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Les puces à adn
1. République Algérienne Démocratique et Populaire
MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA RECHERGHE
SCIENTIFIQUE
UNIVERSITE HASSIBA BEN BOUALI CHLEF
Biotechnologie Microbienne L3
Module :Biologie Moléculaire
Présenté par:
-BOUREZAK RABIAA-NAWEL
-HADJ BEN ELEZAAR ASMA
Dirigé par:
-Mm . NAHAL
2015/2016
3. Les étapes de construction
Fonctionnement des puces a ADN
Domaines d’utilisation
Les avantages et les inconvénient
Conclusion
Notre plan de présentation
4. Le concept de puce à ADN repose sur une technologie
multidisciplinaire intégrant la biologie, la nanotechnologie, la
chimie des acides nucléiques, l’analyse d’images et la bio-
informatique. Grace à cet outil, il est possible de mesurer le
niveau d’expression de plusieurs milliers de gènes
simultanément et les applications sont en plein essor dans un
grand nombre de domaines comme la pharmacologie, la
médecine ou l’environnement.
INTRODUCTION
5. Historique
leur concept date de 1987 « suite logique aux
anciennes méthodes de northern blotting.
La technologie des puces à ADN est basée sur le principe
d’hybridation développé par southern (1974).
Les premières puces à ADN sont apparues en 1993.
Schena et al 1995
6. Définition des puces à ADN
Une biopuce, puce à ADN, est un ensemble de molécules
d'ADN fixées en rangées ordonnées sur une petite surface
qui peut être du verre, du silicium ou du plastique.
puces à
gènes
micromatrice
d'ADN
puce à
ADN
Une
biopuce
biochip
Cette biotechnologie récente permet d'analyser le niveau
d'expression des gènes (transcrits) dans une cellule, un
tissu, un organe, un organisme ou encore un mélange
complexe, à un moment donné et dans un état donné par
rapport à un échantillon de référence.
7. Microarray:
lame en verre
-plus miniaturisé
-utilise les produit
PCR
-200-400 microns
-cibles marquées
par fluorescence
Macroarray:
-utilise des clones
d’ ADNc .
-disposés sur une
membrane de
nylon.
-associés avec des
cibles
Radioactives.
Oligonucléotides:
Affimetrix
-synthèse chimique
d’oligonucléotides
In-situ
-sur surface solide
- un procédé de
photolithographie
http://www.lsp.ups-tlse.fr/Journee_Biopuce_03_2003/jjd.pdf
Les différents types de puces
à ADN
8. Source : The Samuel Roberts
Noble Foundation, Inc
10. Microarrays
Macroarrays
Puces à
oligonucléotides
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La Fabrication
Les fragments d'ADNc amplifiés par la
technique de PCR sont déposés sur
une lame de verre par adressage
mécanique.
L’accrochage de la molécule d’ADNc se
fait grâce à (la poly-lysine).
L’ADN est lié de manière covalente au
support par une exposition aux UV.
Un Support idéal, c’est lui qui permet :
L’immobilisation efficace des sondes
sur la surface.
L’hybridation robuste de la sonde
avec la cible.
11. Microarrays
Macroarrays
Puces à
oligonucléotides
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Préparation de la
cible
-Les ARNm sont extraits des deux
cultures dont on veut comparer leurs
expressions.
-Les ARNm sont ensuite transformés en
ADNc monocaténaires par
transcription inverse RT-PCR.
-L’ADN de la première culture est
marqué avec un fluorochrome vert, et
l'ADN de la seconde culture est
marqué en rouge.
-Mélange des deux ADNc (vert et
rouge) : c’est la cible.
13. MODE DE FIXATION des sondes:
séchage 12H /fixation des ADN par
cuisson à 80c° / lavage
14. Microarrays
Macroarrays
Puces à
oligonucléotides
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La lecture
1-La puce est
placée sous un
scanner
éléctronique.
2-Des résultats
obtenus par
des logiciels
informatiques
3-Superposition des images vertes et rouges :
le vert , c’est seulement l'ADN de la
première condition qui est fixé ; le rouge
c’est seulement l'ADN de la seconde
condition qui est fixé)
*Schena M. et al, TIBTECH. 1998, July; vol 16: pages 301-306
Microarrays: biotechnology’s discovery platform for
functional genomics
17. Microarrays
Macroarrays
Puces à
oligonucléotides
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Analyse des
données
*On calcule le ratio des intensités=
fluorescence rouge / fluorescence verte.
Si ce ratio > 1 (la couleur est
rouge), le gène est plus exprimé, si ce
ratio < 1 (la couleur est verte), le gène
est moins exprimé.
*On suppose alors que la quantité d'ADN
fluorescent fixée est proportionnelle à la
quantité d’ARNm correspondante dans la
cellule de départ
*On mesure la quantité de signal dans la
longueur d'onde d'émission du
fluorochrome (vert et rouge)
pour chacun des spots
20. On réalise une synthèse chimique
d’oligonucléotides représentative des
génes de l’organisme étudié,
directement sur une lame de verre, par
un procédé photolithographique .
1- Les lames sont activées (traitées par des espaceurs) de manière à
fixer des nucléotides.
2- Les extrémités libres des espaceurs sont protégées par des groupements
photholabiles pour empêcher la fixation des nucléotides au hasard.
3-Nous utilisons ensuite un jeu de masque photolithografique (protection
contre les rayons « UV »).Comme ,dans le cas de notre ADN, l’adénine doit
apparaître à la 4eme et la 6eme place sur la lame , le masque doit protéger
toutes les places à l’exception de la 4ème et la 6ème .
4-On procède à l’Insolation par des rayons « UV » qui vont détruire les
groupememts photolabiles de la 4ème et la 6ème place.
5- Puis la lame est trempée dans une solution contenant un nucléotide protégé
portant la base « A »Adénine. Ce nucléotide va se fixer à la 4ème et à la 6ème
place.
3-Réseaux d’oligonucléotides :
synthèse d’oligonucléotides in
situ (sur une surfase)
21. Généralement, quand la limite
d’un ratio est > 2 ou <0,5 » on
considère qu’un gène est
respectivement sur exprimé ou
sous- exprimé, dans une des
cibles par rapport à l’autre.
Source : Le principe des puces à ADN (Cours ENS)
Figure 03:(Intensité dans le rougeCY5) =
f(intensités dans le vertCY3).
22. Domaine d’utilisation
parallèlement à l’analyse des profils d’expression, les puces à
ADN offrent la possibilité de réaliser des études très diverses.
- La cancérologie :l’approche de puce à ADN a permis d’améliorer
la classification des tumeurs.
-Le criblage médicamenteux : les puces à ADN permettent de
découvrir de nouveaux médicaments plus rapidement et d’en
réduire le coût grâce a leur vitesse d’analyser des milliers de
molécules.
-L’environnement: L’applications des puces à ADN, notamment
pour la détection rapide et à bas coût de substances organiques,
principalement des agents pathogènes dilués dans
l’environnement.
-Les applications dans le domaine de la guerre
bactériologique ou chimique: En déterminant par avance les
modifications du fonctionnement génétique des cellules
immunitaires occasionnées par des agents toxiques.
23. Domaine d’utilisation
Avantages Inconvénients
Étude simultanée des profils
d’expression de plusieurs millier
de gènes.
Les données sont
cumulables.
Les groupes de gènes
affichent des comportements
identiques dans une situation
biologique donnée.
La technique est assez
lourde à mettre en place.
L’équipement de départ
est d’un coût relativement
élevé.
Le grand nombre de
résultats obtenu très
rapidement nécessite un
traitement informatique et
statistique non négligeable.
24. conclusion
-Les biopuces se présentent comme une réelle révolution
autant au point de vue technologique qu’applicatif. En
effet, les procédés de fabrication et d’exploitation
nécessitent la participation de sciences à vocations
différentes qui deviennent ici complémentaires : d’un
côté des technologies relevant des télécommunications
telles que l’électronique, l’optique et l’informatique, et
d’autre la biologie.
