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Les technique de protozoaires
Le document traite des techniques de récolte et d'identification des protozoaires intestinaux dans les selles, précisant les méthodes de coloration et de concentration utilisées en parasitologie. Il souligne l'importance des protozoaires en tant que parasites responsables de maladies chez l'homme et les animaux, en détaillant les techniques de laboratoire pour les détecter. La conclusion insiste sur l'essor des techniques de biologie moléculaire, comme la PCR, pour une détection plus précise des espèces et génotypes de protozoaires.
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Les technique de protozoaires
- 1. République Algérienne Démocratiqueet Populaire Université farhat abbes. Setif Faculté science de la nature et de la vie. Département de biologie et physiologie animale. Spécialité de: Parasitologie médicale et vétérinaire(Master 1). Les techniques de récoltes les protozoaires intestinaux dans les selles
- 2. Techniques de laboratoireen parasitologie Colorations Techniques de concentration •Lugol •MIF •Coloration de Ziehl-Neelsen modifiée •Technique de Ritchie •Coloration de Weber •MIF concentration •Coloration de Van Gool •coloration de baillenger : Autres recherche d’antigène parasitaire figuré techniques de biologie moléculaire
- 3. introduction le protozoaire estun être unique par son caractère unicellulaire et sa place en parasitologie , il est aussi unique par la violence des attaques de certains d’entre eux , meurtriers pour l’homme ou pour les animaux ou ils sont responsables des maladies parasitaires les plus répandues et les plus sévères surtout en milieu tropical
- 4. par exemple ily a : les flagellés (Giardia intestinalis) responsables de giardiose, les sporozoaires(Cryptosporidium parvum) qui est responsables de cryptosporidiase les microsporidies les toxoplasma les amibes…….etc.
- 5. Giardia intestinalis 4. Dieune demandera pas quel était ton salaire le plus élevé. Il demandera si tu as fait des compromis pour l’obtenir.
- 6. parmi toutes lesprotozoaires, la majorité provoquent des protozooses intestinales chez l’homme qui sont retrouves sous une forme de résistance appelé kyste, oocyste, spore. ils se répandent souvent -par manque d’hygiène liée aux selles(péril fécal) - par contact avec des animaux(anthropozoonose) - ou par manque de cuisson de nourriture contenant des parasites alors quel est le meilleur prélèvement adapté pour étudier ces protozoaires ? -et comment pouvant les détecter ?
- 7. les protozoaires sontactuellement les parasites les plus fréquemment rencontrés au cours des examens parasociologiques des selles dans les laboratoires d’analyses médicales. leur recherche nécessite souvent l’utilisation des techniques de colorations appropriées et de concentrations. leur identification, aisée pour certains, plus délicate pour la plupart est basée sur leur observation au microscope mais aussi il existe des différentes techniques pour mettre en évidence ces protozoaires.
- 8. l’examen coprologique : •prélèvement de selles : •préparation - éliminer certains médicaments (charbon, laxatifs, baryte….) - éliminer certains aliments (féculents, certains fruits…) matériel Pots transparents, propre fermeture hermétique acheminemen t - Idéal.Selles fraîches prélevées au laboratoire - Si différé conservateur. froid,formol, mif……
- 9. •examen direct microscopique : principe : seul examen à l’état frais permettant de mettre en évidence les formes végétatives de protozoaires et d’étudier leur mobilité. soit -directement à partir du prélèvement des selles, entre lame et lamelle soit plus souvent après coloration d’un frottis de selles : par exemple coloration de ziehl-Nielsen modifiée pour les coccidies des (cryptospridium), coloration de weber pour les microsporidies,… soit enfin après des techniques de concentration pour ce qui concerne les parasites des selles.
- 10. technique : -déposer unegoutte d’eau sur une lame port_objet propre -prélever un fragment des selle en plusieurs endroits -réaliser un mélange homogène et recouvrir d’une lamelle -observer au microscope au G 100 puis 400
- 11. •techniques de coloration : 1.la coloration au lugol : elle est utilisée pour identifier des formes kystique de protozoaire dans les selles, elle permet de mieux visualiser certains éléments, d’identification vacuole, noyau, caryosome qui sont colorés en jaune brun.
- 12. 2.coloration au MIF : I) Réalisation Réaliser un examen direct classique (une goutte d'eau sur une lame porte objet + un fragment des selles) ou utiliser le culot de centrifugation d'une technique de concentration. Rajouter une goutte de MIF (Merthiolate, Iode, Formol) II) Intérêt elle permet de mieux visualiser certains élément d’identification, le cytoplasme est coloré en rouge et les structures nucléaire en rouge sombre ou noire
- 13. 3.coloration de ziehl_neelsen modifié : ellese fait par faire un étalement mince de matière fécale sur un porte-objet (délayer les selles si elles sont trop solides) puis sécher a l’air puis ensuite le fixer au méthanol pendant 5 minutes cette coloration permet d’observer les oocytes de cryptosporidies qui sont coloré en rose sur fong vert.
- 14. Coloration de Weber I) Réalisation Faire une suspension de selles fraîches (et vortexer) Filtrer à l'aide d'un porte filtre fixé sur un tube Falcon Etaler 10µL sur une lame Laisser sécher à l'air Fixer le frottis dans du méthanol pendant 5 min Colorer au trichrome modifié pendant 90 min Rincer 10 secondes avec de l'acide-alcool (4,5 mL d'acide acétique + 995,5 mL d'alcool à 90%) puis rincer brièvement avec de l'alcool à 95% Déshydrater le frottis successivement dans de l'alcool à 95% pendant 5 min puis dans de l'alcool absolu pendant 10min et dans du xylène pendant 10 min Laisser sécher à l'air Lire pendant 10 min au microscope optique (grossissement x1000, objectif 100 à l'immersion) II) Intérêt Coloration utilisée pour mettre en évidence des spores de Microsporidies : - 1-5µm, coloration rose bipolaire sur fond bleu
- 15. coloration de vangool : I) Réalisation Faire une suspension de selles fraîches (et vortexer) Filtrer à l'aide d'un porte filtre fixé sur un tube Falcon Déposer une goutte sur une lame Laisser sécher à l'air libre Fixer les lames dans du méthanol pendant 2 min Laisser sécher à l'air libre Verser sur les lames une goutte de fluorochrome et laisser agir 10 min en protégeant les lames de la lumière Rincer dans du PBS pendant 2 à 5 sec Contre colorer avec une solution de bleu Evans dilué à 0,5% pendant 30 sec Rincer avec du PBS Laisser sécher à l'air libre Observer au microscope à fluorescence au grossissement x400 (objectif 40) ou au ( grossissement x1000 (objectif 100 à l'immersion II) Intérêt Alternative à la coloration de Weber pour la recherche de spores de Microsporidies. L'utilisation d'un fluorochrome permet d'augmenter la sensibilité de l'examen . direct
- 16. 6.coloration de baillenger : il colorechez les protozoaires intestinaux (kyste et trophozoites) le cytoplasme et les bâtonnets cristalloïdes en rouge, les structures nucléaires en noire.
- 17. •techniques de concentration : 1.méthodesdiphasiques ou physico- -chimique Principe : mettre les selles en présence de 2 phases non miscibles : une aqueuse et une organique (éther) En plus de l’action dissolvante de l’éther, la mise en jeu de réalise pour chaque élément fécal un coefficient de partage dont la valeur dépend de sa balance hydrophile / lipophile permettant ainsi de concentrer les éléments fécaux dans le culot.
- 18. thechnique de ritchie : Reactifs solution de formol à 10% et solution d'éther éthylique. intérêt cette technique permet : d’augmenter la sensibilité de la recherche de formes kystiques les formes végétatives ne peuvent plus être en évidence après concentration. MIF concentration : intérêt : C’est le même intérêt que Ritchie
- 19. recherche d’antigène parasitaire figuré : la recherche des parasites au microscope peut faire par une réaction d’immunofluorescence. un frottis de selles dont lequel on recherche les protozoaires intestinaux est recouvert dans un premier temps, d’un anticorps monoclonal spécifique de l’antigène parasitaire recherché ;et dans un deuxième temps, un conjugué fluorescent spécifique de l’Ig monoclonal. la lecture de frottis se fait au microscope. en lumière ultraviolette, les parasites sont brillants sur un fond sombre.
- 20. sédimentation-flottation au saccharose pourprotozoaires : Cette technique est bien exécutée permet de trouver de rares formes végétatives de protozoaires alors que les kystes sont inexistants. Elle est d’exécution rapide et surtout recommandée quand l’examen direct a prouvé la présence de rares formes végétatives et qu’aucun kyste n’a été retrouve pour pouvoir affirmer le diagnostic. Elle est utilisable sur des selles fixées au M.I.F.
- 21. •ces méthodes sontlongues et fastidieuses, présentent l’inconvénient majeur de ne pas détecter spécifiquement les espèces et les génotypes des parasites présents dans les échantillons analysés.
- 22. techniques de biologiemoléculaire Les techniques de biologie moléculaire connaissent actuellement un Essor considérable dans l’analyse d’échantillons environnementaux en autorisant une détection spécifique des microorganismes, basée sur leur génome La PCR (ou polymérase Chain réaction) peut ainsi détecter de façon rapide, spécifique et sensible les différentes espèces mais aussi les génotypes qui ne sont pas différenciables sur la base de critères morphologiques
- 23. la PCR conventionnelleest basée sur l’analyse des résultats après amplification de l’ADN (d’une partie du génome), en revanche la PCR en temps réel développée plus récemment permet d’évaluer la quantité d’ADN initialement contenue dans un échantillon l’utilisation d’une gamme étalon amplifiée de façon simultanée avec les échantillons à analyser, permet de connaître leur concentration initiale en microorganismes.
- 24. conclusion : Les troublesdigestifs persistant sont des plaines fréquemment associées à une infection par les protozoaires. donc on a déjà vu que les techniques classiques de concentrations et de colorations sont basés sur les critères morphologiques des parasites alors que le développement de techniques comme la PCR autorisant une détection spécifique au niveau des génotypes apporterait des données essentielles concernant l’étude des voies de transmission entre les différents hôtes et leur rôle dans la contamination de l’environnement.
- 25. ces données permettraientnotamment de mieux évaluer la place de l’homme et des autres mammifères en tant que réservoir pour les différents génotypes de plusieurs protozoaires intestinaux.
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