TECHNIQUES DE BIOLOGIE MOLECULAIRE EN PARASITOLOGIE ET MYCOLOGIE EXTRACTION D'AN TECHNIQUE PCR SEQUENCAGE D'AN GENOTYPAGE APPORT DE LA BIOLOGIE MOLECULAIRE EN PARASITOLOGIE ET MYCOLOGIE MEDICALE

1. UNIVERSITE CONSTANTINE 3 SALEH BOUBNIDER
FACULTE DE MEDECINE
Année universitaire: 2020/2021

2. La biologie moléculaire désigne l’étude des
acides nucléique, ribonucléique (ARN) et
désoxyribonucléique (ADN).

3. Ses techniques reposent essentiellement sur:
• Hybridation moléculaire,
• Réaction de polymérisation en chaine (PCR),
• Séquençage des acides nucléiques.

4. • Apparition en 1970,
• Développement exponentiel,
• Recueillir en quelques heures les données à
l’échelle du génome entier.

5. En parasitologie:
• Diagnostic de:
– Toxoplasmose,
– Paludisme,
– Leishmanioses,
– Candidoses et aspergilloses invasives.
• Bénéfice largement de l’apport des outils
moléculaires.

6. Diagnostic parasitologique direct :
• Manque de sensibilité,
• Ne permet pas toujours l’identification de
l’espèce,
• Personnel entraîné,
• Peu adapté à la détection de parasite
tissulaire.

7. Les techniques sérologiques :
• Nombreuses, commercialisées, standardisées, simple à
réaliser et automatisées.
• Inconvénients:
– Ne permet pas toujours différentier une infection évolutive
d’une immunité ancienne.
– Réactions croisées entre les Helminthes.
– Distinction difficile entre les parasites du même genre.
– Moins performantes chez les immunodéprimés.

8. Techniques mycologiques d’identification :
• 3 groupes de champignons:
– Levures,
– Champignons filamenteux,
– Champignons dimorphiques.

9. Techniques mycologiques d’identification :
Identification des levures:
– Caractéristiques morphologiques + Analyse des caractères
biochimiques (assimilation et fermentation des sucres) par
des tests standardisés.
– Tests: identifier avec précision les levures les plus
couramment identifiées en pathologie humaine
• Inconvénient:
– Insuffisantes pour l’identification des levures du genre
Trichosporon, des levures émergentes comme Candida
dubliniensis, C. famata.

10. Techniques mycologiques d’identification :
L'identification des champignons filamenteux:
• Caractères morphologiques.
• Inconvénient:
– Certains champignons filamenteux ont une
croissance lente et difficile sur les milieux
standards et ne développent pas touts les critères
nécessaires au diagnostic de l'espèce.

11. Techniques mycologiques d’identification :
Champignons dimorphiques:
• Identification dans des laboratoires
spécialisés à cause du risque de
contamination du manipulateur (Histoplasma
sp.).

12. Techniques mycologiques d’identification :
• Impossibilité d'obtenir une culture in vitro à
partir de prélèvement biologique due à
l'inhibition des culture par traitement
antifongique.

13. • Extraction des AN,
• Réaction de polymérisation en chaine (PCR),
• Séquençage des AN,
• Techniques de génotypage.

14. Extraction des AN:
• Étape initiale de l'examen de biologie
moléculaire.
• Objectif:
Isoler une quantité suffisante d'AN purifié.

15. Extraction des AN:
• 4 Étapes de l'extraction de L'AN à partir du sang, LCR, LBA, selles, urines..:
1. Lyse cellulaire: Libérer de L'AN de la cellule cible par lyse des parois et/ou
membranes..
2. Elimination des inhibiteurs de PCR: Inhibiteurs de PCR sont des
inhibiteurs d'ADN polymérase, leur présence dans l'échantillon donne des
faux négatifs. Ex: l'hémoglobine et les IgG dans le sang.
3. Inactivation des nucléases libérées.
4. Isolement de l'AN cibles: Séparation de l'AN des autres composés
solubles et sa concentration.

16. La PCR est une technique de biologie
moléculaire utilisé pour la détection d'ADN ou
d'ARN.

17. PRINCIPE:
• Amplification spécifique d'une séquence
nucléotidique:
• Repérer un fragment d'ADN ou de gène précis,
même en quantité infime dans un
prélèvement biologique, puis de le multiplier.

18. PRINCIPE:
• Utilisation d'une enzyme polymérase qui
permet de recopier à partir des amorces
nucléotidiques une séquence cible de L'ADN.

19. ACTEURS DE LA PCR:
• ADN cible: sous forme de double brin, contient le fragment à
amplifier.
• Amorces d'ADN: petits fragments complémentaires de chaque brin
de la séquence à amplifier, et correspond à une de ses 2 extrémités.
• Taq polymérase: ADN polymérase thermostable, extraite de la
bactérie Thermus aquaticus.
• 4 nucléotides: dGTP, dATP, dTTP, dCTP
(désoxynucléotides_tri_phosphates), qui sont utilisés par la Taq
polymérase pour synthétiser les brins d'ADN complémentaires.

20. TECHNIQUE:
• PCR est constituée d'une trentaine de cycles chacun d'eux
comportant 3 étapes:
1. Dénaturation,
2. Hybridation,
3. Elongation.
• Tous les éléments nécessaires à la réaction sont regroupés dans un
tube qui sera placé dans un thermocycleur qui permet de monter à
la température qui correspond à chaque étape rapidement.
• Chaque cycle dure 1 à 3 mn selon le type de l'appareillage.

21. TECHNIQUE:
1.Dénaturation:
• Tube chauffé quelques secondes à 94°C.
• Deux brins d'ADN se séparent.

22. TECHNIQUE:
2.Hybridation:
• Température rapidement abaissée à 55°C.
• Amorces s'hybrident sur leur séquence
complémentaire sur les brins d'ADN cible.

23. TECHNIQUE:
3.Elongation:
• Température augmentée à
72 °C,
• Taq polymérase ajouter des
nucléotides complémentaires
à la séquence cible, aux
amorces hybridées, dans le
sens 5' vers 3'.

26. TECHNIQUE:
• 1er cycle: 2 copies de la séquence d'ADN cible.
• 3ème cycle: apparaissent les amplicons (ADN
double brins borné par les amorces).
• 30 cycles: 1 h 30 à 4 h, 2³º copies de la
séquence cible.

28. Détection des amplicons:
• Produit d'amplification analysé par
électrophorèse.
• Séquence amplifiée apparaît sous forme de
bande après coloration au bromure
d'éthylium (molécule intercalante de l'ADN,
fluorescente à l'UV) ou après hybridation avec
une sonde correspondant à cette séquence.

31. TYPE DES TECHNIQUES PCR:
• PCR en point final "PCR conventionnelle ou
classique":
• PCR en temps réel ou RT-PCR ou PCR
quantitative ou qPCR:
• PCR multiplex:
• Nested PCR (PCR nichée):

32. TYPE DES TECHNIQUES PCR:
PCR en point final "PCR conventionnelle
ou classique":
• Détection à partir du produit final de la
réaction.

33. TYPE DES TECHNIQUES PCR:
PCR en temps réel ou RT-PCR ou PCR
quantitative ou qPCR:
• Mesurer la quantité d'ADN polymérisé à
chaque cycle grâce à l'utilisation d'amorces ou
de sondes fluorescentes.

34. TYPE DES TECHNIQUES PCR:
PCR multiplex:
• Amplification de plusieurs
cibles simultanément dans
le même tube en utilisant
plusieurs couples d'amorces.

35. TYPE DES TECHNIQUES PCR:
Nested PCR (PCR nichée):
• Est une PCR en deux étapes:
– 1ère étape: PCR classique.
– 2ème étape: amplification de
l'amplicon à l'aide d'un couple
d'amorces situé dans la partie
interne de la séquence
précédemment amplifiée.
• Augmenter la sensibilité et
la spécificité.

36. Avantages et inconvénients:
Avantages:
• Technique rapide, sensible et spécifique.
• Applications nombreuses: recherche de
parasites, champignons, virus, oncogène..

37. Avantages et inconvénients:
Inconvénients:
• Nécessite des conditions optimales: amorces,
température, nombre de cycles...
• Inhibiteur de PCR.
• Risque de contamination: produit amplifié
contamine un tube prêt à être amplifié
donnant un faux positif.

38. Il consiste à déterminer l'ordre d'enchainement
des nucléotides pour un fragment d'ADN
donné.

39. Principaux types des techniques de
séquençage:
• Séquençage type Sanger:
• Séquençage haut débit (SHD OU NGS):

40. Séquençage type Sanger:
Méthode de synthèse enzymatique sélective
d'où on part d'un brin d'ADN dont on connait
au moins une partie de la séquence.

41. Séquençage type Sanger:
Technique:
• 1ère étape:
Synthèse d'un brin complémentaire d'un brin cible à l'aide d'une
polymérase à partir d'une amorce, en présence de:
– 4 désoxyribonucléotides
– Faible concentration de 4 didésoxyribonucléotides (ddATP, ddCTP,
ddGTP, ddTTP) dont chacun est marqué par un fluorochrome de
couleur différente qui jouent le rôle de terminateur de chaine
(stopper la polymérisation).
• 2ème étape:
Détection et enregistrement de la fluorescence en fonction de
temps et construire la séquence.

43. Séquençage haut débit (SHD OU NGS):
• Obtenir des millions de séquences de l'ordre
d'une centaine de paires de bases.
• Ne nécessitent pas une extraction particulière des
AN.
• Principales techniques de SHD:
– Étude du génome complet:
– Étude du génome ciblé:

44. Séquençage haut débit (SHD OU
NGS):
Étude du génome complet:
• Consiste à séquencer l'ensemble de l'ADN
présent dans le prélèvement.

45. Séquençage haut débit (SHD OU
NGS):
Étude du génome ciblé:
• Consiste à séquencer l'ensemble de l'ADN
après une 1ère PCR plus ou moins ciblée.

46. Séquençage haut débit (SHD OU
NGS):
Lecture:
• Comparer les millions de brin d'ADN à un
génome ou séquence d'ADN dans la base des
données.

49. Techniques de génotypage sont fondées sur
l'analyse du polymorphisme génétique d'un
individu d'une même espèce.

50. 2 types majeurs de polymorphisme sont
utilisés comme marqueurs génétique des
parasites et des champignons:
• Polymorphisme nucléotidique:
• Polymorphisme de longueur des
microsatellites:

51. Le polymorphisme nucléotidique:
• Variation d'un seul nucléotide à un endroit
précis du génome.

52. Le polymorphisme nucléotidique:
• 2 méthodes sont disponibles pour mettre en évidence le
polymorphisme nucléotidique:
– PCR-RFLP (restriction fragment length polymorphisme):
Analyse le polymorphisme de restriction intragénique.
– MLST (multi locus sequence typing):
Fondée sur le séquençage d'ADN,
Analyse des séquences nucléotidiques de plusieurs loci codant
des fragment de gène de ménage (non soumis à des pressions
de sélection qui modifient l'interprétation des relations entre les
souches).

53. Le polymorphisme de longueur des
microsatellites:
• Microsatellites: répétitions en tandem d'un
court motif de bases nucléotidiques (2 à 5
nucléotides).
• Ex: TATATATATATATA OU CTCTCTCTCTCT

54. Le polymorphisme de longueur des
microsatellites:
• MEE de ce type de polymorphisme se fait en 2
étapes:
– Amplifier par PCR la séquence d'ADN contenant le
microsatellite.
– Analyse électrophorétique.

56. La PCR et ses variantes ont été largement
utilisées pour détecter l'ADN parasitaire à
partir de prélèvements biologiques variés:
sang, LBA, LCR, liquide amniotique, humeur
aqueuse, biopsie...

57. Méthodes moléculaires sont appliquées dans:
• Le diagnostic de certaines parasitoses,
• Recherche de marqueurs moléculaires de
résistance aux médicaments,
• Le typage des parasites.

58. Diagnostic de parasitoses:
• Toxoplasmose:
• Paludisme:
• Leishmaniose:
• Trypanosomoses américaine ou maladie de
Chagas:
• Amoebose:

59. Toxoplasmose:
Toxoplasmose congénitale:
• Diagnostic anténatal:
Diagnostic précoce par détection de l'ADN toxoplasmique
par technique PCR dans le liquide amniotique.
Résultat obtenu en 24 à 48 h (6 semaines /inoculation à la
souris).
La PCR est un examen indispensable.
• Diagnostic postnatal:
La PCR est pratiquée sur le placenta, couplée à la sérologie
du nouveau-né.

60. Toxoplasmose:
Toxoplasmose du sujet immunodéprimé:
• Sida:
Détection de l'ADN toxoplasmique dans LCR, sang,moelle
osseuse et LBA par technique PCR est un examen essentiel
pour le diagnostic des formes sévères.
• Greffe de moelle osseuse ou transplantation d'organe
(cœur, rein, foie):
PCR est un examen essentiel pour le diagnostic chez le
greffé par détection de l'ADN dans le sang, moelle osseuse
et biopsie du greffon.

61. Toxoplasmose:
Toxoplasmose oculaire:
• Détection de l'ADN toxoplasmique dans
l'humeur aqueuse par PCR.

62. Paludisme:
• PCR sur le sang: technique complémentaire des
méthodes conventionnelles du diagnostic (frottis
sanguin, gouttes épaisses et QBC).
• PCR facilite le diagnostic d'une espèce difficile sur
frottis sanguin lors de modification morphologique
sous l'effet du traitement.
• PCR et plus performante pour mettre en évidence des
associations d'espèce.

63. Leishmaniose viscérale:
• PCR sur le sang ou la moelle osseuse:
– Diagnostic,
– Suivi post thérapeutique,
• Avantage: sensibilité et rapidité.

64. Trypanosomoses américaine ou maladie
de Chagas:
• PCR permet un diagnostic précoce de la
maladie congénitale que la sérologie.
• La PCR est devenue extrêmement utile durant
la phase chronique de la maladie.

65. Amoebose:
• PCR est la technique de référence pour
distinguer Entamoeba histolytica (pathogène)
de l'E.dispar et l'E. moshkovski (non
pathogènes).

66. Recherche de marqueurs moléculaires de
résistance aux médicaments:
• La mise en évidence de polysmorphismes
nucléotidiques associés à de résistance du à P.
falciparum aux antipaludiques.

67. Typage parasitaire:
• Techniques moléculaires sont massivement utilisées pour le
typage des parasites, au niveau du genre, de l'espèce voire
de la souche.
• Ex:
– Souches de toxoplasmes,
– Espèces et souches de Leishmania,
– Espèces d'amibes,
– Génotype de Giardia intestinalis et Dientamoeba fragilis,
– Espèces de Blastocystis,
– Espèces de microsporidies et de Cryptosporidium,
– Espèce et génotype de Trichinella.

68. • Diagnostic:
• Exploration des mécanismes de résistance
aux antifongiques:
• Enquête épidémiologique:

69. Diagnostic:
Techniques de biologie moléculaire
permettent d'identifier avec précision les
espèces de champignons et de diagnostiquer
plus précocement:
• Infections fongiques invasives dues aux
levures du genre Candida et aux moisissures
du genre Aspergillus.

70. Exploration des mécanismes de résistance
aux antifongiques:
• Recherche des mutations associées à la
résistance, acquise sous traitement ou
d'origine environnementale.
• Ex:
– Résistance aux azolés de l'Aspergillus fumigatus,
– Résistance acquise des levures du genre Candida
aux échinocandines.

71. Enquête épidémiologique:
Typage moléculaire d'isolats de
l'environnement et de malades permet de
définir:
• Mode de transmission et
• Source des épidémies fongiques nosocomiales
(candidoses et aspergilloses).

72. Bibliographie:
1. ANOFEL. Parasitologie et mycologie médicale. Guide des analyses et pratiques
diagnostiques.
2. Guillaume V. fiches pratiques parasitologie sanguine.
3. Bessières M-H et al. Apport de la biologie moléculaire au diagnostic des
parasitoses. Elsevier SAS. Médecine et maladies infectieuses 35(2005) S52-S53.
4. Paugam A. Application de la biologie moléculaire au diagnostic de la
toxoplasmose et d’autres protozooses. Elsevier, Paris. Revue française des
laboratoires,1999, N°315.
5. Cassaing S. et al. Biologie moléculaire et quantification: application en
parasitologie. Elsevier, Paris. Revue française des laboratoires,2002, N°351.
6. Bougnoux M-E. Nouvelles applications des techniques de biologie moléculaire en
mycologie médicale. Elsevier, Paris. Revue française des laboratoires,2003,
N°351.
7. Paugam A. Apports et limites de la biologie moléculaire en mycologie médicale.
Elsevier, Paris. Revue française des laboratoires,1999, N°315.
8. Vassias I. Principe de l’amplification en chaine par polymérase. EMC biologie
médicale 2012 ;7(1):1-5 [ article 90-60-001-A].