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Enzymologie
Franck Rencurel, PhD
BTS diététique
1Franck Rencurel, 2019
Franck Rencurel, 2019 2
Plan du cours
1-Classification des enzymes
2-Notion de cinétique enzymatique
3-Influences physicochimiques sur la cinétique
1-Température
2-pH
3-Inhibiteurs
4-Activateurs
4-Enzymes allostériques
5-Coenzymes et vitamines hydrosolubles
1 vitamines du groupe B
2 vitamine C
6-Régulation de l’activité enzymatique dans les cellules
7-Intérêt des enzymes en clinique et industrie agro
Franck Rencurel, 2019 3
Objectif pédagogique:
A la fin de ce cours vous devez être capable:
• De définir une enzyme,
•Connaitre les 6 différentes classes d’enzymes
•Connaitre la définition de Km et Vmax ainsi que les paramètres
modifiant la cinétique d’une enzyme.
•Définir les différents mode de régulation d’une enzyme.
•Connaitre les vitamines liposolubles, leur rôle, les sources
alimentaires et les besoins chez l’adulte.
Franck Rencurel, 2019 4
Généralités
•Les enzymes sont des protéines qui catalysent des réactions.
•Elles permettent des réactions à T° et pH physiologique
•Sans enzymes les réactions biochimiques seraient trop lentes
•Voir impossibles.
•Certaines enzymes contrôlent des voies métaboliques.
•D’origine protéique, elles sont codées par l’ADN et leur expression
•peut être sous contrôle hormonal ou métabolique.
•Elles sont spécifiques à un substrat (notion de clé/serrure)
Les enzymes ont parfois besoin de fixer une autre partie non
protéique pour catalyser une réaction (transfert d'électrons, de
protons, d'hydrure, de groupe phosphate,…).
Cette partie appelle cofacteurs. Cella peut être un métal, un
nucléotide, une vitamine…
Dans ce cas la partie protéique s'appelle l'apoenzyme
La partie non protéique s'appelle le cofacteur (nécessaire à la
réaction enzymatique).
L'association de la partie protéique (apoenzyme) et de la partie non-
protéique (cofacteur) constitue l'holoenzyme.
Les cofacteurs
NAD est le cofacteur de l’aldose réductase
Glucose + NADH + H+ sorbitol+ NAD+
Aldose réductase
Enzyme
Substrat + cofacteur
5Franck Rencurel, 2019
Les cofacteurs peuvent être labile ou fortement fixés à l'enzyme.
On appelle groupe prosthétique les cofacteurs qui sont fortement
liés à l'enzyme (parfois avec une liaison covalente).
L'enzyme les régénère à la fin de la réaction.
Les autres cofacteurs labiles se dissocient et sont régénérés par d'autres
enzymes.
Ex : ATP
Le site actif de la phosphotriesterase est constitué de 2
atomes de zinc formant un groupe prosthétique
6Franck Rencurel, 2019
Si le cofacteur est d'origine organique
(vitamine, nucléotide,…), le cofacteur est appelé
coenzyme.
7Franck Rencurel, 2019
Exemple: Hydrolyse des protéines par HCL ( 20Kcal)
contre 12 Kcal par trypsine
Catalyse d’une réaction par une enzyme
8Franck Rencurel, 2019
Diagramme énergétique
Sans enzyme
S
P
DGreac
DGreac<0, la réaction se fait du substrat
S vers le produit P
DGact
Pour passer de S à P il faut franchir
l'énergie d'activation DGact..
Cette barrière est à l’image de
l’impulsion d’un skieur au départ d’une
course
Energie thermique,
Mécanique..
9Franck Rencurel, 2019
S
P
Sans enzyme
Avec Enzyme
ES
EP
DGact, l'énergie d'activation est
diminuée, la réaction est fortement
accélérée. L'équilibre n'est pas changé
10Franck Rencurel, 2019
Pour fixer le substrat, il y a une petite barrière d'énergie. Il faut chasser
des molécules d'eau. Il faut que l'enzyme fasse des changements
conformationnels …
L'énergie thermique est suffisante pour passer cette barrière.
Parfois, les enzymes ont un champs électrique afin d'orienter et
d'attirer le substrat (ex acétylcholinestérase).
S
P
ES
EP
DGfix
11Franck Rencurel, 2019
Spécificité des réactions enzymatiques
Une des caractéristiques fondamentales des enzymes est
leur spécificité comparativement aux catalyseurs
chimiques.
D’où la notion du site actif d’une enzyme
On peut considérer que le site actif comporte deux sites
voisins:
 Un site de fixation du substrat ou de reconnaissance :
Spécificité de substrat
 Un site responsable de la réalisation de la réaction
chimique ou le site catalytique: Spécificité de réaction
12Franck Rencurel, 2019
Les enzymes peuvent être extrêmement spécifiques
Grace aux interaction avec les substrats (formes, géométrie, nature
chimique) Elle peuvent discriminer des formes chimiques très proche,
comme les énantiomères …
Ex: D-glucose vs L-Glucose
13Franck Rencurel, 2019
Franck Rencurel, 2019 14
Classification des enzymes
On utilise souvent le suffixe « ase » ajouté au terme
désignant soit le substrat soit le type de réaction que
l’enzyme catalyse.
Exemple : Lactate deshydrogénase
Glucose-6-phosphatase
Il existe une nomenclature officielle qui définie 6
catégories d’enzymes selon le type de réaction
qu’elles catalysent
Franck Rencurel, 2019 15
Classification des enzymes
Classe 1: Les oxydo-réductases
Elles catalysent des transferts de protons et d’électrons (oxydo-
réduction). Exemple: lactate DH
Classe 2: Les Transférases
Catalysent des transferts d’atomes ou de groupement d’atomes .
Exemple: les transaminases transfèrent une fonction amine
Classe 3: Les hydrolases
Coupure de liaisons covalentes nécessitant de l’eau. Exemple des
enzymes digestives (trypsine)
Classe 4: Les lyases
Lyse non hydrolytique et non oxydante en créant des doubles liaisons.
A l’inverse elles peuvent aussi ajouter un groupement sur une double
liaison.exempel l’aldolase coupant le F1,6 bisphosphate en 2 trioses
Franck Rencurel, 2019 16
Classification des enzymes
Classe 5: Les isomérases
Elles catalysent des remaniement intramoléculaires (isomères)
Exemple cycle de Krebs citrateisocitrate
Classe 6: Les ligases
Réactions de ligations, de condensation. Création de liaisons
covalentes nécessitant de l’énergie(hydrolyse d’ATP)
Franck Rencurel, 2019 17
Nomenclature internationnale
Le nom de l’enzyme est suivit de 4 nombres séparés par un point.
Le premier nombre correspond à la classe
Le deuxième à la sous-classe qui précise le type de réaction
Le 3ème et 4ème nombre précise le type de substrat utilisé
Glucokinase= EC 2.7.1.1
Classe 2: Transférase
Transfert d’un
groupement phosphate (kinase)
Transfert sur une fonction alcool
(-OH)
L’accepteur est le glucose
Franck Rencurel, 2019 18
Les Enzymes sont des protéines:
Elles peuvent être constituées uniquement d’acides aminés
(Holoenzymes) exemple des enzymes digestives.
Très souvent ce sont des hétéroprotéines constituées d’une
partie protéique (reconnaissance du substrat) et d’une partie
non protéique (groupement prosthétique) responsable de
l’activité.
On retrouve souvent les vitamines comme groupement
prosthétique (on parle alors de Co-enzyme) , ou des ions ( ce
seront alors des Co-facteurs)
Franck Rencurel, 2019 19
Notions de cinétique enzymatique
La réaction enzymatique peut se diviser en 3 principales étapes:
1- Association de l’enzyme (E) et du substrat (S)
Cette association se fait sur un site spécifique (site actif) et
l’enzyme change légèrement de forme (conformation) pour bien
s’adapter au substrat. Le substrat est lié par des liaisons faibles
(hydrogènes, ioniques, hydrophobes..)
2- Le complexe ES subit des modifications internes pour permettre
La conversion du substrat (S) en produit (P)
3-L’enzyme (E) libère le produit et retrouve son état initiale.
Les enzymes permettent de réguler le métabolisme
On a un substrat A qui peut former le produit B,C,D,E
A
B
C
D
E
A
B
C
D
E
EnzGrace à une enzyme,
on peut canaliser une
réaction
L’activité d'une enzyme peut être régulée par des effecteurs (inhibiteurs ou
effecteur).
Les concentrations de produit ou de substrat (ou autre ligand) peuvent aussi
moduler l'activité d'une enzyme (allostérie). C'est un moyen de contrôle d'une
voie métabolique La quantité d'enzyme est aussi régulée par la
transcription, dégradation ou compartimentalisation.
Toute ces régulations subtiles permettent à l'organisme le maintient d’un
équilibre physiologique
20Franck Rencurel, 2019
Franck Rencurel, 2019 21
Tout ce que ce fixe sur une protéines est appelé ligand.
Le ligand peut être nécessaire à la réaction enzymatique,
avoir un rôle structurale ...
Cela inclus, le substrat, le produit, un régulateur
allostérique etc..
Franck Rencurel, 2019 22
Mode d’action d’une enzyme:
Notions de cinétique enzymatique
Franck Rencurel, 2019 23
 L’étude cinétique d’une réaction enzymatique consiste en
l’étude de la vitesse de la réaction et de l’influence de divers
paramètres susceptibles de la modifiée.
 La vitesse d’une réaction enzymatique est la quantité de
substrat transformé( ou de produit apparu) par unité de
temps.
 Le phénomène fondamental de l’action enzymatique est que
pour agir l’enzyme doit se combiner au substrat puis le
transformer en produit et retrouver sa structure initiale:
S + E ES P+ E
Notions de cinétique enzymatique
Mécanisme général d'une enzyme
S P
Enz
Une enzyme (Enz) transforme un substrat (S) en produit (P).
S ES
1-Première étape. Le substrat se fixe sur l'enzyme
2-Deuxième étape: la catalyse . Le substrat est transformé en produit
EPES
3-Troisième étape. Le produit est relâché
EP E+P
K1
K -1
K2
K-2
K3
K-3
Si il y a plusieurs substrats. La réaction se fera étape par étape.
24Franck Rencurel, 2019
Franck Rencurel, 2019 25
Notions de cinétique enzymatique
E + S E S E + P
K1
K -1
K cat
K constante de vitesse caractérisant le passage de l’enzyme d’un
état à l’autre
K1: Constante d’association (formation du complexe ES) réversible
K-1: Constante de dissociation du complexe ES
K cat: Constante catalytique qui correspond au nombre
d’évènements catalytiques par seconde et par site actif (ordre de
grandeur 103/s)
Influence de la durée: vitesse de réaction enzymatique
en fonction du temps
 La réaction enzymatique peut être divisée en deux phases:
 Phase stationnaire correspond à la période initiale de la réaction
au cours de la quelle la vitesse (Vo) est constante et indépendante
de la concentration du substrat; nous nous trouvons face à une
cinétique d’ordre zéro.
 Ceci implique que Vo est proportionnelle à la [E]
 Une phase d’équilibre: au cours de cette période, l’évolution de
[S] est exponentiellement décroissante et
[P] exponentiellement croissante.
26Franck Rencurel, 2019
Franck Rencurel, 2019
27
Influence de la durée: vitesse de réaction enzymatique
en fonction du temps
On mesure la vitesse d’une réaction enzymatique en fonction de la
concentration en enzyme.
On se place à une concentration de substrat largement suffisante (non
limitante)
On remarque que la vitesse de réaction augmente avec la concentration
en enzyme.
[E]
v
Franck Rencurel, 2019 28
Influence de la durée: vitesse de réaction enzymatique
en fonction du temps.
Evolution de la vitesse de réaction en fonction de la [S] avec une
concentration [Enz] fixe et limitée.
Dans un premier l’augmentation de la vitesse est linéaire puis tend
vers un plateau qui caractérise la vitesse maximale (Vmax).
Vmax
Vmax
2
Km
[S]
v
Franck Rencurel, 2019 29
Vmax
Vmax
2
Km
[S]
v
Vmax n’augmente plus malgré l’abondance de substrat car tous les sites
catalytiques sont occupés
On trace l’hyperbole à l’aide de l’équation de Michaelis-Menten
v Avec Km= K-1 + Kcat
K1
Kcat <<<< K-1 et K1 on peut donc simplifier en écrivant Km= K-1
K1
mmol/min
produit formé
Franck Rencurel, 2019 30
Km défini une constante d’affinité. C’est elle qui caractérise l’équilibre
de
dissociation du complexe ES en E+S
Ainsi plus le Km est grand ( plus K-1est grand par rapport à K1)
moins l’enzyme à une forte affinité pour le substrat
E + S ES
K1
K-1
Le Km et la Vmax sont les deux paramètres permettant
d’apprécier l’activité d’une enzyme.
Pour des facilité expérimentale et de représentation on peut
représenter 1/v en fonction de 1/[S] pour obtenir une droite.
C’est la représentation de Lineweaver-Burk
Franck Rencurel, 2019 31
Représentation de Lineweaver-Burk
1/v
1 / Vmax
1/[S]
-1 / Km
1
Vmax
Km
Vmax
1
[S]
1
V
= + -
 Le Km peut aller de 10-6 mol/l pour les enzymes très
actives comme les peroxydases, à 10-2 mol/l pour les
enzymes peu actives comme les enzymes
protéolytiques.
 La connaissance du Km d’une enzyme est importante
car une enzyme à Km élevé ne pourra agir avec
efficacité dans la cellule que si le substrat s’y trouve à
concentration élevée ou ne sera pas saturée dans ces
mêmes conditions (exemple Glucokinase)
32Franck Rencurel, 2019
http://glycolysis.co.uk/hexokinase.php
glucokinase
Km glucose= 17mM
0 5 10 15 20 mM glucose
Hexokinase (1,2,3)
Glucokinase
Vmax
33
v
Vmax/2
Franck Rencurel, 2019
Franck Rencurel, 2019 34
Influence de la température sur la cinétique enzymatique
Pour qu’une réaction ait lieu il faut que S rencontre E et que les deux aient
suffisamment d’énergie pour s’activer (liaison, changements
conformationnels..).
L’énergie d’activation fournie sous forme d’énergie thermique. Au-delà de 40-
45°C (sauf exception d’enzymes bactériennes) la protéine (Enz) est
dénaturée et perd son activité catalytique
v
T° C
Vmax
T° optimale
Franck Rencurel, 2019 35
Influence du pH
La réaction enzymatique peut être rapidement perturbée par des
variations de pH bien avant La dénaturation de l’enzyme.
Les variations de pH modifient la ionisation (les charges) dans le
site actif (si présence d’acides aminés chargés Arg, His, Lys, Glu,
Asp)
Le pH peut modifier la charge du substrat
Ces modifications empêchent la bonne formation du complexe ES
On définit un pH optimal avec des conditions strictes n’admettant
pas des variations au-delà de +/- 0,5 pH
La plupart des enzymes de notre organisme ont un pH
optimal proche de 7, le pH Physiologique
Les enzymes gastriques comme la pepsine ont un pH optimal
proche de 2
Le bicarbonate libéré dans le grêle tend à augmenter le pH du
chyme pour permettre l’activité des enzymes pancréatiques
Franck Rencurel, 2019 36
Les inhibiteurs
Un grand nombre de molécules sont capables d’interagir avec une
enzyme et de ralentir ou stopper la réaction. Cela permet un contrôle
de voies métaboliques.
Les inhibitions peuvent être irréversibles (pharmaco, bactéries) ou
réversibles.
Les inhibiteurs peuvent se fixer sur le site de liaison du substrat et
entrer en compétition: Inhibition compétitive
Ou se fixer sur un site spécifique (allostérique) différent et moduler
l’activité de l’enzyme: inhibition non compétitive ou allostérique
Franck Rencurel, 2019 37
Inhibition compétitive
Les inhibiteurs compétitifs ont une analogie de structure avec le
substrat et le site catalytique de l’enzyme
Enzyme
Inhibiteur
Compétition pour
le site catalytique
Substrat
E ES E+P
EI
(+S)
(-S)
(- I) (+ I)
La direction prise dépendra de:
[S] et [I]
Affinité de E pour S ou I
Franck Rencurel, 2019 38
Inhibition compétitive
L’augmentation de [I] favorise la dissociation du complexe ES
K-1 augmente et K1 diminue  Km augmente affinité de E pour S est
affectée.
Un inhibiteur compétitif diminue la vitesse de réaction en diminuant la
proportion d’enzyme liée au substrat.
Même si elle est plus longue à atteindre la Vmax n’est pas affectée.. En
augmentant [S] par rapport à [I] on lève l’inhibition.
Km= K-1
K1
Vmax
v
[S]
Sans inhibiteur
Avec
inhibiteur
Km (i) > Km
Franck Rencurel, 2019 39
Inhibition non compétitive
Enzyme
Substrat
Inhibiteur
La fixation de l’inhibiteur n’entre pas en
compétition avec le substrat.
La liaison de S sur E ne change pas le
Km ne change pas.
Seule la Vmax est diminuée
Ainsi l’augmentation de [S] ne peut pas
s’opposer à l’effet de l’inhibiteur
E ES E+P
EI
(+S)
(+ I)
ESI
(+ I)
Franck Rencurel, 2019 40
E ES E+P
EI
(+S)
(+ I)
ESI
(+ I)
Inhibition non compétitive
Seul le couple ES peut aboutir à
une activité. La Vmax est
diminuée. Le Km ne change pas
v
[S]
Vmax
Vmax
Km
Vmax/2
Vmax/2
Avec inhibiteur
non compétitif
Sans inhibiteur
Franck Rencurel, 2019 41
Activation d’enzymes
Dans certains cas particuliers, des enzymes sont produites sous
forme inactive et nécessitent l’intervention d’autres facteurs pour
les activer.
Exemple des enzymes pancréatiques.
Ce sont des protéases. Si elles étaient produites sous forme
active elles digèreraient les protéines du pancréas.
Pour éviter cela, elles sont libérées sous forme inactive dans la
lumière de l’intestin grêle puis activées par l’intervention d’une
enzyme présente dans l’intestin(cellules intestinales ou bactéries
de l’intestin)
Pro-enzymes
Duodenum
pancréas
Trypsinogène
Trypsine
Entérokinase
enzymes
PST1
42Franck Rencurel, 2019
Enzyme produite
par les cellules
De l’intestin
Les cellules de l’intestin
sont protégées de la
digestion enzymatique
grâce au mucus
Sorte de liquide protecteur
en surface des cellules
Chymotrypsinogène
Proélastase 2
Proprotéase E
Kallikréinogène
Procarboxypeptidase A
Procarboxypeptidase B
Prophospholipase A 2
Procolipase
Trypsinogène
Elastase 2
Protéase E
Kallikréine
Carboxypeptidase A
Carboxypeptidase B
Phospholipase A 2
Colipase
Trypsinogène Trypsine
Entérokinase
duodénale
Enzymes inactives Enzymes actives
43Franck Rencurel, 2019
Activateur
Franck Rencurel, 2019 44
Notion d’enzyme allostérique
La cinétique de certaines enzymes ne suit pas un modèle Michaelien
(hyperbole) Mais suit une courbe sigmoïde
v
[S]
Vmax
Sigmoïde
Hyperbole (Michaelienne)
Franck Rencurel, 2019 45
Notion d’enzyme allostérique
Une courbe sigmoïde décrit principalement (sauf exceptions)
une enzyme de structure multimèrique, ayant plusieurs sous-unités.
L’enzyme possède autant de sites actifs que de sous unités.
L’occupation d’un site par le substrat modifie l’affinité du second site
pour le même substrat
T T
R R
R R
T: Tense (tendue)
R: Relax (relachée)
Sous forme « tendue » le substrat met plus de
temps
À accéder au site actif.
La liaison du substrat relache (relax) les autres sites
actifs améliorant l’accés au substrat, l’activité
augmente
Franck Rencurel, 2019 46
7-Intérêt des enzymes en clinique
et industrie agro alimentaire
Franck Rencurel, 2019 47
Intérêt des enzymes en clinique et industrie agro alimentaire
Diagnostique: exemple des transaminases dosées dans le plasma
et révélant des lésions hépatiques
Diagnostique de maladies métaboliques congénitales:
Fructosémie, galactosémie, glycogénose..
En industries: boulangerie, laiterie,
Transformation de l’amidon de maïs en sirop de glucose ou
fructose par l’action d’enzymes
Les enzymes peuvent être à l’origine du développement de
saveurs(acides gras dans le gras du jambon cru développant des
arômes
Rancissement du beurre
Franck Rencurel, 2019 48

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BTS diététique Enzymologie

  • 1. Enzymologie Franck Rencurel, PhD BTS diététique 1Franck Rencurel, 2019
  • 2. Franck Rencurel, 2019 2 Plan du cours 1-Classification des enzymes 2-Notion de cinétique enzymatique 3-Influences physicochimiques sur la cinétique 1-Température 2-pH 3-Inhibiteurs 4-Activateurs 4-Enzymes allostériques 5-Coenzymes et vitamines hydrosolubles 1 vitamines du groupe B 2 vitamine C 6-Régulation de l’activité enzymatique dans les cellules 7-Intérêt des enzymes en clinique et industrie agro
  • 3. Franck Rencurel, 2019 3 Objectif pédagogique: A la fin de ce cours vous devez être capable: • De définir une enzyme, •Connaitre les 6 différentes classes d’enzymes •Connaitre la définition de Km et Vmax ainsi que les paramètres modifiant la cinétique d’une enzyme. •Définir les différents mode de régulation d’une enzyme. •Connaitre les vitamines liposolubles, leur rôle, les sources alimentaires et les besoins chez l’adulte.
  • 4. Franck Rencurel, 2019 4 Généralités •Les enzymes sont des protéines qui catalysent des réactions. •Elles permettent des réactions à T° et pH physiologique •Sans enzymes les réactions biochimiques seraient trop lentes •Voir impossibles. •Certaines enzymes contrôlent des voies métaboliques. •D’origine protéique, elles sont codées par l’ADN et leur expression •peut être sous contrôle hormonal ou métabolique. •Elles sont spécifiques à un substrat (notion de clé/serrure)
  • 5. Les enzymes ont parfois besoin de fixer une autre partie non protéique pour catalyser une réaction (transfert d'électrons, de protons, d'hydrure, de groupe phosphate,…). Cette partie appelle cofacteurs. Cella peut être un métal, un nucléotide, une vitamine… Dans ce cas la partie protéique s'appelle l'apoenzyme La partie non protéique s'appelle le cofacteur (nécessaire à la réaction enzymatique). L'association de la partie protéique (apoenzyme) et de la partie non- protéique (cofacteur) constitue l'holoenzyme. Les cofacteurs NAD est le cofacteur de l’aldose réductase Glucose + NADH + H+ sorbitol+ NAD+ Aldose réductase Enzyme Substrat + cofacteur 5Franck Rencurel, 2019
  • 6. Les cofacteurs peuvent être labile ou fortement fixés à l'enzyme. On appelle groupe prosthétique les cofacteurs qui sont fortement liés à l'enzyme (parfois avec une liaison covalente). L'enzyme les régénère à la fin de la réaction. Les autres cofacteurs labiles se dissocient et sont régénérés par d'autres enzymes. Ex : ATP Le site actif de la phosphotriesterase est constitué de 2 atomes de zinc formant un groupe prosthétique 6Franck Rencurel, 2019
  • 7. Si le cofacteur est d'origine organique (vitamine, nucléotide,…), le cofacteur est appelé coenzyme. 7Franck Rencurel, 2019
  • 8. Exemple: Hydrolyse des protéines par HCL ( 20Kcal) contre 12 Kcal par trypsine Catalyse d’une réaction par une enzyme 8Franck Rencurel, 2019
  • 9. Diagramme énergétique Sans enzyme S P DGreac DGreac<0, la réaction se fait du substrat S vers le produit P DGact Pour passer de S à P il faut franchir l'énergie d'activation DGact.. Cette barrière est à l’image de l’impulsion d’un skieur au départ d’une course Energie thermique, Mécanique.. 9Franck Rencurel, 2019
  • 10. S P Sans enzyme Avec Enzyme ES EP DGact, l'énergie d'activation est diminuée, la réaction est fortement accélérée. L'équilibre n'est pas changé 10Franck Rencurel, 2019
  • 11. Pour fixer le substrat, il y a une petite barrière d'énergie. Il faut chasser des molécules d'eau. Il faut que l'enzyme fasse des changements conformationnels … L'énergie thermique est suffisante pour passer cette barrière. Parfois, les enzymes ont un champs électrique afin d'orienter et d'attirer le substrat (ex acétylcholinestérase). S P ES EP DGfix 11Franck Rencurel, 2019
  • 12. Spécificité des réactions enzymatiques Une des caractéristiques fondamentales des enzymes est leur spécificité comparativement aux catalyseurs chimiques. D’où la notion du site actif d’une enzyme On peut considérer que le site actif comporte deux sites voisins:  Un site de fixation du substrat ou de reconnaissance : Spécificité de substrat  Un site responsable de la réalisation de la réaction chimique ou le site catalytique: Spécificité de réaction 12Franck Rencurel, 2019
  • 13. Les enzymes peuvent être extrêmement spécifiques Grace aux interaction avec les substrats (formes, géométrie, nature chimique) Elle peuvent discriminer des formes chimiques très proche, comme les énantiomères … Ex: D-glucose vs L-Glucose 13Franck Rencurel, 2019
  • 14. Franck Rencurel, 2019 14 Classification des enzymes On utilise souvent le suffixe « ase » ajouté au terme désignant soit le substrat soit le type de réaction que l’enzyme catalyse. Exemple : Lactate deshydrogénase Glucose-6-phosphatase Il existe une nomenclature officielle qui définie 6 catégories d’enzymes selon le type de réaction qu’elles catalysent
  • 15. Franck Rencurel, 2019 15 Classification des enzymes Classe 1: Les oxydo-réductases Elles catalysent des transferts de protons et d’électrons (oxydo- réduction). Exemple: lactate DH Classe 2: Les Transférases Catalysent des transferts d’atomes ou de groupement d’atomes . Exemple: les transaminases transfèrent une fonction amine Classe 3: Les hydrolases Coupure de liaisons covalentes nécessitant de l’eau. Exemple des enzymes digestives (trypsine) Classe 4: Les lyases Lyse non hydrolytique et non oxydante en créant des doubles liaisons. A l’inverse elles peuvent aussi ajouter un groupement sur une double liaison.exempel l’aldolase coupant le F1,6 bisphosphate en 2 trioses
  • 16. Franck Rencurel, 2019 16 Classification des enzymes Classe 5: Les isomérases Elles catalysent des remaniement intramoléculaires (isomères) Exemple cycle de Krebs citrateisocitrate Classe 6: Les ligases Réactions de ligations, de condensation. Création de liaisons covalentes nécessitant de l’énergie(hydrolyse d’ATP)
  • 17. Franck Rencurel, 2019 17 Nomenclature internationnale Le nom de l’enzyme est suivit de 4 nombres séparés par un point. Le premier nombre correspond à la classe Le deuxième à la sous-classe qui précise le type de réaction Le 3ème et 4ème nombre précise le type de substrat utilisé Glucokinase= EC 2.7.1.1 Classe 2: Transférase Transfert d’un groupement phosphate (kinase) Transfert sur une fonction alcool (-OH) L’accepteur est le glucose
  • 18. Franck Rencurel, 2019 18 Les Enzymes sont des protéines: Elles peuvent être constituées uniquement d’acides aminés (Holoenzymes) exemple des enzymes digestives. Très souvent ce sont des hétéroprotéines constituées d’une partie protéique (reconnaissance du substrat) et d’une partie non protéique (groupement prosthétique) responsable de l’activité. On retrouve souvent les vitamines comme groupement prosthétique (on parle alors de Co-enzyme) , ou des ions ( ce seront alors des Co-facteurs)
  • 19. Franck Rencurel, 2019 19 Notions de cinétique enzymatique La réaction enzymatique peut se diviser en 3 principales étapes: 1- Association de l’enzyme (E) et du substrat (S) Cette association se fait sur un site spécifique (site actif) et l’enzyme change légèrement de forme (conformation) pour bien s’adapter au substrat. Le substrat est lié par des liaisons faibles (hydrogènes, ioniques, hydrophobes..) 2- Le complexe ES subit des modifications internes pour permettre La conversion du substrat (S) en produit (P) 3-L’enzyme (E) libère le produit et retrouve son état initiale.
  • 20. Les enzymes permettent de réguler le métabolisme On a un substrat A qui peut former le produit B,C,D,E A B C D E A B C D E EnzGrace à une enzyme, on peut canaliser une réaction L’activité d'une enzyme peut être régulée par des effecteurs (inhibiteurs ou effecteur). Les concentrations de produit ou de substrat (ou autre ligand) peuvent aussi moduler l'activité d'une enzyme (allostérie). C'est un moyen de contrôle d'une voie métabolique La quantité d'enzyme est aussi régulée par la transcription, dégradation ou compartimentalisation. Toute ces régulations subtiles permettent à l'organisme le maintient d’un équilibre physiologique 20Franck Rencurel, 2019
  • 21. Franck Rencurel, 2019 21 Tout ce que ce fixe sur une protéines est appelé ligand. Le ligand peut être nécessaire à la réaction enzymatique, avoir un rôle structurale ... Cela inclus, le substrat, le produit, un régulateur allostérique etc..
  • 22. Franck Rencurel, 2019 22 Mode d’action d’une enzyme: Notions de cinétique enzymatique
  • 23. Franck Rencurel, 2019 23  L’étude cinétique d’une réaction enzymatique consiste en l’étude de la vitesse de la réaction et de l’influence de divers paramètres susceptibles de la modifiée.  La vitesse d’une réaction enzymatique est la quantité de substrat transformé( ou de produit apparu) par unité de temps.  Le phénomène fondamental de l’action enzymatique est que pour agir l’enzyme doit se combiner au substrat puis le transformer en produit et retrouver sa structure initiale: S + E ES P+ E Notions de cinétique enzymatique
  • 24. Mécanisme général d'une enzyme S P Enz Une enzyme (Enz) transforme un substrat (S) en produit (P). S ES 1-Première étape. Le substrat se fixe sur l'enzyme 2-Deuxième étape: la catalyse . Le substrat est transformé en produit EPES 3-Troisième étape. Le produit est relâché EP E+P K1 K -1 K2 K-2 K3 K-3 Si il y a plusieurs substrats. La réaction se fera étape par étape. 24Franck Rencurel, 2019
  • 25. Franck Rencurel, 2019 25 Notions de cinétique enzymatique E + S E S E + P K1 K -1 K cat K constante de vitesse caractérisant le passage de l’enzyme d’un état à l’autre K1: Constante d’association (formation du complexe ES) réversible K-1: Constante de dissociation du complexe ES K cat: Constante catalytique qui correspond au nombre d’évènements catalytiques par seconde et par site actif (ordre de grandeur 103/s)
  • 26. Influence de la durée: vitesse de réaction enzymatique en fonction du temps  La réaction enzymatique peut être divisée en deux phases:  Phase stationnaire correspond à la période initiale de la réaction au cours de la quelle la vitesse (Vo) est constante et indépendante de la concentration du substrat; nous nous trouvons face à une cinétique d’ordre zéro.  Ceci implique que Vo est proportionnelle à la [E]  Une phase d’équilibre: au cours de cette période, l’évolution de [S] est exponentiellement décroissante et [P] exponentiellement croissante. 26Franck Rencurel, 2019
  • 27. Franck Rencurel, 2019 27 Influence de la durée: vitesse de réaction enzymatique en fonction du temps On mesure la vitesse d’une réaction enzymatique en fonction de la concentration en enzyme. On se place à une concentration de substrat largement suffisante (non limitante) On remarque que la vitesse de réaction augmente avec la concentration en enzyme. [E] v
  • 28. Franck Rencurel, 2019 28 Influence de la durée: vitesse de réaction enzymatique en fonction du temps. Evolution de la vitesse de réaction en fonction de la [S] avec une concentration [Enz] fixe et limitée. Dans un premier l’augmentation de la vitesse est linéaire puis tend vers un plateau qui caractérise la vitesse maximale (Vmax). Vmax Vmax 2 Km [S] v
  • 29. Franck Rencurel, 2019 29 Vmax Vmax 2 Km [S] v Vmax n’augmente plus malgré l’abondance de substrat car tous les sites catalytiques sont occupés On trace l’hyperbole à l’aide de l’équation de Michaelis-Menten v Avec Km= K-1 + Kcat K1 Kcat <<<< K-1 et K1 on peut donc simplifier en écrivant Km= K-1 K1 mmol/min produit formé
  • 30. Franck Rencurel, 2019 30 Km défini une constante d’affinité. C’est elle qui caractérise l’équilibre de dissociation du complexe ES en E+S Ainsi plus le Km est grand ( plus K-1est grand par rapport à K1) moins l’enzyme à une forte affinité pour le substrat E + S ES K1 K-1 Le Km et la Vmax sont les deux paramètres permettant d’apprécier l’activité d’une enzyme. Pour des facilité expérimentale et de représentation on peut représenter 1/v en fonction de 1/[S] pour obtenir une droite. C’est la représentation de Lineweaver-Burk
  • 31. Franck Rencurel, 2019 31 Représentation de Lineweaver-Burk 1/v 1 / Vmax 1/[S] -1 / Km 1 Vmax Km Vmax 1 [S] 1 V = + -
  • 32.  Le Km peut aller de 10-6 mol/l pour les enzymes très actives comme les peroxydases, à 10-2 mol/l pour les enzymes peu actives comme les enzymes protéolytiques.  La connaissance du Km d’une enzyme est importante car une enzyme à Km élevé ne pourra agir avec efficacité dans la cellule que si le substrat s’y trouve à concentration élevée ou ne sera pas saturée dans ces mêmes conditions (exemple Glucokinase) 32Franck Rencurel, 2019
  • 33. http://glycolysis.co.uk/hexokinase.php glucokinase Km glucose= 17mM 0 5 10 15 20 mM glucose Hexokinase (1,2,3) Glucokinase Vmax 33 v Vmax/2 Franck Rencurel, 2019
  • 34. Franck Rencurel, 2019 34 Influence de la température sur la cinétique enzymatique Pour qu’une réaction ait lieu il faut que S rencontre E et que les deux aient suffisamment d’énergie pour s’activer (liaison, changements conformationnels..). L’énergie d’activation fournie sous forme d’énergie thermique. Au-delà de 40- 45°C (sauf exception d’enzymes bactériennes) la protéine (Enz) est dénaturée et perd son activité catalytique v T° C Vmax T° optimale
  • 35. Franck Rencurel, 2019 35 Influence du pH La réaction enzymatique peut être rapidement perturbée par des variations de pH bien avant La dénaturation de l’enzyme. Les variations de pH modifient la ionisation (les charges) dans le site actif (si présence d’acides aminés chargés Arg, His, Lys, Glu, Asp) Le pH peut modifier la charge du substrat Ces modifications empêchent la bonne formation du complexe ES On définit un pH optimal avec des conditions strictes n’admettant pas des variations au-delà de +/- 0,5 pH La plupart des enzymes de notre organisme ont un pH optimal proche de 7, le pH Physiologique Les enzymes gastriques comme la pepsine ont un pH optimal proche de 2 Le bicarbonate libéré dans le grêle tend à augmenter le pH du chyme pour permettre l’activité des enzymes pancréatiques
  • 36. Franck Rencurel, 2019 36 Les inhibiteurs Un grand nombre de molécules sont capables d’interagir avec une enzyme et de ralentir ou stopper la réaction. Cela permet un contrôle de voies métaboliques. Les inhibitions peuvent être irréversibles (pharmaco, bactéries) ou réversibles. Les inhibiteurs peuvent se fixer sur le site de liaison du substrat et entrer en compétition: Inhibition compétitive Ou se fixer sur un site spécifique (allostérique) différent et moduler l’activité de l’enzyme: inhibition non compétitive ou allostérique
  • 37. Franck Rencurel, 2019 37 Inhibition compétitive Les inhibiteurs compétitifs ont une analogie de structure avec le substrat et le site catalytique de l’enzyme Enzyme Inhibiteur Compétition pour le site catalytique Substrat E ES E+P EI (+S) (-S) (- I) (+ I) La direction prise dépendra de: [S] et [I] Affinité de E pour S ou I
  • 38. Franck Rencurel, 2019 38 Inhibition compétitive L’augmentation de [I] favorise la dissociation du complexe ES K-1 augmente et K1 diminue  Km augmente affinité de E pour S est affectée. Un inhibiteur compétitif diminue la vitesse de réaction en diminuant la proportion d’enzyme liée au substrat. Même si elle est plus longue à atteindre la Vmax n’est pas affectée.. En augmentant [S] par rapport à [I] on lève l’inhibition. Km= K-1 K1 Vmax v [S] Sans inhibiteur Avec inhibiteur Km (i) > Km
  • 39. Franck Rencurel, 2019 39 Inhibition non compétitive Enzyme Substrat Inhibiteur La fixation de l’inhibiteur n’entre pas en compétition avec le substrat. La liaison de S sur E ne change pas le Km ne change pas. Seule la Vmax est diminuée Ainsi l’augmentation de [S] ne peut pas s’opposer à l’effet de l’inhibiteur E ES E+P EI (+S) (+ I) ESI (+ I)
  • 40. Franck Rencurel, 2019 40 E ES E+P EI (+S) (+ I) ESI (+ I) Inhibition non compétitive Seul le couple ES peut aboutir à une activité. La Vmax est diminuée. Le Km ne change pas v [S] Vmax Vmax Km Vmax/2 Vmax/2 Avec inhibiteur non compétitif Sans inhibiteur
  • 41. Franck Rencurel, 2019 41 Activation d’enzymes Dans certains cas particuliers, des enzymes sont produites sous forme inactive et nécessitent l’intervention d’autres facteurs pour les activer. Exemple des enzymes pancréatiques. Ce sont des protéases. Si elles étaient produites sous forme active elles digèreraient les protéines du pancréas. Pour éviter cela, elles sont libérées sous forme inactive dans la lumière de l’intestin grêle puis activées par l’intervention d’une enzyme présente dans l’intestin(cellules intestinales ou bactéries de l’intestin)
  • 42. Pro-enzymes Duodenum pancréas Trypsinogène Trypsine Entérokinase enzymes PST1 42Franck Rencurel, 2019 Enzyme produite par les cellules De l’intestin Les cellules de l’intestin sont protégées de la digestion enzymatique grâce au mucus Sorte de liquide protecteur en surface des cellules
  • 43. Chymotrypsinogène Proélastase 2 Proprotéase E Kallikréinogène Procarboxypeptidase A Procarboxypeptidase B Prophospholipase A 2 Procolipase Trypsinogène Elastase 2 Protéase E Kallikréine Carboxypeptidase A Carboxypeptidase B Phospholipase A 2 Colipase Trypsinogène Trypsine Entérokinase duodénale Enzymes inactives Enzymes actives 43Franck Rencurel, 2019 Activateur
  • 44. Franck Rencurel, 2019 44 Notion d’enzyme allostérique La cinétique de certaines enzymes ne suit pas un modèle Michaelien (hyperbole) Mais suit une courbe sigmoïde v [S] Vmax Sigmoïde Hyperbole (Michaelienne)
  • 45. Franck Rencurel, 2019 45 Notion d’enzyme allostérique Une courbe sigmoïde décrit principalement (sauf exceptions) une enzyme de structure multimèrique, ayant plusieurs sous-unités. L’enzyme possède autant de sites actifs que de sous unités. L’occupation d’un site par le substrat modifie l’affinité du second site pour le même substrat T T R R R R T: Tense (tendue) R: Relax (relachée) Sous forme « tendue » le substrat met plus de temps À accéder au site actif. La liaison du substrat relache (relax) les autres sites actifs améliorant l’accés au substrat, l’activité augmente
  • 46. Franck Rencurel, 2019 46 7-Intérêt des enzymes en clinique et industrie agro alimentaire
  • 47. Franck Rencurel, 2019 47 Intérêt des enzymes en clinique et industrie agro alimentaire Diagnostique: exemple des transaminases dosées dans le plasma et révélant des lésions hépatiques Diagnostique de maladies métaboliques congénitales: Fructosémie, galactosémie, glycogénose.. En industries: boulangerie, laiterie, Transformation de l’amidon de maïs en sirop de glucose ou fructose par l’action d’enzymes Les enzymes peuvent être à l’origine du développement de saveurs(acides gras dans le gras du jambon cru développant des arômes Rancissement du beurre