BTS diététique acides nucléiques génie biologique

Les acides nucléiques
Franck Rencurel, Ph D
BTS diététique 2019-2020
1Franck Rencurel, 2020

Franck Rencurel, 2020 2
Objectifs pédagogiques
A la fin de la leçon vous devez être en mesure de décrie la
structure Chimique d’un acide nucléique et faire la
différence entre ADN et ARN
Connaitre et pouvoir expliquer les mécanismes de
réplication, transcription et traduction
Connaitre le principe du code génétique

Plan du cours
Partie 1: Structure des acides nucléiques
Partie 2: Biologie moléculaire
La réplication de l’ADN
La transcription
La traduction
Exemple d’utilisation en génie génétique
Les nucléotides
Structure primaire et secondaire de l’ADN
Le code génétique

On connait plus de 10 000 protéines chez l’homme
Chaque protéine est caractérisée par sa séquence en acides aminés
Pour assembler les bons acides aminés et dans le bon ordre
(séquence) Il faut une recette!
La recette c’est le code génétique
Le livre de recettes est contenu dans l’ADN
Séquence en AA de l’insuline

Décryptage de la structure de l’ADN en 1953 Prix Nobel de médecine en 1962
Rosalind Franklin n’aura pas le prix
Nobel car décédée en 1958

Introduction
Deux familles d’acides nucléiques: ADN et ARN
Tailles et fonctions différentes
L’ADN est dans le noyau (et un peu mitochondrie), il porte
l’information Génétique de l’individu (le code génétique)
L’ARN est sous 3 formes: ARN messager, ARN ribosomal, ARN
transfert
(plus récemment des micro ARN ont été découverts  )
ARN messagers Servent à décoder l’information génétique de
l’ADN et transferts l’info du noyau vers le cytoplasme site de la
synthèse protéique.
ARN transfert: Transportent les AA de façon spécifique vers les
ribosomes
ARN ribosomal: Servent à maintenir la structure des ribosomes

Acides nucléiques
Le monomère constitutif de l’ADN est le nucléotide.
Un nucléotide est l’association de 3 éléments:
1 sucre le 2-déoxyribose (ribose pour les ARN)
1 acide phosphorique
1 base azotée

Acides nucléiques
Phosphate Sucre Base
Nucléoside
Nucléotide
=
Nucléoside+phosphate

bases azotées
 Il existe 4 bases azotées:
◦ Purines:
 Adénine
 Guanine
◦ Pyrimidines
 Cytosine
 Thymine
 Uracile
Celle-ci on se la garde pour plus tard
A G
C T U

Les bases pyrimidiques absorbent la lumière UV à
260nm ce qui est pratique pour doser les acides
nucléiques en solution par spectrophotométrie
Parallèlement on détermine leur pureté en mesurant
l’absorbance à 280 nm qui estime la présence de
protéines
En mesurant l’absorbance d’une solution d’acide nucléique pure à 260 nm, on
obtient sa concentration à l’aide de l’équation de la loi Beer-Lambert.
En pratique, c’est une équation modifiée qui est employée :
cm = (A.e) / l
cm = concentration massique d’acide nucléique en ng/µl
A = absorbance à 260 nm
e = coefficient d’extinction massique ou la constante en ng.cm/µl
l = trajet optique en cm

Le coefficient d’extinction ε dépend de la séquence d’ADN ou d’ARN et est
spécifique à chaque ADN/ARN. Ci-dessous, les coefficients d’extinction des
différents nucléotides :
En pratique, il n’est pas nécessaire de calculer le coefficient d’extinction (ε)
spécifique. Des coefficients d’extinction estimatifs, sont généralement utilisés
pour calculer les concentrations des acides nucléiques et qui sont
suffisamment précises pour les expériences de biologie moléculaire.
Ces coefficients d’extinction sont listés ci-dessous :
•ADN double brin = ~50 ng.cm/µl
•ADN simple brin = ~33 ng.cm/µl
•ARN = ~40 ng.cm/µl

Ainsi dans une cuvette de trajet optique d’1cm on estime donc
que:
1 unité A260nm = ~50 µg/ml d’ADN double brin
1 unité A260nm = ~33 µg/ml d’ADN simple brin
1 unité A260nm = ~40 µg/ml d’ARN simple brin
On estime la pureté d’une solution par le rapport
d’absorbance 260/280 nm
D’une manière générale, la pureté d’une solution d’acide nucléique
est considérée comme acceptable lorsque le ratio A260 nm/A280
nm est compris entre 1,8 – 2,0 pour l’ADN et entre 2,0 – 2,2 pour
l’ARN
L’absorbance à 280nm indique la présence de protéines dans la
solution (tryptophane absorbe à 280nm)

Liaisons phosphodiester
Si dans l’ADN il y a 4 bases azotées différentes
(A,T,G,C) alors Il y a 4 sortes de nucléotides
Les nucléotides peuvent se lier les uns aux autres par
leur phosphate et leur sucre

L’association de 2 monomères de
nucléotides se fait par une réaction
d’estérification entre la fonction acide libre
de l’acide phosphorique
portée en 5’ du premier nucléotide et
l’alcool porté par le carbone 3’ du
deuxième nucléotide
Cette opération peut se répéter un grand
nombre de fois pour donner
une chaine composée de « sucre-
phosphate-sucre-phosphate.. »
Sur chaque sucre est accroché une base
azotée
La structure primaire de l’ADN: Nature
des nucléotides et ordre de succession,
c’est ce qu’on appelle la séquence d’un
brin d’ADN
Chaque brin comporte une extrémité 5’
libre et une extrémité 3’ OH libre.
sucre
Phosphate

les polynucléotides
Les nucléotides et les déoxynucléotides
forment des polymères appelés
polynucléotides
Les nucléotides sont liés ensemble via une
liaison phosphodiester;
◦ Implique le 3’OH d’un nucléotide et le
phosphate a en positon 5’ d’un autre
nucléotide;
L’ordre des bases dans un polynucléotide
est la structure primaire ou la séquence
de l’acide nucléique;
Les polynucléotides ont une polarité:
◦ Extrémité 5’ : le phosphate 5’ n’est pas
impliqué dans une liaison phosphodiester
◦ Extrémité 3’ : le 3’OH n’est pas impliqué
dans une liaison phosphodiester;

Si on sépare les nucléotides d’une molécule d’ADN
on aura toujours des appariements
A=T et G= C avec le même nombre de A que de T
et de G que de C
Même si il peut y avoir plus de AT ou de GC selon
les espèces considérées
Pourquoi cet appariement spécifique entre
nucléotides ?

Dans la séquence
des brins d’ADN on ne
peut avoir que:
A face à T
C face à G
Les séquences sont
dites complémentaires
A et T sont reliées par
deux ponts hydrogènes
(liaisons faibles)
C et G par 3 ponts
hydrogènes.
A
AT
T
G
G

Si j’ai la séquence suivante d’un brin d’ADN :
5’- A-T-G-C-G-A-C-C-G-T-OH 3’
Quel sera la séquence du brin complémentaire ?
3’OH-?- ?-?- ?- ?-?- ?- ?-?- ?-5’

La double hélice d’ADN
Les 2 brins sont orientés et antiparallèles
Liaisons hydrogènes
Les liaisons hydrogènes sont possibles seulement si les
atomes sont suffisamment proches. Seule une orientation
antiparallèle permet se rapprochement

5’
5’
3’
3’
Guanine
Cytosine

La structure secondaire de l’ADN

C’est l’orientation antiparallèle des brins qui donne la
structure en double hélice de l’ADN

Petit sillon
12 nm
Grand sillon
22 nm
1 tour d’hélice
3,4 nm
Soit 10 paires de bases

La longueur totale de l’ADN contenu dans le noyau
d’une cellule est de 2 mètres avec un diamètre de
seulement 2nm
Comment faire tenir une telle longueur
d’ADN dans un petit volume comme le
noyau de la cellule?

ADN bactérien
Hors d’une bactérie
Éclatée (choc osmotique)
L’ADN bactérien est court,
N’est pas dans un noyau
Est nu !
(voir suite du cours) 

Pour faire tenir l’ADN dans le noyau il faut le compacter et
ceci grâce à des protéines, les histones
L’ADN compacté autour des
histones constitue La
CHROMATINE
Cette chromatine est enroulée
pour former les chromosomes
46 chromosomes chez
l’homme
(dans chaque cellules!)

Dans les bactéries, l’ADN est nu, càd qu’il n’y a pas
d’histones associées
2,5 tours autour de chaque histone

Chaque histone est constituée de 8 protéines (H2A,H2B,H3 et
H4) associées entre elles, l’histone H1 maintien la structure.
Cela constitue un nucléosome
Ces protéines sont soumises à l’action d’enzymes (acétylase)
modifiant leur forme ce qui les dissocie entre elles rendant libre
l’ADN pour être lu ou dupliqué
Nucléosome=
ADN + histone

Franck Rencurel, 2020
32
L’ADN ainsi enroulé autour des histones, formant la chromatine
peut se compacter (super enroulé) et former un chromosome
Compaction
des nucléosomes
(ADN super enroulé)
Nucléosome
(ADN enroulé)
Les fibres de chromatine
Sont de l’ADN super
enroulé Compacté !

ADN de liaison
libération de la partie centrale
du nucléosome
DIGESTION PAR
NUCLEASE DE
L’ADN DE LIAISON
nucléosome
~200 pb
DISSOCIATION PAR FORTE
CONCENTRATION DE SEL
Chromatine « en collier de perle »
noyau d’histones
du nucléosome
Purifier des histones
et de l’ADN

noyau d’histone
octamérique
double hélice d’ADN
146 pb

Dans Certaines régions du chromosome (actives) l’ADN est nu et
décompacté pour permettre sa lecture

Pour « fabriquer » un être humain il faut 30 000 à 40 000
gènes. L’ensemble de ces gènes constitue le génôme
Le gène est un fragment d’ADN qui contient l’information
nécessaire à la fabrication d’une protéine.
Tous ces gènes sont répartis dans 23 molécules de
chromatine, chaque molécules de chromatine comprend
plusieurs milliers de gènes mis bout à bout.
Ce qui représente plus de 3 milliards de paires de bases
(A=T ou G=C)

Chaque cellule (sauf les gamètes) contient deux
exemplaires du génome, 1 qui vient du père et 1 qui
vient de la mère
Donc chaque cellule contient 23 paires de
chromosomes
Chez l’homme chaque cellule (hors gamètes)
contient 46 chromosomes
Le nombre de chromosome varie selon les espèces:
Chien……………………78
Rat………………………..42

Le code génétique

ADN= information codée =code génétique
Code= faire correspondre un symbole ou un
groupe de symboles à quelque chose d’autre

64= 43
Combien y a-t-il de combinaisons
possibles ?

Une protéine est une séquence d’acide aminés.
Il existe 20 acides aminés donc un code de 4 billes
regroupées 3 par 3 est largement suffisant (43=64).
Dans le noyau on peut remplacer les billes par les
nucléotides (A,T,G,C soit 4 couleurs) .
Si on les regroupe par 3 en désignant 1 acide aminé
correspondant à un triplet de nucléotides on a
suffisamment de possibilités pour « CODER » les 20
acides aminés. Chaque triplet de nucléotide désigne
un acide aminé
Phe Arg Leu LeuPhe

Combien de nucléotides y-a-t-il dans le gène codant
pour une protéine de 100 Acides aminés?

Start

La réplication de l’ADN

Réplication de l’ADN
 Pendant la réplication de
l’ADN, une molécule d’ADN
est copiée en deux
molécules filles, et ce
suivant les règles établies
par Watson et Crick:
1-Complémentarité des
deux brins (pairage des
bases)
2-Antiparallélisme (i.e. les
deux brins courent en
direction 5’3’ opposées);
5’AGCTAGCTGATATCGCGATCG3’
3’TGCATCGACTATAGCGCTAGC5’

Il faut d’abord « ouvrir » le double brin d’ADN
puis des nucléotides libres dans le noyau
(toujours présents en excès) viennent s’apparier
par complémentarité aux deux brins séparés.

Le Réplicon est l’unité de réplication de l’ADN, il
contient une origine et une terminaison .
L’ADN peut être répliqué à plusieurs endroits en même
temps, sans cela la réplication de l’ADN eucaryote
durerait 800 heures !.
Les réplicons sont des segments de taille variant de 30
000 à 150 000 bases. La vitesse de synthèse va
jusqu’à 50 000 pdb/min pour les eucaryotes (plus
rapide chez les procaryotes car par d’histones) .
L’origine de réplication n’est pas localisée au hasard
sur la molécule d’ADN, elle est présente entre des
petites séquences répétée (le promoteur) reconnue
par des protéines (les facteurs de transcription).

Réplicon

53
La fourche de réplication
3’
Fourche de
réplication
5’
3’
5’
5’
3’
3’
5’
Direction de la
fourche de réplication
Les enzymes permettant la synthèse du fragment
d’ADN complémentaire ne peuvent fonctionner que
dans le sens 5’ 3’
« Ouverture » de l’ADN
double brins

54
Chez tous les
organismes vivants, la
réplication de l’ADN se fait
toujours dans la direction
5’3’:
Le brin fille est allongé
par
l’addition de nouveaux
nucléotides à son bout 3’
où se trouve un –OH
Ce qui permet la liaison
phospho-ester
Pourquoi 5’  3’ ?

ADN hélicase
« ouvre» le double brin
L’ADN polymérase
Apparie les nucléotides le long du brin ouvert
Dans le sens 5’  3’
5’3’
5’ 3’
Il faut un double brin pour que la Polymérase s’attache. Il ya donc ajout
d’une amorce mais c’est de l’ARN (T U) . Cette amorce sera ensuite
dégradé et remplacée par de l’ADN (U T)

Séquence des évènements:
1- L’ADN hélicase ouvre l’ADN
2- Une Primase synthétise une amorce
Cette enzyme peut se fixer sur un simple brin d’ADN mais elle
ajoute des U en place des T (c’est de l’ARN)
3-L’ADN polymérase reconnait le fragment double brin et se fixe
dessus. La synthèse peut commencer 5’3’
Sur le brin majeur , l’ADN polymérase avance jusqu’au codon STOP
Sur le brin mineur elle avance par fragment. (les fragments
d’OKASAKI)
4-Une ADN ligase comblera les « trous » entre chaque fragment du
brin mineur
5- Les amorces d’ARN sont éliminées et remplacées par de l’ADN
par une autre isoforme d’ADN polymérase

57
La Primase
 L’ADN polymérase II ne peut
fonctionner que si une extrémité
3’OH est disponible pour catalyser
la formation d’un lien
phosphodiester;
 En d’autres mots: avant que l’ADN
pol ne puisse agir, la synthèse de
l’ADN doit déjà être
débutée…QUOI???
 Ce bout 3’OH est fourni par une
enzyme appelée ADN primase.
 L’ADN primase synthétise une
courte (10 nt) amorce d’ARN
complémentaire au gabarit d’ADN;
 L’ADN pol I replacera plus tard
cette amorce d’ARN par de l’ADN;

 Matériel nécessaire pour la réplication de l’ADN:
◦ Gabarit d’ADN (i.e. la molécule parentale d’ADN);
◦ Les 4 deoxynucléotides triphosphate (dATP, dGTP,
dCTP, dTTP);
◦ ADN polymérase (enzyme)
◦ Une amorce d’ADN ou d’ARN pour initier la
réplication.
◦ Là vous avez les ingrédients pour amplifier de l’ADN
ou de l’ARN en laboratoire!

Synthèse protéique
Transcription
Traduction

L’information est CODEE dans l’ADN qui se trouve dans le
noyau or
la synthèse des protéines se fait dans le cytoplasme (au niveau du
RER)
L’ADN ne sort pas du noyau il doit d’abord être transcrit
(recopié) sous forme d’ARN qui transitent vers le cytoplasme
Acide Ribo Nucleique

ADN Transcrit
primaire
ARNm
Noyau
1 : régulation de la transcription
2 : régulation de la maturation
3: régulation de l’exportation
ARNm
4 : dégradation de l’ARNm
5 : localisation des transcrits
6 : édition
7 : régulation de la synthèse protéique
8 : régulation de l’activité protéique
9: régulation de la dégradation protéique
Protéine
Active/inactive Protéine active
Cytoplasme
1 2 3
4
7
8
ARNm 9
6
5 9

Structure des gènes chez les eucaryotes
Chez les procaryotes : Presque tout l'ADN code pour des
protéines.
Chez les eucaryotes, seulement 3%-5% de l'ADN code
pour des protéines ou des ARN ribosomaux ou de
transfert (voir suite cours).
Les 95%-97% restant sont abusivement qualifiés de
"junk" DNA (ou "garbage" DNA)
Il est plus raisonnable de parler d'ADN non codant

Les introns
Introns = séquence non codantes situées à l'intérieur des
gènes
Parties codantes = exons
90% de certains gènes = introns
Ex. gène du collagène contient 50 introns!
Taille des introns varie de 31 à 210 000 bases

Lors de la transcription, tout le gène (introns + exons) est
copié en ARNm.
L'ARNm doit ensuite être modifié pour, entre autres, en
enlever les introns = épissage de l'ARN.
ADN
ARN
ARNm

Par rapport à l’ADN la base pyrimidique Thymine (T) est remplacée
par une autre base pyrimidique l’Uracile (U).
 On les trouve dans le noyau et le cytoplasme.
 Un ARN est monocaténaire, orienté 5’P3’OH
mais sa chaîne peut se replier, ie former une
structure secondaire stable (épingle à cheveu)
en formant des liaisons hydrogène entre les bases.
Les ARN majoritaires de la cellule sont:
ARNr 83% (ARN ribosomaux))
ARNt (ARN de Transfert) + micro ARN 15%
ARNm 2%. (ARN messager)
L’ARN est un produit de la transcription de l’ADN par
l’ARN polymérase.
Les ARN

L’ARN diffère de l’ADN par son sucre

Brin d’ADN
Brin d’ARN
complémentaire
5’- A TTGCCGAAT TGT C-OH 3’
3’OH’- UAACGGCUUAACAG-5’
La chaine d’ARN synthétisée est identique au codant
et complémentaire de l’autre brin (brin matrice) (voir
suite cours)

L’ARNm est une copie du fragment d’ADN codant pour une
protéine. Il transporte l’information (la recette) il est appelé ARN
messager. La synthèse se fait aussi de 5’ vers 3’
Brin codant
Brin matrice

Plusieurs brin d’ARNm sont synthétisés simultanément
Vue d’une transcription par ME

Le promoteur n’est pas transcrit

L’ARN polymérase se fixe au bon
endroit sur le gène pour
commencer au début et non au
milieu!
Pour se faire des protéines
(facteurs de transcriptions)
s’assemblent sur le site de départ
du promoteur, La TATA box, ainsi
que des sites spécifiques proches
afin d’être reconnues par l’ARN
polymérase.
La polymérase commencera
donc au début du gène
TATA box

Facteurs de transcription
Petites protéines nucléaires (mais pas toujours) qui possèdent un ou
plusieurs motifs leur permettant de s’associer très spécifiquement
à une séquence d’ADN donnée.
La protéine possède
•un domaine de régulation (qui contrôle sa liaison à l’ADN
Ou à d’autres protéines.
•un domaine d’activation ou d’inhibition de la transcription
•Un domaine d’interaction avec d’autres facteurs ou protéines
Certains on un site de liaison d’un ligand, on les appelle des
récepteurs Nucléaires (exemple le récepteur à la vitamine D ou aux
stéroïdes)

Facteurs associés
à la transcription
(communs)
Facteurs de transcription
(inhibition /activation)
Facteurs de transcription, exemple

Les ARN sont modifiés (maturés) afin d’être plus stables
et reconnus par les ribosomes c’est une spécificité
des eukaryotes.
 Ajout d’une « coiffe » en 5 ‘: une 7 methyl guanosine
est ajoutée à l’extrémité 5’ empêchant la dégradation de l’ARN
par une 5’ nucléase.

L’extrémité 3’ de la
plupart des ARNm
eucaryotes est
polyadénylée.
Une fois la transcription
achevée, des AMP seront
ajoutés par une poly(A)
polymérase pour former
une queue poly(A).
La polyadénylation facilite
l’exportation des ARNm
hors du noyau, les protège
des dégradations une fois
dans le cytosol et facilite la
traduction.
La polyadénylation en 3’ des ARNm
Pour purifier des ARN polyA on utilise des colonnes avec des Poly T 
Chromatographie d’affinité ()

20% des maladies génétiques sont dues à des erreurs d'épissage.
Maturation des ARN m
mature

Synthèse protéique ou Traduction

La traduction
La synthèse des protéines (assemblage des acides
aminés) se fait au niveau des ribosomes situés sur la
membrane du réticulum endoplamique granuleux (rugueux)

Pour synthétiser la protéine, il faut:
• ARNm = information (la recette)
• Ribosome = machine à assembler les acides aminés.
• Acides aminés = pièces de construction.
• ARNt (ARN de transfert) = molécules qui transportent
les acides aminés du cytoplasme au ribosome où ils
sont assemblés en protéine.

Les ribosomes

Acides aminés en vert
Modélisation d’un ribosome procaryote

L’ARNt ou ARN de transfert

Deux zones importantes sur l'ARNt :
Extrémité 3' (se termine
par CCA) : peut se lier à
un acide aminé
Anticodon = zone formée de
trois nucléotides pouvant se
lier à l'ARNm (par
complémentarité des
séquences)

Chaque ARNt est caractérisé par son anticodon.
Un ARNt ne transporte pas n'importe quel acide
aminé: ça dépend de l'anticodon
Ex.
ARNt AAA transporte toujours l'acide aminé PHE
ARNt GAU transporte toujours l'acide aminé LEU
(cf voir code génétique)
Le bon acide aminé est attaché à l ARNt par l’enzyme
Aminoacyl-ARNt-synthétase

Ainsi on a vu que de l’ADN ne servait pas seulement à
Coder pour des protéines mais pouvait servir à
synthétiser des ARN r et des ARN t.
Un gène est donc un fragment d’ADN codant pour un
ARN

Les deux sous-unités du ribosome s »’assemblent
autour du brin d’ARNm.
D’abord la petite sous unité puis ensuite la grande

Mécanisme de la traduction
Le site A (Aminoacyl) reçoit les ARNt portant un acide
aminé (ARNt aminoacyl)
Le site P (peptidique) contient un autre aminoacyl-t -
ARN mais à ce stade il y a liaison peptidique avec l’AA
voisin

Les aminoacyl-ARNt, portant les acides aminés se
fixent sur le site A du ribosome.
Il y a une exception avec la PREMIERE methionine
(codée par TACdans l’ADN ou AUG dans l’ARNm
complémentaire) qui se fixe sur le site P afin de laisser
la place sur le site A à un aminoacylt-ARNt et permettre
La première liaison peptidique.
Ensuite la chaine peut commencer sa synthèse en
glissant sur le brin d’ARNm.

Chaque ARNt se fixe par son anticodon sur trois nucléotides de
l’ARNm. Ces trois nucléotides de l’ARNm constituent ce qu’on
appelle un codon. Après leur fixation, les acides aminés qu’ils
transportent sont reliés entre eux par une liaison peptidique.
L’ARNt ayant l’anticodon UAC
se fixe sur le codon AUG.
L’anticodon UGC se fixe sur le
codon ACG
ARNm

Un autre
ARNt se
met en
place
Le ribosome avance de
trois unités
Le
premier
ARNt
est
retiré.
Sens de la traduction

Vitesse de la synthèse:
• Chez E. coli ~ 5 AA / s
• Chez eucaryotes ~ 16 AA / s
Tous les ARNm se terminent par le codon (triplet de
bases) UAA, UAG ou UGA = codons STOP.
Lorsque le ribosome atteint un codon STOP, une enzyme
(facteur de terminaison) s'y fixe et détache l'ARNm du
ribosome.
 le ribosome se sépare en deux, fin de la traduction
Les deux unités se réuniront à nouveau si un ARNm se
fixe à la petite unité.

Chaque triplet de nucléotides
sur l'ADN (brin sens)
correspond à un codon de
l'ARNm.
Chaque codon de l'ARNm
correspond à un anti-codon
spécifique de l'ARNt.
Chaque anti-codon
correspond à un acide aminé
spécifique.
DONC: chaque triplet de nucléotides sur l'ADN
correspond à un acide aminé.

Génie génétique

En sachant manipuler l’ADN on peut maintenant faire de
nombreuses choses
Identifier des mutations responsables de maladies
Corriger ces mutations
Faire exprimer des protéines manquantes dans un
organisme
Faire produire des protéine d’une autre espèce
dans un organisme
Cloner un organisme
Détecter des traces d’ADN à des fins judiciaires
Détecter des traces d’ADN pour identifier une
espèce à partir d’ossements (paléontologie)
Etc..

On isole l’ADN codant de l'insuline humaine et on l'introduit dans le
plasmide d'une bactérie.
Ex. production d'insuline humaine par une bactérie :

Le gène contient des introns et des exons or la bactérie ne
sait pas faire l’épissage des introns il faut donc utiliser un
ADN sans introns
Comment faire?
ADN
ARN
ARNm
En utilisant un ADN complémentaire obtenue à partir
de l’ARNm

3’OH’- UAACGGCUUAACAG-5’
3’OH’- UAACGGCUUAACAG-5’ARNm
purifié
Synthèse d’un fragment d’ADN complémentaire à l’ARN
Purification du brin d’ADN et synthèse du double brin
3’OH’- T AACGGCTT AACAG-5’

3’OH’- T AACGGCTT AACAG-5’
Ce double brin d’ADN contenant la séquence complète
(la recette) de l’insuline peut être introduit dans un
organisme pour fabriquer de l’insuline.
On peut utiliser la bactérie (rapide, facile à utiliser,
facile à purifier le contenu)
On utilise un plasmide, qui est un vecteur permettant
d’introduire le fragment d’ADN dans l’hôte

Plasmides
 Petites molécules d’ADN circulaires
maintenues et amplifiées chez des
cellules eucaryotes (primitives i.e
levures) ou procaryotes
 Amplification chez les bactéries
 Utilisés en tant que vecteur pour le
clonage ou l’expression d’ADN
d’intérêt

Caractéristiques des Vecteurs Plasmidiques
 Sites de restrictions
uniques pour le clonage
 Origine de réplication
(Ori)
 Marqueur de sélection
Gènes de résistance aux
antibiotiques

On extrait les plasmides
de bactéries
Une enzyme de
restriction ouvre les
plasmides
On extrait ou on
synthétise
l’ADNc à greffer
et on le multiplie
en de nombreux
exemplaires.
On mélange des copies
de l’ADNc et des
plasmides.
Une enzyme (ligase)
fusionne les brins
d'ADN
Les plasmides sont
réintroduits dans des
bactéries
Le plasmide est
reproduit quand la
bactérie se multiplie

Enzymes de restriction
 Pour insérer le fragment d’ADN dans le vecteur
plasmidique on utilise des enzymes de restriction
 Clivent les 2 brins d’ADN à des séquences
spécifiques (4-8 nt)
 Nommées pour l’organisme duquel c’était isolé
(e.g. EcoRI est isolée d’Escherichia coli)
 La digestion produit 3 sortes de bouts

 site de coupure = palindrome
5'-GGATCC-3'
3'-CCTAGG-5'
5’ 3’
3’ 5’
site de coupure
(4-8 nt)
ADN double brin
Extension 5’

 site de coupure = palindrome
5'-GGATCC-3'
3'-CCTAGG-5'
5’ 3’
3’ 5’
site de coupure
(4-8 nt)
Extension 3’

5’ 3’
3’ 5’
site de coupure
(4-8 nt)
Bouts francs

 clivent les 2 brins d’ADN à des séquences
spécifiques (4-8 nt)
 nommer pour l’organisme duquel c’était isolé
(e.g. EcoRI est isolée d’Escherichia coli)
 digestion produit 3 sortes de bouts
1. extension 5’
2. extension 3’
3. bouts francs
Bouts cohésifs

Si aux extrémités de mon ADNc j’ajoute des séquences qui
correspondent aux sites de coupure du plasmide je peux
« coller » l’ADN dans le plasmide et dans le bon sens!
ADNc allongé de sites de restrictions
correspondants

Merci !

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