2. Capteurs à
transducteurs
électrochimiques
Les anticorps
comme
récepteurs: Les
immunocapteurs
Paramètres
d’optimisation
4.Conception
PLAN
Dispositif, principe
et mesures
Définitions et
classification
Technologie,
matériaux..
De la preparation
mesures
Immunocapteur électrochimique sans marquage
2
3. Contexte
Le cancer de l'ovaire est l'un des
principaux cancers gynécologiques et la
cause la plus fréquente de décès par
cancer chez les femmes dans le monde,
avec un taux d'incidence qui augmente
avec l'âge, étant rare chez les femmes de
moins de 40 ans.
CA125 est une protéine de haut poids moléculaire et plus
couramment utilisée comme biomarqueur pour le
diagnostic et la surveillance du cancer de l'ovaire, étant
le seul marqueur approuvé pour suivre la progression du
cancer et la réponse au traitement.
considéré comme le marqueur tumoral de
référence dans le cancer de l'ovaire Le CA125 est
présent à la surface des cellules tumorales
ovariennes et peut être détecté à l'aide
d'anticorps polyclonaux tels que l'anti-CA125
3
4. Enjeux
La détection et la quantification du biomarqueur CA125
sont réalisées par :
• dosages immun enzymatiques (ELISA)
• spectrométrie fluorescente
• Dosage radio-immunologique
• immunohistochimie
Ces tests nécessitent l'utilisation de réactifs en grande quantité,
une main-d'œuvre spécialisée, un équipement coûteux et une
maintenance, empêchant l'application de ces techniques en
dehors du laboratoire ou de l'hôpital, en plus d'être invasifs
et/ou inconfortables pour les patients
4
5. Figure 1: Classification des biocapteurs sur la bases des biorécepteurs et des transducteurs utilisés
5
7. Electrochimie
Science qui étudie la relation entre l’électricité, en tant que phénomène
mesurable et quantitatif, et un changement chimique identifiable
L’électricité était considérée comme le résultat d’un changement
chimique particulier
Des réactions impliquent des charges électriques se déplaçant entre les
électrodes et un électrolyte (ou une espèce ionique dans une solution).
Ainsi, l’électrochimie traite de l’interaction entre l’énergie électrique et
le changement chimique.
1. Capteurs à transducteurs électrochimiques
1.1. Définitions
7
8. Processus électrochimique
Constitué par l’ensemble des phénomènes associés a la production d’un
transfert de charge électrique à travers l’interface formé par la mise en
contact d’une électrode avec un électrolyte, c’est-à-dire un conducteur
électronique et un conducteur ionique.
On désigne en conséquence ce type d’interface par l’appellation
d’interface électrochimique
8
9. 1.2. Dispositif : La cellule électrochimique
Cellule
électrochimique
Electrode de travail: répond à
l'analyte cible et est ainsi appelée
électrode indicatrice
Electrode de référence: est d'un
potentiel constant et indépendante
des propriétés de la solution
Electrode auxiliaire (Counter)
9
10. • L’électrolyte support étant un milieu libre, dans lequel il n’existe pas
d’électrons, le transfert d’électrons de l’électrode à l’électrolyte nécessite
qu’une substance située à proximité de l’interface capte les électrons cédés
par l’électrode et les fixe, ce qui correspondent à la réduction de la
substance acceptrice d’électrons (oxydant)
1.2 Principe de mesures électrochimiques: Réaction redox et potentiel électrochimique
10
11. • Pour qu’un transfert d’électron ait lieu en sens contraire, de l’électrolyte à
l’électrode, les électrons doivent à l’inverse être fournis, cédés à l’électrode,
par une substance agissant comme donneur d’électrons (réducteur), situé
également près de l’interface. Ce qui correspond à une oxydation
• Les substances oxydantes ou réductrices qui réagissent de cette manière sont
dite électro actives. Dans le cas le plus simple, l’addition (réduction) ou la
soustraction (oxydation) d’électron(s) se traduit par un système
électrochimique de simple transfert de charge, sans modification de sa
composition atomique. Ou Ox/R désigne le couple oxydant/ réducteur (ou
couple redox), accepteur donneur d’électrons, intervenant à l’électrode.
11
12. Pour tout redox couple, il existe un potentiel d'électrode
correspondant qui est lié à l'énergie libre par
La relation entre le potentiel d'équilibre de l'électrode, E°, et la
concentration est donnée par l'équation de Nernst :
• ΔG est le changement d'énergie libre
• n est le nombre de moles d'électrons
• F est la constante de Faraday (96 485,3 C mol-1)
• E est le potentiel d'électrode (par rapport à l’éléctrode de référence).
• E° est le potentiel d'électrode standard (le potentiel où O et R sont dans leurs
états standard)
• [R] et [O] sont les concentrations des formes réduite et oxydée respectivement
12
13. 1.4. Mesure: Le voltammogramme
La courbe du courant en fonction du potentiel est appelée le
voltammogramme, la forme exacte de la réponse
voltampérométrique est contrôlé par les processus de la réaction
à l’électrode.
représente la somme des courant faradiques de l’électrolyte
et de la solution électrolytique en plus de tous les courants non
faradiques
•Première loi : la quantité de substance libérée
lors de l’électrolyse à une électrode est
proportionnelle au temps et au courant électrique
(ce qui équivaut à la charge).
•Seconde loi : les poids de divers corps séparés
aux électrodes par la même quantité d'électricité
sont entre eux comme leurs équivalents
chimiques.
Courant faradique : courant associé au
transfert de charge à une interface
métal/solution. Ce transfert accompagne
les réactions d'oxydation ou de réduction
qui conduisent à une modification de la
composition chimique. Cette dernière
obéit à la loi de Faraday
13
14. Un biocapteur qui utilise des anticorps ou antigènes comme des ligands biologiques (biorécepteur)
2. Les anticorps comme récepteurs: Les immunocapteurs
2.1. Définitions et atouts
14
15. Ils sont stables, solubles, sélectifs
Leur préparation et leur immobilisation sont bien décrites.
Ils sont disponibles sous forme de mélange d’anticorps reconnaissant différents épitopes
d’un même antigène, dénommés anticorps polyclonaux, ou pur reconnaissant un seul
épitope (anticorps monoclonaux).
Des systèmes simples, fiables et peu onéreux dédiés aux analyses de routine et de
recherche en sciences biologiques et médicales.
15
16. Les immunocapteurs sont basés sur la spécificité du site actif de anticorps liés aux épitopes de
l'antigène pour former un anticorps-antigène.
Cette interaction est généralement maintenue par des liaisons hydrogènes et des forces
électrodynamiques hydrophobes.
Les acides aminés phénylalanine, la tyrosine, le tryptophane et l'histidine ont des groupes
aromatiques, sensible au processus d'oxydation, permettant l'analyse électrochimique de acides
aminés
• directement, en fonction de leurs emplacements dans la structure tridimensionnelle de
l'anticorps
• indirectement, à l'aide de médiateurs électrochimiques (le potassium ferrocyanure utilisé
dans ce travail, peut être utilisé comme médiateur en raison de sa propriété
d'augmentation du signal d'oxydation des acides aminés)
La réaction clé:
16
18. Immunocapteur
Voltamétrique
• basé sur la mesure du
changement de potentiel dû à
la formation d'un complexe
immunologique entre
l'anticorps et l'antigène.
• Le principal avantage des
immunocapteurs
voltamétriques est la simplicité
de fonctionnement, permettant
une utilisation dans
l'automatisation et la
miniaturisation des capteurs à
semi-conducteurs
Immunocapteur
ampérométrique
• Ces transducteurs
mesurent le courant
généré par une réaction
d’oxydo-réduction entre
les 2 électrodes à un
potentiel constant
• Type caractérisé par sa
haute sensibilité et sa
large gamme de linéarité
comparé aux
transducteurs
potentiométriques.
Immunocapteur
conductimétrique
• repose sur une relation
entre la conductance et
un événement de bio-
reconnaissance
• une aptitude à la
miniaturisation sans
électrode de référence
Immunocapteur
impédimétriques
• repose sur la technique de la
spectroscopie d’impédance
basée sur: 1- l’application
d’une contrainte sous forme
d’une variation sinusoïdale en
tension de quelques millivolts
d’amplitude, entre l’électrode
de référence et l’électrode de
travail
• 2-la mesure du courant
généré entre l’électrode de
travail et l’électrode
auxiliaire en fonction de la
fréquence
2.2. Classification selon la technique de transduction (2/2)
18
19. Immunocapteurs:
Sans marquage Avec marquage
déterminer le complexe
antigène-anticorps en
estimant les
changements physiques
causés par le
développement du
complexe
un marqueur
détectable avec une
très haute sensibilité
est introduit
2.3 Classification selon le marquage
19
20. 3. Paramètres d’optimisation
3.1. Technologie de conception de la cellule électrochimique
Ces dernières années, les électrodes imprimées pour des dispositifs capteurs ont connu un important
développement
elles permettent de minimiser les coûts
sont compatibles avec une production industrielle
Des électrodes sérigraphiées sont disponibles dans le commerce proposant différents types de
matériaux d’électrodes, comme l’or ou des matériaux carbonés (nanotubes de carbone, carbones
nanoporeux, fibres de carbone, graphite, graphène….)
Sont en général proposés en systèmes à trois électrodes sur lesquels sont imprimées à la fois
l’électrode de travail, la contre électrode et l’électrode de référence
20
21. 3. Paramètres d’optimisation
3.2. Matériaux de l’électrode de travail
• Les substrats conducteurs et semi-conducteurs peuvent être dérivés de matériaux d'électrode conventionnelles, tandis que
les composant de modification ont des origines et des propriétés très diverses.
21
22. • Pour des applications analytiques, les électrodes modifiées chimiquement devraient posséder certaines
propriétés :
Bonne stabilité mécanique et chimique de la surface de l'électrode
Bonne reproductibilité à court terme et stabilité à long terme de l'activité des modificateurs vis-à-
vis de l'analyte
Large fenêtre dynamique de réponse
Des courants résiduaires faibles et stables sur toute la gamme de potentiel étudiée
Fabrication simple, fiable et qui résulte en cohérence de la réponse d'une électrode à une autre
(bonne reproductibilité).
22
23. 3.3. Fonctionnalisation de l’électrode
3. Paramètres d’optimisation
La modification de sa surface pour le rendre fonctionnel c’est-à-dire lui donner la fonction qui permettra de lui conférer
les propriétés permettant l’application à laquelle il est destiné (Immobilisation d’enzyme, anticorps…)
Une étape importante dans le
développement d'un biocapteur est
l'immobilisation de la biomolécule sonde
sur l'électrode de travail surface. Les
techniques les plus utilisées sont
l'adsorption physique, le piégeage,
réticulation, liaison covalente et
l’encapsulation . Cette étape peut affecter la
stabilité, le temps de réponse, la
reproductibilité et la sensibilité du
biocapteur
23
24. Dans le cas d’électrodes visant des applications de type capteur chimique, la fonctionnalisation a pour but
de rendre l’électrode plus sensible et/ou plus sélective à la détection du polluant visé.
La modification de la surface de l’électrode consiste à déposer, greffer, adsorber une couche
fonctionnelle
La fonctionnalisation de surface est un élément clé du développement des capteurs électrochimiques.
Elle permet en effet d’améliorer la sélectivité et la sensibilité du dispositif de détection,
24
25. 3.4. Choix de la méthode d’analyse voltammétrique
3. Paramètres d’optimisation
Techniques
transitoires
Techniques
d'état stable
25
26. Malgré l'excellente résolution spatiale et temporelle affichée par la voltamétrie en régime permanent, il existe un certain
nombre d'inconvénients pour certaines applications.
• La consommation d'analyte est directement proportionnelle au courant
Cela peut être un inconvénient majeur dans la mesure de l'oxygène où se posent les problèmes biologiques les plus
intéressants sont les tissus où la concentration en oxygène est faible. Le fonctionnement intermittent peut apporter
une solution.
Les seuils de détection et de sensibilité des capteurs sont fréquemment limitées .
Lorsque les courants sont faibles, comme c'est forcément le cas en microélectrode mesures (les courants inférieurs au
nanoampère sont typiques), la sensibilité peut ne pas être adéquat.
Le fonctionnement du capteur avec un potentiel non permanent augmente la sensibilité en échantillonnant le courant
lorsque le gradient de concentration en surface est plus important.
26
27. • Les techniques transitoires plus sophistiquées ne sont généralement pas adaptées à la mise en œuvre des
capteurs, bien qu'elles puissent être utiles pour caractériser à la fois le capteur et le réaction de l'électrode
• La voltamétrie cyclique est une technique de « premier regard » particulièrement utile mais, à
l'exception de la recherche sur les neurotransmetteurs n'a pas été largement utilisé dans les applications
de biodétection en raison des limites de détection relativement élevées.
• La voltamétrie à impulsions différentielles et la voltamétrie à onde carrée impliquent toutes deux la
modulation de une rampe ou un escalier respectivement avec un train d'impulsions carrées
27
30. Les films polymères modifient la réactivité, la
sélectivité et la sensibilité, ce qui les rend très
attractifs pour les grandes applications, en
particulier dans la fabrication de nouveaux
biocapteurs. La modification du screen printed
carbon electrode (SPCE) entraîne une réponse
électrochimique accrue par rapport au SPCE
nu, confirmant la présence de polymère à la
surface du graphite
1.Electrodeposition of poly(3-HPA)
30
31. 1. Verser une solution d'anticorps anti-CA125 (4
µL, 2 µmol L−1) a été versée goutte à goutte
sur l'électrode en graphite modifié
[SPCE/poly(3-HPA)].
2. Evaporer Le solvant à température ambiante
pendant 30 min et laver au tampon phosphate.
3. Immerger l’électrode a été immergée dans une
solution de blocage (BSA 0,5 %, p/v) pendant 1
h à 8 °C
4. Laver avec du tampon phosphate
Adsorption de des anticoprs
2. Immobilisation de la sonde Anti-CA 125
31
32. 3. Réaction avec l’antigène CA 125
1. Ajouter l’antigène CA 125 (4 µL, 80 U mL−1) dans du
tampon phosphate (0,1 mol L−1) goutte à goutte sur
l'immunocapteur [SPCE/poly(3-HPA)/anti-CA125]
2. Le maintenir maintenu à 30 °C, pendant 30 min, pour
favoriser l'interaction entre la sonde antigénique et
l'anticorps cible.
3. Rincer l’électrode dans du tampon phosphate, sous
agitation, pour éliminer le matériel non lié puis la
sécher à température ambiante
32
33. La détection se réalise en utilisant une solution de
ferrocyanure de potassium (100 µL, 5 mmol L−1) dans une
solution de KCl (0,1 mol L−1).
Le signal de courant est la mesure par voltampérométrie
différentielle à impulsions, à partir de -0,10 V à +0,30 V
4. Détection de l’antigène CA 125
La Voltamétrie impulsionnelle différentielle (DPV) est la plus importante et la plus largement appliquée des technique
voltamétriques impulsionnelles .
La DPV utilisée comme outil d’analyse offre des avantages par rapport à d’autres techniques électrochimiques. Le
DPV est très sensible, permettant souvent des analyses directes au niveau ppb
33
34. Références
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Références
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