origine d’une double fonction : le contrôle de la prolifération et de la différenciation musculaire 90 MODELISATION & CONCLUSION 93 REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES 95 ANNEXE 1 117 Article de revue 1 118 ANNEXE 2 130 Article 2 131 ANNEXE 3 141 Article 3 142 ANNEXE 4 151 Curriculum Vitae 152
  • 6. i Remerciements Je tiens vivement à remercier le Pr Christian Auclair d’avoir accepté d’être le président du Jury de ma thèse. Également merci aux Drs Laurence Vandel et Laurent Delva d’avoir été rapporteurs de ma thèse et de m’avoir aider à améliorer ce manuscrit. Enfin, un grand merci au Pr Jonathan Weitzman, mon directeur d’unité, qui me fait l’honneur d’être examinateur de ma thèse. Ma dernière année de thèse a été ponctuée par l’installation de mon équipe sur le campus de l’université Paris-Diderot, au sein de l’unité « Epigénétique et Destin Cellulaire » dirigé par le Pr Jonathan Weitzman. Jonathan, j’admire ta manière de créer cette cohésion et cette dynamique dans notre unité. Malgré ton busy schedule, tu trouves toujours le temps d’écouter et de conseiller. Un merci tout particulier à Pierre-Antoine Defossez, aka Mr Management. Merci pour tes livres, pour ton temps précieux, tes conseils et tes astuces. Grâce à tout ça, je ne me suis fait que partiellement ensevelir par la préparation de ma thèse. Ouf ! Ensuite, un grand merci à mon laboratoire d’accueil, littéralement ma deuxième maison pendant ma thèse. Slimane, je tiens à te remercier pour tous nos échanges. Lancer ma thèse en même temps que l’installation de ton labo était un pari risqué. Aujourd’hui c’est un pari gagné et je ne suis pas peu fière d’avoir survécu à l’aventure ! Plus qu’un enseignement scientifique, c’est une leçon de vie que j’ai apprise dans ton équipe. Alors, du fond du cœur : « Merci ! ». Mes manips ont largement profité du savoir-faire de nos deux « experts » au laboratoire, Lolo et Phiphi ! Merci pour tous vos conseils techniques et votre temps. Je tiens également à remercier Véronique, pourtant à peine arrivée dans l’équipe. Sa bonne humeur contagieuse m’a permis de positiver jusqu’au bout de l’aventure. Et puis il y a Aurélie avec qui ce n’était franchement pas gagné, mais qui finalement s’est révélée indispensable pour ma santé mentale sur la dernière ligne droite. Merci un million de fois : parce que tu sais râler avec classe, pour « l’escalator » , pour les fous rires, et pour ta playlist bien moisie. Enfin, je n’oublie pas ma petite Céline, la meilleure stagiaire du monde entier : ma petite padawanette, je sais que tu iras loin ! Tu as fait un boulot fantastique sur le projet. Merci pour ton investissement, tes lumières, ton soutien, ta sagesse, tes sourires et ta bonne humeur quotidienne.
  • 7. ii Je n’oublie pas mon premier labo dirigé par le Dr Annick Harel-Bellan, où s’est déroulée la majeure partie de ma thèse! Merci à tous ceux qui ont pris le temps de résoudre mes problèmes techniques et qui m’ont wisely conseillé, je pense notamment à Jacques, Sylvain, Anna… Un merci tout particulier aux « nénettes », Corinne et Cathy, pour les ragots, les imitations et les fous rires ! Et à ma Nora, celle qui a suivi de très près mes péripéties au lab et qui a toujours été là sans que je ne lui demande rien. Merci à mon rital préféré, Néri, toujours là prêt à sauter du Pont Neuf avec moi quand la qPCR a foirée! Merci à Sélim, mon coach sportif et détente: entre la piscine à l’aube les samedi mat’, les cours de salsa, les randos rollers et les après-midi bronzette, que de bons souvenirs! Je sais que tu es entre de bonnes mains avec Anna et il me tarde d’assister à ta soutenance de thèse ! Merci à ma nouvelle famille sur le campus de Paris-Diderot. Alors, à mes coacheuses shopping : Sandra, Mélanie et Fabienne. Merci pour vos tips pour ne pas me perdre dans Manhattan et profiter des bonnes affaires !! Après il y a mes fans, enfin, mon unique fan : merci Andrew de soutenir avec autant d’enthousiasme ma carrière cinématographique. Tu peux prendre rendez-vous avec mon attachée de presse A. Marchand pour une interview. Thank you Guillaume pour ton optimisme et tes blagounettes ; si t’es sage, je te léguerai mon collier de Stone-Age. Ensuite, un petit mot gentil pour Mika : n’oublie pas de m’inviter à ta crémaillère ! J’ai encore oublié de remercier Damien : merci de me prévenir avant d’aller manger, c’est mieux qu’après ! Merci Florent pour la bonne ambiance et tes communiqués de choc. Au fait, ya Heidi qui veut que je lui rende sa veste en poil de renard synthétique, merci de m’avoir balancé ! Enfin, ma chère Ryma, je te remercie pour nos petites discussions privées et aussi pour tes superbes compliments (je rigole encore pour le coup des Oscars !). Et pour finir, je lance un énorme merci à tous ceux que je n’ai pas cités mais qui ont été là à un moment ou à un autre et qui contribuent à la bonne ambiance de notre unité. Je remercie aussi ceux qui n’ont rien à voir avec le lab, mais sans qui j’aurai pris le premier TGV pour rentrer à la maison. Et bien ça y est, vous pouvez enfin me demander : alors cette thèse, tu la finis quand ? Mais il te reste encore combien d’années ? C’est normal que ce soit si long ? Et bien, « Guess what everybody ?! I did it!… and please, call me Doc’ ! » Enfin, merci à « toi, toi, mon toi ». Merci pour cette patience dont je n’ai jamais entrevu les limites. Tu as contribué à faire de cette année la meilleure des quatre… et de loin ! J’admire ton optimisme, ton énergie, ta bonne humeur, tes beaux yeux bleus… et tout le reste!
  • 8. iii Liste des figures Figure 1 : Les trois grandes étapes de la formation du muscle squelettique 3 Figure 2 : Structure du muscle strié (ou squelettique) 4 Figure 3 : Mise en place du muscle strié 5 Table 1 : Inactivations géniques chez la souris et phénotypes observés 6 Figure 4 : Boucles d’auto-amplification des MRFs et des protéines Mef2 8 Figure 5 : Domaines fonctionnels de MyoD 9 Figure 6 : La différenciation musculaire terminale se décompose en deux étapes discrètes 11 Figure 7 : Régulation de l’activité de Rb au cours du cycle cellulaire 13 Figure 8 : Modifications post-traductionnelles de MyoD 14 Figure 9 : Expression de MyoD au cours du cycle cellulaire 14 Figure 10 : MyoD participe au remodelage de la chromatine sur ses gènes cibles 15 Figure 11 : Dualité entre les régulateurs du cycle cellulaire et l’engagement dans la voie de différenciation terminale 18 Figure 12 : MyoD participe au remodelage de la chromatine sur ses gènes cibles 21 Figure 13 : Réponse des cellules satellites suite à une lésion ou un traumatisme 25 Figure 14 : Organisation des différents lignages hématopoïétiques 32 Figure 15 : Organisation du gène RUNX1 humain 34 Figure 16 : Structure génomique et variants d’épissage de CBFβ 36 Figure 17 : Structure du complexe formé du domaine runt de Runx1, CBFβ et l’ADN 37 Figure 18 : Domaines fonctionnels de la protéine Runx1 38 Figure 19 : Interaction particulière entre Runx1 (humain) et Ets-1 sur le site composite PBS (PEBP2 binding site) et les site EBS (Ets binding site) 39 Figure 20 : Changement de conformation de Runx1 après dimérisation avec CBFβ 40 Figure 21 : Runx1 associé à ses coactivateurs et ses corépresseurs 42 Figure 22 : Cascade de phosphorylation initiée par Runx1/p300 43 Figure 23 : Modélisation des résultats 83 Figure 24 : Représentation des rôles possibles pour MyoD, Runx1 et CBFβ dans le muscle présentés dans la discussion 93 Figure 25 : Diagramme du projet de recherche proposé par le Dr Slimane AIT-SI-ALI 94
  • 9. iv Liste des abréviation ACh : acétylcholine Ala : alanine ALP : phosphatase alcaline AML : acute myeloid leukemia ARNi : ARN interférence APC : anaphase promoting complex Asp : asparagine bHLH : basic helix loop helix Bgb : Big brother BMP : bone morphogenetic protein BSP : bone sialo protein Bro : Brother CamK : Ca2+/calmodulin-dependent protein kinase CARM1 : coactivator-associated arginine methyltransferase 1 CBF : core binding factor CBP : creb binding protein Cdk : cycline dependent kinase ChIP : chromatin immunoprecipitation CKI : cyclin-dependent kinase inhibitor CREB : cAMP-responsive element binding protein EC : mouse embryonal carcinoma cells EGF : epithelium growth factor ERK : extracellular signal-regulated kinases FAB : French-American-British classification FGF : fibroblast growth factor GRIP1 : glucocorticoid receptor interacting protein 1 HA : Hemaglutinine HAT : histone acétyltransférase HDAC : histone désacétylase HGH : hepatocyte growth factor HIPK : homeodomain-interacting protein kinase HLH : helix loop helix HMT : histone méthyltransférase HP1 : heterochromatin protein 1 IGF1 : insulin-like growth factor 1 IL-3 : interleukine-3 IRES : internal ribosomal entry site Jak : kinase Janus MAPK : mitogen-activated protein kinase MCK : muscle creatine kinase Mef2 : myogenic enhancer factor 2 MHC : myosin heavy chain MPC : muscle precursor cells MRF : myogenic regulatory factor NAD : Aldehyde dehydrogenase NCAM : Neural Cell Adhesion Molecule N-CoR : nuclear receptor corepressor NLS : nuclear localisation signal NMTS : nuclear matrix targeting sequence
  • 10. v NRDBn/c : negative regulatory region for DNA binding N/C-terminal to the runt domain NRHn/c : negative regulatory region for heterodimerisation N/C-terminal to the runt domain OCN : ostéocalcine ORN : olfactory receptor neurons Osx : osterix PCAF : p300/CBP associated factor PE : Py enhancer PEBP2 : Py Enhancer Binding Protein 2 PRMT : protein-arginine N-methyltransferase Py : polyomavirus RD : runt domain SMMHC : smooth muscle myosin heavy chain SMRT : silencing mediator of retinoic acid and thyroid hormone receptor SRA : steroid receptor RNA activator STAT : signal transducer and activator of transcription SWI/SNF : switch/sucrose non fermentable TAD : transactivation domain TCR : T-cell receptor TGFβ : tumor growth factor beta TLE1 : transducin-like enhancer of split Thr : thréonine
  • 11. 1 Avant-propos Une cellule peut être dans divers états physiologiques comme la prolifération, la différenciation, l’apoptose, la sénescence ou la quiescence. L’orientation d’une cellule vers l’une ou l’autre de ces voies doit être minutieusement contrôlée. En particulier, l’équilibre prolifération-différenciation de la cellule est fondamental pour maintenir l’intégrité des tissus. Il existe d’ailleurs de nombreuses pathologies graves associées à une dérégulation de cet équilibre. L’objectif principal de mon projet de thèse est de mieux comprendre comment l’équilibre prolifération-différenciation est régulé dans la cellule et pour cela nous avons utilisé comme modèle d’étude le muscle strié, où la différenciation terminale est bien caractérisée. Dans le muscle strié, la prolifération et la différenciation sont mutuellement exclusives : l’arrêt de la prolifération est requis pour permettre aux cellules de s’engager dans le processus de différenciation terminale. Ainsi, les régulateurs positifs de la différenciation terminale sont généralement des répresseurs de la prolifération. Dans le premier chapitre de ce manuscrit, je présente les caractéristiques du muscle squelettique. J’y décris sa structure, la manière dont il se met en place au cours du développement embryonnaire, les facteurs de transcription majeurs impliqués, l’équilibre prolifération-différenciation régulé par le facteur myogénique MyoD et, enfin, la régénération du muscle adulte et sa régulation par innervation. Dans un deuxième chapitre, je présente un facteur de transcription connu pour son rôle au cours du développement : le facteur CBF (formé du dimère Runx1 et CBFβ). Comme il sera décrit plus tard dans mes résultats, pour la première fois, je montre que ce facteur de transcription, initialement non-apparenté au muscle strié, joue de fait un rôle clé dans la régulation de l’équilibre prolifération-différenciation du muscle squelettique.
  • 13. 2 Chapitre I Le Muscle Squelettique I. INTRODUCTION: PRESENTATION DU MODELE D’ETUDE, LE MUSCLE STRIE I.1 Les types cellulaires qui composent le muscle strié Il existe trois types de cellules constituant le muscle strié (ou « muscle squelettique ») : les cellules extra fusales, majoritaires et également appelées cellules musculaires striées, les cellules satellites, et les cellules du fuseau neuromusculaire. I.1.1 Les cellules extra fusales, ou cellules musculaires striées Le muscle squelettique fait partie des muscles à contraction volontaire, contrairement aux muscles lisse et cardiaque, et il ne se contracte normalement qu’en présence de stimulation nerveuse. Il y a deux types de cellules musculaires striées en proportion variable chez l’Homme : les muscles de type I qui sont les muscles à contraction lente mais durable et les muscles de type II qui sont les muscles à contraction rapide mais courte. La différenciation du muscle en type I ou II dépend du motoneurone qui les innerve. Dans les gros muscles des membres, les petites unités lentes sont les premières recrutées dans la plupart des mouvements ; elles résistent bien à la fatigue et sont les plus fréquemment utilisées. Les unités rapides se fatiguent plus vite et sont généralement sollicitées pour les mouvements plus rigoureux. Les myotubes qui constituent les cellules musculaires fonctionnelles, dérivent des cellules progénitrices du muscle, également appelées MPCs (Muscle Progenitor Cells). Pour donner naissance aux myotubes, ces MPCs subissent d’abord une étape de détermination qui les convertit en myoblastes (figure 1). Contrairement aux myotubes, les myoblastes ont encore la
  • 14. Figure 1. Les trois grandes étapes de la formation du muscle squelettique. Après l’induction de MyoD et/ou Myf5, les cellules progénitrices du muscle (MPCs) sont engagées dans le lignage musculaire (myoblastes). Plus tard, l'activation des MRFs secondaires (myogénine et MRF4) induit la différenciation musculaire terminale des myoblastes, qui expriment alors les protéines spécifiques du muscle et fusionnent en myotubes multinucléés. Les myotubes subissent finalement une dernière étape de maturation, avec notamment leur innervation par les motoneurones, pour donner les myofibres striées. Figure adaptée de Chargé et Rundnicki, 2004. Progéniteur musculaire (MPC) Myofibre mature Myotube précoce Myoblaste Détermination MaturationDifférenciation
  • 15. 3 possibilité de se diviser, en revanche, ils ne sont plus multipotents, c’est-à-dire qu’ils sont déterminés à se différencier en muscle. Sous l’influence de signaux extérieurs, les myoblastes se différencient, c’est-à-dire qu’ils sortent du cycle prolifératif, expriment des protéines spécifiques du muscle comme la créatine kinase musculaire (MCK) ou la chaîne lourde de la myosine (MHC), et fusionnent entre eux, donnant ainsi naissance aux myotubes (figure 1). Les myotubes subissent finalement une étape de maturation pour donner les fibres musculaires striées. Chaque fibre musculaire striée résulte donc de la fusion de plusieurs dizaines de cellules musculaires appelées myoblastes. La cellule musculaire striée est une cellule très spécialisée, très allongée (jusqu’à 50 cm de longueur) et de forme cyclindrique (10 à 50 µm de diamètre) : c’est pourquoi on parle également de fibre musculaire. Chaque fibre individuelle qui forme le muscle squelettique représente une unité de base du système musculaire. Elle possède une centaine de noyaux situés en périphérie. La plus grande partie du cytoplasme de ces cellules (appelé également sarcoplasme ou myoplasme) est constituée de milliers de myofibrilles organisées en faisceaux. Une myofibrille est constituée de petits cylindres allongés dans le sens de la cellule et qui donne son aspect strié à la cellule musculaire squelettique : ce sont les sarcomères, véritables unités contractiles de la cellule musculaire striée (figure 2). Le sarcomère est constitué de myofilaments fins d’actine et de myofilaments épais de myosine orientés selon le grand axe de la myofibrille. Dans le cytoplasme restant, se trouvent notamment du glycogène, des mitochondries, le réticulum endoplasmique lisse et l’appareil de Golgi. La fibre musculaire est limitée par une membrane plasmique, appelée sarcolemme, entourée par une membrane basale. Afin d’étudier les mécanismes impliqués dans la différenciation musculaire terminale sans être gêné par des cellules non-musculaires dans l’interprétation des résultats, la lignée de myoblastes murins C2C12 a été isolée et caractérisée (Blau et al, 1985; Yaffe & Saxel, 1977). Les myoblastes C2C12 sont devenus un outil de prédilection pour l’étude de la différenciation musculaire ex vivo et ont permis de mieux caractériser la différenciation musculaire et d’étudier notamment l’équilibre prolifération-différenciation du muscle squelettique. Cette lignée a la capacité à se différencier rapidement et à produire des myotubes contractiles exprimant des protéines caractéristiques du muscle. I.1.2 Les cellules satellites Les cellules satellites sont une population de cellules mononucléées et indifférenciées. Elles s’attachent à la surface de chaque fibre musculaire au niveau du sarcolemme, avant que la
  • 16. Figure 2. Structure du muscle strié (ou squelettique). Le muscle squelettique est formé de plusieurs faisceaux de fibres musculaires. Chaque faisceau comprend plusieurs milliers de fibres musculaires. Une fibre musculaire résulte de la fusion de plusieurs centaines de cellules musculaires appelées myoblastes. En fusion, les myoblastes forment d’abord des myotubes qui sont des cellules multinucléées. Après une étape de maturation, les myotubes deviennent des myofibres. Les myofibres (ou fibres musculaires) sont caractérisées par leur aspect strié. La striation est due à l’alternance des myofilaments d’actine et de myosine à l'intérieur de la fibre. La zone où les myofilaments fins d’actine d’un sarcomère se chevauchent avec les filaments d’actine du sarcomère suivant se trouvent les stries Z. Le sarcomère, véritable unité contractile de la fibre musculaire, est délimité par deux stries Z. Image adaptée de http://t.verson.free.fr/PHYSIOLOGIE/PHYSIOLOGIE_EXERCICE Faisceaux de fibres musculaires Fibre musculaire (cellule musculaire) composée de myofibrilles Vaisseaux sanguins Noyau de la cellule musculaire Myofibrille composée de filaments d’actine et de myosine Filament d’actine Filament de myosine Stries Z Stries Z Sarcomère
  • 17. 4 lame basale n’entoure à la fois la cellule satellite et la fibre musculaire. Il y a environ une à cinq cellules satellites pour cent noyaux d’une fibre musculaire. Dans le muscle adulte, les cellules satellites interviennent durant l’hypertrophie musculaire liée à l’exercice et au cours de la régénération suite à une blessure, une dénervation ou l’absence de fonctionnement. En effet, bien que les cellules satellites soient mitotiquement quiescentes chez l’adulte, elles peuvent retrouver leur capacité à proliférer lors d’un stress ou d’un traumatisme, permettant la croissance et la régénération du muscle. L’équilibre entre la quiescence, l’activation des cellules satellites et l’induction de leur différenciation pour former de novo une fibre musculaire sera développé dans la dernière section de ce chapitre. I.1.3 Les cellules du fuseau neuromusculaire L’innervation du muscle est importante pour sa mise en place et son maintien dans le muscle adulte. L’absence d’innervation du muscle conduit d’ailleurs à la destruction progressive de la fibre musculaire. L’importance de l’innervation du muscle pour le maintien de son intégrité sera présentée dans la dernière section de ce chapitre. Les fuseaux neuromusculaires comportent des cellules intra fusales (cellules striées modifiées, spécialisées), des fibres nerveuses et des vaisseaux sanguins. Ce sont des formations allongées dans le même sens que les cellules musculaires striées et sont répartis à l’intérieur de la partie charnue du muscle. Chacun est délimité par une capsule conjonctive. Les cellules musculaires intra-fusales constituent des mécanorécepteurs qui renseignent sur le degré d’étirement ou de contraction du muscle. Elles sont de deux types : cellules musculaires à sac (qui renseignent sur la vitesse de variation de la longueur du muscle) et cellules musculaires à chaîne (qui codent en plus pour la longueur instantanée du muscle). Dans les deux cas, la partie contractile de ces fibres se situe à leurs deux extrémités et la partie centrale reçoit l’innervation afférente. L’allongement de la partie centrale des fibres est à l’origine d’une déformation mécanique des terminaisons sensorielles qui s’enroulent dans cette région. Cela entraîne un potentiel de récepteur qui remonte vers la moelle épinière et le cortex pariétal. II. MISE EN PLACE DES FIBRES MUSCULAIRES STRIEES II.1 Mise en évidence des MRFs Les “Myogenic Regulatory Factors”, ou MRFs, ont été mis en évidence pour la première fois grâce à des expériences de traitement des fibroblastes par un agent déméthylant de l’ADN, la 5-azacytidine. En effet, le traitement à la 5-azacytidine des fibroblastes induisait
  • 18. Figure 3. Mise en place du muscle strié. Pendant le développement, les cellules souches mésodermiques s’engagent dans un des multiples lignages cellulaires possibles, notamment dans le lignage musculaire. L’expression de Pax3 dans les cellules progénitrices contribue à l’expansion myogénique. Après l’induction de MyoD et/ou Myf5, les cellules progénitrices mésodermiques sont engagées dans le lignage musculaire (myoblastes). Plus tard, l'activation des MRFs secondaires (myogénine et MRF4) induit la différenciation musculaire terminale des myoblastes en myocytes. Finalement, la fusion des myocytes donne naissance aux myotubes multinucléés qui subiront une dernière étape de maturation avec notamment leur innervation par les motoneurone, pour donner les myofibres striées. Pendant la phase plus tardive de de la myogenèse embryonnaire, une population cellulaire distincte des myoblastes et dérivée des cellules satellites du muscle, fusionne avec la fibre musculaire existante permettant ainsi à la fibre musculaire de s'accroitre. Certaiens cellules satellites restent associées aux myofibres, sous une forme quiescentes et dans un état indifférencié. L’origine embryonnaire des cellules satellites n’est pas bien connue à ce jour. Cependant, l’expression de Pax7 est nécessaire pour la spécification et l’expansion de la population de cellules satellites. FC : facteurs de croissance. Figure adaptée de Chargé et Rundnicki, 2004. Progéniteur mésodermique Myogénine, p21, Rb, Mef2 Cyline D1 Rb-P Myofibre mature Myotube précoce Myoblaste Détermination myogénique Evénements plus tardifs de la différenciation (« innervation ») Myogénine, MRF4 FC Id, Pax3 MyoD Myf5 MyocytesCellule somitique mésoder- mique Sortie du cycle prolifératif Expression des gènes spécifiques du muscle BMP4 Wnts Shh Noggin
  • 19. 5 spontanément leur conversion en myoblastes, qui pouvaient alors entrer en pseudo- différenciation musculaire terminale en absence de signaux mitogènes. Un criblage différentiel entre les fibroblastes traités ou non-traités à la 5-azacytidine a permis d’isoler le gène MyoD (Davis et al, 1987). MyoD est un facteur de transcription myogénique puissant qui, lorsqu’il est exprimé ectopiquement dans des cellules non-musculaires (neurones, adipocytes, mélanocytes, chondrocytes), est capable de les convertir en myotubes (Choi et al, 1990; Weintraub et al, 1989) ; Davis et al, 1987). Sur la base de ces résultats, le gène MyoD a été proposé comme un des acteurs principaux dans le développement musculaire. Cette démarche a permis l’identification de trois autres gènes, myogénine (Edmondson & Olson, 1989; Wright et al, 1989), Myf5 (Braun et al, 1989) et MRF4 (Rhodes & Konieczny, 1989), qui interviennent aussi dans le développement musculaire. La famille des MRFs est ainsi composée de quatre membres : MyoD, Myf5, MRF4 et myogénine. Cette famille de facteurs de transcription est exclusivement exprimée dans la lignée myogénique. II.2 Détermination et différenciation des cellules musculaires au cours de la myogenèse embryonnaire Pendant le développement de l’embryon de souris, l’expression de Myf5 est induite dans les somites dorsaux-médiants (qui donnent plus tard les muscles du tronc et intercostaux), elle est suivie par l’expression de MyoD dans les somites dorso-latéraux (qui donnent naissance par la suite aux muscles des membres et de l’enveloppe corporelle). Les voies Wnts, Sonic hedgehog (Shh) et d’autres voies de signalisation contribuent à la détermination du muscle, en induisant les expressions de Myf5 et MyoD (pour revue voir (Buckingham, 2001)) (figure 3). L’expression de MyoD et Myf5 est une étape clé qui marque l’engagement des cellules somitiques multipotentes dans le lignage myogénique. L’activation de MyoD est retardée dans les embryons où le gène Myf5 est inactivé, montrant que l’expression de MyoD est initialement sous le contrôle de Myf5 (Tajbakhsh et al, 1997). Cependant, par la suite MyoD est activé indépendamment et la myogenèse se déroule normalement avec une localisation correcte des cellules (Kassar-Duchossoy et al, 2004) (table 1). De même, en absence de MyoD, la myogenèse se déroule apparemment normalement aussi, bien que les muscles des membres se forment plus tardivement, certainement en raison du niveau initial insuffisant de Myf5 pour déclencher la différenciation (Rudnicki et al, 1992). Après induction de MyoD, normalement le niveau de Myf5 diminue. Ainsi, chez les souris dont le gène MyoD est inactivé, le niveau de Myf5 reste relativement élevé probablement pour pallier l’absence de MyoD. Dans les doubles mutants Myf5:MyoD (Rudnicki et al, 1993), la myogenèse n’a pas lieu
  • 20. Pas de différenciation terminale. Létalité. Myogénine Musculature normale MRF4 Pas de muscle squelettique MyoD:Myf5 Musculature normale MyoD Musculature normale Myf5 Phénotype observé Inactivation génique Table 1. Inactivations géniques chez la souris et phénotypes observés.
  • 21. 6 et les cellules myogéniques sont absentes (Braun & Arnold, 1996); Petrovick et al, 1998). Ces expériences mettent en avant le rôle important de MyoD et Myf5 dans la myogenèse. Le rôle joué par MRF4 pendant la myogenèse est plus compliqué. En effet, MRF4 est exprimé de manière transitoire dans le myotome de souris au jour E9, en suivant de près l’expression de Myf5. Son expression disparaît au jour E11,5 et est réinitiée au jour E16 dans les fibres musculaires en différenciation. MRF4 a donc un rôle à la fois dans la spécification des somites en progéniteurs myogéniques, mais également au cours de la différenciation terminale (table 1). Enfin, la myogénine joue un rôle critique au cours de la différenciation musculaire terminale. En effet, chez les souris dont le gène myogénine a été inactivé, la deuxième phase d’expression de MRF4 et la formation des fibres secondaires (Ontell & Kozeka, 1984a; Ontell & Kozeka, 1984b) sont sévèrement compromis (table 1). Chez ces souris, les myoblastes sont présents, montrant que la myogénine n’est pas requise pour acquisition de l’identité de myoblastes, cependant la différenciation terminale est fortement compromise (Venuti et al, 1995). En résumé, ces études d’inactivation montrent que Myf5 et MyoD sont requis pour l’engagement dans le lignage myogénique, alors que la myogénine joue un rôle critique dans l’expression du phénotype musculaire final. Enfin, MRF4 participe à ces deux fonctions. Ainsi, MyoD, Myf5, et dans une certaine mesure MRF4, sont considérés comme des facteurs d’engagement ou de « détermination», alors que la myogénine est perçue comme un facteur de « différenciation » uniquement (figure 3). II.3 Les protéines Mef2, co-facteurs des MRFs Parallèlement aux MRFs, une autre famille de facteurs de transcription joue un rôle clé dans la différenciation musculaire : les protéines de la famille des Myocyte Enhancer Factor 2 (Mef2). Les protéines Mef2 appartiennent à la famille de facteurs de transcription à domaine MADS (MCM1, agamous, deficiens, serum response factor) (Yu et al, 1992) et sont induites quand les myoblastes entrent dans le programme de différenciation terminale (Gossett et al, 1989). L’inactivation de l’unique gène Mef2 chez la drosophile entraîne une létalité embryonnaire, ainsi qu’une perte complète de différenciation musculaire dans les trois lignages musculaires (squelettique, lisse et cardiaque). Cependant, dans ce cas, les myoblastes sont présents et correctement localisés, ce qui indique que c’est le processus de différenciation terminale et non de détermination qui est affecté (Bour et al, 1995; Lilly et al, 1995).
  • 22. 7 Chez les mammifères, la famille Mef2 comprend quatre membres, Mef2 A à D, chacun codé par un gène séparé. Alors que l’expression des MRFs est strictement cantonnée au muscle, les gènes Mef2 sont exprimés dans une grande variété de tissus et de lignées cellulaires et sous la forme de nombreux transcrits différents, en raison de leur épissage alternatif. Cependant, les protéines elles-mêmes et leur activité de liaison à l’ADN semblent limitées aux cellules musculaires différenciées et aux neurones. Les protéines Mef2 se fixent ainsi sur un site riche en A/T retrouvé dans les promoteurs et les enhancers de nombreux gènes spécifiques du muscle : CTA(A/T)4TAG (Gossett et al, 1989). L’expression ectopique de Mef2 ne permet pas d’induire le programme de différenciation myogénique in vitro. En revanche, plusieurs éléments permettent de dire que les protéines Mef2 assistent les MRFs. Ainsi, MyoD et Mef2 interagissent directement in vitro et activent de manière synergique des gènes rapporteurs contenant des boîtes E et des sites de liaison Mef2 (Molkentin et al, 1995). Les boîtes E sont situées dans la région régulatrice des gènes spécifiques du muscle, tels que MCK (créatine kinase musculaire), Desmine, Troponine I, et sont des sites de fixation reconnus par les MRFs. Dans les promoteurs et enhancers des gènes spécifiques du muscle, les boîtes E sont souvent situées à proximité des sites Mef2, appuyant encore une fois le rôle coopératif de Mef2 et MyoD pour activer la transcription (Wasserman & Fickett, 1998). Par exemple, les protéines Mef2 se fixent sur l’enhancer du gène codant pour MCK et leur présence est nécessaire pour l’activité maximale de cet enhancer (Gossett et al, 1989). Des sites de fixation fonctionnels pour les protéines Mef2 ont également été identifiés dans les promoteurs de nombreux gènes structuraux des muscles cardiaques et squelettiques. Certaines études in vitro ont montré que l’activation de certains promoteurs par MyoD nécessite la présence de deux boîtes E sur lesquelles MyoD se fixe de manière coopérative (Thomson et al, 1999). Sur les promoteurs cibles de MyoD ne possédant qu’une seule boîte E, il est possible que la présence d’une boîte Mef2 compense fonctionnellement l’absence d’une seconde boîte E, facilitant ainsi la fixation de MyoD. De manière intéressante, Mef2 peut se fixer sur le promoteur de la myogénine et son site de fixation est nécessaire pour l’activité complète du promoteur (Edmondson et al, 1992). La capacité de la myogénine à induire l’expression de Mef2, qui en retour régule l’expression de la myogénine, fournit un mécanisme par lequel ces facteurs s’amplifient et se maintiennent mutuellement quand les myoblastes entrent en différenciation. Finalement, les protéines Mef2 sont capables de transactiver les gènes MyoD (Leibham et al, 1994; Wong et al, 1994), myogénine (Cheng et al, 1993; Edmondson et al, 1992) et MRF4 (Black et al, 1995; Naidu et al, 1995). La surexpression de Mef2A peut en effet activer l’expression de MyoD et de la
  • 23. Figure 4. Boucles d’auto-amplification des MRFs et des protéines Mef2. Au cours de la différenciation musculaire, MyoD déjà exprimé dans les myoblastes active l’expression de la myogénine, MRF4 et Mef2. En retour, la myogénine et Mef2 stimulent l’expression de MyoD. MRF4 stimule également l’expression de la myogénine et Mef2. Ensemble, ces boucles d’activation permettent l'amplification efficace des MRFs et des facteurs Mef2 au cours de la différenciation terminale. Signaux Externes Facteurs de croissance MyoD Myf5 Détermination Différenciation Myog Activation Inhibition Myf5 MRF4 Mef2 Myog MRF4
  • 24. 8 myogénine, et réciproquement l’expression des MRFs dans des cellules non-musculaires induit l’activité des protéines Mef2 (Cserjesi & Olson, 1991). Ceci tend à montrer que les membres de la famille Mef2 interviennent dans le maintien et l’amplification de l’expression des MRFs (figure 4). Il a été précédemment montré qu’une boucle d’autorégulation des MRFs existe et qu’elle repose en partie sur les MRFs eux-mêmes. Notamment, l’expression ectopique de MyoD active l’expression de la myogénine de manière directe (Hollenberg et al, 1993; Thayer et al, 1989). MyoD est également capable de se fixer sur des séquences en 5’ de son propre gène et de s’autoactiver (Hollenberg et al, 1993). Réciproquement, la myogénine est capable d’activer MyoD, notamment lorsque les cellules entrent en différenciation. Mais il existe un rétrocontrôle positif de MyoD indépendamment de la myogénine, ce qui suggère fortement l’intervention d’autres facteurs tels que les facteurs Mef2 (Hollenberg et al, 1993; Thayer et al, 1989). II.4 Relation structure/ fonction des MRFs Les quatre protéines MyoD, Myf5, myogénine, et MRF4 appartiennent à la famille des facteurs de transcription de type bHLH (basic helix loop helix). Les MRFs présentent une homologie de séquence à 80% sur un fragment de 70 acides aminés qui regroupe une région basique et un domaine hydrophobe hélice-boucle-hélice (HLH). Ils contiennent également des domaines de transactivation dans leur parties amino- et carboxy- terminales, qui sont importants pour l’activation efficace de la transcription des gènes spécifiques du muscle (figure 5) (Edmondson & Olson, 1993). II.4.1 Le domaine bHLH est impliqué dans la fixation sur l’ADN et dans la dimérisation avec les protéines E Le motif bHLH définit une superfamille de protéines, dont font partie les bHLH myogéniques : MyoD, Myf5, MRF4 et myogénine. Près du centre de ces protéines se trouve une région basique (b), voisine du domaine hydrophobe hélice-boucle-hélice (HLH). La région basique des bHLH myogéniques joue un double rôle dans le contrôle de la transcription des gènes spécifiques du muscle en permettant la liaison à l’ADN des MRFs et en conférant une spécificité de transcription. Les bHLH myogéniques diffèrent des autres bHLH du fait qu’ils contiennent un motif de reconnaissance conservé au sein du domaine basique. Ce « code myogénique » comprend les résidus conservés « Ala86, Thr87, Asp109, Ala114 et Thr115 » et leur confère la capacité à activer les gènes spécifiques du muscle (Brennan et al, 1991; Davis et al, 1990; Huang et al, 1998a). La mutation de la région basique empêche la liaison à l’ADN mais pas la dimérisation (Brennan et al, 1991; Davis et al, 1990).
  • 25. Figure 5. Domaines fonctionnels de MyoD. Les différentes régions fonctionnelles de MyoD sont représentées par des rectangles : en bleu pour le domaine d’activation, en gris clair pour le domaine C/H, en orange pour le domaine basique, en jaune pour le domaine HLH et en gris foncé pour le domaine C-terminal. Les chiffres indiquent la position des acides aminés aux bornes de chaque domaine. Figure adaptée d’après « Puri and Sartorelli, Journal of cellular physiology, 2000 ». 1 53 108 125 137 146 166 319 Activité de remodelage de la chromatine Activité de remodelage de la chromatine DimérisationFixation sur l’ADN
  • 26. 9 Des expériences de mutagenèse montrent que ce motif HLH sert d’interface à la dimérisation, ce qui permet de former un domaine composite de liaison à l’ADN après dimérisation de deux protéines bHLH (Davis et al, 1990; Voronova & Baltimore, 1990). Le motif bHLH est également trouvé dans une classe de protéines ubiquitaires connues sous le nom de protéines E, qui inclut HEB/HTF4, E2-2/ITF-2 et l’epissage alternatif du produit du gène E2A : E12/E47. Ainsi, les bHLH myogéniques peuvent soit s’homodimériser, soit s’hétérodimériser avec les facteurs de transcription bHLH de classe I, que sont les protéines E. Les dimères formés par dimérisation de protéines bHLH diffèrent par leur affinité de liaison pour l’ADN. Par exemple, le dimère MyoD-E47 se forme efficacement et se fixe fortement sur l’ADN, alors que l’homodimère MyoD se fixe à l’ADN faiblement (Murre et al, 1989). Les hétérodimères MRF-protéine E se fixent sur la séquence consensus “CANNTG”, appelée boîte E. Des préférences de liaison à l’ADN dépendantes des séquences adjacentes et des séquences internes à la boîte E ont été identifiées pour les homodimères et les hétérodimères MRF-protéine E in vitro (Blackwell & Weintraub, 1990). Les boîtes E sont fréquemment représentées dans le génome et pas seulement dans les régions régulatrices des gènes du muscle. Ainsi, des interactions intramoléculaires sont indispensables pour que MyoD puisse activer spécifiquement la transcription des gènes du muscle. Par exemple, la présence d’un site de liaison pour le facteur Mef2, augmente de manière coopérative la transcription. Par ailleurs, Mef2C interagit directement avec le dimère MyoD-E12, mais pas avec ces protéines individuellement (Molkentin et al, 1995; Molkentin & Olson, 1996; Olson et al, 1995). II.4.2 Les domaines de transactivation (TAD) N-terminal et C-terminal régulent l’activité des MRFs En plus du domaine bHLH, des analyses de mutation et de délétion ont identifié trois domaines de MyoD ayant des fonctions importantes dans la régulation des gènes spécifiques du muscle : le domaine acide N-terminal, le domaine riche en histidine et cystéine (H/C) et l’hélice III. Le domaine N-terminal, qui comprend les résidus 1 à 53, est très acide et permet l’activation d’un promoteur hétérologue (Weintraub et al, 1991). Le domaine acide N-terminal de MyoD est requis pour l’activation d’un plasmide rapporteur dirigé par plusieurs boîtes E, suggérant qu’il fonctionne comme un domaine de transactivation (TAD) et qu’il est nécessaire pour la fixation de MyoD sur les boîtes E (Weintraub et al, 1990).
  • 27. 10 En plus du domaine de transactivation N-terminal, deux autres motifs conservés ont été identifiés : du côté N-terminal du domaine bHLH, il y a le domaine riche en H/C et du côté C-terminal, il y a une structure en hélice α, également appelée hélice III. Ces deux domaines de MyoD sont nécessaires pour le remodelage de la chromatine, au niveau du promoteur de la myogénine (Gerber et al, 1997), en coopérant avec Pbx et Meis. Les facteurs Pbx et Meis font partie de la famille de facteurs de transcription à homéodomaine, initialement identifiés pour leur rôle au cours de l’embryogenèse (Berkes et al, 2004). Les complexes Pbx-Meis interagissent de manière coopérative avec les bHLH myogéniques in vitro sur un ADN synthétique contenant les sites consensus de fixation de Pbx et Meis et une boîte E. Cette liaison coopérative requiert la présence d’un résidu tryptophane conservé au sein du domaine riche en H/C des bHLH (Knoepfler et al, 1999). Les mutants de MyoD pour la région riche en H/C sont incapables d’initier le remodelage de la chromatine sur le locus de la myogénine (Gerber et al, 1997), probablement car le mutant ne peut plus interagir avec le complexe Pbx/Meis. L’hélice III a été montrée comme nécessaire pour initier l’activation de la myogénine au niveau endogène (Bergstrom & Tapscott, 2001). Par ailleurs, un exemple qui montre que chaque MRF a sa propre spécificité est le fait que MyoD et la myogénine possèdent leur propre hélice III. Cette hélice permettrait à MyoD d’activer certains gènes cibles spécifiquement, car si on remplace l’hélice III de la myogénine par celle de MyoD, la protéine chimère devient à son tour capable d’activer certains gènes cibles de MyoD (Bergstrom & Tapscott, 2001). II.5 La différenciation terminale se décompose en deux étapes discrètes La différenciation des myoblastes en myotubes implique une cascade d’événements modifiant profondément la cellule à la fois au niveau morphologique et moléculaire. Ceci implique une reprogrammation importante du profil d’expression des gènes des cellules en question, aboutissant à l’inhibition de certains gènes et à l’activation d’autres gènes. Lorsqu’il est exprimé de manière ectopique dans certains types cellulaires, MyoD est capable d’induire la conversion de ces cellules en cellules myoblastiques, ce qui montre que MyoD est capable d’induire cette reprogrammation génique. De fait, l’ensemble des études effectuées à ce jour sur MyoD montre que c’est un facteur de transcription capable de transactiver un nombre important de gènes qui interviennent à toutes les étapes du processus de différenciation musculaire. Notamment, MyoD est capable d’orchestrer les deux étapes discrètes de la différenciation terminale : la sortie du cycle prolifératif et l’expression des gènes spécifiques
  • 28. Myotube précoce Myoblaste Myocytes alignés Sortie du cycle prolifératif Expression des gènes spécifiques du muscle & fusion Figure 6. La différenciation musculaire terminale se décompose en deux étapes discrètes. Les myoblastes exprimant MyoD prolifèrent sous l’influence des facteurs de croissance. Sous l’influence de stimuli extérieurs (ex vivo, les signaux mitogènes sont diminués artificiellement), les myoblastes vont sortir définitivement du cycle cellulaire grâce à l’action concertée de MyoD, Rb hypophosphorylé, et p21. L’action de Mef2 entretient les boucles d’amplification des MRFs et va induire l’expression de myogénine de concert avec MyoD et MRF4. Les myocytes fusionnent enfin pour former les myotubes multinucléés et expriment les gènes spécifiques du muscle. MyoD, Rb, p21 Myogénine, MyoD, Mef2, MRF4
  • 29. 11 de la différenciation musculaire. MyoD fonctionne ainsi comme un interrupteur moléculaire, en « éteignant » la prolifération et en « allumant » la différenciation terminale, et permet ainsi la séparation de ces deux processus (figure 6). II.5.1 La sortie du cycle prolifératif Pendant le processus de différenciation musculaire, les facteurs myogéniques ne sont pas seulement impliqués dans l’induction des gènes spécifiques du muscle, mais également dans la régulation de la transition entre l’état prolifératif (quand MyoD et Myf5 sont déjà exprimés) et la sortie ordonnée du cycle de division cellulaire. L’arrêt du cycle prolifératif est un pré-requis pour que la différenciation musculaire terminale puisse avoir lieu. Cette étape clé de la différenciation musculaire squelettique implique la diminution des activateurs du cycle cellulaire, tels que les cyclines et les kinases dépendantes des cyclines (Cdks), et l’augmentation des inhibiteurs du cycle cellulaire, tels que Rb, p21, p27 et p57. Ainsi, MyoD intervient tout d’abord au niveau de la sortie du cycle cellulaire en activant notamment les gènes p21 (Halevy et al, 1995), la cycline D3 (Cenciarelli et al, 1999) , et Rb (Bergstrom et al, 2002). En particulier, Rb et p21 jouent un rôle très important dans l’arrêt de la croissance des myoblastes. Leur niveau d’expression et leur activité, bien que régulés négativement par les facteurs de croissance, sont régulés positivement par MyoD, qui joue un rôle coopératif dans l’induction de l’arrêt du cycle cellulaire. D’ailleurs, MyoD peut bloquer la prolifération indépendamment de son activité transcriptionnelle. En effet, exprimé ectopiquement dans des cellules non musculaires, MyoD inhibe le cycle cellulaire avant la phase S, indépendamment de son activité de liaison à l’ADN et de l’induction de la différenciation myogénique (Crescenzi et al, 1990; Sorrentino et al, 1990). II.5.2 L’activation des gènes spécifiques du muscle Pour induire la différenciation terminale ex vivo, les signaux mitogènes sont diminués artificiellement en cultivant les cellules dans un milieu à faible teneur en sérum et en laissant les cellules à confluence. Ce n’est qu’après l’arrêt permanent de la prolifération que les myoblastes vont exprimer les protéines spécifiques du muscle et fusionner entre eux pour former des cellules multinucléées appelées myotubes. Plusieurs études indépendantes ont permis d’identifier certains gènes cibles de MyoD. En particulier, une étude utilisant comme modèle la conversion myogénique de fibroblastes, a permis d’étudier le transcriptome de ces cellules lorsque la différenciation musculaire est induite par MyoD (Bergstrom et al, 2002). Simultanément à l’arrêt du cycle, MyoD active l’expression d’autres acteurs importants de la différenciation comme la myogénine et Mef2 (Black & Olson, 1998; Cheng et al, 1993; Edmondson et al, 1992). Comme il a été mentionné précédemment, la myogénine intervient
  • 30. 12 en aval de MyoD dans le processus de différenciation. Elle peut elle aussi assurer l’activation des gènes de la famille Mef2 (Cserjesi & Olson, 1991). L’activation de la famille Mef2 et de la myogénine permettrait de prendre le relais de MyoD et/ou de contribuer à la reprogrammation transcriptionnelle des noyaux des myoblastes en cours de différenciation. Plus tard au cours de la différenciation, MyoD participe à l’activation de gènes codant des protéines fonctionnelles du muscle, comme la créatine kinase musculaire (MCK), la troponine I et la chaîne lourde de la myosine (MHC), qui sont indispensables à la fois à la structure et au fonctionnement des myotubes (Bergstrom et al, 2002; Lassar et al, 1989). MyoD semble également intervenir dans l’expression de gènes codant des protéines d’adhérence, et de certains intermédiaires des voies de transduction des signaux comme le gène codant le récepteur à l’acétylcholine (Bergstrom et al, 2002; Gilmour et al, 1991). III. L’EQUILIBRE PROLIFERATION-DIFFERENCIATION DANS LE MUSCLE III.1 Régulation négative de l’activité de MyoD dans les myoblastes proliférants MyoD est exprimé dans les myoblastes en prolifération, alors que les gènes cibles principaux de MyoD ne sont pas activés. Cela implique une inhibition active de l’activité de MyoD. On comprend donc aisément que les cellules assurent une régulation de l’activité de MyoD à plusieurs niveaux. Comme cela va maintenant être décrit, l’activité de MyoD dépend beaucoup des partenaires protéiques avec lesquels il interagit. Ainsi, ses partenaires influent sur la fixation de MyoD à l’ADN, son intensité de transactivation, sa stabilité protéique, sa spécificité sur ses promoteurs cibles, ainsi que le contexte chromatinien qui rend possible ou non la transcription. III.1.1 MyoD et ses cofacteurs sont régulés négativement au cours du cycle cellulaire La décision cellulaire de progresser vers un nouveau cycle de division cellulaire a lieu à la transition G1/S. Au niveau moléculaire, plusieurs régulateurs positifs et négatifs du cycle cellulaire ont été identifiés. Parmi les régulateurs positifs du cycle se trouvent les complexes cycline/Cdks (Nurse, 1994; Sherr, 1994). Les régulateurs négatifs du cycle, qui sont aussi des coactivateurs de la différenciation musculaire, comprennent entre autres les inhibiteurs de Cdks (CKIs) (Sherr & Roberts, 1995; Sherr & Roberts, 1999) et la famille des protéines à
  • 31. Figure 7. Régulation de l’activité de Rb au cours du cycle cellulaire. Durant le début la phase G1, la transcription des gènes de la phase S dépendante de E2F, est réprimée par la fixation de Rb à E2F. Au point de restriction R, des complexes cyclines/CDKs phosphorylent Rb, qui se décroche alors de E2F, permettant à celui-ci d’activer la transcription de ces gènes cible et le passage en S. La sortie du cycle précédant la différenciation cellulaire se fait au cours de la phase G1 lorsque l’inhibition de E2F par Rb est toujours active. Figure extraite de Giacinti and Giordano, Oncogene 2006. R
  • 32. 13 poche : la protéine Rb, le produit du gène de susceptibilité au rétinoblastome, et deux protéines apparentées à Rb : p107 et p130 (Mulligan & Jacks, 1998). III.1.1.1 Phosphorylation de Rb par les complexes cycline/cdk Le passage de la phase G1 vers la phase S est contrôlé par les cyclines D (associées aux Cdk4 et Cdk6), la cycline E et la cycline A (associées à Cdk2). Une des cibles les plus étudiées pour les cyclines A ou E/Cdk2 pendant la transition G1/S est la protéine Rb. Dans sa forme hypophosphorylée, Rb régule négativement la progression du cycle cellulaire au niveau de la progression de la phase G1 vers la phase S. Rb hypophosphorylé agit au niveau transcriptionnel en interagissant et en modulant l’activité de nombreux facteurs de transcription (Kouzarides, 1995; Taya, 1997), réprimant ainsi l’expression des gènes requis pour l’entrée en phase S. Trois facteurs de transcription de la famille E2F (E2F1, E2F2 et E2F3) régulent notamment les gènes associés à la prolifération. Les facteurs E2F sont les cibles de Rb les plus étudiées pendant la phase G1 (Chellappan et al, 1991; Helin, 1998). Dans sa forme active (hypophosphorylée), Rb interagit avec E2F et réprime ainsi son activité. Au cours de la phase G1, la phosphorylation progressive et massive de Rb par les complexes cycline/Cdk, induit sa dissociation de E2F et ce qui permet l’entrée des cellules en phase S (Mittnacht, 1998). La protéine Rb reste ainsi hyperphosphorylée jusqu’à l’entrée en mitose, ce qui conduit à sa dégradation. Ainsi, la progression du cycle cellulaire est largement sous le contrôle de la régulation génique dépendante de Rb-E2F (figure 7). L’expression de la cycline D1 est induite par les facteurs de croissance tels que le FGF (fibroblast growth factor) et le TGF-β (tumor growth factor), et son niveau est maximal pendant la phase G1 (Sherr, 1994). La surexpression de la cycline D1 accélère la progression G1/S (Quelle et al, 1993) et inhibe la transactivation des gènes spécifiques du muscle en partie par la voie Rb/E2F (Guo & Walsh, 1997; Rao et al, 1994; Skapek et al, 1995). Des expériences de transdifférenciation musculaire de fibroblastes en culture cellulaire montrent que les cyclines A et E bloquent la différenciation. La présence d’une protéine Rb mutante non- phosphorylable abolit l’effet négatif des cyclines A et E sur la différenciation musculaire (Skapek et al, 1996). En revanche, l’expression de la cycline D1 réussit quand même à inhiber la différenciation musculaire même en présence de ce mutant de Rb. Ceci indique que l’activité des cyclines/cdk bloque la différenciation musculaire à la fois par un mécanisme dépendant de la phosphorylation de Rb, et par un second mécanisme indépendant de la phosphorylation de Rb (Skapek et al, 1996).
  • 33. Myoblastes (prolifération) ? Myotubes (différenciation) Figure 8. Modifications post-traductionelles de MyoD. Les cercles rouges entourant un «  P  » représentent un résidu phosphorylé, les cercles jaunes indiquant «  Ub  » représente un acide aminé ubiquitinylé et un cercle bleu indiquant « Ac » représente un résidu acétylé. Les modifications post-traductionnelles retrouvées dans les myoblastes en prolifération sont placées au dessus et celles apparaissant en condition de différenciation sont illustrées en bas. Figure adaptée d’après « Puri and Sartorelli, Journal of cellular physiology, 2000  ». Figure 9 : Expression de MyoD au cours du cycle cellulaire. Le niveau de MyoD augmente au cours de la phase G1 et atteint son niveau maximum en milieu de phase G1 au niveau d’un point de restriction noté « R ». En présence de signaux mitogènes, Cdk2 phosphoryle alors MyoD sur la sérine 200 ce qui entraîne sa dégradation. Le niveau de MyoD augmente à nouveau durant la phase G2. La phosphorylation de MyoD par CDK1 au niveau des sérines 5 et 200 entraîne sa dégradation avant l’entrée en mitose.
  • 34. 14 III.1.1.2 Modifications post-traductionnelles de MyoD conduisant à sa dégradation La protéine MyoD comporte plusieurs sites de modifications post-traductionnelles (figure 8). Ces modifications vont réguler l’activité de MyoD et/ou provoquer sa dégradation par le protéasome (Breitschopf et al, 1998; Floyd et al, 2001). Ainsi, MyoD est phosphorylé dans les myoblastes en prolifération et cette phosphorylation diminue lorsque les myoblastes se différencient en myotubes (Kitzmann et al, 1999). MyoD est phosphorylé sur la sérine 200 dans les myoblastes en prolifération et cette phosphorylation est induite par cdk1 ou cdk2 (Tintignac et al, 2000). La phosphorylation de MyoD sur la sérine 200 est impliquée dans la dégradation de MyoD, puisque les mutants de MyoD ayant une alanine 200 non- phosphorylable ont une demie-vie augmentée trois à quatre fois par rapport à la protéine sauvage (Song et al, 1998). La phosphorylation de MyoD par le complexe cycline E/cdk2 est impliquée dans sa dégradation dépendante de l’ubiquitine pendant la phase G1-S (Tintignac et al, 2000). Parce que la cycline D1 est essentielle pour l’induction de la cycline E (Nurse, 1994; Sherr, 1994), le rôle du complexe cycline E/cdk2 dans la phosphorylation de MyoD et sa dégradation consécutive, fournit une explication supplémentaire pour le rôle inhibiteur de la cycline D1 dans la myogenèse. En particulier, la surexpression de la cycline D1 induit l’accumulation de Cdk4 dans le noyau, qui se lie alors à l’extrémité N-terminale de MyoD et empêche sa liaison à l’ADN (Zhang et al, 1999a). Finalement, MyoD atteint son plus haut niveau d’expression en début de phase G1, et si les stimuli extérieurs sont favorables, c’est pendant cette fenêtre de temps que les myoblastes sortent du cycle cellulaire pour s’engager dans le processus de différenciation terminale, sinon, MyoD est dégradé. Le point du cycle matérialisant le moment auquel se fait le choix entre la sortie et la poursuite du cycle cellulaire est nommé point de restriction. Après la phase S, le niveau de MyoD commence à augmenter à nouveau (figure 9). Cependant, à l’enclenchement de la mitose, MyoD est à nouveau phosphorylé sur les sérines 5 et 200 par les complexes cycline/cdk, puis ubiquitinylé et dégradé (pour revue voir (Kitzmann & Fernandez, 2001)). III.1.2 Les protéines bHLH inhibitrices séquestrent MyoD et ses co-facteurs L’activité de MyoD et celle de ses co-facteurs, les protéines E et les facteurs MEF2, sont hautement régulées par des interations protéine-protéine. Toutes les protéines à domaine HLH ne possèdent pas de propriétés activatrices, au contraire, la plupart fonctionnent comme des régulateurs négatifs de la transcription. Un cas bien illustré est celui des protéines Id, qui possèdent un motif HLH mais pas de domaine basique. Id est donc capable de former des hétérodimères avec les protéines bHLH, mais empêche leur liaison à l’ADN (Benezra et al, 1990a; Benezra et al, 1990b). Id se lie à MyoD, et plus préférentiellement aux protéines E
  • 35. Figure 10. MyoD participe au remodelage de la chromatine sur ses gènes cibles. Sur les gènes spécifiques du muscle, la chromatine et les protéines interagissant au niveau de la chromatine sont dans un état réprimé dans les myoblastes en prolifération. MyoD, Mef2 et YY1 recrutent des complexes co-répresseurs contenant des histones désacétylases (HDACs) et des histones méthylases (par exemple Ezh2), qui empêchent l’hyperacétylation et induisent la di- ou tri-méthylation de résidus lysine spécifiques (comme K27 et K9) pour donner une conformation répressive à la chromatine au niveau des gènes spécifiques du muscle. La voie CaMK activée pendant la différenciation et les niveaux de Rb hypophosphorylé (suite à la baisse des signaux mitogènes) déplacent les HDACs de la chromatine et permettent l’hyperacétylation des histones par les acétyltransférases. Figure adaptée de Forcales and Puri, Cell and Developmental Biology, 2005. YY1 Ezh2 Rb HDAC classe I Rb Histone méthyl- transférases Mef2 MyoD HDAC classe 2 CaMK PP Pol II Enhancer /Promoteur musculaire HDAC classe I cytoplasme K27 Me Me Me K9 Me Me Boîte Mef2 Boîte E
  • 36. 15 (Benezra et al, 1990a), empêchant ainsi la formation d’un dimère actif MyoD-protéine E (Jen et al, 1992). À l’enclenchement de la différenciation musculaire, la localisation de Id devient cytoplasmique et il ne peut plus interagir avec MyoD. De plus, alors que son taux de dégradation par le protéasome reste inchangé, les niveaux d’ARNm et protéique de Id sont diminués lorsque les signaux mitogènes sont diminués et pendant la myogenèse (Norton et al, 1998; Sun et al, 2005; Trausch-Azar et al, 2004). Une autre classe d’inhibiteurs à domaine HLH sont les protéines HES qui répriment l’activité transcriptionnelle via leur liaison à une boîte N (apparentée aux boîtes E) sur l’ADN (Sasai et al, 1992). De la même manière, la protéine bHLH Twist altère l’activité de MyoD en bloquant sa liaison à l’ADN, à la fois en titrant les protéines E, mais aussi en interagissant directement avec Mef2 (Hamamori et al, 1997; Spicer et al, 1996). D’autres protéines bHLH qui régulent négativement l’activité de MyoD et bloquent la différenciation musculaire, sont les protéines MyoR et Mist1. Ces facteurs contiennent des régions basiques et forment des dimères avec les MRFs. MRF/MyoR et MRF/Mist1 sont des hétérodimères inactifs, capables de se fixer sur les boîtes E, mais sans activer la transcription (Lemercier et al, 1998; Lu et al, 1999). La protéine bHLH Mist1 peut aussi occuper les boîtes E en formant un homodimère Mist1- Mist1 (Lemercier et al, 1998). Enfin, il a été démontré qu’une autre bHLH, Dermo-1, est capable d’inhiber l’activité transactivatrice de MyoD d’une manière plus efficace que Id (Gong & Li, 2002). Contrairement à l’inhibition liée à Id qui peut être levée par compétition en co-transfectant la protéine E12, l’inhibition par Dermo-1 n’est apparemment pas ou peu dépendante de E12. Dermo-1 induit la répression de la transcription des gènes cibles de MyoD par son interaction directe avec la protéine Mef2C, mettant en jeu ses domaines N- et C-terminaux (Gong & Li, 2002). III.1.4 Dans les myoblastes en prolifération, MyoD contribue à la répression épigénétique de ses gènes cibles Si MyoD est titré hors de l’ADN et ses cofacteurs séquestrés ou dégradés, une fraction de MyoD est malgré tout retrouvée sur la chromatine. Dans ce cas, MyoD est associé à la répression de ses gènes cibles car il interagit avec différents facteurs de modification ou de remodelage de la chromatine (figure 10), agissant ainsi au niveau épigénétique. En effet, de nombreuses études ont permis d’établir une relation entre la structure chromatinienne et la régulation de la transcription. L’induction de la transcription s’accompagne d’une altération de la structure des nucléosomes positionnés sur les séquences régulatrices. La structure de la chromatine est affectée par différents complexes de remodelage, dont les complexes dépendants de l’ATP et les complexes d’acétylation ou de désacétylation des histones. Les
  • 37. 16 histones peuvent subir de multiples modifications post-traductionnelles comme la phosphorylation, la méthylation, l’ubiquitinylation et l’acétylation. Ces modifications interviennent essentiellement au niveau des queues N-terminales, qui sont à l’extérieur du nucléosome. Elles constituent autant de signaux de reconnaissance pour des facteurs impliqués dans les processus de transcription, de réparation, de condensation des chromosomes, de dégradation. En 2000, Strahl et Allis font ainsi référence à « code des histones », dans lequel chaque modification aurait son propre rôle dans l’activation de la transcription, mais également un effet combinatoire avec les autres modifications (Strahl & Allis, 2000). III.1.4.1 Les histones désacétylases Les histones désacétylases régulent négativement l’expression des gènes spécifiques du muscle via leur interaction avec les protéines MyoD et Mef2. De ce fait, dans les myoblastes en prolifération, MyoD est associé à la répression de ses propres gènes cibles. En effet, les histones désacetylases (HDACs) de classes I et II sont exprimées dans les myoblastes, fournissant un autre fragment d’explication pour l’incapacité de MyoD et Mef2 à activer leurs gènes cibles avant leur entrée en différenciation. Dans les myoblastes en prolifération, MyoD est en fait associé aux HDACs de classe I, via son domaine bHLH. Cette interaction réprime l’activité transcriptionelle de MyoD à deux niveaux : (i) en désacétylant MyoD lui-même, (ii) en désacétylant les histones sur ses promoteurs cibles. Par exemple, HDAC1 s’associe avec MyoD et est capable de le désacétyler in vitro (Mal et al, 2001). De plus, MyoD est trouvé complexé à HDAC1 dans les myoblastes en prolifération, mais pas dans les myotubes en différenciation (Mal et al, 2001). Le recrutement de HDAC1 sur les gènes cibles de MyoD se fait probablement par le co-répresseur N-CoR/SMRT, qui interagit directement avec MyoD et qui est connu pour recruter HDAC1 sur l’ADN. L’histone désacétylase de classe II, Sir2, une HDAC dépendante du NAD+, inhibe également la myogenèse en formant un complexe avec l’histone acétyltransférase PCAF (p300/CBP associated factor) et MyoD, et lorsque Sir2 est surexprimée, elle retarde la différenciation musculaire. Inversement, la diminution de Sir2 accélère la différenciation musculaire (Fulco et al, 2003). L’activité de Mef2 est elle aussi réprimée par son association avec les HDACs de classe II (telles que les HDACs 4 et 5), provoquant la désacétylation et la répression des gènes contenant les sites de fixation de Mef2 (Lu et al, 2000). HDAC7 inhibe également spécifiquement Mef2 (-A, -C, -D) et n’affecte pas MyoD et la myogénine (Dressel et al, 2001). Les HDACs de classe II n’interagissent pas directement avec MyoD, mais répriment
  • 38. 17 l’expression de ses gènes cibles lorsqu’ils contiennent un site Mef2 en supplément de la boîte E, en s’associant aux facteurs Mef2 (Lu et al, 2000). III.1.4.2 Les histones méthyl-transférases Il a été montré que le recrutement de complexes HDACs pour désacétyler les histones sur les promoteurs du muscle avant la différenciation, contribue à la méthylation de l’histone H3 sur sa lysine 9 (H3K9) par des histones méthyl-transférases (HMTs), sur ces mêmes promoteurs (Zhang et al, 2002). À ce propos, Mal et Harter montrent que dans les myoblastes en prolifération, MyoD est associé à HDAC1 sur le promoteur de la myogénine et que ce promoteur présente alors une désacétylation ainsi qu’une méthylation de l’histone H3 sur la lysine 9 (H3K9), ce qui correspond à des marques épigénétiques répressives (Mal & Harter, 2003). Par ailleurs, l’histone méthyltransférase Suv39h, qui méthyle H3K9, interagit avec MyoD dans les cellules en prolifération et ce complexe est détecté sur le promoteur de la myogénine qui est un gène cible de MyoD réprimé en prolifération. La présence de Suv39h1 sur ce promoteur est corrélée à la méthylation de H3K9 (Mal, 2006). La méthylation de H3K9 est une marque épigénétique reconnue par la protéine de l’hétérochromatine HP1, qui va contribuer à former une structure hétérochromatinienne compacte non-permissive à la transcription. J’ai d’ailleurs participé à une étude montrant que la protéine HP1 est impliquée dans la répression de la différenciation musculaire et qu’elle interagit directement avec MyoD (Yahi et al, 2008) (Annexe 3). D’autres méthyltransférases d’histones régulent négativement la différenciation musculaire. Notamment Ezh2, une protéine polycomb avec une activité spécifique de méthylation de H3K27, est recrutée spécifiquement sur les gènes spécifiques du muscle dans les myoblastes en prolifération (Caretti et al, 2004). Ezh2 est retrouvée dans un complexe protéique contenant HDAC1. Les promoteurs du muscle sont hyperméthylés sur H3K27 et donc réprimés. L’enclenchement de la différenciation est couplé à la disparition de ce complexe sur ces mêmes loci. H3K27 devient donc hypométhylé et MyoD et Mef2 sont recrutés, permettant la transcription de leurs gènes cibles. La diminution de Ezh2 est corrélée avec une activation de l’expression des gènes du muscle et sa surexpression inhibe la différenciation musculaire (Caretti et al, 2004).
  • 39. Figure 11. Dualité entre les régulateurs du cycle cellulaire et l’engagement dans la voie de différenciation terminale. MyoD et Myf5 sont exprimés dans les myoblastes en prolifération, où leur activité est inhibée par les complexes Cdk4/Cycline D. Les complexes cycline/Cdk sont activés par les signaux mitogènes. En absence de facteurs de croissance, MyoD induit l’expression de p21 et de Rb ce qui résulte en l’arrêt du cycle cellulaire. Notamment, p21 inhibe les complexes cycline/Cdk, qui ne peuvent alors plus phosphoryler Rb. En effet, en condition de prolifération cellulaire, Rb est normalement hyperphosphorylé par les complexes cycline/cdks, ce qui rend la protéine Rb inactive et l’empêche de s’associer avec le facteur E2F. E2F est donc libre d’aller transcrire les gènes nécessaire à la prolifération cellulaire. En absence de signaux mitogènes, Rb hypophosphorylé séquestre E2F et contribue à l’arrêt du cycle cellulaire. La myogénine est activée dans les myoblastes ayant arrêté de proliférer et c’est un élément intermédiaire important dans la différenciation terminale des myoblastes. Figure adaptée d’après Molkentin and Olson, Current Opinion in Genetics and Development, 1996). MyoD/Myf5 Myogénine p21 Arrêt de la prolifération Différenciation musculaire Rb-E2F cyclineD/Cdk4 E2F Prolifération Rb- P inactif Facteurs de croissance
  • 40. 18 III.2 MyoD orchestre la différenciation musculaire terminale III.2.1 MyoD promeut la sortie du cycle cellulaire en stimulant l’expression de Rb, p21 et la cycline D3 Un point de contrôle de l’entrée en différenciation a été mis en évidence (Puri et al, 2002). Ce point de contrôle semble permettre aux myoblastes d’interrompre leur prolifération, notamment lors d’un traitement des cellules par des agents génotoxiques. MyoD coopère avec les régulateurs du cycle cellulaire, notamment les complexes cycline/cdk, les CKIs et Rb, dans la voie de signalisation qui mène à l’arrêt du cycle en phase G1 et l’engagement dans la voie de différenciation (Guo et al, 1995; Halevy et al, 1995; Novitch et al, 1996; Parker et al, 1995; Schneider et al, 1994) et pour revue voir (De Falco et al, 2006) (figure 11). III.2.1.1 Régulation des complexes cycline/cdk Globalement, l’expression et l’activité des régulateurs positifs du cycle cellulaire sont diminuées pendant la différenciation terminale. Si l’expression de cdk4 et cdk2 reste inchangée pendant la différenciation musculaire squelettique, celle de cdk1, des cyclines D, E et A décline. Cependant, une catégorie de cycline et Cdk échappe à cette règle, les cyclines T et Cdk9 sont augmentées dans les myotubes en différenciation et aideraient même MyoD à activer ses gènes cibles (Giacinti et al, 2006; Simone & Giordano, 2001; Simone et al, 2002b). Dans les myoblastes, la protéine Rb interagirait également avec cycline T2/cdk9 (Simone et al, 2002a). La cycline D3 est également une cycline dont l’expression est augmentée au cours de la différenciation musculaire (Kiess et al, 1995; Rao & Kohtz, 1995). MyoD stimule lui- même l’expression de la cycline D3, par un mécanisme qui requiert l’acétyltransférase p300 (Cenciarelli et al, 1999). La cycline D3 contribue à la sortie du cycle cellulaire et elle est associée à cdk4 et Rb dans les myotubes différenciés (Cenciarelli et al, 1999). III.2.1.2 Régulation des CKIs L’expression des inhibiteurs de cdks (CKIs), en particulier p21 (Guo et al, 1995; Halevy et al, 1995; Parker et al, 1995; Skapek et al, 1995), mais également p27 (Zabludoff et al, 1998) et p18 (Franklin & Xiong, 1996), est renforcée pendant la myogenèse embryonnaire et pendant la différenciation myogénique de myoblastes en culture. Dans les myoblastes, la majorité des CKIs sont capables d’améliorer la capacité de transactivation de MyoD. L’augmentation des CKIs à l’enclenchement du processus de différenciation terminale, explique la diminution drastique de l’activité des complexes cycline/cdk au cours de la différenciation. Par exemple, le complexe cdk2/ cycline E est inhibé par p57 (Reynaud et al, 2000). La sortie du cycle cellulaire est essentiellement contrôlée par l’expression de deux inhibiteurs de cdk, p21 et p57
  • 41. 19 (Zhang et al, 1999b). MyoD induit directement l’expression de p21 au cours de la myogenèse (Guo et al, 1995; Halevy et al, 1995; Parker et al, 1995). L’importance du rôle joué par p21 dans la sortie du cycle prolifératif est illustrée par le fait que l’expression forcée de p21 dans les myoblastes est suffisante pour enclencher le programme de différenciation terminale, même en présence de facteurs de croissance (Guo et al, 1995). L’expression de p21 et p57 est indispensable à la différenciation musculaire comme le montre la double inactivation génique p57:p21, qui donne le même phénotype que les souris inactivées pour la myogénine (Zhang et al, 1999b). III.2.1.3 Régulation de Rb En plus de réguler l’expression de la cycline D3 et p21, MyoD active directement l’expression de Rb. Le mécanisme par lequel MyoD active Rb est distinct de sa fonction myogénique (Martelli et al, 1994). L’activation de l’expression de Rb passe par le recrutement du facteur de transcription CREB (cAMP-responsive element binding protein) qui reconnaît un site CRE sur le promoteur du gène codant pour Rb. De manière intéressante, les auteurs montrent que MyoD s’associe à CREB dans un complexe comprenant également les protéines à activité acétyl-transférase, p300 et PCAF. Cependant les auteurs montrent que l’acivité acétyl- transférase de p300 n’est pas requise pour augmenter l’activité transcriptionnelle de MyoD, en revanche celle de PCAF est indispensable. Les auteurs notent également que MyoD se fixe sur le promoteur de Rb uniquement en présence de CREB (Magenta et al, 2003). À l’enclenchement de la différenciation terminale, la baisse massive des régulateurs du cycle permet à la protéine Rb de rester dans une forme hypophosphorylée. Rb hypophosphorylé peut alors interagir directement avec le domaine d’activation des facteurs E2Fs, les empêchant ainsi d’agir pour stimuler la progression vers la phase S. Par ailleurs, le facteur E2F voit également son expression diminuer et les myocytes surexprimant E2F1 n’arrivent pas à sortir du cycle cellulaire, même dans des conditions favorables à la différenciation (Wang et al, 1995). De plus, l’interaction de la protéine Rb dans sa forme hypophosphorylée avec MyoD et les autres bHLH myogéniques est nécessaire à la différenciation musculaire. Rb coopère notamment avec MyoD pour stimuler l’activité transcriptionnelle de Mef2 dans les myoblastes en différenciation (Novitch et al, 1999). Rb va subir des modifications post- traductionnelles comme sa phosphorylation par la cycline T2/Cdk9, mais aussi une acétylation par p300 et PCAF sur sa région N-terminale. Ces modifications sont indispensables pour la sortie du cycle cellulaire et l’induction de la transcription des gènes spécifiques du muscle (Chan et al, 2001; Nguyen et al, 2004). Notamment, Rb va stimuler
  • 42. 20 l’expression de gènes tardifs de la différenciation comme MCK et MHC, en augmentant significativement l’activité transcriptionnelle de MyoD (Gu et al, 1993). III.2.2 MyoD interagit avec des facteurs régulant de manière positive sa fixation à l’ADN La protéine musculaire LIM interagit avec le dimère E12-MRF, augmente son activité de liaison à l’ADN et stimule la myogenèse (Arber et al, 1994). Des expériences ont montré que son inhibition dans les myoblastes empêche leur différenciation terminale, alors que sa surexpression favorise ce processus (Kong et al, 1997). La protéine Pbx est une homéoprotéine exprimée de manière ubiquitaire et qui peut se fixer de manière constitutive à certains promoteurs. En particulier, Pbx1 peut se fixer sur le promoteur de la myogénine avant la fixation de MyoD, alors même que la structure de la chromatine est défavorable à la transcription. Par ailleurs, MyoD forme un complexe avec Pbx1 sur ce même promoteur, suggérant que Pbx1 pourrait aider à la fixation de MyoD sur son gène cible (Berkes et al, 2004). MyoD peut être phosphorylé par d’autres kinases que les Cdks et notamment par la kinase Mos. L’inhibition de Mos dans les myoblastes diminue leur potentiel de différenciation alors que sa surexpression augmente l’activité de MyoD. Ceci montre que Mos est un régulateur positif de la différenciation musculaire. Mos phosphoryle MyoD directement sur la sérine 237 et favorise ainsi la dimérisation de MyoD avec la protéine E12 (Aurade et al, 1994; Lenormand et al, 1997; Solhonne et al, 1999). III.2.3 Plusieurs voies de signalisation régulent positivement la différenciation musculaire III.2.2.1 La voie Jak/STAT La protéine STAT3 est un facteur de transcription activé par la kinase Janus (Jak) en réponse à des stimuli extracellulaires tels que certains facteurs de croissance. Sa phosphorylation par Jak2 permet l’homodimérisation et la relocalisation de STAT3 dans le noyau, où STAT3 se fixe sur ses gènes cibles. Deux études montrent clairement que l’expression de STAT3 est augmentée au cours de la différenciation musculaire et que la diminution de STAT3 par ARN-interférence inhibe la différenciation. De plus, les auteurs montrent que MyoD et STAT3 interagissent et proposent un rôle positif pour STAT3 au cours de la différenciation musculaire (Wang et al, 2008; Yang et al, 2009a).
  • 43. Figure 12. MyoD participe au remodelage de la chromatine sur ses gènes cibles. Les signaux induits par la différenciation aboutissant au déplacement de YY1 et des méthyltransférases, ainsi que la déméthylation des résidus lysine des histones ne sont pas bien connus. Après, (ou au même moment) que le déplacement des complexes corépresseurs et des marques épigénétiques de la chromatine, l’assemblage du transcriptosome myogénique induit le recrutement de plusieurs complexes dotés de différentes activités enzymatiques (comme les acétyltransférases, les complexes de remodelage dépendants de l’ATP ou les arginine méthyltransférases). La kinases p38 activée pendant la différenciation régule plusieurs étapes de l’assemblement du transcriptosome, en ciblant et en phosphorylant les facteurs de transcriptions (Mef2), les partenaires d’hétérodimérisation des MRFs (E47) et les composants du complexe SWI/SNF (BAF60). p38 peut également réguler la stabilité de l’ARN naissant. Le recrutement d’acétyltransférases sur les régions régulatrices des gènes du muscle n’est apparemment pas dépendant de la voie p38 et est probablement régulé par une cascade parallèle activée pendant la différenciation. Chacun des composants recrutés dans le transcriptosome myogénique est essentiel pour conférer la capacité à activer la transcription. Figure adaptée de Forcales and Puri, Cell and Developmental Biology, 2005. Enhancer /Promoteur musculaire R Me R Me p300 GRIP1 Mef2 MyoDE12/47 P P P/CAF SWI/SNF Brg1 Brm P CARM1 Acétylation Remodelage de la chromatine p38 ARNm Pol II Boîte Mef2 Boîte E
  • 44. 21 III.2.2.2 La voie p38 MAPK La kinase p38 a un rôle particulièrement important dans l’expression des gènes spécifiques du muscle, et le mécanisme par lequel p38 affecte les voies de régulation des gènes musculaires a été abondamment décrit. L’activité de la kinase p38 augmente progressivement au fur et à mesure du processus de différenciation et son activité est surtout nécessaire pour la différenciation terminale (Wu et al, 2000). p38 est responsable de la phosphorylation du domaine de transactivation de Mef2 (Cox et al, 2003; Zetser et al, 1999; Zhao et al, 1999). L’inhibition de p38 atténue le potentiel d’activation de Mef2 et inversement l’expression d’un mutant de p38 actif constitutivement promeut la différenciation musculaire (Puri et al, 2000; Wu et al, 2000; Zhao et al, 1999). La kinase p38 jouerait également un rôle dans le recrutement du complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF sur les gènes cibles de MyoD (Simone et al, 2004) et dans la phosphorylation des histones, comme cela a été montré sur certains gènes précoces de la différenciation musculaire (Clayton et al, 2000; Thomson et al, 1999). Notamment, la voie p38 MAPK, de concert avec deux autres voies de signalisation, agirait pour stimuler la liaison de MyoD, Mef2 et des protéines Six sur le promoteur proximal de la myogénine pour activer son expression (Xu et al, 2002). III.2.3 MyoD recrute des enzymes de remodelage de la chromatine sur ses gènes cibles Principalement deux classes de co-activateurs coopèrent avec les facteurs de transcription pour permettre l’expression spécifique des gènes : les protéines modifiant les histones (telles que les acétyltransférases ou les méthyltransférases) et les facteurs de remodelage de la chromatine dépendants de l’ATP (tels que les protéines de la famille SWI/SNF) (figure 12). III.2.3.1 Les histones acétyl-transférases Les histone-acétyltransférases (HATs) fonctionnent en transférant des groupements acétyl de l’acétyl-coA sur les résidus lysine des protéines histones, ainsi que des protéines non-histones. L’acétylation des histones provoque le transfert des histones H2A/H2B de l’ADN vers des protéines chaperonnes (Ito et al, 2000), augmentant ainsi l’accessibilité des facteurs de transcription à l’ADN. Les HATs et les HDACs interagissent toutes deux avec MyoD et ont des activités opposées qui sont critiques pour faire basculer MyoD d’un état répresseur à un état activateur sur certains loci. Par exemple, la protéine Rb peut déplacer HDAC1 de MyoD (Puri et al, 2001), laissant MyoD libre d’activer la transcription. D’ailleurs, la libération de MyoD de HDAC1 est un préalable à l’association de MyoD avec la HAT PCAF (Mal et al, 2001). Une régulation de la transition des interactions HATs et HDACs est également contrôlée pour Mef2. Le complexe
  • 45. 22 Mef2/HDAC de classe II est sensible à la kinase CamK dépendante du calcium, qui médie l’effet stimulant de IGF1 (insulin-like growth factor 1) sur la différenciation musculaire. CamK phosphoryle HDAC5 sur deux résidus sérine, ce qui stimule sa liaison à la protéine chaperonne 14-3-3. L’interaction de HDAC5 avec la protéine 14-3-3 provoque l’exposition d’un signal d’export nucléaire de HDAC5 et sa sortie du noyau (McKinsey et al, 2000; McKinsey et al, 2001). Les coactivateurs transcriptionnels tels que p300, c-AMP response element-binding protein (CREB)- binding protein (CBP) et p300/CBP-associated factor (PCAF) possèdent une activité acétyl- transférase sur les lysines. L’activité acétyl-transférase (AT) générale augmente au cours de la différenciation myogénique (Polesskaya et al, 2001b) et l’activité de MyoD est augmentée par l’acétylation de ses résidus lysines par CBP, p300 et PCAF in vitro (Duquet et al, 2006; Polesskaya et al, 2000; Polesskaya & Harel-Bellan, 2001; Sartorelli et al, 1999). Il y a une association préférentielle entre MyoD acétylé (en comparaison avec MyoD non-acétylé ou non-acétylable) et le bromodomaine de CBP et p300 (Polesskaya et al, 2001a). Dans la même étude, les auteurs montrent avec un système rapporteur que l’acétylation de MyoD augmente significativement sa capacité à activer la transcription. Une étude très récente montre que l’acétylation de la lysine 99 de MyoD est indispensable pour son interaction avec le bromodomaine de CBP et que la double acétylation des lysines 99 et 102 est requise pour l’interaction de MyoD avec p300 (Wei et al, 2008). De nombreux groupes qui ont étudié le rôle de CBP et p300 dans la différenciation musculaire n’ont pas toujours discriminé la présence de CBP et p300 dans les complexes HATs où est retrouvé MyoD. Cependant, puisque le motif de reconnaissance de CBP et p300 se situe au niveau de la lysine 99, ceci génère certainement un encombrement stérique prévenant la formation d’un complexe contenant à la fois CBP et p300. Il est donc fort à parier que les complexes HAT dans lesquels MyoD est retrouvé pour activer le programme myogénique contiennent soit p300, soit CBP selon les gènes cibles de MyoD à activer. Bien que p300 ait été identifié comme un coactivateur de MyoD et accroisse l’activité transcriptionnelle de ce dernier (Sartorelli et al, 1997; Yuan et al, 1996), l’activité AT de p300 est dispensable pour l’activation des gènes cibles précoces de MyoD (Polesskaya et al, 2001b; Puri et al, 1997). La protéine p300 agirait comme un pont moléculaire et permettrait le recrutement de PCAF. Dans les myotubes différenciés, MyoD est en effet complexé avec p300 (ou CBP) et PCAF. Ce complexe trimérique est capable de se lier à une boîte E in vitro, suggérant que MyoD recrute p300 (ou CBP) et PCAF sur les promoteurs spécifiques du muscle (Puri et al, 1997). Le démantèlement de ce complexe en neutralisant PCAF inhibe la
  • 46. 23 différenciation musculaire, indiquant que le recrutement de PCAF par MyoD, via p300/CBP, est indispensable pour l’activation du programme myogénique. D’après une étude utilisant un système rapporteur, il est proposé que l’acétylation des histones soit effectué par p300 et que l’acétylation de MyoD soit effectué par PCAF (Dilworth et al, 2004). La liaison de MyoD à certains promoteurs spécifiques est concomitante avec l’acétylation des histones (Bergstrom et al, 2002). Cette acétylation favoriserait le recrutement du complexe de remodelage SWI/SNF sur ces gènes cibles (de la Serna et al, 2005). III.2.3.2 Les histones méthyl-transférases L’arginine méthyl-transférase CARM1 a été impliquée positivement dans la myogenèse. CARM1 (également appelée PRMT4) est un membre de la famille des PRMT (protein-arginine N-methyltransferase) et catalyse la méthylation des résidus arginine sur une large série de substrats. Par exemple, CARM1 peut méthyler l’histone H3 in vitro et est impliquée dans la différenciation de différents types cellulaires. CARM1 stimule la myogenèse en étant associée directement avec GRIP1 (le coactivateur du récepteur aux stéroïdes) et Mef2C dans un complexe (Chen et al, 2002). De plus, Mef2 et CARM1 sont recrutés sur le promoteur de MCK en condition de différenciation et l’inhibition de CARM1 inhibe la différenciation musculaire en abolissant l’expression de facteurs de transcription clés de la différenciation terminale, tels que Mef2 et la myogénine (Chen et al, 2002). Paradoxalement, CARM1 a également été montré comme modifiant les arginines des histones H3R17 et H3R26 de la région promotrice de la cycline E1, stimulant l’expression de la cycline E1 et de ce fait stimulant la prolifération dans ces cellules (El Messaoudi et al, 2006). Cette étude n’a pas été réalisée dans des cellules musculaires et la stimulation de l’expression de la cycline E1 reste à montrer dans les myoblastes. Par ailleurs, il n’est pas exclu que CARM1 ait un double rôle, mais que son rôle prédominant dans les myoblastes soit de stimuler la différenciation terminale. Une autre protéine de la même famille, PRMT5, a également été montrée comme stimulant la myogenèse. En effet, l’arginine diméthylée en position 8 de l’histone H3 (H3R8) et PRMT5 sont retrouvées au cours de la différenciation sur un promoteur cible de MyoD activé précocement : le promoteur de la myogénine (Dacwag et al, 2007). Les auteurs montrent que PRMT5 est nécessaire pour la diméthylation de H3R8 et la diminution de PRMT5 prévient la fixation de Brg1, la sous-unités ATPasique du complexe SWI/SNF et de MyoD lui-même. III.2.3.3 Le complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF Les membres de la famille du complexe de remodelage de la chromatine SWI/SNF jouent des rôles critiques dans le contrôle de la transcription. Les protéines SWI/SNF sont les
  • 47. 24 composants d’un complexe multimérique qui modifie la structure de la chromatine en altérant les contacts entre ADN et histones au sein d’un nucléosome, d’une manière dépendante de l’ATP (pour revue voir (Martens & Winston, 2003) et (Racki & Narlikar, 2008)). La sous- unité ATPasique, Brm ou Brg1, du complexe SWI/SNF possède un motif appelé bromodomaine, qui est capable de lier les résidus lysine acétylés dans la queue N-terminale des histones in vitro. Plusieurs travaux ont mis en évidence un rôle essentiel de SWI/SNF dans la transactivation des promoteurs musculaires médiée par MyoD. Il a tout d’abord été montré que la conversion myogénique de fibroblastes par MyoD est inhibée par la surexpression d’un mutant dominant négatif de Brm ou de Brg1 et au plan moléculaire, cela se traduit par l’inhibition de la transcription de certains gènes cibles de MyoD, comme par exemple la myogénine et MHC (de la Serna et al, 2001a). Par ailleurs, une autre étude montre que la fixation du complexe SWI/SNF sur le promoteur de la myogénine nécessite la présence de MyoD (de la Serna et al, 2005). De manière intéressante, une étude complémentaire montre que les gènes cibles de MyoD impliqués dans la sortie du cycle cellulaire (p21, Rb, Cycline D3) ne sont pas affectés par les mutants de Brm ou de Brg1 ; SWI/SNF interviendrait donc au niveau de l’étape de différenciation elle-même, mais pas dans la sortie du cycle cellulaire (de la Serna et al, 2001b). Les sous-unités ATPasiques, Brm et Brg1, sont nécessaires pour la myogenèse dans les cellules exprimant MyoD (de la Serna et al, 2001a; Roy et al, 2002). MyoD et Mef2 recruteraient le complexe SWI/SNF sur les gènes spécifiques du muscle pour activer leur transcription pendant la différenciation musculaire. MyoD co-précipite ainsi avec p300, PCAF et Brg1 dans l’extrait nucléaire de myoblastes en différenciation (Simone et al, 2004) et ces protéines sont retrouvées (de pair avec MyoD) sur les promoteurs de la myogénine et de MCK. Une étude intéressante par Giacinti et ses collègues montre une relation entre le complexe cdk9/cyclin T2 qui, de concert avec p300 et PCAF et le complexe de remodelage SWI/SNF, est recruté par MyoD sur les promoteurs et les enhancers des gènes spécifiques du muscle. Ce recrutement aboutit au final à l’acétylation des queues N-terminales des histones, au remodelage de la chromatine et à la phosphorylation de l’ARN polymérase II sur ces sites, permettant l’activation de la transcription des gènes cibles de MyoD (Giacinti et al, 2006). Récemment et pour la première fois, SRA (steroid receptor RNA activator), un ARN non-codant, a été montré associé à MyoD et à deux protéines ARN hélicases, p68 et p72. Comme le suggèrent leurs expériences d’immunoprécipitation de la chromatine, cette association serait retrouvée sur certains loci. De plus, in vitro les auteurs montrent que la présence concomitante
  • 48. Figure 13. Réponse des cellules satellites suite à une lésion ou un traumatisme. En réponse à une lésion, les cellules satellites sont activées et prolifèrent (a). Une partie des cellules satellites réapprovisionnent le stock de cellules satellites quiescentes présentes sur la myofibre grâce à un processus d’auto-renouvellement. Les cellules satellites vont migrer au niveau de la région endommagée (b), et en fonction de la gravité de la lésion, vont fusionner à la fibre existante (c) ou vont s’aligner et fusionner entre elles pour produire une nouvelle fibre musculaire (d). Dans la myofibre régénérée, les noyaux des cellules qui viennent de fusionner sont initialement centraux (e), mais migreront plus tard vers la périphérie de la myofibre. Figure adaptée de Hawke and Garry, Journal of Applied Physiology, 2001. a. Activation et prolifération des cellules satellites b. Attraction par chimiotactisme des cellules satellites vers la fibre endommagée c. Fusion avec la fibre endommagée (hypertrophie) d. Alignement et fusion pour produire une nouvelle myofibrille (hyperplasie) e. Myofibrille régénérée avec un noyau central
  • 49. 25 de p68, p72 et SRA augmente significativement l’activité de MyoD dans un système rapporteur. Par ailleurs, la présence de p68 et p72 faciliterait le remodelage de la chromatine initié par Brg1 sur certains gènes cibles de MyoD (Caretti et al, 2006). IV. LE MAINTIEN DU MUSCLE ET SA REGENERATION DEPENDENT DE SON INNERVATION IV.1 Le maintien de muscle adulte par les cellules satellites Le muscle squelettique des mammifères est capable de réaliser une régénération massive et rapide en cas de dommage sévère. La régénération musculaire est caractérisée par une phase dégénérative et une phase régénérative (Lecker et al, 2004). Dans un premier temps, les sites lésés sont envahis par les cellules inflammatoires, notamment les neutrophiles et les macrophages. La dégénération est suivie par la régénération et la réparation du muscle. La phase de régénération est caractérisée par la prolifération des cellules myogéniques appelées cellules satellites, situées le long de chaque fibre musculaire. La prolifération de ces cellules permet de former un réservoir suffisant de cellules musculaires qui pourront alors fusionner et remplacer les fibres musculaires lésées. En absence de stimuli, les cellules satellites sont quiescentes et transcriptionnellement moins actives que les noyaux des myofibres. L’activation des cellules satellites n’est pas restreinte à la zone lésée. Un dommage causé à l’extrémité de la fibre musculaire peut activer les cellules satellites situées tout le long de la fibre, conduisant à une prolifération et à une migration des cellules satellites vers le site de régénération (Schultz et al, 1985). La particularité des cellules satellites est leur division asymétrique qui permet de restaurer la réserve de cellules satellites au tour de la fibre musculaire néo-formée. Après l’activation de leur prolifération, une partie des cellules satellites fusionne pour régénérer le muscle et une autre partie retourne à l’état de quiescence pour reconstituer la réserve de cellules satellites (Kuang et al, 2008) (figure 13). Les processus d’activation et de différenciation des cellules satellites pendant la régénération sont similaires à ceux observés durant la mise en place de la musculature embryonnaire. Les cellules satellites sont caractérisées par l’expression du facteur de transcription Pax7 (Kuang et al, 2006; Seale et al, 2000), et dans plusieurs muscles également Pax3 (Buckingham, 2007). D’ailleurs les souris dont le gène Pax7 est inactivé ne possèdent (pratiquement) pas de cellules satellites (Seale et al, 2000). Outre la mise en place des cellules satellites avant la naissance, Pax7 aurait lui-même un rôle au cours de la régénération musculaire. Les cellules