méthode de dénombrement des bactéries

1. Université Mohammed IV
Agdal
Coursde
Méthodesd’analysedes aliments
Méthodes microbiologique
Dr El yadini Meryem
Faculté des Sciences
Rabat

2. Méthodesconventionnelles
dedénombrement
desbactéries

3. 2-1. Mesure du nombre decellules
 Nombre de cellules totales
 Cellule de Thomas / lame de Petrof-Hausser
 Dispositif électronique (Compteur de Coulter)
 Nombre de cellules viables
 Sur milieu solide
 Sur milieu liquide
2-2. Mesure de lamasse
 Mesure du poids sec: (P. frais d'1 bact.= 1,5 10-12g)
 Dosage de l'azote total / méthode de kjeldahl (14% du poidssec).
 La turbidimétrie: consiste à mesurer l’intensité du troublebactérien.
Méthodes

4. • L’échantillon àêtre énuméré est appliqué sur une lame
d’hématimètre
qui retient un volume fixe dans une cellule de
comptage.
• Le nombre de cellules est compté.
• Le nombre de cellules dans le volume donné est
déterminé
1- Dénombrement microscopique

5. Hématimètre
Cette lame possède 2 cellules de comptage indépendante
5
1- Dénombrement microscopique

6. Cellule de Malassez
La cellule de Malassez possède un quadrillage spécifique
comportant 100 rectangles :
1- Dénombrement microscopique

7. 7
• Compter le nombre de cellules dans trois
carrés indépendant: 8, 8 et 5
• Déterminer la moyenne
(8 + 8 + 5)/3 =7 Donc 7 cellules/carré
1- Dénombrement microscopique

8. 8
Donc 7/ 1 X 10-4 ml = 7 X 104 cellules/ml
1mm Profondeur : 0.1mm
1- Dénombrement microscopique
• Calculer le volume d’un carré:
= 0.1cm X 0.1cm X 0.01cm= 1 X 10-4cm3 ou ml
• Diviser le nombre moyen de cellules par le
volume d’un carré:
Donc 7/ 1 X 10-4 ml = 7 X 104 cellules/ml

9. 9
1- Dénombrement microscopique
Avantages:
 Rapide
Aucune croissance requise
Désavantages:
Ne discrimine pas entre vivant et mort
Peux être difficile de discriminer entre les
bactéries.
Peux être difficile de discriminer entre les
bactéries et les détritus.

10. Problème
Un échantillon est appliquéàune lame d’hématimètredont
les cellules de comptage ont les dimensions suivantes: 0.1mm
X 0.1mm X 0.02mm et qui possèdent 100 carrés. Des
comptes de 6,4 et 2 cellules ont été faits dans trois carrés
indépendants.
Quel est le volume d’une cellule de comptage?
Quel est le volume d’un carré?
Quel est le nombre de cellules par millilitre dans l’échantillon?

11. Exercice
On veut déterminer le nombre de bactéries vivantes dans l’urine d’un malade atteint d’une
infection bactérienne et suivant un traitement antibiotique. Les dénombrements avant le traitement
ont montré que l’urine du patient contient une concentration de 106 cellules bactériennes
vivantes par ml d’urine. Après un jour de traitement au Bactrim (trimethoprim +
sulphamethoxazol), le pharmacien biologiste dépose un volume de 0,01 ml à la surface d’une
cellule de Thoma. Après 30 minutes de repos permettant la décantation des cellules, la lame est
examinée au microscope, au fort grossissement.
- Calculer la concentration des cellules par ml dans cette urine sachant qu’on a
compté 350 cellules dans 10 petits carrés dans une solution 10 fois plus
concentrée de l’urine originale.
Rappel : La cellule de Thoma est une lame creuse au centre avec un quadrillage d’environ 400
petits carrés. Chaque petit carré a une surface de 1/400 mm2 . La distance entre la grille et la
lamelle est de 1/10 mm.

12. Résolution de l’exercice
Volume d’un petit carré = surface x profondeur
= 1/400x 1/10= 1/4000 mm3= 0,25 .10-3 mm3= 0,25.10-6 cm3
(ml)
Le volume de 10 petits carrés= 0,25 10-5 cm3
Nous avons 350 cellules dans 10 petits carrés
Le nombre total = 350 divisé par 0,25 .10-5
= 14. 107 cellules /ml de l’échantillon analysé.
Puisque l’urine du départ était concentrée 10 fois, donc le
nombre de bactéries dans l’urine est :14 .106 cellules /ml
d’urine.

13. Fluorescence
Certains systèmes (atomes, molécules, cristaux,…) lorsqu’ils
sont dans un niveauexcité,peuvent se désexciter en émettant
des photons.
excitation
La fluorescence est lapropriété que possèdent certains corps d'émettre
de lalumièreaprès avoir absorbé des photons de plus haute énergie.
Il est possible de sélectionner spectralement lalumière émise
→ microscopie de fluorescence

14. Microscopie de fluorescence
Il s’agitdonc d’une
détection sur fond noir
Le déplacement de Stokes décrit ladifférenceentre lalongueur d'onde
absorbée par l'objet (émisepar lasource lumineuse du microscope) et
émise par l'objet.

15. Les biomolécules en fluorescence
•En général, les molécules biologiques (protéines, acides nucléiques,…)
ne sont pas fluorescentes dans le visible (quelques exceptions: flavines,
NADH, GFP
,…). Certains acides aminés ont néanmoins des propriétés de
fluorescence dans l’UV (tryptophane).
•On attachespécifiquement des marqueurs fluorescents :
 Couplage covalent (liaison chimique)
Marquage d’affinité:on utiliseune moléculefluorescentequi vient
s’attacherspécifiquement (anticorps,toxines,…)
 Clonage d’uneprotéine fluorescente

16. Dénombrement avec le microscope à
épifluorescence
C'est un comptageaumicroscope àfluorescence après marquages des cellules par
un colorant de l'ADN (fluorochrome).
Exemple:
Acridine orange,
DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole),
SYBRTM Green,
Picogreen.

17. Dénombrement au compteur à particules.
On met les microorganismes en suspension dans une
solution unique et on fait passer la suspension à travers un
orifice à la sortie duquel il y a deux électrodes qui se font
face. Il y a une variation de la conductivité quand la cellule
passe entre ces deux électrodes.
Chaque variation de conductivité est comptée comme une
cellule ;toutes les cellules sont ainsi comptées.

18. Dénombrement au compteur à particules.
Avantages:
 Facile et rapide à utiliser.
Utile pour des micro-organismes
de grande taille ou des cellules
sanguines.
Désavantages:
Ne peut pas distinguer entre des
cellules vivantes ou mortes.

19. Cytométrie en flux : même principe que le
compteur à particule à la différence que le comptage
est effectué lorsque les cellules passent devant un
faisceau laser et qu'il y a réémission de lumière
fluorescente ou diffraction créant une diffusion de la
lumière reçue.
Méthode plutôt utilisée pour fairedu tri cellulaire selon
plusieurs critères.
Dénombrement au cytomètre en flux

20. Dénombrement au cytomètre en flux
Il y aplusieurs étapes:
Incubation des cellules avecun
marqueur ou un colorant
Les cellules passent dans un faisceau
laser
.
Elles diffractentlalumièreet émettent
une fluorescence.
Les données lumineuses sont
converties en données numériques et
analysées par un ordinateur
, Ilpermet
de compter et même de trier les

21. https://www.youtube.com/watch?v=PCJ13LjncMc
https://www.youtube.com/watch?v=oaU1ZO41dpY
https://www.youtube.com/watch?v=wtgIemnzUOA

22. En milieu liquide
On utiliselaméthode du NPP (nombre leplus probable).
En milieu solide
On réalise une série de dilution de l'échantillon àdénombrer (en
général de 10 en 10).
 Un certain volume de lasuspension est étalée àlasurfaced'un
milieu gélosé en boite de Pétri ou incorporé dans la masse.
 Après incubation on compte lenombre de colonies dans les
boîtes (30-300 colonies).
Dénombrement après culture

23. Dénombrement après culture
En milieu liquide
Nombre le Plus probable: NPP
 Commencer avec un bouillon qui permet de déceler les caractéristiques
désirées.
 Inoculer differentes dilutions de l’échantillon à être testé dans
chacun de 3 tubes.
-1 -2 -3 -4 -5 -6
3 Tubes/Dilution
de chaque dilution dans chaque tube
Après une période d’incubation approprié, enregistrer les TUBES POSITIFS (qui ont de la
CROISSANCE et les caractéristiquesdésirées)

24. Dilutions: -1 -2 -3 -4
Tubes positifs: 3 2 1 0
Dénombrement après culture
En milieu liquide
Nombre le Plus probable: NPP
 L’objectifest de dilué l’organismeà zero.
 Après l’incubation,lenombre de tubes qui démontre les
caractéristiques désirées sont enregistré:
Exemple de résultats pour une suspension de 1g/10ml de terre
 Choisir labonne suite: 321 et laretrouver dans le tableau
 Multiplier le résultat par le facteur de dilution central
 150 X 102 = 1.5 X 104/mL
 Puisque vous avez1g dans 10mL doit multiplierencore par 10
 1.5 X 105/g

25. Principe de la méthode NPP
 Cette méthode est une estimation statistique du nombre
de micro-organismes supposés distribués dans
l’échantillon de manière parfaitement aléatoire.
 L’estimation de la densité bactérienne est obtenue par
application du principe de vraisemblance, à partir de
réponses positives observées pour une ou plusieurs
dilutions successives de la suspension bactérienne
originelle dans des milieux de cultures liquides. Il s’agit
d’une méthode quantique et non pas énumératif.

26. 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7
La dilution cible est obtenue par
dilution sériée d’ordre 10.
1 mL est versé dans 9 mL (d = 1/10). La solution obtenue est à nouveau
diluée au 1/10, etc.
Solution mère
Dilution de l’échantillon

27. Interprétation des résultats
Lecture
La seule manièrede savoir si un micro-organisme est
présent ou non dans l'inoculum par les techniques en
milieu liquide sera de le mettre en évidence par l’unde ses
caractères: trouble et production de gaz.
Si l'un de ses caractères apparait, le résultat sera positif.
L'absence de l'un de ses caractères, le résultat sera négatif

28. Interprétation: Cas d’un seul tube
Volumede
l'inoculu
m: 1mL
Produit pur 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
Résultat + + + + - -
exemple de résultat:
Il y a au moins 1 micro-organisme dans 1 mL de la dilution 10-3 et
moins d'un micro-organisme dans 1mL de la dilution 10-4 et donc on
peut en déduire qu'il y a au moins 103 micro-organismes mais
moins de 104micro-organismes dans 1mL de produitpur.

29. Cas de deux tube
Dilution 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
Résultats ++
2
++
2
++
2
+-
1
--
0
combinaison 1
2 1 0
Combinaison 2
2 2 1
Combinaison 3
2 2 2
Volume de l'inoculum: 1mL

30. Choisir le nombre le plus grand possible et si possible
inférieur à220 (meilleure répartition dans les dilutions).
Lire le NPP dans latable de Mac Grady pour 2 tubes par
dilution.
En déduire laconcentration en micro-organismes par mL
de produit pur [N] :
N=

31. NPP= nombre le plus probable obtenu par lecture
de latable de Mac Grady
V inoculum= volume de bactérie prise
Fd= facteur de ladilution correspondant au chiffre
des centaines du nombre caractéristique.

32. Dilution 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5
Résultats ++
2
++
2
++
2
+-
1
--
0
combinaison 1
2 1 0
Combinaison 2
2 2 1
Combinaison 3
2 2 2
Dans le cas de l’exemple,on choisit 210 (car < 220) pourla
dilution 10-3.
Volume de l'inoculum: 1mL

33. Dans latablede
Mac Grady, le
NNP
correspondant à
210 est 6,0.

34. calcul
On a:
N=
NPP= 6
Vinoc=1ml
Fd= 10-3
Cela signifie qu’il y a
statistiquement 6 bactéries
dans l’inoculum de la
dilution 10-3 mL
En déduire laconcentration en micro-organismes par mL de
produit pur N
N=6X103 UFC /ml

35. Cas de trois tubes
Dilution 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Résultats +++
3
+++
3
++-
2
++-
2
+--
1
---
0
combinaison 1
2 1 0
Combinaison 2
2 2 1
Combinaison 3
3 2 2
Combinaison 4
3 3 2
Volume de l'inoculum: 1mL

36. •Choisir le nombre le plus grand possible et si possible
inférieur à330 (meilleure répartition dans les dilutions).
•Lire le NPP dans latable de Mac Grady pour 3 tubes par
dilution.
•En déduire laconcentration en micro-organismes par mL
de produit pur [N] :
N=

37. Dilution 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6
Résultats +++
3
+++
3
++-
3
++-
2
+--
1
---
0
combinaison 1
2 1 0
Combinaison 2
2 2 1
Combinaison 3
3 2 2
Combinaison 4
3 3 2
Volume de l'inoculum: 1mL

38. Se
table
Grady
reporter au
de Mac
pour 3
tubes de dilution
afin de trouver le
NPP
correspondant au
nombre 322: le
NPP est 21

39. calcul
On a:
N=
NPP= 21
Vinoc=1ml
Fd= 10-2
Cela signifie qu’il y a
statistiquement vingt et un
bactéries dans l’inoculum
de ladilution 10-2 mL
En déduire laconcentration en micro-organismes par mL de
produit pur N
N=2.1X103 UFC /1ml

40. Conclusion
Le dénombrement des bactéries sur milieu liquide reste
une technique classique nécessite un long temps de
réponse(au moins 24h) et ne permet pas de détecter les
bactéries actives mais non cultivable.
Par conséquent la méthode la plus utilisée est la méthode
enzymatique qui ne comporte aucune étape de mise en
culture et permet un gain de temps d'incubation
considérable par rapport aux méthodes classiques(réponse
20-30 min) et permet aussi de détecter les bactéries
actives mais non cultivables.

41. En milieu solide
Cellule viable: une cellulecapable de se diviser et de générer
une population (ou colonie).
1. Un compte viable est fait en diluant l’échantillon original
2. Étaler des échantillons des dilutions sur un milieu de culture
approprié
3. Incuber sous les conditions appropriées pour permettre la
croissance
Des colonies sont formées
4. Les colonies sont comptées et le nombre original de cellules
viables est déterminé en fonction de la dilution
Dénombrement après culture

43. Dilution d’un Échantillon de Bactéries

44. Analyse de la croissance sur boîte
Exemple:Escherichia colisur milieu minimum à42°C Culture liquide en LB + Amp de nuit à30°C (DO 4)
diluée àD O 0,3 –dépôt de 5μl –incubation 24 ou 48h

45. En milieu solide
Le nombre total de cellules viables est indiqué en tant qu’Unité
Formatrice de Colonies (UFC) plutôt que nombre de cellule.
 Chaque colonie est originaire d’une unité formatrice de colonie (UFC).
 Une plaque avec 30-300 colonies est choisie Calcul:
Dénombrement après culture
Nombre d’UFC/ml = Nombre de colonies sur la plaque X la réciproque de la dilution
(facteur de dilution)
Ex.57 UFC X 106 = 5.7 X 107 UFC/mL
n
N = —————— x d
V
n = Nombre de colonies compté
d= dilution de l’échantillon
V= Volume de l’inoculum cm3

46. Avantages:
 Dénombre les microorganismes viables
 Peut distinguer différents microorganismes
Désavantages:
 Pas de milieu universel
 Nécessite la croissance du microorganisme
 Seule les cellules vivantes génèrent des colonies
 Des amas ou des chaînes de cellules génèrent une
seule colonie UFC  une bactérie
Ex. Un UFC de Streptococcus  un UFC d’E.coli
Dénombrement après culture
En milieu solide

47. Exercice d’application
L'analyse bactériologique d'une urine infectéedonne le
tableau de résultats suivant, sachant que l'on aensemencé
0,1 ml de chaque dilution par boite de milieu de culture.

48. 1) Quelle dilution doit-on utiliser pour réaliser le
dénombrement ?
2) Déterminez le nombre de bactéries par ml d'urine.
3)Le dénombrement bactérien sur le même échantillon
d'urine, par laméthode directe au microscope optique,a
donné 15.105bactéries /ml,comparer les deux résultats et
interpréter.

49. Résolution
Parmi les boites comptables on ne considèrera que laboite qui
adonné un nombre de colonies compris entre 30 et 300
colonies.
Dans notre exemple, ladilution choisie est ladilution 10-3.
Le nombre de bactéries= 106 (moyenne) x 10 (volume
ensemencé 0,1ml) x 103 ( facteur de dilution)
= 10,6 x 105 UFC /mld’urine
La différence entre les deux méthodes vient du faitque la
méthode directe au microscope compte aussi bien les cellules
vivantes et les cellules mortes.

50. Dénombrement des bactéries :
Détermination poids sec
Directe
détermination du poids sec des organismes
culture/centrifugation/lavage/séchage à100-110°C dans un
four/pesées
- méthode longue et peu sensible/précise,
- pas de distinction entre les vivantes et les mortes.

51. Approches optiques
Détermination visuelle de la turbidité
Mesure de l’opacimétrieou de la néphélométrie
(la densité optique )
La turbidimétrie :est lamesure de lalumière
transmise par des particules en suspension.
Elle exige des concentrations relativementélevées et
se conforme àlaloi de Beer Lambert.
Mesure de la Turbidimétrie

52. Dénombrement des bactéries:
Mesure de la Turbidimétrie
52
 Mesure ladensité optique = Mesure laquantité de lumière qui
peut traverser un échantillon
Le moins de lumière qui traverse l’échantillonle plus dense.
Spectrophotomètre (A600)

54. l’importancede ladiffraction de lalumière est mesurée par
un spectrophotomètre (opacimétrie) ou un néphélomètre
àdes longueurs d’ondes autour de 600 nm (pour
minimiser absorbance du milieu).
 Dédié àlamesure de particules d’unetaille typiquement
comprise entre 0.05 μm et 5 μm.
Dénombrement des bactéries:
Mesure de la Turbidimétrie

55. Cuve de
spectrophotomètre
Source de
lumière
I0 I
……
…
…
.…
.
…
…
.
…
.
.
.
..
. .
…....
…
.
.
…
…
…
.. ..
Lumière réfléchie
(absorbée)
I  I0
Toute suspension bactérienne
obéit à la Loi de Beer Lambert :
D.O = log I0 / I = ∑ l C = KC
∑ = constante d’absorbance
Ιο= l'intensité lumineuse incidente,
Ι =l'intensité lumineuse transmise
C = concentration
∑ et l sont constantes, donc DO proportionnelle à C
La longueur d'onde utilisée pour les suspensions bactériennes est
comprise entre 600 et 620 nm (spectre d'absorbance).

56. Avantages:
 Méthode directe, précise, simple,rapide
Désavantages:
 Méthode ne distingue pas cellules vivantes et mortes.
 peu sensible (il fautplus de 106bactéries/ml).
 Problème des milieux très colorés ou très troubles
Dénombrement des bactéries:
Mesure de la Turbidimétrie