Année universitaire 2014-2015
Méthodes d’extraction et de purification des enzymes
Microprojet
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CHEB...
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Liste des figures
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Introduction 1
Chapitre 1. Généralités sur les enzymes
1- Définition
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Chapitre 3. Purification des enzymes
1- Définition
2- Objectifs de la purification des enzymes
3- Méthodes de purification...
LISTE DES FIGURES
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Figure 1. Représentation schématique d’un processus d’isolement et de purification d’une
enzyme…………...
Introduction
1
Le mot enzyme a été inventé en 1878 par le professeur Willy Kuhne de l’université de
Heidelberg. Le mot vie...
Chapitre 1. Généralités sur les enzymes
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1-Définition
Les enzymes sont des catalyseurs des réactions chimiques qui se dér...
Chapitre 1. Généralités sur les enzymes
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2- Propriétés des enzymes
D’après DESCAMPS (2008), on peut résumer les propriété...
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4-Domaines d’application des enzymes dans l’industrie agro-alimentaire
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Chapitre 1. Généralités sur les enzymes
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Enzymes
protéolytiques
(Protéases)
Aspergillus oryzœ
(moisissure)
Bacillus subti...
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1-Définition et principe
Le mot extraction est formé de deux mots d’origine latine : «...
Chapitre2. Extraction des enzymes
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3-2 Méthodes mécaniques
 Congélation-décongélation
Suite à un refroidissement brusque...
Chapitre2. Extraction des enzymes
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Figure 2. Schéma représentant l’appareil utilisé dans l’extraction par billes de verre...
Chapitre2. Extraction des enzymes
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Après l’extraction, les phases sont séparées, dans le cas des protéines qui ne sont pa...
Chapitre 3. Purification des enzymes
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1. Définition
La purification est un ensemble d’opérations visant à enlever toutes...
Chapitre 3. Purification des enzymes
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Le sulfate d’ammonium (SA) est utilisé comme un sel favorisant la précipitation : ...
Chapitre 3. Purification des enzymes
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3.2.2. Centrifugat...
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fonctionnement stable (HAINQUE et al., 2008). On distingue deux types de procédés,...
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affinité différente pour l’une et l’autre des deux phases. Il en résulte une diffé...
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 Chromatographie de partage
Fonctionne par partage de solutés entre deux phases n...
Chapitre 3. Purification des enzymes
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3.3.2 L’électrophorèse
L’électrophorèse est une technique extrêmement puissante po...
Conclusion
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Notre travail avait pour but de mettre en évidence les différentes méthodes
d’extraction et de purification ...
Référence bibliographiques
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1. ABDELLAOUI R. (2007). Obtention et caractérisation d’une enzyme coagulant le lait
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extraction et purification des enzymes

  1. 1. Année universitaire 2014-2015 Méthodes d’extraction et de purification des enzymes Microprojet Thème : Présenté par : CHEBIRA Hadjar MOUSSAOUI Rahima 5e Année ingénieur Devant le jury : Président : Dr KECHID M. MCB I.N.A.T.A.A.-U.C.1 Promoteur : M. GOMRI M. A. MAB I.N.A.T.A.A.-U.C.1 Examinateur : M. BOUGUERRA A. MAA I.N.A.T.A.A.-U.C.1 REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE Université Constantine 1 Institut de la Nutrition, de l’Alimentation et des Technologies Agro-Alimentaires (INATAA)
  2. 2. SOMMAIRE Page Liste des figures Liste des tableaux Introduction 1 Chapitre 1. Généralités sur les enzymes 1- Définition 2- Propriétés des enzymes 3- Sources d’enzymes 4- Domaines d’application des enzymes dans l’industrie agro-alimentaire 5- Schéma général d’obtention d’une enzyme 2 2 3 3 4 5 Chapitre 2. Extraction des enzymes 1- Définition et principe 6 2- Critères de choix et préparation du matériel biologique de départ 6 3- Méthodes d’extraction 3-1- Méthode physiques - Choc osmotique 3-2 - Méthodes mécaniques - Congélation-décongélation - Broyage ou agitation avec des abrasifs - Bombe à disruption - Homogénéisateur d’Elvjm de potier - Les billes de verre - Sonication 3-3- Extraction chimique 3-4- Enzymes lytiques 3-5- Extraction liquide-liquide 3-6- Extraction liquide-solide 6 6 6 7 7 7 7 7 7 8 8 9 9 9
  3. 3. Chapitre 3. Purification des enzymes 1- Définition 2- Objectifs de la purification des enzymes 3- Méthodes de purification des enzymes 3-1- Méthode basée sur les différences de solubilité - Précipitation différentielle au sulfate d’ammonium 3-2- Méthodes basées sur la taille des molécules 3-2-1 Dialyse 3-2-2 Centrifugation 3-2-3 Filtration membranaire 3-3- Méthodes basées sur les propriétés ioniques 3-3-1 Chromatographie - Définition - Principe -Types de chromatographie  Chromatographie par adsorption  Chromatographie par échange d’ions  Chromatographie de partage  Chromatographie d’exclusion  Chromatographie d’affinité 3-3-2 Electrophorèse 10 10 10 10 10 10 11 11 12 12 13 13 13 13 14 14 14 15 15 15 16 Conclusion 17 Références bibliographiques 18
  4. 4. LISTE DES FIGURES Page Figure 1. Représentation schématique d’un processus d’isolement et de purification d’une enzyme………………………………………………………………………………………..5 Figure 2. Schéma représentant l’appareil utilisé dans l’extraction par billes de verre……….8 Figure 3. Précipitation au sulfate d’ammonium……………………………………………...11 Figure 4. Schéma générale d’une dialyse…………………………………………………….12 Figure 5. Chromatographie par échange d’ions……………………………………………...14 Figure 6. Chromatographie d’affinité………………………………………………………..15 LISTE DES TABLEAUX Page Tableau 1. Classification des enzymes par l’ « Enzyme Commission » E.C………………2 Tableau 2. Exemples de quelques enzymes utilisées en industrie agro-alimentaire …………………………………………..…………………………………………………..4-5
  5. 5. Introduction 1 Le mot enzyme a été inventé en 1878 par le professeur Willy Kuhne de l’université de Heidelberg. Le mot vient du grec « en zume », et signifie, de façon assez appropriée, « dans la levure ». Les enzymes sont des biocatalyseurs, ce sont des macromolécules de haute masse moléculaire présentes dans les cellules de tous les organismes vivants (KENT, 2012). Aujourd’hui, la plupart des applications pour les enzymes industrielles se trouvent dans l’industrie agro-alimentaire. L’application de la technologie enzymatique débuta dans les années 1960, avec l’utilisation de la gluco-amylase pour augmenter le rendement et la pureté du glucose produit à partir de l’amidon ainsi que pour faciliter la cristallisation lors de ce procédé (KENT, 2012). Dans l’industrie alimentaire, les enzymes peuvent intervenir lors du procédé de fabrication pour améliorer les qualités de l’aliment comme dans la panification, la fabrication des fromages, ou pour une meilleure conservation (DUPRET et al., 2004 ; SPINNLER, 2008). Les enzymes utilisées en industrie agro-alimentaire sont extraites à partir de différentes sources biologiques (végétale, animal, microbienne) et doivent donc être purifiées dans le but d’obtention de maximum de rendement et de maximum de pureté possible. L’objectif de notre travail est de passer en revue les différentes méthodes d’extraction et de purification des enzymes industrielles décrites par la bibliographie.
  6. 6. Chapitre 1. Généralités sur les enzymes 2 1-Définition Les enzymes sont des catalyseurs des réactions chimiques qui se déroulent chez les êtres vivants, elles possèdent trois caractéristiques essentielles : ce sont des protéines, elles ont une spécificité d’action élevée, et elles augmentent considérablement la vitesse des réactions qu’elles catalysent (SABLONNIERE et CARAYON, 2006). Dans certains cas, pour être active, l’enzyme doit au préalable s’associer avec un coenzyme, qui est une molécule de nature et de structure très variable (NAD, ATP...) (SANTELLI, 2012). En plus des noms dits « traditionnels » donnés pour les enzymes d’après leurs origines, action ou autres considérations. L’Enzyme Commission (EC), a établie une nomenclature des enzymes basée sur quatre nombres précédés de EC. Toutes les enzymes sont regroupées en six classes principales de 1 à 6 qui constituent le premier chiffre de la nomenclature. Le second chiffre indique une sous -classe, le troisième une sous-sous-classe et le quatrième est un nombre arbitraire (SANTELLI, 2012) (Tableau 1). Tableau 1. Classification des enzymes par l’ « Enzyme Commission» (BURSTEIN, 2000). CLASSE Exemples Code EC 1- OXYDO-REDUCTASES (Oxydases, déshydrogénases) Glucose oxydase GOD L-Lactate deshydrogénase LDH E.C.1.1.3.4 E.C.1.1.1.27 2- TRANSFERASES (Méthyl, carbonyl, acyl, amino, glycosyl, phosphoryl) Phosphorylase E.C.2.4.1.1 3- HYDROLASES Acétylcholine estérase Phosphodiestérases -α-amylase -cellulase E.C.3.1.1.7 E.C.3.1.4.1 E.C.3.2.1.1 E.C.3.2.1.4 4- LYASES Carboxylases : -oxalate décarboxylase ammonia-lyases -aspartate ammonia-lyase E.C.4.1.1.3 E.C.4.3.1.1 5- ISOMERASES Racemases, Epimérases : -Alanine racémase -Lactate racémase -Glucose isomérase E.C.5.1.1.1 E.C.5.1.2.1 E.C.5.3.1.18 6- LIGASES Tyrosine- RNAt ligase Glutamate- ammoniac ligase E.C.6.1.1.1 E.C.6.3.1.2
  7. 7. Chapitre 1. Généralités sur les enzymes 3 2- Propriétés des enzymes D’après DESCAMPS (2008), on peut résumer les propriétés générales des enzymes dans les points suivants :  Ce sont des biocatalyseurs de nature protéique qui accélèrent une réaction biochimique et se retrouvent intact en fin de réaction ;  toute enzyme possède une zone particulière appelée site actif. Cette zone se décompose en un site de fixation du substrat (molécule qui sera modifiée par l’action de l’enzyme) et d’un site catalytique ;  la vitesse de réalisation d’une réaction enzymatique se mesure par la quantité de substrat disparaissant par unité de temps ou la quantité de produit formé par unité de temps. La vitesse initiale de catalyse est proportionnelle à la quantité de substrat, et lorsque tous les sites de fixation sont occupés par le substrat, l’enzyme est saturée ;  les enzymes sont sensibles à de nombreuses modifications environnementales telles que les changements de température et de pH. Toute enzyme possède une température optimale d’activité enzymatique pour laquelle la vitesse initiale de catalyse est maximale. L’enzyme possède également un pH optimal d’activité (le pH modifie en effet la charge ionique des acides aminés, ce qui entraine une modification de la structure) ;  un seul substrat a une configuration tridimensionnelle complémentaire de celle du site de fixation enzymatique et peut former une liaison temporaire avec celui-ci : il y a spécificité de substrat. La formation du complexe enzyme substrat provoque alors l’activation du site catalytique qui ne permet la réalisation que d’un type de réaction biochimique, qui peut être une condensation, une hydrolyse, un transfert d’électrons ou de groupement ou encore une isomérisation : cela induit une spécificité d’action. 3- Sources d’enzymes Les tissus végétaux et les organes animaux étaient les sources les plus importantes des enzymes au début de la biotechnologie des enzymes. En 1960, environ 70% des enzymes étaient extraites à partir des tissus végétaux ou d'exsudats et organes animaux. Vingt ans après, la situation s'était inversée et la plupart des enzymes industrielles ont été produites à partir de sources microbiennes. De nos jours, les enzymes issues des plantes et des animaux, la plupart du temps des protéases, sont toujours sur le marché et certaines d'entre elles sont d'importance commerciale mais la plus grande part du marché mondial des enzymes industrielles est occupée par des enzymes d’origine microbienne (ILLANES, 2008).
  8. 8. Chapitre 1. Généralités sur les enzymes 4 4-Domaines d’application des enzymes dans l’industrie agro-alimentaire Au cours des fermentations alimentaires, ce sont les multiples enzymes des cellules microbiennes qui provoquent les modifications complexes observées. Il est également possible de faire intervenir des enzymes seules, en l’absence de toute cellule vivante. Ces enzymes jouent plusieurs rôles dans les productions alimentaires industrielles, le tableau suivant représente des exemples de différents enzymes utilisées dans l’industrie agro- alimentaire, leurs sources, leurs actions et leurs usages (SPINNLER, 2008). Tableau 2. Exemples de quelques enzymes utilisées en industrie agro-alimentaire (SPINNLER, 2008) Enzymes Sources Actions Usages Amylases Aspergillus oryzae (moisissure) Bacillus subtilis (bactérie) hydrolyse de l'amidon en sucres solubles Améliorer la fermentation (pain, bière) Clarifier les jus de fruits et de légumes, etc. Invertase Saccharomyces cerevisiœ (levure) Candida utilis hydrolyse le saccharose en glucose et fructose Réduire la cristallisation dans les sirops et Produire du sucre inverti Lactase (B-Galactosidase) (A-Galactosidase) Aspergillus niger (moisissure) Kluyveromyces fragilis (levure) Candida hydrolyse le lactose en glucose et galactose Faire disparaître le lactose dans les produits laitiers Glucose isomérase Streptomyces, Bacillus coagulans, Arthrobacter conversion du glucose en fructose Produire du sirop de maïs à teneur élevée en fructose Glucose oxydase Aspergillus niger, Pénicillium transformation du glucose en acide gluconique Éliminer le glucose dans les œufs déshydratés Pectinases Aspergillus niger (moisissure) Rhizopus oryzœ Pénicillium hydrolyse de la pectine Clarifier le vin ou le jus de fruits et de légumes et Empêcher la gélification Cellulase Trichoderma viride (moisissure) Aspergillus niger (moisissure) hydrolyse de la cellulose en sucres Clarifier les jus de fruits Produire davantage de sucres fermentescibles Lipases Saccharomycopsis lipolytica (levure) Aspergillus niger (moisissure) Pénicillium roqueforti, Rhizopus, Candida lipolytica hydrolyse les lipides en acides gras et glycérides Produire davantage de composés d'arômes dans les fromages et autres produits laitiers
  9. 9. Chapitre 1. Généralités sur les enzymes 5 Enzymes protéolytiques (Protéases) Aspergillus oryzœ (moisissure) Bacillus subtilis (bactérie) hydrolyse des protéines en acides aminés Améliorer la texture de la pâte à pain Stabiliser la bière Rennine (ou rennet) Mucor pusillus (moisissure) coagulation de la caséine du lait Coaguler le lait pour la fabrication de fromages 5-Schéma général d’obtention d’une enzyme Pour l’isolement d’une enzyme, deux grandes étapes constituent le processus d’obtention de la biomolécule : l’extraction et la purification (Figure 1) (LAURENT, 1982). Figure 1. Représentation schématique d’un processus d’isolement et de purification d’une enzyme (LAURENT, 1982). MATIERE PREMIERE Végétale MicrobienneAnimale ENZYME PURE EXTRAIT BRUT Etape1 EXTRACTION Etape 2 PURIFICATION
  10. 10. Chapitre2. Extraction des enzymes 6 1-Définition et principe Le mot extraction est formé de deux mots d’origine latine : « ex » et « traction » qui signifie tiré à l’extérieur. On peut dire que le mot extraction désigne l’action de séparer une substance quelconque du composé dont elle fait partie (BRISSET, 2005). Les méthodes d’extraction correspondent au transfert sélectif d’un soluté contenu dans le milieu initial vers un second milieu dans le quel il est soluble en vue de son isolement (BRISSET, 2005). L’extraction consiste en la libération des enzymes des cellules ou constituants cellulaires, nécessitant donc un éclatement de la paroi ou de la membrane cellulaire, par des procédés mécaniques, physiques ou chimiques (LAURENT, 1982). 2-Critères de choix et préparation du matériel biologique de départ Bien qu’il n'y ait aucune règle précise et rapide pour choisir le tissu et/ou l'organisme pour l'isolement d'une enzyme, il est toujours préférable de choisir une source enrichie en cette enzyme particulière, d’autres éléments sont à prendre en considération (KUMAR et GARG, 2006):  vérifier si l'enzyme est produite universellement (chez les animaux, les plantes aussi bien que des micro-organismes) ou confiné à un royaume particulier ;  dans le cas ou l’enzyme visée est universellement produite, choisir une enzyme microbienne ou animale de préférence, car il est plus facile de travailler sur ce type de matériel biologique comparativement aux végétaux, puisque les plantes sont généralement riches en composés phénoliques, qui sont convertis en quinones au contact de l'air, ces quinones se lient avec la protéine enzymatique pour la rendre inactive ;  pour le tissu animal, on devra sacrifier l'animal dans le laboratoire ou apporter le tissu d'un abattoir ;  dans le cas des micro-organismes, on devra les accroîtront dans un milieu approprié de croissance dans des conditions aseptiques ; 3-Méthodes d’extraction 3-1 Méthode physique  Choc osmotique Le choc osmotique permet de briser certaines cellules fragiles avec un minimum de dommages. Les cellules sont incubées dans une solution hypo-osmotique. Cherchant à rétablir l’équilibre osmotique, l’eau pénètre dans la cellule et finit par causer une rupture de la membrane plasmique (LEBLANC, 2013).
  11. 11. Chapitre2. Extraction des enzymes 7 3-2 Méthodes mécaniques  Congélation-décongélation Suite à un refroidissement brusque et à la concentration du soluté intra et extracellulaire, la formation de cristaux intra et extracellulaires entraîne des cassures dans la cellule (LAURENT, 1982).  Broyage ou agitation avec des abrasifs L’agitation violente en présence de microbilles de verre désintègre les microorganismes avec rupture de la paroi (LAURENT, 1982).  Bombe à disruption Elle consiste en une chambre pressurisée dans laquelle les cellules sont traitées avec de l'azote à haute pression. La pression force l'azote à se solubiliser dans les liquides. On libère alors la pression tout d'un coup; l'azote en solution reprend son état gazeux, forme des bulles à l'intérieur des cellules et les fait éclater (LEBLANC, 2013).  Homogénéisateur d'Elvejm de potier Elle est considérée comme une technique douce et est généralement employée pour l'homogénéisation des tissus mous tels que les tissus animaux. L’homogénéisateur d'Elvejm de potier est un équipement simple ayant un pilon sous forme de tige de verre avec des dents sur son bout. La manipulation du pilon se fait manuellement ou par dispositif mécanique (KUMAR et GARG, 2006).  Les billes de verre L’appareil utilisé pour cette technique ressemble à un blinder, à ceci près qu’il est beaucoup plus petit et ne contient pas de lames. Son contenant amovible est rempli de petites billes en verre sur lesquelles on verse la suspension de cellules. La suspension se répartit entre les billes. Il est important de remplir complètement le contenant et de ne pas y laisser d’air pour éviter de faire de la mousse et d’oxyder les protéines. Le tout est alors scellé et on lance la machine, qui fait furieusement tourbillonner les billes de verre dont l’action abrasive fait de dégrader les cellules (LEBLANC, 2013). Séparer les billes du lysat est très facile parce que les billes coulent au fond dès que l'agitation cesse. On doit prendre soin de garder le tout au frais; le contenant est souvent nanti d’une chambre où on installe de la glace. Le mouvement des billes génère en effet beaucoup de chaleur (Figure 2) (LEBLANC, 2013).
  12. 12. Chapitre2. Extraction des enzymes 8 Figure 2. Schéma représentant l’appareil utilisé dans l’extraction par billes de verre (LEBLANC, 2013).  Sonication L’application des ultrasons dans un liquide crée le phénomène connu sous le nom de cavitation. Des aires de compression et raréfaction apparaissent, et les cavités s’effondrent rapidement. Les bulles produites dans les cavités sont compressées à plusieurs centaines d’atmosphère. Ces chocs constituent les éléments de destruction des tissus cellulaires : tout d’abord, une attaque de la structure cellulaire, puis une lyse (LAURENT, 1982). L’efficacité de cette technique est liée à des paramètres tels que le pH, la température et la force ionique du milieu de suspension, ainsi que du temps d’exposition aux ultrasons. (LAURENT, 1982). 3-3 Extraction chimique Cette technique, l’une des plus utilisées en industrie, consiste à mélanger le produit en solution aqueuse avec un petit volume de solvant organique dans lequel il est très soluble. On agite ensuite vigoureusement le mélange pour permettre au produit de se déplacer de la phase aqueuse vers la phase organique, puis on récupère celle-ci. Le choix du solvant est déterminant dans l’efficacité de l’extraction. Il repose sur plusieurs critères (TESSIER, 2007) :  la solubilité du produit dans la phase organique par rapport à la phase aqueuse (coefficient de partage) ;  la stabilité du produit dans la phase organique ;  la sélectivité du solvant (faible solubilité des impuretés).
  13. 13. Chapitre2. Extraction des enzymes 9 Après l’extraction, les phases sont séparées, dans le cas des protéines qui ne sont pas solubles ou sont déstabilisées dans des solvants organiques, on peut les extraire en créant deux ou plusieurs phases aqueuses séparables, à l’aide de polymères hydrophiles comme le ployéthylèneglycol (PEG) et le dextrane (TESSIER, 2007). 3-4 Enzymes lytiques Avec les levures, les plantes, les bactéries, il faut tenir compte de la paroi cellulaire qui protège la membrane plasmique. Pour ceci les enzymes lytiques comme les cellulases, pectinases, xylanases, protéases, etc., peuvent être employées pour rompre les parois de ces cellules (KUMAR et GARG, 2006). 3-5 Extraction liquide-liquide C’est une opération qui consiste à extraire un ou plusieurs constituants d’une solution A (solvant initial) au contact d’un solvant liquide B (solvant d’extraction) pour lequel le ou les constituants à isoler ont une grande affinité par rapport au liquide initial. Les deux solvants A et B sont non miscibles. L’extraction liquide-liquide est aussi nommée extraction par solvant. (BRISSET, 2005). 3-6 Extraction liquide-solide Ce procédé d’extraction est de plus en plus utilisé. Une extraction liquide-solide se déroule en deux étapes. Une première étape consiste en un passage d’un soluté (ou de solutés) d’un milieu liquide à un milieu solide, ce dernier ayant pour finalité de retenir ce (ou ces) soluté (s). La seconde étape consiste en une élution du soluté d’intérêt, par un solvant approprié, permettant de rompre les interactions soluté-matrice de la phase solide. La « fixation » du soluté doit donc être réversible. Les relations entre la phase solide et les solutés sont des interactions de type Van der Waals, électrostatiques, ou de type liaisons hydrogène (BRISSET, 2005).
  14. 14. Chapitre 3. Purification des enzymes 10 1. Définition La purification est un ensemble d’opérations visant à enlever toutes les impuretés d’un extrait brut contenant l’enzyme d’intérêt. En principe, n'importe quelle méthode destinée au fractionnement de protéines peut être employée pour la purification d'enzymes (ILLANES, 2008). La purification d’une protéine donnée passe par l’étude de différents critères la caractérisant, et permettant de la séparer des autres molécules (taille, forme, charge…) (CEZARD, 2009). 2. Objectifs de la purification des enzymes Alors, la purification des enzymes a comme objectifs essentiels d’avoir (HAINQUE et al., 2008 ; CEZARD, 2009):  Un maximum du rendement de l’enzyme ;  Un maximum de pureté possible ;  Un maximum de son activité catalytique. 3. Méthodes de purification des enzymes Les méthodes sont celle utilisées dans la purification des protéines. On peut désigner les différentes méthodes en fonction de leur propriété générale de purification (CEZARD, 2009):  Méthodes basées sur les différences de solubilité.  Méthodes basées sur la taille des molécules.  Méthodes basées sur les propriétés ioniques. 3.1. Méthode basée sur les différences de solubilité 3.1.1 Précipitation Les techniques de précipitation consistent à rendre une protéine insoluble dans un solvant donné. Cette solubilité dépend de l’hydratation de ces protéines, de leur structures et leur PH. (CEZARD, 2009).  Précipitation différentielle au sulfate d’ammonium [(NH4)2SO4] La précipitation différentielle est une technique plus douce qui préserve en générale la structure, et donc la fonction des protéines (peu dénaturante, elle n’altère pas non plus l’activité des éventuelles enzymes (CEZARD, 2009).
  15. 15. Chapitre 3. Purification des enzymes 11 Le sulfate d’ammonium (SA) est utilisé comme un sel favorisant la précipitation : c’est un sel très soluble dans l’eau, permettant d’atteindre des forces ioniques très élevées (CEZARD, 2009). L’addition du sulfate d’ammonium à une solution protéique provoque une déshydratation et précipitation des protéines, induisant ainsi le phénomène de relargage (l’avantage du relargage est que les protéines conservent leur conformation native et peuvent être dissoutes sans dénaturation) (ABDELLAOUI, 2007). Les ions sulfates et ammonium sont petits et neutralisent efficacement les charges des protéines. Cette méthode devra être suivie d’un lavage pour éliminer le sel résiduel (en général par dialyse, gel de filtration) (CEZARD, 2009) (Figure 3). Figure 3. Précipitation au sulfate d’ammonium (WENK et FERNANDIS, 2007). 3.2. Méthodes basées sur la taille des molécules 3.2.1 Dialyse La dialyse permet de séparer des substances en utilisant leur capacité respective à franchir les pores d’une membrane semi-perméable appelée membrane de dialyse. Les membranes de dialyse utilisées se présentent sous forme de cylindres allongés qu’il faut fermer aux deux extrémités et qui contiennent le liquide à dialyser. Ce cylindre prend alors le nom de « boudin » de dialyse. Il est placé dans un récipient contenant le liquide contre lequel s’effectue la dialyse ou liquide de contre-dialyse (Figure 4) (HAINQUE et al., 2008). Bécher Lysat Glace Récipient Barreau magnétique Agitateur
  16. 16. Chapitre 3. Purification des enzymes 12 Figure 4. schéma générale d’une dialyse (HAINQUE et al., 2008). 3.2.2. Centrifugation La centrifugation est une méthode permettant de séparer les constituants d’un mélange sur la base de leur différence de densité dans un solvant (HAINQUE et al., 2008). Dans cette méthode, les molécules de protéine sont soumises aux forces (centrifuges) de la gravité (les molécules de protéine sont des macromolécules) (NITIN et al., 2007). En effet, si la particule a une densité plus élevée que le fluide en lequel elle est immergée, elle tend à émigrer en bas, suivant la direction de force de pesanteur (MIKKELSEN et CORTON, 2004). Ce déplacement des particules dans le sens de la force centrifuge est dénommé sédimentations ; lorsque les particules en suspension dans leurs solvant sont ainsi placées dans le rotor d’une centrifugeuse, la mise en œuvre de la centrifugation génère une accélération qui pousse les particules vers l’extérieur du rotor, donc vers le fond du tube de centrifugation. La vitesse à laquelle se déplacent les particules est proportionnelle à (HAINQUE et al., 2008):  la force gravitationnelle à laquelle les particules sont soumises (dans le cas d’une simple sédimentation, cette force est due à la seule pesanteur) ;  la masse des particules ;  la différence entre la densité des particules et celle du solvant. 3.2.3 Filtration membranaire La filtration est l’opération qui consiste à séparer les particules solides qui se trouvent en suspension dans un liquide par une membrane, tout en limitant son colmatage pour obtenir un Dialysant (Les molécules de grandes tailles, protéines par exemple, restent dans le boudin de dialyse) Contre – dialyse (Les petites molécules contenues dans le boudin sortent du sac de dialyse vers le liquide de contre –dialyse)
  17. 17. Chapitre 3. Purification des enzymes 13 fonctionnement stable (HAINQUE et al., 2008). On distingue deux types de procédés, la filtration tangentielle et la filtration frontale (JAFFRIN, 2014).  Filtration tangentielle Le fluide circule parallèlement à la membrane à partir d’un réservoir sous l’action d’une pompe. Seule une partie, le perméat, traverse les pores de la membrane par l’effet d’une différence de pression (pression transmembranaire, Ptm) tandis que le reste (retentât) est évacué ou recyclé sur le réservoir. Les pores de la membrane vont arrêter les macromolécules et les particules de taille supérieure, tandis que les microsolutés (molécules et particules plus petites que les pores) passeront dans le perméat (JAFFRIN, 2014).  Filtration frontale Dans ce cas, le fluide est forcé de traverser la membrane placée perpendiculairement à l’écoulement et la concentration du retentât augmente rapidement. Ce système est surtout employé avec des fluides dilués et le colmatage de la membrane est plus rapide qu’en filtration tangentielle (JAFFRIN, 2014). 3.3. Méthodes basées sur les propriétés ioniques 3.3.1 Chromatographie  Définition La chromatographie est la plus importante de toutes les méthodes de purification. Bien que ce soit la technique qui trouve l'applicabilité la plus large, la chromatographie est une méthode relativement simple de séparation du composé désiré de ses impuretés, ou d'isoler différents composants d'un mélange (BUDHIRAJA, 2004). Elle sert en analyse pour identifier et qualifier des composés au sein d’échantillons divers. (FRANCIS et ANNIK ROUESSAC, 2004). Les méthodes chromatographique sont des méthodes mettant en jeu différents processus physicochimiques (GWENOLA et JEAN-LOUIS BURGOT, 2011).  Principe La chromatographie est une méthode physique de séparation basée sur les différentes affinités d’un (des) composé (s) à l’égard de deux phases (BOURGUET et AUGE, 2008). L’une, dite stationnaire, est emprisonné dans une colonne ou fixé sur un support et l’autre, dite mobile, se déplace au contact de la première. (FRANCIS et ANNIK ROUESSAC, 2004). L’échantillon est entrainé par la phase mobile à travers la phase stationnaire qui a tendance à retenir plus ou moins les composés de l’échantillon à l’aide d’interactions comme les forces de van der waals ou les liaisons hydrogène. Une fois la phase stationnaire traversée, les composés sont élués. Les différents composants de l’échantillon ont généralement une
  18. 18. Chapitre 3. Purification des enzymes 14 affinité différente pour l’une et l’autre des deux phases. Il en résulte une différence de vitesse de progressions des produits et donc l’élution. Ceci permet de les séparer les uns des autres voire de les identifier. Cette vitesse de séparation est fortement dépendante de la nature des phases mobile et stationnaire (BOURGUET et AUGE, 2008).  Types de chromatographie  Chromatographie par adsorption La phase solide est constituée d’une résine adsorbante qui fixe, faiblement et de façon non spécifique, certains composés en solution par l’entremise de liaisons de van der waals lorsqu’on charge la colonne, la phase mobile (l’éluant est généralement un solvant) modifie ensuite les propriétés de la résine, ce qui force la désorption des composés qui y étaient adsorbés et permet leur séparation au cours de l’élution (TESSIER, 2007).  Chromatographie par échange d’ions Dans une chromatographie d’échange d’ions, les protéines sont séparées sur la base de leur charge électrique globale. Dans une chromatographie échangeuse d’anions, une colonne contenant des billes chargées positivement est utilisée pour fixer des protéines ayant une charge électrique globale négative alors que dans une chromatographie d’échange de cations, des billes chargées négativement sont utilisées pour lier des protéines à charge électrique globale positive. Les protéines liées sont ensuite éluées en ajoutant une solution de chlorure de sodium ou en modifiant le pH du tampon (HAMES al., et 2000) (Figure 5). Figure 5. Chromatographie par échange d’ion (WENK et FERNANDIS, 2007). Molécule chargé positivement Molécule positivement chargée Molécule négativement chargée Molécule moins chargée Solvant
  19. 19. Chapitre 3. Purification des enzymes 15  Chromatographie de partage Fonctionne par partage de solutés entre deux phases non miscibles ; l’une mobile et l’autre stationnaire. Plus la répartition des composés d’un mélange dans la phase stationnaire est grande plus leur rétention est grande et inversement. L’affinité de chaque constituant pour la phase stationnaire dépend de sa solubilité dans cette phase et de sa polarité (KABOUCHE, 2007).  Chromatographie d’exclusion La phase stationnaire est un gel ou un réseau macromoléculaire exerçant un véritable effet de tamis vis-à-vis de grosses molécules, celles-ci migrant plus vite que les molécules de plus faible poids moléculaire qui elles peuvent diffuser librement dans la phase stationnaire alors que les premières ne le peuvent pas (GWENOLA et JEAN-LOUIS BURGOT, 2011).  Chromatographie d’affinité On utilise ici une interaction plus spécifique pour obtenir une séparation, en mettant à profit un système biologique du type antigène-anticorps, enzyme-inhibiteur ou autre. Un ligand ayant la propriété de fixer spécifiquement une molécule ou un groupe de molécules est lié de façon covalente à la phase solide. Ainsi, au moment du chargement de la colonne, les composés qui ont une affinité pour le ligand sont fixés alors que les impuretés sont éliminées. Par la suite, les composés sont élués avec un solvant dont les caractéristiques chimiques favorisent leur dissociation d’avec le ligand (TESSIER, 2007) (Figure 6). Figure 6. Chromatographie d’affinité (WENK et FERNANDIS, 2007). Protéine liée Molécule avec la protéine d’affinité attachée Protéine non liée Solvant
  20. 20. Chapitre 3. Purification des enzymes 16 3.3.2 L’électrophorèse L’électrophorèse est une technique extrêmement puissante pour séparer les protéines. Elle a de nombreuses applications. Elle permet, entre autre, de vérifier la pureté des solutions obtenues par les techniques précédentes (CEZARD, 2009). Elle est basée sur le principe de la mise en mouvement différentiel. Des particules chargées sont donc placées dans un champ électrique crée par une tension continue et se déplacent vers le pôle de signe opposé à leur charge à une vitesse proportionnelle à cette charge. Si on dépose une espèce anionique (chargée négativement) elle migrera vers l’anode (+) et une espèce cationique (chargée positivement) migrera du côté de la cathode (─) (BOURGUET et AUGE, 2008).
  21. 21. Conclusion 17 Notre travail avait pour but de mettre en évidence les différentes méthodes d’extraction et de purification des enzymes, notamment celles utilisées en industrie agro- alimentaire. Ce sont ses caractéristiques intrinsèques de l’enzyme cible, qui permettront de la séparer de ses congénères cellulaires. Une protéine a une masse, une forme, des structures primaire, secondaire, tertiaire et peut-être quaternaire; elle a une certaine charge à un pH donné, elle présente une certaine densité; elle possède un certain degré d’hydrophilicité ou d'hydrophobicité. Elle peut avoir des isoformes. Elle se retrouve peut-être dans une certaine région de la cellule ou dans une organelle donnée. Tous ces critères peuvent être utilisés dans le choix de la stratégie de purification. Une bonne stratégie d’obtention d’une enzyme dans les meilleures conditions possibles comportera donc le bon choix du matériel biologique de départ, le choix des techniques d’extraction les plus adaptées à ce dernier et les techniques de séparation et de purification adéquates aux propriétés physico-chimiques de l’enzyme.
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