BTS diététique Enzymologie

Enzymologie
Franck Rencurel, PhD
BTS diététique
1Franck Rencurel, 2019

Franck Rencurel, 2019 2
Plan du cours
1-Classification des enzymes
2-Notion de cinétique enzymatique
3-Influences physicochimiques sur la cinétique
1-Température
2-pH
3-Inhibiteurs
4-Activateurs
4-Enzymes allostériques
5-Coenzymes et vitamines hydrosolubles
1 vitamines du groupe B
2 vitamine C
6-Régulation de l’activité enzymatique dans les cellules
7-Intérêt des enzymes en clinique et industrie agro

Objectif pédagogique:
A la fin de ce cours vous devez être capable:
• De définir une enzyme,
•Connaitre les 6 différentes classes d’enzymes
•Connaitre la définition de Km et Vmax ainsi que les paramètres
modifiant la cinétique d’une enzyme.
•Définir les différents mode de régulation d’une enzyme.
•Connaitre les vitamines liposolubles, leur rôle, les sources
alimentaires et les besoins chez l’adulte.

Généralités
•Les enzymes sont des protéines qui catalysent des réactions.
•Elles permettent des réactions à T° et pH physiologique
•Sans enzymes les réactions biochimiques seraient trop lentes
•Voir impossibles.
•Certaines enzymes contrôlent des voies métaboliques.
•D’origine protéique, elles sont codées par l’ADN et leur expression
•peut être sous contrôle hormonal ou métabolique.
•Elles sont spécifiques à un substrat (notion de clé/serrure)

Les enzymes ont parfois besoin de fixer une autre partie non
protéique pour catalyser une réaction (transfert d'électrons, de
protons, d'hydrure, de groupe phosphate,…).
Cette partie appelle cofacteurs. Cella peut être un métal, un
nucléotide, une vitamine…
Dans ce cas la partie protéique s'appelle l'apoenzyme
La partie non protéique s'appelle le cofacteur (nécessaire à la
réaction enzymatique).
L'association de la partie protéique (apoenzyme) et de la partie non-
protéique (cofacteur) constitue l'holoenzyme.
Les cofacteurs
NAD est le cofacteur de l’aldose réductase
Glucose + NADH + H+ sorbitol+ NAD+
Aldose réductase
Enzyme
Substrat + cofacteur

Les cofacteurs peuvent être labile ou fortement fixés à l'enzyme.
On appelle groupe prosthétique les cofacteurs qui sont fortement
liés à l'enzyme (parfois avec une liaison covalente).
L'enzyme les régénère à la fin de la réaction.
Les autres cofacteurs labiles se dissocient et sont régénérés par d'autres
enzymes.
Ex : ATP
Le site actif de la phosphotriesterase est constitué de 2
atomes de zinc formant un groupe prosthétique

Si le cofacteur est d'origine organique
(vitamine, nucléotide,…), le cofacteur est appelé
coenzyme.

Exemple: Hydrolyse des protéines par HCL ( 20Kcal)
contre 12 Kcal par trypsine
Catalyse d’une réaction par une enzyme

Diagramme énergétique
Sans enzyme
S
P
DGreac
DGreac<0, la réaction se fait du substrat
S vers le produit P
DGact
Pour passer de S à P il faut franchir
l'énergie d'activation DGact..
Cette barrière est à l’image de
l’impulsion d’un skieur au départ d’une
course
Energie thermique,
Mécanique..

S
P
Sans enzyme
Avec Enzyme
ES
EP
DGact, l'énergie d'activation est
diminuée, la réaction est fortement
accélérée. L'équilibre n'est pas changé

Pour fixer le substrat, il y a une petite barrière d'énergie. Il faut chasser
des molécules d'eau. Il faut que l'enzyme fasse des changements
conformationnels …
L'énergie thermique est suffisante pour passer cette barrière.
Parfois, les enzymes ont un champs électrique afin d'orienter et
d'attirer le substrat (ex acétylcholinestérase).
S
P
ES
EP
DGfix

Spécificité des réactions enzymatiques
Une des caractéristiques fondamentales des enzymes est
leur spécificité comparativement aux catalyseurs
chimiques.
D’où la notion du site actif d’une enzyme
On peut considérer que le site actif comporte deux sites
voisins:
 Un site de fixation du substrat ou de reconnaissance :
Spécificité de substrat
 Un site responsable de la réalisation de la réaction
chimique ou le site catalytique: Spécificité de réaction

Les enzymes peuvent être extrêmement spécifiques
Grace aux interaction avec les substrats (formes, géométrie, nature
chimique) Elle peuvent discriminer des formes chimiques très proche,
comme les énantiomères …
Ex: D-glucose vs L-Glucose

Classification des enzymes
On utilise souvent le suffixe « ase » ajouté au terme
désignant soit le substrat soit le type de réaction que
l’enzyme catalyse.
Exemple : Lactate deshydrogénase
Glucose-6-phosphatase
Il existe une nomenclature officielle qui définie 6
catégories d’enzymes selon le type de réaction
qu’elles catalysent

Classe 1: Les oxydo-réductases
Elles catalysent des transferts de protons et d’électrons (oxydo-
réduction). Exemple: lactate DH
Classe 2: Les Transférases
Catalysent des transferts d’atomes ou de groupement d’atomes .
Exemple: les transaminases transfèrent une fonction amine
Classe 3: Les hydrolases
Coupure de liaisons covalentes nécessitant de l’eau. Exemple des
enzymes digestives (trypsine)
Classe 4: Les lyases
Lyse non hydrolytique et non oxydante en créant des doubles liaisons.
A l’inverse elles peuvent aussi ajouter un groupement sur une double
liaison.exempel l’aldolase coupant le F1,6 bisphosphate en 2 trioses

Classe 5: Les isomérases
Elles catalysent des remaniement intramoléculaires (isomères)
Exemple cycle de Krebs citrateisocitrate
Classe 6: Les ligases
Réactions de ligations, de condensation. Création de liaisons
covalentes nécessitant de l’énergie(hydrolyse d’ATP)

Nomenclature internationnale
Le nom de l’enzyme est suivit de 4 nombres séparés par un point.
Le premier nombre correspond à la classe
Le deuxième à la sous-classe qui précise le type de réaction
Le 3ème et 4ème nombre précise le type de substrat utilisé
Glucokinase= EC 2.7.1.1
Classe 2: Transférase
Transfert d’un
groupement phosphate (kinase)
Transfert sur une fonction alcool
(-OH)
L’accepteur est le glucose

Les Enzymes sont des protéines:
Elles peuvent être constituées uniquement d’acides aminés
(Holoenzymes) exemple des enzymes digestives.
Très souvent ce sont des hétéroprotéines constituées d’une
partie protéique (reconnaissance du substrat) et d’une partie
non protéique (groupement prosthétique) responsable de
l’activité.
On retrouve souvent les vitamines comme groupement
prosthétique (on parle alors de Co-enzyme) , ou des ions ( ce
seront alors des Co-facteurs)

Notions de cinétique enzymatique
La réaction enzymatique peut se diviser en 3 principales étapes:
1- Association de l’enzyme (E) et du substrat (S)
Cette association se fait sur un site spécifique (site actif) et
l’enzyme change légèrement de forme (conformation) pour bien
s’adapter au substrat. Le substrat est lié par des liaisons faibles
(hydrogènes, ioniques, hydrophobes..)
2- Le complexe ES subit des modifications internes pour permettre
La conversion du substrat (S) en produit (P)
3-L’enzyme (E) libère le produit et retrouve son état initiale.

Les enzymes permettent de réguler le métabolisme
On a un substrat A qui peut former le produit B,C,D,E
A
B
C
D
E
A
B
C
D
E
EnzGrace à une enzyme,
on peut canaliser une
réaction
L’activité d'une enzyme peut être régulée par des effecteurs (inhibiteurs ou
effecteur).
Les concentrations de produit ou de substrat (ou autre ligand) peuvent aussi
moduler l'activité d'une enzyme (allostérie). C'est un moyen de contrôle d'une
voie métabolique La quantité d'enzyme est aussi régulée par la
transcription, dégradation ou compartimentalisation.
Toute ces régulations subtiles permettent à l'organisme le maintient d’un
équilibre physiologique

Tout ce que ce fixe sur une protéines est appelé ligand.
Le ligand peut être nécessaire à la réaction enzymatique,
avoir un rôle structurale ...
Cela inclus, le substrat, le produit, un régulateur
allostérique etc..

Mode d’action d’une enzyme:

 L’étude cinétique d’une réaction enzymatique consiste en
l’étude de la vitesse de la réaction et de l’influence de divers
paramètres susceptibles de la modifiée.
 La vitesse d’une réaction enzymatique est la quantité de
substrat transformé( ou de produit apparu) par unité de
temps.
 Le phénomène fondamental de l’action enzymatique est que
pour agir l’enzyme doit se combiner au substrat puis le
transformer en produit et retrouver sa structure initiale:
S + E ES P+ E

Mécanisme général d'une enzyme
S P
Enz
Une enzyme (Enz) transforme un substrat (S) en produit (P).
S ES
1-Première étape. Le substrat se fixe sur l'enzyme
2-Deuxième étape: la catalyse . Le substrat est transformé en produit
EPES
3-Troisième étape. Le produit est relâché
EP E+P
K1
K -1
K2
K-2
K3
K-3
Si il y a plusieurs substrats. La réaction se fera étape par étape.

E + S E S E + P
K1
K -1
K cat
K constante de vitesse caractérisant le passage de l’enzyme d’un
état à l’autre
K1: Constante d’association (formation du complexe ES) réversible
K-1: Constante de dissociation du complexe ES
K cat: Constante catalytique qui correspond au nombre
d’évènements catalytiques par seconde et par site actif (ordre de
grandeur 103/s)

Influence de la durée: vitesse de réaction enzymatique
en fonction du temps
 La réaction enzymatique peut être divisée en deux phases:
 Phase stationnaire correspond à la période initiale de la réaction
au cours de la quelle la vitesse (Vo) est constante et indépendante
de la concentration du substrat; nous nous trouvons face à une
cinétique d’ordre zéro.
 Ceci implique que Vo est proportionnelle à la [E]
 Une phase d’équilibre: au cours de cette période, l’évolution de
[S] est exponentiellement décroissante et
[P] exponentiellement croissante.

Franck Rencurel, 2019
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en fonction du temps
On mesure la vitesse d’une réaction enzymatique en fonction de la
concentration en enzyme.
On se place à une concentration de substrat largement suffisante (non
limitante)
On remarque que la vitesse de réaction augmente avec la concentration
en enzyme.
[E]
v

en fonction du temps.
Evolution de la vitesse de réaction en fonction de la [S] avec une
concentration [Enz] fixe et limitée.
Dans un premier l’augmentation de la vitesse est linéaire puis tend
vers un plateau qui caractérise la vitesse maximale (Vmax).
Vmax
Vmax
2
Km
[S]
v

Vmax
Vmax
2
Km
[S]
v
Vmax n’augmente plus malgré l’abondance de substrat car tous les sites
catalytiques sont occupés
On trace l’hyperbole à l’aide de l’équation de Michaelis-Menten
v Avec Km= K-1 + Kcat
K1
Kcat <<<< K-1 et K1 on peut donc simplifier en écrivant Km= K-1
K1
mmol/min
produit formé

Km défini une constante d’affinité. C’est elle qui caractérise l’équilibre
de
dissociation du complexe ES en E+S
Ainsi plus le Km est grand ( plus K-1est grand par rapport à K1)
moins l’enzyme à une forte affinité pour le substrat
E + S ES
K1
K-1
Le Km et la Vmax sont les deux paramètres permettant
d’apprécier l’activité d’une enzyme.
Pour des facilité expérimentale et de représentation on peut
représenter 1/v en fonction de 1/[S] pour obtenir une droite.
C’est la représentation de Lineweaver-Burk

Représentation de Lineweaver-Burk
1/v
1 / Vmax
1/[S]
-1 / Km
1
Vmax
Km
Vmax
1
[S]
1
V
= + -

 Le Km peut aller de 10-6 mol/l pour les enzymes très
actives comme les peroxydases, à 10-2 mol/l pour les
enzymes peu actives comme les enzymes
protéolytiques.
 La connaissance du Km d’une enzyme est importante
car une enzyme à Km élevé ne pourra agir avec
efficacité dans la cellule que si le substrat s’y trouve à
concentration élevée ou ne sera pas saturée dans ces
mêmes conditions (exemple Glucokinase)

http://glycolysis.co.uk/hexokinase.php
glucokinase
Km glucose= 17mM
0 5 10 15 20 mM glucose
Hexokinase (1,2,3)
Glucokinase
Vmax
33
v
Vmax/2
Franck Rencurel, 2019

Influence de la température sur la cinétique enzymatique
Pour qu’une réaction ait lieu il faut que S rencontre E et que les deux aient
suffisamment d’énergie pour s’activer (liaison, changements
conformationnels..).
L’énergie d’activation fournie sous forme d’énergie thermique. Au-delà de 40-
45°C (sauf exception d’enzymes bactériennes) la protéine (Enz) est
dénaturée et perd son activité catalytique
v
T° C
Vmax
T° optimale

Influence du pH
La réaction enzymatique peut être rapidement perturbée par des
variations de pH bien avant La dénaturation de l’enzyme.
Les variations de pH modifient la ionisation (les charges) dans le
site actif (si présence d’acides aminés chargés Arg, His, Lys, Glu,
Asp)
Le pH peut modifier la charge du substrat
Ces modifications empêchent la bonne formation du complexe ES
On définit un pH optimal avec des conditions strictes n’admettant
pas des variations au-delà de +/- 0,5 pH
La plupart des enzymes de notre organisme ont un pH
optimal proche de 7, le pH Physiologique
Les enzymes gastriques comme la pepsine ont un pH optimal
proche de 2
Le bicarbonate libéré dans le grêle tend à augmenter le pH du
chyme pour permettre l’activité des enzymes pancréatiques

Les inhibiteurs
Un grand nombre de molécules sont capables d’interagir avec une
enzyme et de ralentir ou stopper la réaction. Cela permet un contrôle
de voies métaboliques.
Les inhibitions peuvent être irréversibles (pharmaco, bactéries) ou
réversibles.
Les inhibiteurs peuvent se fixer sur le site de liaison du substrat et
entrer en compétition: Inhibition compétitive
Ou se fixer sur un site spécifique (allostérique) différent et moduler
l’activité de l’enzyme: inhibition non compétitive ou allostérique

Inhibition compétitive
Les inhibiteurs compétitifs ont une analogie de structure avec le
substrat et le site catalytique de l’enzyme
Enzyme
Inhibiteur
Compétition pour
le site catalytique
Substrat
E ES E+P
EI
(+S)
(-S)
(- I) (+ I)
La direction prise dépendra de:
[S] et [I]
Affinité de E pour S ou I

Inhibition compétitive
L’augmentation de [I] favorise la dissociation du complexe ES
K-1 augmente et K1 diminue  Km augmente affinité de E pour S est
affectée.
Un inhibiteur compétitif diminue la vitesse de réaction en diminuant la
proportion d’enzyme liée au substrat.
Même si elle est plus longue à atteindre la Vmax n’est pas affectée.. En
augmentant [S] par rapport à [I] on lève l’inhibition.
Km= K-1
K1
Vmax
v
[S]
Sans inhibiteur
Avec
inhibiteur
Km (i) > Km

Inhibition non compétitive
Enzyme
Substrat
Inhibiteur
La fixation de l’inhibiteur n’entre pas en
compétition avec le substrat.
La liaison de S sur E ne change pas le
Km ne change pas.
Seule la Vmax est diminuée
Ainsi l’augmentation de [S] ne peut pas
s’opposer à l’effet de l’inhibiteur
E ES E+P
EI
(+S)
(+ I)
ESI
(+ I)

E ES E+P
EI
(+S)
(+ I)
ESI
(+ I)
Inhibition non compétitive
Seul le couple ES peut aboutir à
une activité. La Vmax est
diminuée. Le Km ne change pas
v
[S]
Vmax
Vmax
Km
Vmax/2
Vmax/2
Avec inhibiteur
non compétitif
Sans inhibiteur

Activation d’enzymes
Dans certains cas particuliers, des enzymes sont produites sous
forme inactive et nécessitent l’intervention d’autres facteurs pour
les activer.
Exemple des enzymes pancréatiques.
Ce sont des protéases. Si elles étaient produites sous forme
active elles digèreraient les protéines du pancréas.
Pour éviter cela, elles sont libérées sous forme inactive dans la
lumière de l’intestin grêle puis activées par l’intervention d’une
enzyme présente dans l’intestin(cellules intestinales ou bactéries
de l’intestin)

Pro-enzymes
Duodenum
pancréas
Trypsinogène
Trypsine
Entérokinase
enzymes
PST1
Enzyme produite
par les cellules
De l’intestin
Les cellules de l’intestin
sont protégées de la
digestion enzymatique
grâce au mucus
Sorte de liquide protecteur
en surface des cellules

Chymotrypsinogène
Proélastase 2
Proprotéase E
Kallikréinogène
Procarboxypeptidase A
Procarboxypeptidase B
Prophospholipase A 2
Procolipase
Trypsinogène
Elastase 2
Protéase E
Kallikréine
Carboxypeptidase A
Carboxypeptidase B
Phospholipase A 2
Colipase
Trypsinogène Trypsine
Entérokinase
duodénale
Enzymes inactives Enzymes actives
Activateur

Notion d’enzyme allostérique
La cinétique de certaines enzymes ne suit pas un modèle Michaelien
(hyperbole) Mais suit une courbe sigmoïde
v
[S]
Vmax
Sigmoïde
Hyperbole (Michaelienne)

Notion d’enzyme allostérique
Une courbe sigmoïde décrit principalement (sauf exceptions)
une enzyme de structure multimèrique, ayant plusieurs sous-unités.
L’enzyme possède autant de sites actifs que de sous unités.
L’occupation d’un site par le substrat modifie l’affinité du second site
pour le même substrat
T T
R R
R R
T: Tense (tendue)
R: Relax (relachée)
Sous forme « tendue » le substrat met plus de
temps
À accéder au site actif.
La liaison du substrat relache (relax) les autres sites
actifs améliorant l’accés au substrat, l’activité
augmente

7-Intérêt des enzymes en clinique
et industrie agro alimentaire

Intérêt des enzymes en clinique et industrie agro alimentaire
Diagnostique: exemple des transaminases dosées dans le plasma
et révélant des lésions hépatiques
Diagnostique de maladies métaboliques congénitales:
Fructosémie, galactosémie, glycogénose..
En industries: boulangerie, laiterie,
Transformation de l’amidon de maïs en sirop de glucose ou
fructose par l’action d’enzymes
Les enzymes peuvent être à l’origine du développement de
saveurs(acides gras dans le gras du jambon cru développant des
arômes
Rancissement du beurre

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