LES PRINCIPES DES METHODES ANALYTIQUE EN BIOLOGIE MEDICALES

1. Présentée par BOUABID ABDERRAHIM CQA LAB

2. Introduction
 Qu’est ca veut dire une méthode analytique ?
 C’est quoi le principe analytique ?

3. Images de quelques analyseurs

4. Chapitre I: La méthode analytique

5. 1. La méthode analytique : de quoi s’agit-il?
 La méthode analytique est une technique qui se
consacre à l’analyse des substances chimiques. Elle
permet d’identifier la composition chimique des
échantillons et de mesurer leur quantité.
 Différentes méthodes sont utilisées pour analyser les
substances, dont la spectrométrie de masse, la
chromatographie, la spectroscopie infrarouge et
l’analyse thermique. Les résultats obtenus sont
précieux pour diverses disciplines comme la médecine,
l’industrie pharmaceutique, l’agriculture ainsi que
pour la recherche scientifique.

6. 1. Le principe de la méthode: de quoi
s’agit-il?
La méthode doit être décrite et doit inclure les éléments
ci-dessous :
 Analyte/mesurande détecté
 Principe analytique évalué
 Type d’échantillon/matrice
 Référence du réactif
 Référence de l’équipement
 Référence des contrôles d’étalonnage

7. 2. Les principe de méthodes
 Les principes biologiques, chimiques et physico-chimiques
 Les réactions chimiques, biochimiques, enzymatiques.
 Principe des analyses physico-chimiques, microscopie
électronique.
 Éléments de biologie cellulaire, bactériologie, virologie,
hématologie, immunologie.
 Intérêt clinique des analyses, intégration du laboratoire
dans le système de santé.

8. 3 Technologie des équipements
et méthodes d'analyses
Vue d'ensemble des techniques et équipements des laboratoires d'analyses médicales.
 Biochimie:
Techniques et méthodes d'analyses en biochimie: Spectrophotomètres, photomètres
d'émission, photomètres d'absorption, fluorimétrie, spectrofluorimétrie, techniques
enzymatiques, etc...
Principes et caractéristiques des appareillages et des automates d'analyses.
Principe des électrodes sélectives et à gaz (Ph, Po2, Pco2).
Pharmacologie: Appareils et méthodes.
 Microbiologie:
Bactériologie, virologie, sérologie. Automatisation.
 Hématologie: Hémostase, Groupage sanguin, Numération Formule sanguine.
Trieurs de cellules, Cytométrie en flux
 Immunoanalyse: Techniques et méthodes en immunologie (Immuno-enzymologie,
immunochimie, Immuno-spectrofluorimétrie, radio-immunologie,). Automatisation
et perspectives en immunoanalyse.
 Biologie moléculaire:
Principes et automatisation en Biologie Moléculaire. Intérêts cliniques, équipements.

9. Les différente technique utilise en
laboratoire d’analyses médicales

10. SOMMAIRE
1. BIOCHIMIE
2. IMMUNOLOGIE
3. BACTERIOLOGIE
4. HEMATOLOGIE
5. HEMOSTASE

11. 1. BIOCHIMIE
 NEPHELEMETRIE
 Correspond à la mesure de la lumière diffusée par une
suspension , d'une valeur sous un angle de : 70° par
rapport à la direction du faisceau incident.

12. 1. BIOCHIMIE
 TURBIDIMETRIE
C’est des techniques d’immunoprécipitation quantitatives en milieu liquide.
Les complexes antigènes anticorps dans cette technique restent en solution et
ne précipitent pas, pour cela on travaille en zone d’excès d’anticorps si on veut
doser des antigènes. La réaction se fait dans des cuves de mesure traversée par
une lumière.

13. 1. BIOCHIMIE
 La spectrophotométrie

14. 1. BIOCHIMIE
 La spectrophotométrie permet de mesurer l’absorbance (appelée
aussi densité optique) d’une substance en solution. Pour mesurer
cette absorbance, on utilise un spectrophotomètre.
 Le spectrophotomètre comprend tout d’abord une source de
lumière. Celle-ci va ensuite passer dans un monochromateur
(réseau diffractant la lumière de la source) qui va sélectionner une
longueur d’onde.
 La lumière d'intensité I0 va ensuite traverser une cuve qui contient
la solution a analyser.
 La lumière transmise I est ensuite analysée. (En passant par une
cellule photoélectrique et un amplificateur).

15. 1. BIOCHIMIE
Courbe de La calibration
Créatinine [mg/dL] = ΔA Échantillon x Conc. Cal. [mg/dL] / ΔA Cal.
ASAT [U/L] =ΔA/min. Échantillon x Conc. Cal [U/L] / ΔA/min. Cal
Glucose [g/L] = A Échantillon x Conc. Cal. [g/L] / A Cal

16. EXERCICE
 On cherche à déterminer la concentration Cx d'une solution. Le dosage par étalonnage va s'appuyer sur
une caractéristique physique de cette solution : par exemple sa conductivité pour une solution ionique
ou son absorbance pour une solution colorée. On réalise alors plusieurs solutions de même nature que la
solution à doser. Ces solutions serviront d'étalons : on les réalisera de façon à ce que leur concentration
soit connue avec la meilleure précision possible. On obtient ainsi une « gamme étalon » dans le cas d'une
solution colorée)

17. 1. BIOCHIMIE
 Chromatographie en phase gazeuse (CPG)

18. 1. BIOCHIMIE
 Chromatographie en phase gazeuse (CPG)
 Principe La chromatographie en phase gazeuse
(CPG) s’adresse à la séparation des constituants
volatils ou volatilisables. Le mélange gazeux ou
liquide est introduit dans le système d’injection,
volatilisé s’il y a lieu puis entraîné par un gaz
vecteur (phase mobile)

19. 1. BIOCHIMIE
 Électrophorèse
 Définition L’électrophorèse est une méthode de
séparation de constituants en solution. Elle est
basée sur la différence de migration de particules
chargées électriquement, sous l’effet d’un champ
électrique. Elle s’applique aux ions métalliques,
aux molécules chargées quelle que soit leur taille.

20. 1. BIOCHIMIE

21. 1. BIOCHIMIE
 Réflectance - spectrophotomètre
 Pour mesurer la couleur en mode réflexion, un
spectrophotomètre projette toutes les longueurs d’ondes de la
lumière (de 360 à 750) à travers le flash, puis mesure la
lumière réfléchie pour créer un graphique quantifié de la
couleur. Les longueurs d’ondes dominantes réfléchies
désignent la couleur. Les tons violets, indigo et bleus ont une
plage de longueurs d’ondes réduite, comprise entre 400 et
550. Les verts se situent au centre, avec une longueur
d’ondes entre 550 et 600. Les nuances de jaune, d’orange et
de rouge possèdent les plus grandes longueurs d’ondes
visibles. Les azurants optiques et les agents fluorescents, les
extrêmes, culminent à plus de 100 %.

22. 1. BIOCHIMIE
 la réfractométrie
 Utilisation des principes optiques pour
analyser les substances
 La réfractométrie est une technique de mesure
quantitative et non destructive basée sur des
principes optiques évidents dans la nature : Par
exemple, lorsque la lumière traverse l’eau, le
faisceau lumineux est réfléchi – et les objets sous
l’eau semblent avoir des proportions différentes de
celles observées au-dessus de l’eau. Ce
phénomène est appelé réflexion et réfraction.

23. 1. BIOCHIMIE
 la réfractométrie

24. ELISA, (= Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay)
Le test ELISA (acronyme de Enzyme Linked Immuno
Sorbent Assay) est destiné à détecter et/ou doser une
protéine dans le sang. Cette protéine appelée "enzyme",
va se fixer à certains constituants spécifiques de la
maladie dans le sang, et par repérage et quantification
de cette enzyme, la maladie pourra être affirmée.
2. Immunologie

25. 2. Immunologie

26. 2. Immunologie
 Enzyme-Linked fluorescence Assay (ELFA)

27. 2. Immunologie
 Enzyme-Linked fluorescence Assay (ELFA)
 Son principe repose sur la technique ELFA (méthode ELISA avec une lecture finale
en fluorescence) et permet l’obtention de résultats QUANTITATIFS

28. 2. Immunologie
 Electrochimiluminescence (ECLIA)
 L'Electrochimiluminescence (abréviation ECL) ou encore chimiluminescence
électro générée est un phénomène de luminescence qui est initié par une étape
de transfert d'électron à la surface d'une électrode.
 ECLIA s'appuie sur l'interaction entre les anticorps et les antigènes du corps,
déclenchant une réaction qui émet de la lumière. La quantité de lumière produite
est proportionnelle à la concentration de la molécule cible.
 De plus, l’intensité ECL est proportionnelle à la quantité de luminophore et de
Co-réactif engagée, ce qui permet d’acquérir un signal dépendant de la
concentration sur plusieurs ordres de grandeur. Ainsi, l’ECL est très utilisée dans
le diagnostic médical, notamment pour détecter la présence d’anticorps
spécifiques même sous forme de traces dans des échantillons de sang ou
d’urine. Dans ce contexte.

29. 2. Immunologie
 Immunoblotting (Immuno-dot)
Les techniques d'immun transfert utilisent des anticorps (ou d'autres ligands spécifiques dans des techniques apparentées) pour
identifier des protéines cibles parmi un certain nombre d'espèces protéiques non apparentées. Ils impliquent l’identification d’une
cible protéique via des réactions spécifiques antigène-anticorps (ou protéine-ligand). Les protéines sont généralement séparées
par électrophorèse et transférées sur des membranes (généralement de la nitrocellulose). La membrane est recouverte d'un
anticorps primaire destiné à une cible spécifique, puis d'un anticorps secondaire marqué, par exemple, avec des enzymes ou des
radio-isotopes. Lorsque le ligand n’est pas un anticorps, la réaction peut être visualisée à l’aide d’un ligand directement marqué.
Le dot blot est une procédure simplifiée dans laquelle les échantillons de protéines ne sont pas séparés par électrophorèse mais
sont déposés directement sur la membrane. L'immun transfert est désormais largement utilisé en conjonction avec
l'électrophorèse bidimensionnelle sur gel de Polyacrylamide, non seulement à des fins traditionnelles, telles que l'identification par
immun affinité des protéines et l'analyse des réponses immunitaires.

30. 3. Bactériologie
 Technique d’ensemencement (mise en culture)

31. 3. Bactériologie
 Identification bactérienne
 L’identification exacte d’un micro-organisme permet d’utiliser les
caractéristiques connues d’un groupe taxonomique pour en évaluer
les risques. Les renseignements sur ce groupe taxonomique peuvent
également contribuer à identifier des organismes « étroitement
apparentés » (au niveau de l’espèce ou des souches), lesquels
peuvent servir à fournir des renseignements complémentaires
permettant de déterminer le danger lié à un micro-organisme déclaré
et de faire la distinction entre celui-ci et de possibles pathogènes
d’importance clinique ou environnementale. En outre, les
renseignements sur des organismes étroitement apparentés
pourraient servir à fournir des données de substitution pour d’autres
éléments d’information du règlement.

32. 3. Bactériologie
 Identification bactérienne

33. 3. Bactériologie
 Identification bactérienne

34. 3. Bactériologie
 Antibiogramme
 L’antibiogramme est un examen de laboratoire visant à
déterminer la sensibilité d’une bactérie à différents
antibiotiques. En effet, de nombreuses bactéries sont
devenues, avec le temps, résistantes aux antibiotiques. Il n’est
donc pas toujours évident de trouver l’antibiotique qui sera
efficace pour traiter une souche bactérienne donnée.
 En mettant en contact des bactéries (prélevées chez un
malade) avec plusieurs antibiotiques, l’antibiogramme permet
de voir quels sont les produits qui inhibent la croissance
bactérienne et qui seront efficaces pour traiter l’infection.

35. 3. Bactériologie
 Antibiogramme

36. 3. Bactériologie

37. 3. Bactériologie
Cytologie
 L’examen à l’état frais
L'analyse d'un prélèvement effectué dans un but
diagnostique est en règle générale une analyse à la fois
cytologique et bactériologique. Ainsi, l'examen
microscopique est une étape clé dans la démarche
diagnostique des infections bactériennes.

38. 3. Bactériologie

39. 3. Bactériologie
 L’examen après coloration
- Les techniques les plus communément utilisées au laboratoire de bactériologie médicale
font appel à descolorations.
- La préparation est fixée sur une lame puis colorée.


40. 3. Bactériologie
 Coloration de Gram
 les bactéries à GRAM négatif tacheront le rose / rouge
 les bactéries à Gram positif tacheront le bleu / violet.

41. 3. Bactériologie
 Coloration de Ziehl-Neelsen
❖ La méthode de choix pour la bacilloscopie des frottis d’expectoration est la
coloration de Ziehl-Neelsen (ZN) car elle est la seule à fournir régulièrement
de bons résultats sansnécessiter un équipement spécial.

42. 3. Bactériologie
 Microscopie optique à fluorescence

43. 4. HEMATOLOGIE

44. 4. HEMATOLOGIE
 Les différents systèmes d’analyse des cellules étudient
de nombreux paramètres cellulaires.
Exemples :
 la taille et le volume des cellules
 la taille et l’aspect du noyau (segmentation, densité chromatinienne)
 le contenu granulaire intracytoplasmique
 l’activité peroxydasique du cytoplasme.
 la concentration en hémoglobine

45. 4. HEMATOLOGIE
2principes sont utilisés :
 détection électrique
 détection optique

46. 4. HEMATOLOGIE
 Principe de la détection électrique
- Détection volumétrique par différence de conductivité (variation d’impédance)
Ce principe est basé sur la différence de conductivité entre les cellules mauvaises
conductrices et le milieu salin, électro-conducteur dans lequel baignent les cellules.

47. 4. HEMATOLOGIE
 Principe des détections généralement optique après focalisation hydrodynamique
Ce principe associe les principes de bases de la Cytométrie en Flux (1977):
• Focalisation hydrodynamique: les cellules passent en file indienne devant un système de détection ou
chambre de mesure.
• Détection des signaux optiques ou physiques émis par les cellules natives ou ayant subi un traitement
préalable et coupant le faisceaux d'un laser ou d'une lampe à mercure
Les signaux mesurés sont essentiellement relatifs :
- aux propriétés optique par étude de la diffusion lumineuse liés à la taille de la cellule, à sa structure interne
(estimation de la granulométrie du cytoplasme, de la forme du noyau ...)
- aux propriétés des enzymes cytoplasmique (ex: recherche d'activité peroxydasique)
- aux propriétés du noyau (densité) par mesure de la conductivité à l'aide d'un courant haute fréquence.
• Ces signaux séparés par des filtres optiques sont collectés par des photomultiplicateurs, amplifiés,
numérisés, traités et stockés par un ordinateur.

48. 4. HEMATOLOGIE

49. 4. HEMATOLOGIE
 - Détection optique
Étude de la diffusion de la lumière
La diffusion de la lumière est la résultante de plusieurs phénomènes : diffraction, réflexion,
réfraction et absorption.
Lorsqu’une cellule traverse un faisceau lumineux (laser ou lampe) excitateur, le faisceau
lumineux incident va subir une diffusion dépendant des propriétés physiques de la cellule
(diamètre, forme du noyau, contenu cytoplasmique). La lumière laser (monochromatique,
unidirectionnelle) diffusée par une cellule est détectable par un photodétecteur sous des
angles différents.

50. 5. Hémostase
 L'Hémostase est souvent comparée à une balance
 En effet, la fluidité du sang (homéostasie) est
maintenue grâce à un judicieux équilibre entre
activateurs et inhibiteurs (antithrombine, Protéine C,
Protéine S). Toute rupture de cet équilibre fera
pencher la balance vers un processus pathologique :
• La thrombose : formation de caillot pouvant provenir
d'un déficit en inhibiteur
• L'hémorragie : saignement pouvant être dû à un
déficit en facteur de la coagulation

51. 5. Hémostase
 En première intention, l'exploration de la coagulation repose sur la réalisation du temps
de Quick (taux de prothrombine) et du temps de
céphaline + activateur (TCA).
 PRINCIPE
 grâce au système de détection viscosimétrie (mécanique) unique de Stago présent sur
tous nos systèmes, la fiabilité des résultats est garantie, les mesures n'étant pas affectées
par les interférences optiques. De plus, ce système de détection affiche une sensibilité
maximale pour la détection des caillots faibles.