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République Algérienne Démocratique et
                    Populaire
Université farhat abbes. Setif
Faculté science de la nature et de la vie.
Département de biologie et physiologie animale.



 Spécialité de:
 Parasitologie médicale et
 vétérinaire(Master 1).

  Les techniques de récoltes
   les protozoaires intestinaux
  dans les selles
Techniques de laboratoire en
                      parasitologie

                    Colorations             Techniques de concentration


•Lugol
•MIF
•Coloration   de   Ziehl-Neelsen modifiée   •Technique de Ritchie
•Coloration   de   Weber                    •MIF concentration
•Coloration   de   Van Gool
•coloration   de   baillenger :

                      Autres                              


recherche d’antigène parasitaire figuré 

                                             
techniques de biologie moléculaire
introduction
le protozoaire est un être unique par son
  caractère unicellulaire et sa place en
             parasitologie ,
 il est aussi unique par la violence des
    attaques de certains d’entre eux ,
  meurtriers pour l’homme ou pour les
 animaux ou ils sont responsables des
maladies parasitaires les plus répandues
  et les plus sévères surtout en milieu
                  tropical
par exemple il y a :


les flagellés (Giardia intestinalis)
 responsables de giardiose,

les sporozoaires(Cryptosporidium parvum)
qui est responsables de cryptosporidiase

 les microsporidies

les toxoplasma

les amibes…….etc.
Giardia intestinalis
 




4. Dieu ne demandera pas quel était ton salaire le plus élevé.
Il demandera si tu as fait des compromis pour l’obtenir.
parmi toutes les protozoaires, la majorité
   provoquent des protozooses intestinales chez
   l’homme qui sont retrouves sous une forme de
   résistance appelé kyste, oocyste, spore.

ils se répandent souvent
-par manque d’hygiène liée aux selles(péril fécal)
- par contact avec des animaux(anthropozoonose)
- ou par manque de cuisson de nourriture contenant
des parasites

       alors quel est le meilleur prélèvement
      adapté pour étudier ces protozoaires ?

       -et comment pouvant les détecter ?
les protozoaires sont actuellement les
parasites les plus fréquemment rencontrés au
cours des examens parasociologiques des
selles dans les laboratoires d’analyses
médicales.
leur recherche nécessite souvent l’utilisation
des techniques de colorations appropriées et
de concentrations.
      leur identification, aisée pour certains,
      plus délicate pour la plupart est basée sur
      leur observation au microscope

   mais aussi il existe des différentes techniques
   pour mettre en évidence ces protozoaires.
l’examen coprologique  :
        •prélèvement de
        selles :
     •préparation
    - éliminer certains médicaments (charbon, laxatifs,
    baryte….)
    - éliminer certains aliments (féculents, certains
    fruits…)
matériel
  Pots transparents, propre fermeture hermétique

    acheminemen
    t
       - Idéal.Selles fraîches prélevées au laboratoire
       - Si différé conservateur. froid,formol, mif……
•examen direct microscopique :
  principe :
seul examen à l’état frais permettant de
mettre en évidence les formes végétatives
de protozoaires et d’étudier leur mobilité.

 soit   -directement à partir du prélèvement des
        selles, entre lame et lamelle
 soit
  plus souvent après coloration d’un frottis de selles :
    par exemple coloration de ziehl-Nielsen
   modifiée pour les coccidies des
   (cryptospridium),
    coloration de weber pour les microsporidies,…

            soit    enfin après des techniques de
                    concentration pour ce qui concerne
                    les parasites des selles.
technique  :

-déposer une goutte d’eau sur une lame
port_objet propre


-prélever un fragment des selle en plusieurs
endroits

-réaliser un mélange homogène et recouvrir
d’une lamelle

 -observer au microscope au G 100 puis 400
•techniques de
coloration :


 1. la coloration au lugol :



   elle est utilisée pour identifier des formes
   kystique de protozoaire dans les selles, elle
   permet de mieux visualiser certains
   éléments, d’identification vacuole, noyau,
   caryosome qui sont colorés en jaune brun.
2.coloration au MIF  :

   I) Réalisation
                        Réaliser un examen direct classique
                         (une goutte d'eau sur une lame porte
                         objet + un fragment des selles) ou
                         utiliser le culot de centrifugation
                         d'une technique de concentration.
                         Rajouter une goutte de MIF
                         (Merthiolate, Iode, Formol)

         II) Intérêt
                          elle permet de mieux visualiser
                          certains élément d’identification,
                          le cytoplasme est coloré en
                          rouge et les structures nucléaire
                          en rouge sombre ou noire
3.coloration de ziehl_neelsen
modifié :
elle se fait par faire un étalement mince de
matière fécale sur un porte-objet
(délayer les selles si elles sont trop solides)
puis sécher a l’air puis ensuite le fixer au
méthanol pendant 5 minutes



  cette coloration permet
  d’observer les oocytes de
  cryptosporidies qui sont coloré
  en rose sur fong vert.
   Coloration de Weber
   I) Réalisation

   Faire une suspension de selles fraîches (et vortexer)
    Filtrer à l'aide d'un porte filtre fixé sur un tube Falcon
    Etaler 10µL sur une lame
    Laisser sécher à l'air
    Fixer le frottis dans du méthanol pendant 5 min
    Colorer au trichrome modifié pendant 90 min
    Rincer 10 secondes avec de l'acide-alcool (4,5 mL d'acide acétique +
    995,5 mL d'alcool à 90%) puis rincer brièvement avec de l'alcool à
    95%

    Déshydrater le frottis successivement dans de l'alcool à 95%
    pendant 5 min puis dans de l'alcool absolu pendant 10min et dans du
    xylène pendant 10 min
    Laisser sécher à l'air

    Lire pendant 10 min au microscope optique (grossissement x1000,
    objectif 100 à l'immersion)

   II) Intérêt
   Coloration utilisée pour mettre en évidence des spores de
    Microsporidies :
   - 1-5µm, coloration rose bipolaire sur fond bleu
coloration de van gool :

                                    I) Réalisation
              Faire une suspension de selles fraîches (et vortexer)
            Filtrer à l'aide d'un porte filtre fixé sur un tube Falcon
                          Déposer une goutte sur une lame
                             Laisser sécher à l'air libre
                  Fixer les lames dans du méthanol pendant 2 min
                             Laisser sécher à l'air libre
  Verser sur les lames une goutte de fluorochrome et laisser agir 10 min en
                         protégeant les lames de la lumière
                       Rincer dans du PBS pendant 2 à 5 sec
  Contre colorer avec une solution de bleu Evans dilué à 0,5% pendant 30 sec
                                 Rincer avec du PBS
                             Laisser sécher à l'air libre
Observer au microscope à fluorescence au grossissement x400 (objectif 40) ou au
                ( grossissement x1000 (objectif 100 à l'immersion

                                    II) Intérêt
      Alternative à la coloration de Weber pour la recherche de spores de
                                 Microsporidies. 
  L'utilisation d'un fluorochrome permet d'augmenter la sensibilité de l'examen
                                      . direct
6.coloration de
baillenger :

il colore chez les protozoaires intestinaux
(kyste et trophozoites) le cytoplasme et les
bâtonnets cristalloïdes en rouge, les
structures nucléaires en noire.
•techniques de
concentration :
 1.méthodes diphasiques ou physico-
 -chimique

Principe :
             mettre les selles en présence de 2
             phases non miscibles : une
             aqueuse et une organique (éther)

En plus de l’action dissolvante de l’éther, la mise en
jeu de réalise pour chaque élément fécal un
coefficient de partage dont la valeur dépend de sa
balance hydrophile / lipophile permettant ainsi de
concentrer les éléments fécaux dans le culot.
thechnique de ritchie :
   Reactifs
          solution de formol à 10% et solution d'éther
          éthylique.
    intérêt          cette technique permet
    :                d’augmenter la sensibilité de la
                      recherche de formes kystiques
                      les formes végétatives ne
                      peuvent plus être en évidence
                      après concentration.

MIF concentration :
     intérêt 
     :
          C’est le même intérêt que Ritchie
recherche d’antigène parasitaire
figuré :
   la recherche des parasites au microscope
   peut faire par une réaction
   d’immunofluorescence.
un frottis de selles dont lequel on recherche les
protozoaires intestinaux est recouvert dans un
premier temps, d’un anticorps monoclonal spécifique
de l’antigène parasitaire recherché ;et dans un
deuxième temps, un conjugué fluorescent spécifique
de l’Ig monoclonal.

  la lecture de frottis se fait au microscope. en
  lumière ultraviolette,
  les parasites sont brillants sur un fond sombre.
sédimentation-flottation au
saccharose pour protozoaires :


Cette technique est bien exécutée permet de
trouver de rares formes végétatives de protozoaires
alors que les kystes sont inexistants. Elle est
d’exécution rapide et surtout recommandée quand
l’examen direct a prouvé la présence de rares
formes végétatives et qu’aucun kyste n’a été
retrouve pour pouvoir affirmer le diagnostic. Elle est
utilisable sur des selles fixées au M.I.F.
•ces méthodes sont longues et fastidieuses,
présentent l’inconvénient majeur de ne pas
détecter spécifiquement les espèces et les
génotypes des parasites présents dans les
échantillons analysés.
techniques de biologie moléculaire
  Les techniques de biologie moléculaire
 connaissent actuellement un
 Essor considérable dans l’analyse
 d’échantillons environnementaux en
 autorisant une détection spécifique des
 microorganismes, basée sur leur génome
                         La PCR (ou polymérase
                         Chain réaction) peut ainsi
                         détecter de façon rapide,
                         spécifique et sensible les
                         différentes espèces mais
                         aussi les génotypes qui ne
                         sont pas différenciables sur
                         la base de critères
                         morphologiques
la PCR conventionnelle est basée sur l’analyse
des résultats après amplification de l’ADN
(d’une partie du génome), en revanche la PCR
en temps réel développée plus récemment
permet d’évaluer la quantité d’ADN initialement
contenue dans un échantillon


        l’utilisation d’une gamme étalon
        amplifiée de façon simultanée avec les
        échantillons à analyser, permet de
        connaître leur concentration initiale en
        microorganismes.
conclusion  :

Les troubles digestifs persistant sont des plaines
fréquemment associées à une infection par les
protozoaires. donc on a déjà vu que les techniques
classiques de concentrations et de colorations sont
basés sur les critères morphologiques des parasites

   alors que le développement de techniques
    comme la PCR autorisant une détection
   spécifique au niveau des génotypes apporterait
   des données essentielles concernant l’étude
   des voies de transmission entre les différents
   hôtes et leur rôle dans la contamination de
   l’environnement.
ces données permettraient notamment de mieux
évaluer la place de l’homme et des autres
mammifères en tant que réservoir
pour les différents génotypes de plusieurs
protozoaires intestinaux.
Fin 

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Les technique de protozoaires

  • 1. République Algérienne Démocratique et Populaire Université farhat abbes. Setif Faculté science de la nature et de la vie. Département de biologie et physiologie animale. Spécialité de: Parasitologie médicale et vétérinaire(Master 1). Les techniques de récoltes les protozoaires intestinaux dans les selles
  • 2. Techniques de laboratoire en parasitologie Colorations Techniques de concentration •Lugol •MIF •Coloration de Ziehl-Neelsen modifiée •Technique de Ritchie •Coloration de Weber •MIF concentration •Coloration de Van Gool •coloration de baillenger : Autres   recherche d’antigène parasitaire figuré    techniques de biologie moléculaire
  • 3. introduction le protozoaire est un être unique par son caractère unicellulaire et sa place en parasitologie , il est aussi unique par la violence des attaques de certains d’entre eux , meurtriers pour l’homme ou pour les animaux ou ils sont responsables des maladies parasitaires les plus répandues et les plus sévères surtout en milieu tropical
  • 4. par exemple il y a : les flagellés (Giardia intestinalis) responsables de giardiose, les sporozoaires(Cryptosporidium parvum) qui est responsables de cryptosporidiase  les microsporidies les toxoplasma les amibes…….etc.
  • 5. Giardia intestinalis   4. Dieu ne demandera pas quel était ton salaire le plus élevé. Il demandera si tu as fait des compromis pour l’obtenir.
  • 6. parmi toutes les protozoaires, la majorité provoquent des protozooses intestinales chez l’homme qui sont retrouves sous une forme de résistance appelé kyste, oocyste, spore. ils se répandent souvent -par manque d’hygiène liée aux selles(péril fécal) - par contact avec des animaux(anthropozoonose) - ou par manque de cuisson de nourriture contenant des parasites alors quel est le meilleur prélèvement adapté pour étudier ces protozoaires ? -et comment pouvant les détecter ?
  • 7. les protozoaires sont actuellement les parasites les plus fréquemment rencontrés au cours des examens parasociologiques des selles dans les laboratoires d’analyses médicales. leur recherche nécessite souvent l’utilisation des techniques de colorations appropriées et de concentrations. leur identification, aisée pour certains, plus délicate pour la plupart est basée sur leur observation au microscope mais aussi il existe des différentes techniques pour mettre en évidence ces protozoaires.
  • 8. l’examen coprologique  : •prélèvement de selles : •préparation - éliminer certains médicaments (charbon, laxatifs, baryte….) - éliminer certains aliments (féculents, certains fruits…) matériel Pots transparents, propre fermeture hermétique acheminemen t - Idéal.Selles fraîches prélevées au laboratoire - Si différé conservateur. froid,formol, mif……
  • 9. •examen direct microscopique : principe : seul examen à l’état frais permettant de mettre en évidence les formes végétatives de protozoaires et d’étudier leur mobilité. soit -directement à partir du prélèvement des selles, entre lame et lamelle soit plus souvent après coloration d’un frottis de selles : par exemple coloration de ziehl-Nielsen modifiée pour les coccidies des (cryptospridium), coloration de weber pour les microsporidies,… soit enfin après des techniques de concentration pour ce qui concerne les parasites des selles.
  • 10. technique  : -déposer une goutte d’eau sur une lame port_objet propre -prélever un fragment des selle en plusieurs endroits -réaliser un mélange homogène et recouvrir d’une lamelle -observer au microscope au G 100 puis 400
  • 11. •techniques de coloration : 1. la coloration au lugol : elle est utilisée pour identifier des formes kystique de protozoaire dans les selles, elle permet de mieux visualiser certains éléments, d’identification vacuole, noyau, caryosome qui sont colorés en jaune brun.
  • 12. 2.coloration au MIF  :  I) Réalisation  Réaliser un examen direct classique (une goutte d'eau sur une lame porte objet + un fragment des selles) ou utiliser le culot de centrifugation d'une technique de concentration. Rajouter une goutte de MIF (Merthiolate, Iode, Formol)  II) Intérêt elle permet de mieux visualiser certains élément d’identification, le cytoplasme est coloré en rouge et les structures nucléaire en rouge sombre ou noire
  • 13. 3.coloration de ziehl_neelsen modifié : elle se fait par faire un étalement mince de matière fécale sur un porte-objet (délayer les selles si elles sont trop solides) puis sécher a l’air puis ensuite le fixer au méthanol pendant 5 minutes cette coloration permet d’observer les oocytes de cryptosporidies qui sont coloré en rose sur fong vert.
  • 14. Coloration de Weber  I) Réalisation  Faire une suspension de selles fraîches (et vortexer) Filtrer à l'aide d'un porte filtre fixé sur un tube Falcon Etaler 10µL sur une lame Laisser sécher à l'air Fixer le frottis dans du méthanol pendant 5 min Colorer au trichrome modifié pendant 90 min Rincer 10 secondes avec de l'acide-alcool (4,5 mL d'acide acétique + 995,5 mL d'alcool à 90%) puis rincer brièvement avec de l'alcool à 95%  Déshydrater le frottis successivement dans de l'alcool à 95% pendant 5 min puis dans de l'alcool absolu pendant 10min et dans du xylène pendant 10 min Laisser sécher à l'air  Lire pendant 10 min au microscope optique (grossissement x1000, objectif 100 à l'immersion)  II) Intérêt  Coloration utilisée pour mettre en évidence des spores de Microsporidies :  - 1-5µm, coloration rose bipolaire sur fond bleu
  • 15. coloration de van gool : I) Réalisation Faire une suspension de selles fraîches (et vortexer) Filtrer à l'aide d'un porte filtre fixé sur un tube Falcon Déposer une goutte sur une lame Laisser sécher à l'air libre Fixer les lames dans du méthanol pendant 2 min Laisser sécher à l'air libre Verser sur les lames une goutte de fluorochrome et laisser agir 10 min en protégeant les lames de la lumière Rincer dans du PBS pendant 2 à 5 sec Contre colorer avec une solution de bleu Evans dilué à 0,5% pendant 30 sec Rincer avec du PBS Laisser sécher à l'air libre Observer au microscope à fluorescence au grossissement x400 (objectif 40) ou au ( grossissement x1000 (objectif 100 à l'immersion II) Intérêt Alternative à la coloration de Weber pour la recherche de spores de Microsporidies.  L'utilisation d'un fluorochrome permet d'augmenter la sensibilité de l'examen . direct
  • 16. 6.coloration de baillenger : il colore chez les protozoaires intestinaux (kyste et trophozoites) le cytoplasme et les bâtonnets cristalloïdes en rouge, les structures nucléaires en noire.
  • 17. •techniques de concentration : 1.méthodes diphasiques ou physico- -chimique Principe : mettre les selles en présence de 2 phases non miscibles : une aqueuse et une organique (éther) En plus de l’action dissolvante de l’éther, la mise en jeu de réalise pour chaque élément fécal un coefficient de partage dont la valeur dépend de sa balance hydrophile / lipophile permettant ainsi de concentrer les éléments fécaux dans le culot.
  • 18. thechnique de ritchie : Reactifs solution de formol à 10% et solution d'éther éthylique. intérêt  cette technique permet : d’augmenter la sensibilité de la recherche de formes kystiques les formes végétatives ne peuvent plus être en évidence après concentration. MIF concentration : intérêt  : C’est le même intérêt que Ritchie
  • 19. recherche d’antigène parasitaire figuré : la recherche des parasites au microscope peut faire par une réaction d’immunofluorescence. un frottis de selles dont lequel on recherche les protozoaires intestinaux est recouvert dans un premier temps, d’un anticorps monoclonal spécifique de l’antigène parasitaire recherché ;et dans un deuxième temps, un conjugué fluorescent spécifique de l’Ig monoclonal. la lecture de frottis se fait au microscope. en lumière ultraviolette, les parasites sont brillants sur un fond sombre.
  • 20. sédimentation-flottation au saccharose pour protozoaires : Cette technique est bien exécutée permet de trouver de rares formes végétatives de protozoaires alors que les kystes sont inexistants. Elle est d’exécution rapide et surtout recommandée quand l’examen direct a prouvé la présence de rares formes végétatives et qu’aucun kyste n’a été retrouve pour pouvoir affirmer le diagnostic. Elle est utilisable sur des selles fixées au M.I.F.
  • 21. •ces méthodes sont longues et fastidieuses, présentent l’inconvénient majeur de ne pas détecter spécifiquement les espèces et les génotypes des parasites présents dans les échantillons analysés.
  • 22. techniques de biologie moléculaire Les techniques de biologie moléculaire connaissent actuellement un Essor considérable dans l’analyse d’échantillons environnementaux en autorisant une détection spécifique des microorganismes, basée sur leur génome La PCR (ou polymérase Chain réaction) peut ainsi détecter de façon rapide, spécifique et sensible les différentes espèces mais aussi les génotypes qui ne sont pas différenciables sur la base de critères morphologiques
  • 23. la PCR conventionnelle est basée sur l’analyse des résultats après amplification de l’ADN (d’une partie du génome), en revanche la PCR en temps réel développée plus récemment permet d’évaluer la quantité d’ADN initialement contenue dans un échantillon l’utilisation d’une gamme étalon amplifiée de façon simultanée avec les échantillons à analyser, permet de connaître leur concentration initiale en microorganismes.
  • 24. conclusion  : Les troubles digestifs persistant sont des plaines fréquemment associées à une infection par les protozoaires. donc on a déjà vu que les techniques classiques de concentrations et de colorations sont basés sur les critères morphologiques des parasites alors que le développement de techniques comme la PCR autorisant une détection spécifique au niveau des génotypes apporterait des données essentielles concernant l’étude des voies de transmission entre les différents hôtes et leur rôle dans la contamination de l’environnement.
  • 25. ces données permettraient notamment de mieux évaluer la place de l’homme et des autres mammifères en tant que réservoir pour les différents génotypes de plusieurs protozoaires intestinaux.
  • 26. Fin