1. République Algérienne Démocratique et
Populaire
Université farhat abbes. Setif
Faculté science de la nature et de la vie.
Département de biologie et physiologie animale.
Spécialité de:
Parasitologie médicale et
vétérinaire(Master 1).
Les techniques de récoltes
les protozoaires intestinaux
dans les selles

2. Techniques de laboratoire en
parasitologie
Colorations Techniques de concentration
•Lugol
•MIF
•Coloration de Ziehl-Neelsen modifiée •Technique de Ritchie
•Coloration de Weber •MIF concentration
•Coloration de Van Gool
•coloration de baillenger :
Autres
recherche d’antigène parasitaire figuré
techniques de biologie moléculaire

3. introduction
le protozoaire est un être unique par son
caractère unicellulaire et sa place en
parasitologie ,
il est aussi unique par la violence des
attaques de certains d’entre eux ,
meurtriers pour l’homme ou pour les
animaux ou ils sont responsables des
maladies parasitaires les plus répandues
et les plus sévères surtout en milieu
tropical

4. par exemple il y a :
les flagellés (Giardia intestinalis)
responsables de giardiose,
les sporozoaires(Cryptosporidium parvum)
qui est responsables de cryptosporidiase
les microsporidies
les toxoplasma
les amibes…….etc.

5. Giardia intestinalis
4. Dieu ne demandera pas quel était ton salaire le plus élevé.
Il demandera si tu as fait des compromis pour l’obtenir.

6. parmi toutes les protozoaires, la majorité
provoquent des protozooses intestinales chez
l’homme qui sont retrouves sous une forme de
résistance appelé kyste, oocyste, spore.
ils se répandent souvent
-par manque d’hygiène liée aux selles(péril fécal)
- par contact avec des animaux(anthropozoonose)
- ou par manque de cuisson de nourriture contenant
des parasites
alors quel est le meilleur prélèvement
adapté pour étudier ces protozoaires ?
-et comment pouvant les détecter ?

7. les protozoaires sont actuellement les
parasites les plus fréquemment rencontrés au
cours des examens parasociologiques des
selles dans les laboratoires d’analyses
médicales.
leur recherche nécessite souvent l’utilisation
des techniques de colorations appropriées et
de concentrations.
leur identification, aisée pour certains,
plus délicate pour la plupart est basée sur
leur observation au microscope
mais aussi il existe des différentes techniques
pour mettre en évidence ces protozoaires.

8. l’examen coprologique :
•prélèvement de
selles :
•préparation
- éliminer certains médicaments (charbon, laxatifs,
baryte….)
- éliminer certains aliments (féculents, certains
fruits…)
matériel
Pots transparents, propre fermeture hermétique
acheminemen
t
- Idéal.Selles fraîches prélevées au laboratoire
- Si différé conservateur. froid,formol, mif……

9. •examen direct microscopique :
principe :
seul examen à l’état frais permettant de
mettre en évidence les formes végétatives
de protozoaires et d’étudier leur mobilité.
soit -directement à partir du prélèvement des
selles, entre lame et lamelle
soit
plus souvent après coloration d’un frottis de selles :
par exemple coloration de ziehl-Nielsen
modifiée pour les coccidies des
(cryptospridium),
coloration de weber pour les microsporidies,…
soit enfin après des techniques de
concentration pour ce qui concerne
les parasites des selles.

10. technique :
-déposer une goutte d’eau sur une lame
port_objet propre
-prélever un fragment des selle en plusieurs
endroits
-réaliser un mélange homogène et recouvrir
d’une lamelle
-observer au microscope au G 100 puis 400

11. •techniques de
coloration :
1. la coloration au lugol :
elle est utilisée pour identifier des formes
kystique de protozoaire dans les selles, elle
permet de mieux visualiser certains
éléments, d’identification vacuole, noyau,
caryosome qui sont colorés en jaune brun.

12. 2.coloration au MIF :
 I) Réalisation
 Réaliser un examen direct classique
(une goutte d'eau sur une lame porte
objet + un fragment des selles) ou
utiliser le culot de centrifugation
d'une technique de concentration.
Rajouter une goutte de MIF
(Merthiolate, Iode, Formol)
 II) Intérêt
elle permet de mieux visualiser
certains élément d’identification,
le cytoplasme est coloré en
rouge et les structures nucléaire
en rouge sombre ou noire

13. 3.coloration de ziehl_neelsen
modifié :
elle se fait par faire un étalement mince de
matière fécale sur un porte-objet
(délayer les selles si elles sont trop solides)
puis sécher a l’air puis ensuite le fixer au
méthanol pendant 5 minutes
cette coloration permet
d’observer les oocytes de
cryptosporidies qui sont coloré
en rose sur fong vert.

14.  Coloration de Weber
 I) Réalisation
 Faire une suspension de selles fraîches (et vortexer)
Filtrer à l'aide d'un porte filtre fixé sur un tube Falcon
Etaler 10µL sur une lame
Laisser sécher à l'air
Fixer le frottis dans du méthanol pendant 5 min
Colorer au trichrome modifié pendant 90 min
Rincer 10 secondes avec de l'acide-alcool (4,5 mL d'acide acétique +
995,5 mL d'alcool à 90%) puis rincer brièvement avec de l'alcool à
95%

Déshydrater le frottis successivement dans de l'alcool à 95%
pendant 5 min puis dans de l'alcool absolu pendant 10min et dans du
xylène pendant 10 min
Laisser sécher à l'air

Lire pendant 10 min au microscope optique (grossissement x1000,
objectif 100 à l'immersion)
 II) Intérêt
 Coloration utilisée pour mettre en évidence des spores de
Microsporidies :
 - 1-5µm, coloration rose bipolaire sur fond bleu

15. coloration de van gool :
I) Réalisation
Faire une suspension de selles fraîches (et vortexer)
Filtrer à l'aide d'un porte filtre fixé sur un tube Falcon
Déposer une goutte sur une lame
Laisser sécher à l'air libre
Fixer les lames dans du méthanol pendant 2 min
Laisser sécher à l'air libre
Verser sur les lames une goutte de fluorochrome et laisser agir 10 min en
protégeant les lames de la lumière
Rincer dans du PBS pendant 2 à 5 sec
Contre colorer avec une solution de bleu Evans dilué à 0,5% pendant 30 sec
Rincer avec du PBS
Laisser sécher à l'air libre
Observer au microscope à fluorescence au grossissement x400 (objectif 40) ou au
( grossissement x1000 (objectif 100 à l'immersion
II) Intérêt
Alternative à la coloration de Weber pour la recherche de spores de
Microsporidies.
L'utilisation d'un fluorochrome permet d'augmenter la sensibilité de l'examen
. direct

16. 6.coloration de
baillenger :
il colore chez les protozoaires intestinaux
(kyste et trophozoites) le cytoplasme et les
bâtonnets cristalloïdes en rouge, les
structures nucléaires en noire.

17. •techniques de
concentration :
1.méthodes diphasiques ou physico-
-chimique
Principe :
mettre les selles en présence de 2
phases non miscibles : une
aqueuse et une organique (éther)
En plus de l’action dissolvante de l’éther, la mise en
jeu de réalise pour chaque élément fécal un
coefficient de partage dont la valeur dépend de sa
balance hydrophile / lipophile permettant ainsi de
concentrer les éléments fécaux dans le culot.

18. thechnique de ritchie :
Reactifs
solution de formol à 10% et solution d'éther
éthylique.
intérêt cette technique permet
: d’augmenter la sensibilité de la
recherche de formes kystiques
les formes végétatives ne
peuvent plus être en évidence
après concentration.
MIF concentration :
intérêt
:
C’est le même intérêt que Ritchie

19. recherche d’antigène parasitaire
figuré :
la recherche des parasites au microscope
peut faire par une réaction
d’immunofluorescence.
un frottis de selles dont lequel on recherche les
protozoaires intestinaux est recouvert dans un
premier temps, d’un anticorps monoclonal spécifique
de l’antigène parasitaire recherché ;et dans un
deuxième temps, un conjugué fluorescent spécifique
de l’Ig monoclonal.
la lecture de frottis se fait au microscope. en
lumière ultraviolette,
les parasites sont brillants sur un fond sombre.

20. sédimentation-flottation au
saccharose pour protozoaires :
Cette technique est bien exécutée permet de
trouver de rares formes végétatives de protozoaires
alors que les kystes sont inexistants. Elle est
d’exécution rapide et surtout recommandée quand
l’examen direct a prouvé la présence de rares
formes végétatives et qu’aucun kyste n’a été
retrouve pour pouvoir affirmer le diagnostic. Elle est
utilisable sur des selles fixées au M.I.F.

21. •ces méthodes sont longues et fastidieuses,
présentent l’inconvénient majeur de ne pas
détecter spécifiquement les espèces et les
génotypes des parasites présents dans les
échantillons analysés.

22. techniques de biologie moléculaire
Les techniques de biologie moléculaire
connaissent actuellement un
Essor considérable dans l’analyse
d’échantillons environnementaux en
autorisant une détection spécifique des
microorganismes, basée sur leur génome
La PCR (ou polymérase
Chain réaction) peut ainsi
détecter de façon rapide,
spécifique et sensible les
différentes espèces mais
aussi les génotypes qui ne
sont pas différenciables sur
la base de critères
morphologiques

23. la PCR conventionnelle est basée sur l’analyse
des résultats après amplification de l’ADN
(d’une partie du génome), en revanche la PCR
en temps réel développée plus récemment
permet d’évaluer la quantité d’ADN initialement
contenue dans un échantillon
l’utilisation d’une gamme étalon
amplifiée de façon simultanée avec les
échantillons à analyser, permet de
connaître leur concentration initiale en
microorganismes.

24. conclusion :
Les troubles digestifs persistant sont des plaines
fréquemment associées à une infection par les
protozoaires. donc on a déjà vu que les techniques
classiques de concentrations et de colorations sont
basés sur les critères morphologiques des parasites
alors que le développement de techniques
comme la PCR autorisant une détection
spécifique au niveau des génotypes apporterait
des données essentielles concernant l’étude
des voies de transmission entre les différents
hôtes et leur rôle dans la contamination de
l’environnement.

25. ces données permettraient notamment de mieux
évaluer la place de l’homme et des autres
mammifères en tant que réservoir
pour les différents génotypes de plusieurs
protozoaires intestinaux.

26. Fin