DIAGNOSTIC DES OPPORTUNISTES CRYPTOSPORIDIUM SP MICROSPORIDIES PNEUMOCYSTIS

1. BENLARIBI Imane Halima
Pharmacienne praticienne spécialiste
Assistante en parasitologie _ mycologie médicale
Année: 2017/2018

2. CRYPTOSPORIDIES

3. • Parasite cosmopolite, opportuniste,
• Protozoaire, coccidie: Cryptosporidium parvum et
C.hominis, Phylum: Apicomplexa
• Contamination: orale (eau souillée/oocystes)+++,
inhalation
• Bénigne chez l’IC, diarrhée grave chez VIH+ et
enfant.

4. Oocyste:
• Arrondie;
• 3 à 6 µm
• Éliminé dans les selles sporulé
• 4sporozoïtes, corps résiduel et vacuole

7. • Fuchsine phéniquée :
• Solution A…………………….10ml
• Eau phéniquée à 5%.......90ml
• Solution A :
• Fuchsine ……………………..15g
• Ethanol à 95°…………….100ml
• Acide sulfurique à 2%:
• Acide sulfurique …………..2ml
• Eau distillée……………….100ml
– Verser l’acide goutte à goutte dans l’eau.
• Vert malachite à 5% :
• Vert malachite………………5g
• Eau distillée……………….100ml

8. • Utiliser des lames dégraissées.
• Prélever, avec une anse de platine, un fragment de selle, ou à
partir d’un culot de centrifugation d’une méthode de
concentration (Ritchie).
• Etaler délicatement sans revenir au point de départ.

9. • Faire 2 à 3 frottis de selle à examiner directement ou après
technique de concentration (Ritchie);
• Sécher à l’air;
• Fixation: méthanol/5mn;
• Coloration: fuchsine/1h;
• Rinçage: eau de robinet;
• Différentiation: acide sulfurique à 2%/ 20 s en agitant la
lame;
• Rinçage;
• Coloration: vert malachite à 5%/5mn;
• Rinçage;
• Lecture: à l’immersion à l’objectif x100.

10. • Fond de la préparation: vert ou bleu violacé;
• Les oocystes:
– arrondies,
– colorés en rose +/- intense,
– 3 à 6 µm;
– Paroi épaisse;
– Cytoplasme granuleux, contient une vacuole;
– Corps résiduel et sporozoïtes: noirs;
• Levures: vert

13. MICROSPORIDIES

14. • Eucaryotes dépourvus de mitochondries;
• Études récentes: règne des champignons et non
protozoaires;
• + de mille espèces, parasitant les vertébrés et les
invertébrés;
• Qq espèces parasites de l’homme: Enterocytozoon bieneusi
(intestin grêle et VB), Encephalitozoon intestinalis (intestin
grêle et V urinaire, arbre respiratoire)et Encephalitozoon
hellem.

15. • Les microsporidies se multiplient dans les
entérocytes s/forme de spore de 1-3µm;
• La contamination: V digestives (eau et
aliments);
• Microsporidioses: cosmopolites,
opportunistes, ID (VIH++++); diarrhée aigüe
vers chronique.

17. • Flacon de 125ml, mélanger:
– 6g chromophore 2R;
– 150mg vert lumière;
– 0,7g acide phosphotungstique;
– 3ml acide acétique glacial.
Laisser reposer 30mn puis ajouter 100ml d’ED.

18. • Dilution: 1V selle+ 2V formol à 10%;
• Bien mélanger;
• Etaler sur une lame, au min 5ml de cette dilution;
• Séchage;
• Coloration: colorant de Weber/90 mn;
• Rinçage: mélange acide-alcool (200µl acide
acétique+44ml alcool à 90°)/10s;
• Différentiation: alcool 95°/5mn, alcool absolu/10mn,
xylène/10mn;
• Séchage;
• Lecture: à l’immersion, X100.

19. • Les spores de 1- 3 µm se colore en rose
bipolaire sur fond bleu.

21. Pneumocystis jirovecii

22. • Pneumocystose: affection respiratoire opportuniste due à un
champignon Pneumocystis
• La pneumocystose humaine: Pneumocystis jirovecii
• Déficit immunitaire profond / SIDA +++
• Transmission par voie aérienne!!
• Clinique: pneumonie

23. • Kystes matures: 4 à 7 µm: éléments probable infectants:
– libèrent in situ 8 corps intrakystiques
– Kystes vides: forme en ballon dégonflé
• Trophozoïtes = formes végétatives: 2 µm ; mononucléés et
amiboïdes: s’attachent étroitement aux pneumocytes de type I ;
se multiplient activement
• Prékystes: 3 à 8 µm, forme ovoïde, d’abord mononucléés puis
multinucléés avec 3 stades (précoce, intermédiaire et tardif) en
fonction du nombre des noyaux de 1-8.

25. • LBA (lavage broncho-alvéolaire) ++++:
• L’expectoration induite ;
• Biopsie pulmonaire.

26. • LBA (lavage broncho-alvéolaire) ++++:
– Moyen peu invasif d’exploration du poumon distale
– Au cours de la fibroscopie bronchique
– Sous anesthésie locale
– Le liquide instillé: sérum physiologique stérile,
réchauffé à 37°C.
– Volume total:150 à 300ml afin de récupérer 50 à 60%
(min100ml). Fractions successives de 40 à 60ml,
– Récupération: au fur et à mesure par aspiration
douce.
– Flacon siliconé posé sur de la glace pour éviter
l’adhérence des macrophages aux parois.

27. • LBA:
– Centrifugation: 10 à 20ml à 1500 tours/min
pendant 5minutes.
• Le culot est déposé sur plusieurs lames, séché
à l’air et fixé au méthanol.

28. • Giemsa :
– les trophozoïtes et les corps intrakystique,
– le cytoplasme est bleu, le noyau est rouge.

30. • Imprégnation argentique de Musto :
– La paroi des kystes
– En brun.

32. • Bleu de Toluidine :

33. • Réactif de sulfatation R1:
– Placer dans la glace fondante un récipient
contenant 60ml d’acide acétique;
– Ajouter doucement 20ml d’ acide sulfurique
concentré (travailler s/hotte)
– Mélanger avec un agitateur,
– Conservation: 1semaine, boucher au parafilm;

34. • Réactif de Bleu de toluidine O R2:
– 0,3 g de sigma- toluidine bleu O
– 60 ml d’ED;
– 2 ml d’HCL concentré;
– 140 ml éthanol absolu.
Conservation: 1 an à T° ambiante ds un flacon
bouché.

35. • Sulfatation dans R1/10 mn;
• Mélanger la solution après y avoir plongé les
lames avec un agitateur 5 mn
• Rinçage: eau courante/5 mn
• Séchage;
• Coloration: R2/3-5 mn;
• Déshydratation: alcool à 95°, alcool absolu
puis xylène ou toluène;

36. • BT colore la paroi et les éléments fongiques;
• Les kystes groupés au sein des amas,
apparaissent en bleu, peuvent être arrondies
ou aplatis lorsqu’ils sont vides.

38. Bibliographie
• Y.J.Golvan, P.Ambroise-Thomas. Les nouvelles techniques en parasitologie.
Paris, 1990. ISBN: 2-257-13107-X.
• Diagnostic de laboratoire en parasitologie, tome 1.
• Anofel 4.
• C. Moulinier. Parasitologie et mycologie médicales, éléments de
morphologie et biologie. Paris, 2003.ISBN:2-7430-0488-6.
• V.Guillaume. Fiches pratiques parasitologie. INSB 978-2-8041-5038-8.
Paris, 2007.
• I. Achir, B.Hamrioui. Grands cours d’institut Pasteur d’Algérie, La
coprologie parasitaire, parasitologie pratique.

39. Merci
de votre
attention