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1. LES TECHNIQUES
IMMUNOLOGIQUES
Faculté de médecine Département de pharmacie
Parasitologie et Mycologie Médicale
4ème Année pharmacie

2. 1) INTRODUCTION
• Le diagnostic de certitude des parasitoses et des mycoses repose sur la
mise en évidence de l’agent causale dans les milieux biologiques
• Néanmoins, les tests immunologiques sont très utiles et parfois
indispensables pour le diagnostic, le suivi thérapeutique et les enquêtes
épidémiologiques.
• Plusieurs techniques sont disponibles et il est souvent nécessaire de les
associer….

3. Quelque définition
•Vrais positifs (VP): représente le nombre d'individus malades avec un test positif,
•Faux positifs (FP): représente le nombre d'individus non malades avec un test positif,
•Faux négatifs (FN): représente le nombre d'individus malades avec un test négatif,
•Vrais négatifs (VN) représente le nombre d'individus non malades avec un test négatif.
La sensibilité, ou la probabilité que le test soit positif si la maladie est présente, se mesure chez les malades
seulement.
 la spécificité: la probabilité d'obtenir un test négatif chez les non-maladies se mesure chez les non-malades
seulement.

4.  Le seuil :
Le seuil d'un test est la valeur à laquelle on décide qu'il devient positif (influence / sa sensibilité et sa spécificité).
 Réactions croisées:
• réactivité d’un Ac vis à vis d’un Ag différent de celui qui a suscité son apparition.
• Dans les dépistages, on privilégie les tests les plus sensible.
• alors que pour les diagnostics avec certitude on privilégie les tests les plus spécifique
NB:
• Aucune technique n’est parfaite:
Associer au minimum deux techniques de dépistage (une qualitative et l’autre quantitative) si
discordance : technique de confirmation.
• Interprétation: toujours rattacher les résultats sérologiques aux symptômes cliniques.

5.  Ces techniques sont basées sur :
l’utilisation d’Ag:
Figurés: constitués par des:
- parasites entiers, vivants (adulte, larve ,ou œuf) ou tués,
- fragments parasitaires (coupes)
Ag solubles: contiennent soit la totalité des constituants du parasite, soit un seul constituant:
-Ag extraits des corps parasitaires(Ag somatiques),
-Ag produits par des parasites vivants (Ag métaboliques ).
 l’utilisation d’AC:
Ac Polyclonaux : il s’agit d’anticorps spécifiques d’un antigène mais reconnaissant plusieurs zones de
l’antigène(spécificités différentes)
Ac Monoclonaux : reconnaissant une seule spécificité sur l’antigène (fabriqués par une lignée unique de lym
B=clone cellulaire)

6.  Techniques immunologiques utilisées:
L'immunofluorescence
Agglutination
Immunoenzymatiques
Précipitation
Autres

7. L'immunofluorescence
L'immunofluorescen
ce directe (IFD)
L'immunofluorescence
indirecte (IFI) :

8. A-1L'immunofluorescence directe (IFD)
Consiste à appliquer sur une lame à examiner un anticorps fluorescent spécifique
(généralement un AC monoclonal) qui va se fixer sur l’Ag recherché observé au microscope à
UV
Le parasite sera fluorescent.

9. Application
• En parasitologie:
- amibiase: le recherche de l’E.h dans les différents liquides biologiques.
- toxoplasmose: recherche des tachyzoites dans: LA, placenta, LCR,LBA…..
- cryptosporidiose: sensibilité et spécificité > techniques de coloration( ziel
Neelsen).
• En mycologie:
Dans les mycose profondes mais la principale indication est le diagnostic de
la pneumocystose(sur pvt LBA, elle utilise les AC monoclonaux anti-P.carinii
dirigés contre les kystes et les formes végétatives.

10. L'immunofluorescence indirecte (IFI)
• Principe :
Consiste à mettre en présence un Ag figuré connu et le sérum à tester puis à révéler dans un 2éme temps les
Ac fixés sur cet Ag par un sérum antiglobulines marqué à la fluorescéine.
Donc elle permet la mise en évidence d’Ac spécifiques dans un sérum .

12. Application
• Amibiase:
-Dgc amibiase hépatique
-l’Ag: soit étalement sur lames d’amibes, soit des coupes à la congélation de foie de hamsters
parasités par l’E.h .
-le seuil de spécificité: 1/50
-suivie post thérapeutique.
• La leishmaniose:
-Dgc LV
-l’Ag préparé à partir du milieu de culture NNN
-seuil de spécificité : 1/80
• Trypanosomiase:
Le seuil de spécificité: 1/100

13. • La toxoplasmose:
-technique de référence ( Dye test)
-capacité de détecter: IgG, IgM, IgA
-seuil de spécificité: 1/50
• Hydatidose:
-Dgc de l’hydatidose ( dgc direct est impossible).
-seuil de spécificité: 1/20 à 1/40
-KHF: sensibilité >95% ,KHP: sensib =60%
• En mycologie:
IFI complète le diagnostic mycologique dans les mycoses profond où le dgc
des champignons peut étre difficile: Aspergillose, candidose, cryptococcose,
pneumocystose,….

14. Avantages :
•Technique simple et facile à réaliser.
•C'est une réaction sensible, reproductible, economique
• Détecte les différentes classes d’Ig : IgG, IgM, IgA
Inconvénients :
•Sa lecture est subjective et nécessite un technicien entraîné (la décroissance de la fluorescence est très progressive et la
limite de la positivité est souvent difficile à préciser, surtout pour les titres faibles).
•N’est pas automatisable.
•Utilise des conjugués fluorescents du commerce de qualité variable .

15. LES RÉACTIONS D’AGGLUTINATION

16. • Principe
Les réactions d’agglutination mettent en jeu un Ag situé a la surface d’une particule de
taille comprise entre le dixième et la dizaine de micron (globules rouges, globules blancs,
plaquettes, micro-organismes, billes de latex ).
C’est un phénomène complexe au cours duquel les Ac s’unissent aux Ag portes par la
particule formant ainsi des ponts spécifiques entre ces particules permettant leur réunion
en amas.

17. Les diverses catégories d’agglutination :
Agglutination active Agglutination passive
La particule ne possède pas
naturellement l’Ag : on lui fait
subir une greffe chimique.
utile pour tester un Ag soluble
l’Ag est naturellement
porté par la particule
L’agglutination directe
ADS
ISAGA
Hémagglutination passive
Agglutination au particules
de Latex
agglutination directe sensibilisée

18. Agglutination active
Définition :
L’agglutination est dite active quand elle résulte d’une union spécifique entre un anticorps
agglutinant et un antigène appartenant en propre à la particule.
Ces réactions peuvent être effectuées :En tube, en microplaques ou sur lames.
- Ces réactions peuvent être :
Qualitatives : détecter la présence d’un antigène ou d’un anticorps.
Quantitatives : en réalisant des dilutions successives de l’échantillon dans lequel on
souhaite déterminer la quantité d’anticorps, La dernière dilution du sérum donnant encore une
agglutination nette permet de déterminer alors le titre du sérum.
Ou traité par des enzymes protéolytiques pour en augmenter la sensibilité
(agglutination directe sensibilisée ADS, ISAGA)

19. Agglutination passive
Agglutination réalisée entre un anticorps et un antigène normalement soluble, mais rendu particulaire par fixation
sur un support figuré.
Nature du support figuré :
Ces diverses particules ne peuvent pas être utilisées indifféremment pour tous les Antigènes.
Pour chacun d’eux il est nécessaire de rechercher les particules les mieux adaptées
Particules de Latex : Agglutination au particules de Latex
Les hématies : Hémagglutination passive

20. Particules de Latex :
De forme sphérique, Ce sont généralement des particules de 0,81 μm de diamètre qui
sont utilisées.
L’antigène est fixé par simple contact sur ces particules. Afin d’éviter toute
agglutination spontanée, on travaille à pH fixe égal à 8,2.
Les hématies :
Elles sont fragiles, s’hémolysant en trois semaines. L’emploi d’hématies formolées
atténue cette fragilité.

21. Hémagglutination passive
Son principe consiste à mettre en présence diverses dilutions des sérums étudiés et des
hématies de mouton jouant le rôle de particules inertes à la surface desquelles ont été fixés
les Ag parasitaires solubles
Cette technique est simple, rapide, mais elle est peu spécifique et présente un léger manque
de reproductibilité.
-difficulté de sensibiliser les GR.
-Cette technique est influencée par les Ac naturels non spécifique , responsable de
réactions faussement positives , elle doit tjrs associée à une autre technique.

22. Tampon phosphate
50 μl
Sérum dilué
50µl
Suspension de GR sensibilisés par un Ag

24. Agglutination au particules de Latex :
-Même type de réaction que l’hémagglutination
-Ici le latex remplace les GR .
Principe:
10 μl de latex sensibilisé et un même volume de sérum à étudier, dilué au 1/5 dans le tampon glycocolle, sont déposés sur une
plaque de verre à fond noir et mélangés à l’aide d’un agitateur à usage unique.
-Une réaction positive se traduit, après rotation lente de la lame, par une agglutination des particules de latex, visible à l’œil nu,
dans un temps n’excédant pas cinq minutes.
-Un témoin positif et un témoin négatif sont systématiquement utilisés dans chacune des séries de réactions.
avantage: spécifique, rapide, sensibilité suffisante pour le diagnostic de dépistage.
inconvénient: phénomène de prozone.

25. Effet de la prozone. :
Occasionnellement, on n’observe pas d’agglutination aux fortes concentrations d’anticorps (c’est à dire aux
premières dilutions) et celle-ci n’apparaît qu’à des dilutions plus fortes.
L’absence d’agglutination à forte concentration d’anticorps s’appelle « effet de prozone ».
L’absence d’agglutination dans la prozone est due à un excès d’anticorps qui conduit à la formation de
complexes trop petits pour être visibles sous la forme d’une agglutination.

26. Techniques immuno enzymatiques

27. Techniques immuno enzymatiques
ELISA(Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay)
But: doser un Ag ou un Ac(quantitative).
Principe: fixer spécifiquement l’Ag ou l’Ac à doser sur un support, et les complexes immuns sont révélés
par Ac ou Ag spécifique marqué par une enzyme.

28. Principe du test ELISA
Saturation
Support
Incubation30 min T° ambiante
Saturation (solution protéique qui bouche les endroits
Ou les Ag (AC) ne sont pas fixés; éviter les faux +
Lavages(éliminer le liquide ayant apporter l’Ag ou l’Ac)
Introduir le sérum dilué à tester, incubation à 37C° 30min à 2h
Lavages par des automates(retirer les Ac non spécifiques non liés)

29. Substrat incolore
O2, Produit coloré
Addition du ligand marqué avec l’enzyme
Principe du test ELISA (2)
Lavages: PBS-Tween(éliminer les Ac conjugués libres)
Addition du substrat de l ’enzyme, H2O2,dans un liquide incolore contenant le
Chromogène
Enzymes
arrêter la réaction: acide sulfurique

30. Les différents types d’ELISA
-ELISA indirect
-ELISA direct
-ELISA Double Sandwich
-ELISA par compétition

31. ELISA direct
Anticorps marqué Antigène marqué
ELISA indirect
Recherche d’anticorps dans le plasma
E
S
P
E
S
P
E
S
P
Recherche d’ Ag dans le produit pathologique
anti globuline

32. Avantages:
Dosage des IgG
Lecture objective, rapide(2à3h)
Economique: qtée infime d’Ag et AC/plusieurs séries
Automatisable
Bonne reproductibilité, simple, spécifique, très sensible
Réactifs commercialisés
Suivi post thérapeutique
Inconvénient:
Phénomène de compétition antigénique entre IgM et IgG
Matériel spécifique
interférence/facteur rhumatoïde, phénomène de compétition de sites en présence d’excès d’IgG.
ELISA indirecte:

33. • Pour cela d’autre méthodes ont été proposées pour la
détection des IgM: techniques d’immunocapture
E
ELISA reverse
E
S
P
S
P
double sandwich ELISA
Immunoglobuline anti-IgM
IgM

34. ELISA (reverse)
Avantages:
recherche des IgE,IgM, IgA
Lecture objective
Automatisable
Réactifs commercialisés
Pas de compétition avec les IgG
Inconvénient:
Matériel spécifique

35. ELISA par compétition
Compétition au niveau de l’anticorps
Anticorps à doser
Compétition au niveau de l’antigène
Antigène à doser
E
Élimination par lavage
E
E
S
P
S
P
quantité limitée
quantité limitée

36. Réactions de précipitation

37. Précipitation en milieu liquide
Le ring test ou test de l'anneau :
réaction réalisée en micro tubes.
La solution d’anticorps est introduite au fond du tube et la solution antigénique est ajoutée . Après
remplissage, le tube est maintenu vertical .
Si antigène et anticorps sont spécifiques, là où ils se rencontrent, un réseau visible apparaît en moins de
cinq minutes sous forme d’un précipité fin et net formant un anneau.
Cet ancien test, surtout qualitatif, est un peu quantitatif

38. Précipitation en milieu gélifié
 Les gels utilisés :
-Inertes chimiquement.
-Visqueux à 50°C ce qui permet ‘y inclure Ag et Ac sans qu’ils soient dénaturés,
Solides à 37°C, Transparents, permettant l’observation des précipités
Principe :
 La diffusion :
- diffusion ( Ag et Ac) dans l’eau d’imbibition du gel.
-Il se réalise, à partir de la source de diffusion, un gradient de concentration décroissante à partir du point d’introduction.
-Cette diffusion dans le milieu gélifié réalise donc une dilution continue du réactif.
 La réaction antigène-anticorps :
-Lorsqu’à l’intérieur du gel, antigène et anticorps spécifiques se trouvent dans un rapport optimal de concentrations,
-l’union Ag-Ac aboutit à la formation d’un complexe de grande taille ne pouvant plus diffuser dans le gel.
-Il se forme alors une ligne de précipitation parfaitement visible avec ou sans coloration.

39. (Ouchterlony)
La gélose est coulée en plaque ou en boite de pétri
L’Ag et l’Ac diffusent en fonction de leur PM à partir de puits creusés à l’emporte pièce dans la gélose et distants de
15mm (En général, on place le sérum au centre, et les Ag en périphérie).
Il se produit ainsi des traits de précipitations dans la région où Ag et Ac se rencontrent
C’est une technique qualitative qui consiste à comparer entre elles des solutions Agéniques

40. Avantages:
oSimple à réaliser
oReproductible
oPeu couteuse
Inconvénients:
oLongue (lecture en 48 à 72h)
oPeu sensible, peu spécifique que IEP

41. • Analyse électrophorétique des sérums
• Les fractions antigéniques placées dans un champ
électrique migrant en fonction de leur charge le long
de l’axe de migration .
• La diffusion perpendiculairement à cet axe d’un
immun sérum montrera des arcs de précipitation
formés aux points de rencontre de l’Ac spécifique
avec l’Ag correspondant.
Immunoélectrophorèse

42. principe
Couler 5 ml de gélose dans le tampon
pH8,2 sur les lames pré enduites.
Laisser solidifier 1h(T° labo ) ou 4h(T°
+ 4).
Creuser les rigoles et les puits.
Déposer l’Ag soluble dans les puits/
migration sous courant électrique(cuve à
électrophorèse à migration horizontale)..
dans une chambre humide/remplir le
sérum dans les rigoles.
Laisser diffuser 24h à T° ambiante+ 24h
à T° +4

43. Lavage dans un bain de citrate trisodique 5% pd
3h pour éliminer la CRP(protéine C réactive).
déminéralisation par papilles buvard imbibé
H2O distillée/incubation à 37C° une nuit.
Lavage par le tampon pH 8,2
Colorer par amidon Schwartz 7
min/décolorer(méthanol et acide acétique dans
H2O distillé)
Témoin + et témoin -
Lecture: Ag et Ac diffusent l’un vers l’autre et
ils se forment alors des arcs de précipitation.

44. Avantages:
oBonne spécificité
oSimple à réaliser
oReproductible
oPeu couteuse
oSuivi post thérapeutique
oT. choix pr standardisation des Ags.
Inconvénients:
oLongue à réaliser
oUtilise une grande quantité de sérum et d’Ag
oPeu sensible Par rapport aux techniques quantitatives.

45. Application
• Protozoonoses: très peu employées
• Métazoaires: très utilisées
Bilharzioses : arc 4 spécifique du genre
arc 9 spécifique de l’espèce
Schistosoma.h
Distomatose:arc 2 spécifique de F.hepatica
Hydatidose: arc 5 spécifique E.granulosus
• Mycoses profondes: très utilisées (aspergillose)

46. • Appelée aussi: immunoélectrodiffusion (IED)
• Cette méthode dérive en fait de la technique d'immunodiffusion double d'Ouchterlony.
• Elle consiste à accélérer la diffusion par un champ électrique.
• Les conditions électrophorétiques sont choisies de façon à ce que les antigènes et les anticorps migrent
en sens inverse (ceci est possible car le pHi des Immunoglobulines est supérieur à celui de beaucoup de
protéines).
Electrosynerèse

47. • Comme pour les autres, de la gélose est coulée sur une plaque d’acétate de cellulose.
• l’Ag et l’Ac sont déposés dans des réservoirs circulaires de 2mm de diamètre distants de 10mm
• Migration à pH 8,2 (cuve à électrophorèse rempli de tampon pH8,2 )
• Lors de l’électrophorèse, l’Ag chargé - migre vers le pole +, il rencontre ainsi l’Ac et une ligne de précipitation
apparait .
• Cette technique évite les inconvénients
de l’IEP (gain de temps et d’Ac)
• Inconvinient : Bcp de faux positifs,

48. Autre technique

49. Cette technique combine le pouvoir de séparation de
l’électrophorèse et la grande sensibilité de
l’immunodétection, ce qui
en fait un outil performant pour l’identification d’un Ag ou
d’un Ac.
Le complexe Ac-Ag peut être visualisé selon une variété de
techniques : la colorimétrie la chimiluminescence ,
l’autoradiographie …
L’immuno-empreinte (immunotransfert)
« western blot »)

50. A. Séparation des Ag :
Les protéines d’un extrait
tissulaire ou cellulaire ou des
protéines recombinantes
dénaturées et chargées
négativement,migrent dans un
gel d’acrylamide /
bis-acrylamide (de teneur x %)
sous l’action d’un champ
électrique.
Elles sont séparées en fonction
de leur PM.

51. B. Le transfert des protéines
sur membrane
afin de rendre les protéines
accessibles à la détection par
Ac , elles sont transférées
depuis le gel sur une
membrane de nitrocellulose
sous l’action d’un champ
électrique.

52. C. Blocage:
Pour minimiser les interactions entre membrane et AC ;on
bloque les sites d’interactions non spécifiques entre ces
derniers
En plongeant la membrane dans une solution diluée de
protéines ;le +souvent de l’albumine bovine(BSA)ou du
lait sans matières grasses(lait dilué à 5%)en présence de
détergent
Les protéines dans la solution diluée se lient à la
membrane dans tous les sites non occupés par la protéines
cibles

53. D.détection:
Ac sensibles et spécifiques se liant directement à la
protéine.
Ac secondaire dirigés contre une portion spécifique de AC
primaire lié à une enzyme ou couplé à un marqueur
radioactif (isotope radioactif de l’iode)ou une molécule
fluorescente (biotine)

54. a. En protozoologie :
1) La leishmaniose viscérale:
Le diagnostic de la leishmaniose viscérale est basé sur la
caractérisation de 3 groupes d’Ac correspondants aux
Ag de PM compris entre 14-16Kd , 30-46Kd , et au
environ de 90Kd
Chez l’ID+++
APPLICATION

55. 2) La toxoplasmose congénitale:
Cette technique est d’1 grand apport au diagnostic , elle permet de
comparer le sérum de la mère et celui de son enfant ds le dg de
la toxoplasmose congénitale
• Nné indemne de Toxoplasmose congénitale: bandes identiques
• Nné atteint : bandes spécifique du Nné , sont différent de ceux
de la mère
3) La toxoplasmose oculaire
4) La toxoplasmose de l’immunodéprimé

56. En Helminthiases:
2. Bilharziose: bande 65Kd , bande 120Kd
3. Trichinellose: Ag extrait larvaire de T.spiralis
Présence de 3 bandes spécifiques : 43-44-64Kd
Ag de la famille du groupe TSL-1
4. Fasciolose: intérêt épidémiologique , Ag excrété-
secrété par la douve adulte 60Kd , 42Kd ,(27-28Kd) ,
(8-9Kd)

58. c. En mycologie:
 dans des laboratoires spécialisés
 exemples:
 Penicilliose :50-54Kd Penicilliose
disséminée
 Histoplasmose américaine: 70Kd (Ag circulant)

59. techniques de précipitations à Ag figuré vivant
 (Circum ovilar) : décrite en1954 par Gonzales
Sur une lame porte objet incuber le sérum du
malade+œuf vivant de schistosoma mansoni
à 37C° 48hà 72h dans une chambre humide.
lecture au microscope .
R +: précipité digitiforme autour de l’œuf
techniques de vogel et minning:
même principe, et l’Ag figuré: furcocercaire
R+: décollement de la paroi péricercarienne des
furcocercaires mises en présence d’un sérum de
patient parasité
cette méthode sensible permet un diagnostic
précoce, dès les premières semaines de la parasitose

60. CONCLUSION
• La réaction antigène – anticorps est une réaction, spécifique et réversible utilisée en
pratique courante dans les différentes techniques sérologiques.
• Dans certains cas ( Hydatidose, migration larvaire…) le sérodiagnostic est l’argument
essentiel
• Les méthodes du diagnostic immunologique sont très utiles, mais présentent encore certains
défauts(réactions croisées…), et doivent compléter et non se substituer aux recherches directs
des parasites