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1. LGUENSAT Asmae
SAYAH Kaoutar
ABBAD Anass
S5 Génie biologique
Mme Elouaii

2. Plan:
I. La réaction Ag-Ac
1)les bases moléculaires de la réaction
2) Aspect de la réaction
a) Forces attractives intramoléculaires
b) Affinité
c) Avidité
3) Caractéristiques de la réaction
II. Techniques immunologiques
1-immunoagglutination
2-immunoprecipitation
3-immunofluorescence
4-immunoenzymologie
III. Applications des techniques immunologiques en
biotechnologie

3. I-Réaction Ac-Ag
1-Les bases moléculaires de la réaction
a- l ’antigène
• Considérée comme
étrangère de l’organisme,
C’est une molécule qui
contient des épitopes dont la
structure est particulièrement
définie,et reconnus par les
sites de liaisons des
anticorps.
• L’antigène peut porter
plusieurs épitopes ce qui
détermine sa valence.
b- l’anticorps
• Les anticorps sont caractérisés
par la présence des paratopes
qui varient selon l’anticorps
reconnaissant ainsi un antigène.

4. Groupement
glucidique
Ponts disulfures
Chaînes lourdes (H)
Site de fixation à l’antigène
ou PARATOPE
Chaîne légère (L)
Partie
variable
Partie
constante

5. C- le complexe immun
• Le complexe immun est une combinaison de l’Ac avec l’Ag
Ag Ag
Epitope de
l’antigène
Le paratope a une structure
tridimensionnelle
complémentaire à celle de
l’épitope
La structure du paratope
est variable. Elle dépend
de la structure
tridimensionnelle de
l’épitope
Le paratope se fixe sur
l’épitope à l’image du clef/
serrure

6. • L’interaction entre épitope et paratope est considérer comme
la clé du complexe Ac-Ag.
• La complémentarité entre épitope et paratope induit la
formation du complexe immunitaire:
• Si l’épitope correspond au paratope alors il y a présence d’une
force d’attraction ,si non on a une force de répulsion.
• La réaction entre Ac-Ag est une combinaison spécifique et
réversible des Ac et Ag correspondant.
Antigène
Déterminants
antigéniques
Ou épitopes
Anticorps
Paratope

7. 2- Aspects de la réaction
a- Forces attractives intramoléculaires
• Il s’agit d’un ensemble de forces qui fusionnent les Ac aux Ag
correspondants.
• Il existe 4 types de forces non covalentes; dépendantes de la
complémentarité entre les sites d’ Ac et les déterminant des Ag.
Forces non-
covalentes
Application Schématisation
Liaisons hydrogène Deux atomes électronégatifs
partagent un atome
d’hydrogène
Liaison hydrophobes L’interaction est difficile entre
les groupes hydrophobes et
l’eau qui se réuni pour exclure
l’eau
Forces de Van Der Waal: Résultent de la fluctuation des
nuages électroniques de charge
opposé autour des molécules.
Forces électrostatiques
ou ioniques
attraction entre atomes de
charges opposées

8. b- l’affinité
• C’est la somme des
forces d’attractions et
de répulsions entre un
épitope et un
paratope.
• Définie par la réaction :
Ag+Ac Ag-Ac
c- l’avidité
• c’est la force de fusion
d’un anticorps
possédant multiples
paratopes avec un
antigènes contenant
plusieurs épitopes.
• Ainsi l’avidité est
supérieur à la somme
des affinités.
• Donc l’avidité est
influencé par la
valence, tout comme
la T , le pH et la force
ionique.

9. 3) Caractéristiques de la réaction
La formation d’une
liaison Ac/Ag libérant
de l’énergie, ce qui
influence la
température et donc
un bon déroulement
de la réaction.
Les liaisons qui s’effectuent entre l'Ac et
l’Ag sont des liaisons faibles, facilement
rompues
Ag +Ac Ag – Ac + chaleur
Si ↘ pH, ↗ force ionique → dissolution
du complexe Ag-Ac
La spécificité de la
réaction Ag –Ac
dépend de la
complémentarité
spatiale entre le
paratope et
l’épitope, elle est
très étroite. Cette
spécificité n’est pas
absolue, il existe
des réactions
croisées
Exothermique Réversible Spécifique
Réaction
Ac/Ag
Exothermique Réversible SpécifiqueRéversible

10. II. Techniques immunologiques
CI visible à l’œil nu CI non visible à l’œil nu
 Immunoagglutination
 Immunoprécipitation
 immunofluorescence
 Immunoenzymologie
Détection de réaction Ac/Ag

11. 1-Immunoagglutination
a- Principe:
• C’est le produit d’une réaction des Ac dirigés vers des Ag
formant ainsi des ponts spécifiques entre les particules,
constituant un réseau sous forme d’amas.
• On trouve deux sortes d’agglutination; active et passive.

12. b- les différents types
d’agglutination
ACTIVE PASSIVE
c’est une
agglutination bien
visible à l’œil nu
lorsque les Ac et les
Ag forment un amas.
On utilise Ag
particulaire et un Ac
agglutinant.
c’est une agglutination
artificielle résultante
d’une faible quantité
d’Ac et d’Ag. Entre
autre, utilise un Ag
particulaire et un Ac non
agglutinant
c’est la fixation d’un Ac
soluble sur une surface
inerte indépendante de la
réaction Ac-Ag. C’est-à-
dire la particule ne
possède pas naturellement
l’Ag donc on l’introduit
manuellement
L’agglutination des
particules sur lesquelles
l’Ag est fixé détermine la
présence de l’Ac
Directe Indirect

13. Ac
agglutinant
Ag
particulaire
SAB
SAB SAB SAB
SAB
Ac non
agglutinant
SAB
Ag
particulaire
Agglutination Directe
Agglutination Indirecte

14. L’agglutination passive

15. Immunoprécipitation:
1)Principe
 Les réactions de précipitation ont lieu entre un anticorps et
un antigène soluble :soit en milieu liquide ou gelifié
 Chaque molécule d‘Ag multivalent peut fixer plusieurs
molécules d‘Ac et chaque molécule d‘Ac est liée à plus d'une
molécule d'antigène. Ce qui influence la taille des agrégats
formés qui deviennent importante et leur solubilité diminue:
Si la masse des agrégats dépasse les forces qui les
maintiennent en solution, ils peuvent devenir insolubles et se
précipiter.

16. 1-L’immunoprécipitation en milieu liquide
a)Test de l’anneau:
Techniques qualitative est un peu quantitatif : Basé sur la
diffusion des Ac et des Ag solubles (non mélangé) , qui
aboutissent lorsqu’ il y a autant de paratope que d'épitopes (a
l'équivalence) au formation d’un anneau de précipitation
Rq:plus il y a d'antigène, plus l'anneau est bas.

17. 2) technique de Heidelberg et Kendall
• On mélange dans des tubes une quantité constante
d‘Ac , et une quantité croissante d'Ag ,on centrifuge les
tubes, et on compare la quantité de précipité en fonction
de la concentration.

18. 2-L’immunoprécipitation en milieu gelifié
A-immunodiffusion :
Simple radial simple double diffusion
technique Oudin technique Mancini technique
d’Ouchterlony
un seul des deux
éléments diffuse; la
précipitation a lieu à
l'endroit où les
concentrations en Ag
et Ac correspondent à
la zone
d'équivalence.
Consiste à introduit des Ac
spécifique dans le gélose,
et de remplit des puits avec
un antigène de
concentrations différentes,
Après la diffusion On
observe des cercle de
précipitation dont le diamètre
est proportionnel à la
concentration d'antigène
C'est une méthode
qualitative et semi
quantitative
Les 2 éléments Ac et Ag
diffusent selon leur taille

19. B-immunoelectrophorèse:
• C’est une méthode qui sert à differencier plusieurs systèmes
précipitants
• Elle est effectuée en 2 temps :
- séparation des protéines
- révelation des proteines fixées

20. C- Immunofixation :
c’est une technique de précipitation en milieu gélifié
résultante d’une électrophorèse d’une solution
antigénique qu’on lui ajoute des Ac spécifiques . Ainsi
elle induit la pénétration et la précipitation des Ac en
présence des Ag correspondant

21. L’immunoflurescence
1-Principe
• C’est une technique qui sert à marquer différentes molécules grâce aux
anticorps rendus fluorescents.
• Elle utilise plusieurs types de molécules fluorescentes :
Fluorescein isothiocyanate :, son spectre d’émission : 520 nm, couleur verte.
Rhodamine : utilisé en général pour le double marquage, donne une fluorescence rouge-
orangée
.
Anticorps primaires:
Ce sont des anticorps dirigés
spécifiquement vers l’antigène
Anticorps secondaires:
Ce sont des anticorps dirigés vers
les anticorps primaires; ce sont eux
qui portent généralement la
molécule fluorescente
Elle met en jeux deux types
d’anticorps

22. 2-Types d’immunoflurescence :
• Il existe deux :
Immunofluorescence directe Immunofluorescence indirecte
- l’anticorps primaire
couplé au molécule
fluorescente.
- Lorsque l’anticorps
secondaire, porteur de
molécule fluorescente
se lie spécifiquement à
l’anticorps primaire.

23. A – l’immunofluresence directe :
•
• Méthode rapide, en un temps
• Révélation de l’Ag cherché directement par l’Ac porteur du
molécule fluorescente (flueorechrome)
• Pour observer le résultat, on utilise un microscope à
épiflurescence.

24. B- L’immunoflurecence indirecte :
Dans ce cas, le marquage passe par deux étape ;
lors de la première étape, des ac primaires spécifiques à l’ag ont été
lancés,
En deuxième temps, d’autres Ac anti Ac fluorescent et ayant une forte
affinité pour les Ac primaires ont été lancés
Le tous frome un complexe détectable par le microscope épiflurescent

25. Immunoenzymologie :
1-Principe
• Dans cette technique , l’antigène ou l’anticorps est marqué avec une enzyme,
qui permet de transformer un substrat incolore en produit coloré.
• Principe de la réaction : La reaction mise en jeux
• Ag + Ac * substrat molécule signale (détectable)
• * : le marquage par une enzyme ne touche qu’une molécule , soit l’ag, soit l'Ac
et ne consiste pas les deux à la fois
• L’immunoenzymologie met en œuvre deux types de réactions:
Réactions qualitatives :
qui consistent soit à :
- La détection de protéines
après électrophorèse :
Western-blot
- Détection de protéines sur
une coupe histologique
Réactions quantitatives:
Dosage d’antigènes
Dosage d’anticorps
ELISA (direct, compétitif…)

26. • La réaction peut s’effectuer soit en:
• phase homogène; en milieu liquide contenant tous les acteurs et où
se fera la détection.
• En phase hétérogène:
• fixation d’un des composés sur un support (puits, lame, bille,
tissu, …)
• nécessité de lavages pour éliminer les composants non fixés
Molécule détectée Phase Technique
Antigène Hétérogène Western blot,
immunohistochimie
ELISA compétition
Immunométrique
(ELISA sandwich)
Homogène EMIT (Enzymes
Multiplied
Immunoassay
Technique
Anticorps Hétérogène Immunométrique
de type ELISA

27. • A- ELISA (Enzyme-Linked immunosorbent Assay) :
• c’est un dosage immunenzymatique sur support solide.
• Principe général :
• Mise en évidence d’anticorps présents dans un sérum par
la visualisation d’une réaction colorée.

28. Les types d’ELISA :
ELISA PAR
COMPETITION
ELISA
INDIRECT
ELISA
SANDWICH
Repose sur la
compétition entre
l’antigène à doser avec
un ag marqué vis-à-vis
d’un même ligand
spécifique
Cherche des ag de
petite taille
Elle est le plus
souvent utilisée pour
déterminer la
concentration en
anticorps.
C’est une variante
moins commune de
cette technique,
utilisée afin de
détecter un
échantillon d'antigène
dans le sérum ou tout
autre échantillon.

29. B- Le western-blot :
• est une méthode de protéomique, ayant recours à la
biologie moléculaire, la biochimie et
l'immunogénétique, pour détecter une protéine
spécifique dans un échantillon donné d'extrait ou
d'homogénat tissulaire.
• But : Analyse et identification des Ac
Se rassurer du résultat d’ELISA en cas de test positif.
• Principe : Cette technique associe 3 grands principes :

30. Séparation des
protéines
Transfert des
protéines
Révélation
immunologique
Cette séparation
est en fonction
de leurs poids
moléculaires par
électrophorèse
sur gel de
polyacrylamide
en présence de
SDS et
mercaptoéthanol
Sur une feuille de
nitrocellulose ou
de nylon
-S’effectue par
des Ac marqués
(l’ajout des ac
spécifiques de la
protéine
d’intérêt).
Puis, on ajoute
des ac porteurs
d’enzyme.

31. III- Application en biotechnologie
Immunoflrescence -immunocapteur
-observation de la division
cellulaire
-activation cellulaire
-hybridation moléculaire
Immunoprécipitation -immunoprécipitation d’une
protéines
- Immunoprécipitation d’ARN
- Immunoprécipitation de
chromatine
Immunoagglutination -………………………..
immunoenzymologie -western blot
-elisa

32.  les biocapteurs dans l’industrie
agroalimentaire
• Biocapteur = élément de reconnaissance moléculaire (anticorps par
exemple) +transducteur

33. • Immunocapteur: C’est un biocapteur qui utilise des anticorps comme
élément de reconnaissance moléculaire(ligand) .
• Les transducteurs les plus couramment utilisés sont de type optique
ou électrochimique.
Réactions mises en jeu : Mesure de l’absorbance
Mesure de la fluorescence

34. Application dans le domaine
agroalimentaire :
Immunocapteur portable pour E-coli O157 : H7

35.  Immunoprécipitation de chromatine
• L’immunoprécipitation du chromatine est une procédure
utilisée pour déterminer si la protéine a analysée est localisée
sur une séquence d’ADN spécifique ou non .
Les DNA-binding proteines sont
liées à la molécule de DNA avec
formaldéhyde in vivo.
- Isoler la chromatine.
-Cliver le DNA avec les bound
proteines en fragments.
-couplage des anticorps specifiques
avec le DNA-binding proteine
-Pour isoler le complexe, on a recours
à l’immunoprecipitation. Reverse the
cross-linking to release the DNA and
digest the proteins.
Utiliser le PCR pour amplifier la
sequence du DNA pour savoir si elle se
sont précipité avec les anticorps