Cinétique enzymatique 2

1. En 1903, le français Victor Henri montre qu’une enzyme peut fixer un
ligand (tout ce qui se fixe sur une protéine est appelé ligand).
En 1913, Maud Menten introduit avec Leonor Michaelis un nouveau
concept qui révolutionne les études des réactions biologiques.
Notion de complexe enzyme-substrat
Complexe enzyme-substrat

2. milieu réactionnel
contenant à t=0 une
concentration de
substrat [S]0
Complexe enzyme-substrat

3. Molécules de
substrat
Complexe enzyme-substrat

4. ajout de
l’enzyme [E]T
on est au temps 0
[E]T pour [E]TOTALE
milieu réactionnel
contenant à t=0 une
concentration de
substrat [S]0
Complexe enzyme-substrat

5. Molécule
d’enzyme
Complexe enzyme-substrat

6. à t=0, la concentration en substrat est désignée [S]0
à t=0, la concentration en produit est égale à 0
la concentration en enzyme est désignée [E]T et reste
constante tout au long de la mesure
à t=0, la concentration du complexe enzyme-substrat, [ES],
est égale à 0
E + S E + P
ES
Complexe enzyme-substrat

7. Temps
Concentrations
[S]
[P]
[E]libre
[ES]
état pré-
stationnaire
état
stationnaire
état post-
stationnaire
[S]0
[E]libre
[P]
[ES]
Complexe enzyme-substrat
E + S E + P
ES

9. mesure d’une activité enzymatique
La concentration en enzyme doit rester constante au sein de tous les
essais.
Les paramètres physico-chimiques (température, force ionique et pH)
du milieu doivent rester stables pour tous les essais.
Sauf , le seul paramètre variable doit être la concentration en
substrat.
Phases de la réaction

10. concentration en substrat [S]
vitesse
initiale
(Vi)
Vmax
[E]T cste
Équation d’une
hyperbole
Phases de la réaction

11. E + S E + P
ES
k1
k-1
k2
vi = k2 [ES]
La vitesse d’apparition du produit P (vitesse de la
réaction catalysée par l’enzyme) dépend de k2 et de la
concentration en ES.
La [ES] dépend de sa vitesse de formation et de sa
vitesse de disparition.
vformation ES = k1 [E] [S]
vdisparition ES = k-1 [ES] + k2 [ES] = (k-1 + k2) [ES]
Équation de Michaelis-Menten

12. Temps
Concentrations
[S]
[P]
[E]libre
[ES]
état pré-
stationnaire
état
stationnaire
état post-
stationnaire
E + S E + P
ES
[S]
[P]
[E]libre
[ES]
d[ES]
dt
=0
Vi
Équation de Michaelis-Menten

13. (k-1 + k2) [ES] = k1 [E] [S]
vformation ES = vdisparition ES
Pendant l'état dit "stationnaire" ou en "vitesse initiale", les
vitesses de formation et de disparition de ES sont égales.
Si on réarrange l’expression mathématique :
[ES] =
k1 [E] [S]
(k-1 + k2)
ou
[ES] =
[E] [S]
(k-1 + k2)
k1
Équation de Michaelis-Menten

14. KM =
(k-1 + k2)
k1
On simplifie l’équation en définissant une nouvelle constante, KM,
appelée constante de Michaelis et Menten :
Si on réarrange l’expression mathématique :
[ES] =
[E] [S]
KM
Équation de Michaelis-Menten
[ES] =
[E] [S]
(k-1 + k2)
k1

15. la [S] est égale à celle de départ ([S]0), puisque la concentration en
substrat est très largement supérieure à celle en enzyme.
[ES] =
[E] [S]
KM
La concentration en enzyme libre [E] doit être égale à la concentration
totale en enzyme ([E]T) moins la concentration en enzyme lié ([ES]).
[E] = [E]T – [ES]
[ES] =
[E] [S]
KM
devient [ES] =
([E]T – [ES]) [S]
KM
Équation de Michaelis-Menten

16. [ES] =
([E]T – [ES]) [S]
KM
Si on développe
cela devient [ES] =
[E]T [S] – [ES] [S]
KM
[ES] + =
[E]T [S]
KM
[ES] [S]
KM
[ES] =
[S]
KM
[E]T
1 +
[S]
KM
[ES] ( 1 + ) =
[E]T [S]
KM
[S]
KM
Équation de Michaelis-Menten

17. [ES] =
[S]
KM
[E]T
1 +
[S]
KM
Or on sait que : Vi = k2 [ES]
Donc on peut écrire : Vi = k2
[S]
KM
[E]T
1 +
[S]
KM
On peut simplifier :
vi = k2
[S]
KM
[E]T
+
[S]
KM
KM
KM
= k2
[E]T
[S]
[S]
KM +
Équation de Michaelis-Menten

18. On sait que lorsque toutes les molécules d’enzyme sont saturées,
[ES] = [E]T et la vitesse de transformation du substrat en produit
est alors maximale :
Vmax = k2 [E]T
L’équation de Michaelis-Menten devient :
vi = Vmax
[S]
[S]
KM +
Vitesse
initiale
Équation de Michaelis-Menten
vi = k2
[E]T
[S]
[S]
KM +

19. vi = Vmax
[S]
[S]
KM +
Si vi = ½ Vmax
½ Vmax = Vmax
[S]
[S]
KM +
½ (KM + [S]) = [S]
½ KM = [S] - ½ [S]
½ KM = ½ [S]
KM = [S]
KM est inversement proportionnelle à l’affinité de l’enzyme. Plus
l’affinité est élevée, et moins il faudra de substrat pour que
l’enzyme fonctionne.
Constante de Michaelis-Menten
KM est la concentration en substrat
pour laquelle l’enzyme fonctionne à
la moitié de sa vitesse maximale

20. KM s’exprime en unité de concentration de substrat.
KM = [S] lorsque vi = ½ Vmax
mole/L
µmole/L
mg/L
g/L
etc…
Constante de Michaelis-Menten

Nomenclature :
M signifie Michaelis mais,
officiellement, il faudrait
écrire cette constante Km

21. Détermination de Km et Vmax:
Graphiquement on ne peut pas déterminer Km
et Vmax a partir de la courbe v= f [s]
On préfère placer les points expérimentaux sur
un diagramme ou ils s’alignent sur une droite.
Parmi les différentes transformation de
l’equation de michaelis réaliser dans ce but: la
représentation de lineweaver et burk (L.B)la
représentation en double inverse.
Consiste à porter les variation de 1/v en
fonction de 1/ [s]

24. Les enzymes sont des protéines constituées d’acides aminés pouvant
porter des fonctions chimiques sensibles aux variations de pH.
Ces fonctions chimiques peuvent se protonner ou se déprotonner
selon le pH du milieu dans lequel se trouve l’enzyme.
Effet du pH
pH
Vmax
Zone de pH
optimum
 effet du pH sur l’ionisation des groupes fonctionnels acides ou basiques des
substrats et/ou de l’enzyme
 effet sur liaison enzyme-substrat, structure de la protéine (pH extrême)
pH optimum, variable d'une enzyme à l'autre la plupart: 7 à 8
Extrêmes: pepsine (1,5) et phosphatase alcaline (10,5)

25. pepsine
2,2
créatine kinase
7,9
Effet du pH
pH
Vmax

26. Augmentation de la probabilité de rencontres entre enzyme et
substrat.
Augmentation de la vitesse de la phase de transformation du
substrat en produit .
A températures élevées : dénaturation thermique, souvent
irréversible.
Effet de la température
V
max
0 50
stabilité
activation
chimique
100

27. Unités de vitesse : système international
vi = 600 µmoles de P / min
Par convention, il a été décidé que chaque fois qu’une quantité
d’enzyme donnée produirait 1 µmole de produit par min cela
correspondrait à 1 U ou 1 UIE (unité internationale enzymatique).
Exemple
vi = 600 U = 600 UIE
correspond à
Unités utilisées

28. Unités de vitesse : système international
vi = 600 µmoles de P / min
Aujourd'hui, l'unité recommandée est le katal (kat). Elle correspond
à l’apparition d’une mole de produit par seconde (activité énorme
jamais retrouvée physiologiquement). On utilise donc des sous
multiples le mkat, le µkat, le nkat, etc…
Exemple
vi = 10 µmoles de P / sec
correspond à
donc à
vi = 10 µkat
Unités utilisées

29. Activité Spécifique (AS)=
Activité enzymatique (unité d’enzyme)(UI)
Quantité de protéine (mg)

30. 5.6. Inhibiteurs
• Molécule modifiant la réaction enzymatique en
influençant la liaison enzyme-substrat
• substances naturelles : modulation du métabolisme
– médicaments et agents toxiques
– outils expérimentaux (mécanisme enzymatique, voies métaboliques)
• Inhibition irréversible: souvent liaison covalente E-I stable
– diminution de la concentration de l’enzyme actif; ex l’aspirine inhibe
irréversiblement la prostaglandine synthétase .
• Inhibition réversible : liaison E-I non covalente
– inhibition compétitive
– inhibition non compétitive
– inhibition incompétitive

31. E + P
ES
k1
k-1
k2
E + S
Mécanisme général d'une inhibition enzymatique
I
EI + S
+
k1
k-1
ESI
I
+
Kiu
Kic

32. Inhibition compétitive
Il s'agit d'un exemple d'inhibition où le substrat et l'inhibiteur sont en
compétition pour le même site de fixation
On définit Kic
comme la constante de dissociation du complexe EI
k-1
E + P
ES
k1 k2
E + S
I
EI
+
Kic
complexe en "cul de sac"
I se fixe à E

33. A. Inhibition compétitive
L’inhibiteur et le substrat possèdent une analogie
structural qui est connue par le site de fixation sur
l’enzyme
L’inhibiteur ne peut se combiner avec l’enzyme
en même temps que le substrat.
En présence d’inhibiteur, L’affinité diminue (Km
augmente)
Vmax reste inchangée

34. Exemples d’inhibition compétitive
• inhibition par le produit de la réaction:
phosphatase alcaline inhibée par le Pi

35. 1
[S]
vi
1
1
Vmax
[I]
1
KM
-
Inhibition compétitive

36. E + P
ES
k1
k-1
k2
E + S
I
EI + S
+
k1
k-1
ESI
I
+
Kiu
Kic avec Kic
= Kiu
Inhibition non compétitive pure
I se fixe à E et ES avec la même affinité

37. B. Inhibition non compétitive
L’inhibiteur se combine avec l’enzyme
indépendamment du substrat : les deux peuvent
donc se fixer simultanément.
I bloque l’activité de l’enzyme
La fixation de I sur l’enzyme ne modifie pas Km.
 l’inhibiteur se manifeste par la diminution de la
vitesse maximale

38. Inhibition non compétitive pure
1
[S]
vi
1
[I]
1
Vmax
KM
1
-

39. Inhibition anti-compétitive
E + P
ES
k1
k-1
k2
E + S
ESI
I
+
Kiu
I se fixe à ES

40. KM abaissé
Vmax abaissée
KM
Vmax
V0
[S]
+ I
Inhibition incompétitive

41. Cas particulier : inhibition irréversible
1
[S]
vi
1
[I]
1
Vmax
KM
1
-
E + P
ES
k1
k-1
k2
E + S
EI
I
+
k3
Cette représentation ressemble à celle d'une inhibition non-compétitive pure.

42. état T (tendu)
conformation passive
ligands: inhibiteurs
état R (relaché)
conformation active
ligands: substrats, stimulateurs
Allostérie
• enzymes constitués de plusieurs sous-unités  plusieurs sites
actifs
 Il existe au moins un site de fixation pour le substrat (site
actif, catalytique) et au moins un site de fixation (spécifique) pour
un modulateur (site régulateur).
• Les enzymes allostériques font intervenir une liaison réversible, non
covalente, d’une molécule régulatrice appelée modulateur, ou
effecteur, allostérique.

43. Structure aux rayons X de l’ATCase
Etat T (tense) - passif
Fixation de CTP
Etat R (relaxed) - actif
Fixation des substrats et d’ATP
6 chaînes catalytiques: 2 trimères (2C3) : en rouge et bleu
activité catalytique hyperbolique
insensible à l’ATP et au CTP
6 chaînes régulatrices: 3 dimères (2R2) : en vert
pas d’activité catalytique
fixe ATP et CTP
suit le modèle symétrique

44. A part les hydrolase, les enzymes ont parfois besoin de fixer une autre partie non
protéique pour catalyser une réaction (transfert d'électrons, de protons, d'hydrure, de
groupe phosphate,…).
Cette partie appelle cofacteurs. Cella peut être un métal, un nucléotide…
Dans ce cas la partie protéique s'appelle l'apoenzyme
La partie non protéique s'appelle le cofacteur (nécessaire à la réaction enzymatique).
L'association de la partie protéique (apoenzyme) et de la partie non-protéique
(cofacteur) constitue l'holoenzyme.
Les cofacteurs
Ex Nicotinamide adénine dinucléotide NAD dans l'aldose réductase
+ NADH + H+ + NAD+
glucose sorbitol

45. Cofacteurs
cofacteur + apoenzyme  holoenzyme
(protéine, inactive) (système complet,
actif)
• Structure du cofacteur
– ion (ion essentiel)
– molécule organique (coenzyme)
• Fixation
– Transitoire – lâche (co-substrats)
– Permanente – ferme (groupes prosthétiques )

46. Pour catalyser correctement une réaction chimique, un enzyme a
parfois besoin d'une molécule "exogène".
Il peut s’agir d’un ion ou d’un coenzyme.
Il y a deux familles de coenzymes :
- ceux qui ne sont que transitoirement liés à l’enzyme et que
l’on considère alors comme des co-substrats,
- ceux que l’on nomme groupes prosthétiques et qui sont
liés de façon covalente à la protéine.
COENZYMES
Le cofacteur d’un enzyme est une molécule qui apporte un
groupement chimique important pour la catalyse enzymatique,
groupement que ne possède pas l’enzyme seul.

47. Ion essentiel : 2 types
• ions activateurs (lâchement liés)
– permet la liaison entre le substrat et les enzymes activées par les
métaux
– Ex: kinase et Mg++
• ions métalliques (fermement liés)
– rôle catalytique lors de sa liaison à la protéine métallo-enzymes
– Ex: la phosphotriesterase et Zn++
Le site actif de la phosphotriesterase est constitué de 2 atomes de zinc

48. Coenzyme (molécule organique) : 2 types
• cosubstrat (fixation transitoire à la protéine)
– subit une transformation au cours de la réaction
– Ex: NAD(P)/NAD(P)H : réactions d'oxydo-réduction
• groupe prosthétique (fixation permanente à la protéine)
– retrouve sa forme initiale en fin de réaction
– Ex: pyridoxal-5-phosphate : transfert de groupements aminés, biotine :
réaction de carboxylation
• Nombreuses vitamines: précurseurs de coenzymes
• Nicotinamide: NAD et NADP (B3)
• pyridoxine (B6)
• biotine (B8)
• acide folique (B9)
• cobalamine (B12)

49. Nicotinamide Adénine Dinucléotide
(NAD+
)
COENZYMES
N
N
N
N
O
OH OH
H H
H
H2C O P O P O CH2
O
O-
H
NH2
O
OH
OH
H
H H
H
+
C
O
NH2
O
O-
N

50. NAD-NADH et NADP-NADPH
NAD - NADH : nicotinamide adenine dinucleotide
NADP - NADPH : nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
NAD : Forme oxydée NADH : Forme réduite

51. Lactate + NAD+
 Pyruvate + NADH + H+
Superposition des molécules de
NAD+ dans les structures en cristaux
de LDH et Glycéraldéhyde-P DH
Lactate déshydrogénase

52. COENZYMES
Biotine Carboxylation
Coenzyme à cobalamine
(vit B12)
Alkylation
Coenzyme A Transfert de groupe acyl
Acide folique Transfert de groupe acyl
Coenzymes à nicotinamide Oxydo-réduction
Phosphate de pyridoxal Transfert de groupe amino
Cofacteur Réaction impliquée
Coenzymes flaviniques Oxydo-réduction
Tétrahydrofolate Transfert de groupe à un carbone
Thiamine pyrophosphate Transfert de groupe aldéhyde

53. Pantothénate
HO-CH2-C-CH-C-N-CH2-CH2-COO-
H3C
H3C
OH O
H
COENZYMES
Vitamine B5

54. N
N
N
N
O
OH
O
H
H H
CH2-O-P-O-P-O-CH2-C-CH-C-NH-CH2-CH2-C-NH-CH2-CH2-SH
O
O-
H
NH2
O
O-
H3C OH O O
H3C
-
O-P=O
O-
Coenzyme A
(HS-CoA)
COENZYMES

55. N
C
O
NH2
N
C
O
OH
nicotinamide
(niacinamide)
acide nicotinique
(niacine)
Vitamine B3
COENZYMES