HIGH-RESOLUTION MELT ANALYSIS FOR MUTATION SCANNING PRIOR TO SEQUENCING Communication de Hamza Ben Salah, doctorant à l''IPT, Colloque Jeunes Chercheurs de l'IPT (8-9 décembre 2016) Introduction: Sanger DNA sequencing remains the most straightforward, reliable method for determining the precise genetic sequence of DNA fragments. However, it requires a fairly significant investment in time and materials. Mutation scanning strategies seek to quickly and efficiently scan DNA samples from many individuals for minor genetic variations to identify candidates to be subjected to full sequencing analysis. High resolution melt analysis (HRM), a technology that is based on the analysis of the melting profile of PCR products through gradual temperature increase, is suitable for mutation scanning to Identify candidates for Sequencing. Aim: The aim of this work is to apply qPCR-HRM for mutation detection based on the melting behavior of double stranded DNA. Method: DNA from 25 individuals was extracted from whole blood using salting out method then resuspended in a low-salt buffer TE (10 mM Tris, 1 mM EDTA) prior to PCR. Primer couple was designed to amplify the target sequence using primer3 software then specificity checked with BLAST tool. Amplification was performed into Bio-Rad CFX96 thermo-cycler. Precision melt analysis software was used for melting curves analysis. Samples with atypical shape are considered candidate to be subjected to sequencing in order to identify genetic variation. ABI 3100 genetic analyzer (Applied biosystem) was used to determine the nucleic acid sequence of candidate samples. Results :We detected with HRM analysis one sample with shape and Tm different from the other samples and forming a cluster separately. To confirm whether this change is due to a DNA variation or eventual troubleshooting, the sample was sequenced. A single nucleotide variation was detected confirming the previous result of HRM. Conclusion : This work allowed: (i) the application of qPCR-HRM method for mutation detection. (ii) Highlighting

1. Mise au point de la technique High Resolution melt (HRM) pour
le génotypage des polymorphismes génétiques ponctuels
(SNPs) et la détection des mutations
BEN SALAH Hamza
Laboratoire de Parasitologie Médicale, Biotechnologies
et Biomolecules, Institut Pasteur de Tunis, LR 11-IPT-06

2. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Les polymorphisms génétiques ponctuels (SNPs)
représente la forme de variation la plus abondante dans
l’ADN humain.
Parmi les objectifs de l’analyse des SNPs est l’étude de la
susceptibilité génétique des maladies humaines complexes.
Les polymorphismes génétiques ponctuels (SNPs)

3. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Génotypage des SNPs
Couteûses
Lourdes
Manipulations post-PCR
Séquençage, PCR-
RFLP, Essais TaqMan,
Spectrométrie de
masse, puces à ADN…
Efficacité, cependant,…

4. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
La technique High resolution melt (HRM)
 Technique rapide: 90-120 minutes
 Faible risque de contamination:
’closed tube technique’
 Technique non destructive
 Excellent Rapport coût/efficacité

5. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Historique
L’analyse HRM est une extension de l’analyse classique des
courbes de fusion.
Une méthode relativement nouvelle mise en place en 2003.
Collaboration entre le laboratoire d’analyse d’ADN de l'Université de
l'Utah (Pr. Carl wittwer) et Idaho Technology, Inc (Salt Lake City, UT).
Appliquée avec succès au Génotypage des SNPs, détection de
variants, identification des espèces, étude de la méthylation de
l’ADN…

6. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
High Resolution Melt (Fusion à haute résolution)
… C’est quoi ? … en quoi consiste… ?
La méthode HRM caractérise les échantillons d'acides
nucléiques pour leur comportement à la dissociation
("melting") suite a une montée standard en température.
La discrimination se fait en fonction de la température de
fusion (Tm) et l’allure des courbes de fusion.

7. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Syber green: intercalant non saturant Eva green: intercalant saturant
…Agent intercalant saturant ou non
saturant ?
VSRéincorporation de l’intercalant
Pas de changement dans le signal de fluorescence Diminution du signal de fluorescence

8. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Gène Polymorphisme
USP03 rs17765311A/C
APH rs2131109 A/G
USP40 rs12472244 A/G
Les gènes étudiés

9. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
L’ Acyl peptide hydrolase (APH)
Le gène APH humain est localisé sur le chromosome
3 (3p21.31).
Les gènes étudiés
Le Polymorphisme rs2131109A/G
Substitution type transition d’une adénine par une
guanine A>G.
Localisation du gène APH sur le chromosome 2

10. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Les gènes étudiés
La protéase spécifique d’ubiquitine 40 (USP40)
Le gène USP40 humain est localisé sur le
chromosome 2 (2q37.1)
Substitution type transition d’une adénine par une guanine
A>G.
Le Polymorphisme rs12472244A/G
Localisation du gène USP40 sur le chromosome 2

11. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Les gènes étudiés
La protéase spécifique d’ubiquitine 3 (USP03)
Le gène USP03 est localisé sur le chromosome 15
(q22.31).
Le polymorphisme rs17765311A/C
Localisation du gène USP03 sur le chromosome 15
Mutation type transversion, substitution d’une adénine
par une guanine A>C.

12. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Objectif
 La mise au point de la technique qPCR-HRM pour
le génotypage des polymorphismes
rs17765311A/C, rs12472244A/G, rs2131109A/G
et la détermination de leur distribution génotypique
chez la population générale tunisienne.

13. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Matériel et Méthodes

14. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
La population d’étude
• 118 sujets « sains ».
• Services de consultants externes de l’Institut Pasteur de Tunis.
Consentement des participants
et éthique
Un accord a été obtenu suite a une
demande déposée, pour une
évaluation complète d’éthique,
auprès de comité d’éthique
médicale de l’Institut Pasteur à
l’entame de ce projet.
Matériel

15. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Conception d’amorces
Outils de conception
 Logiciel Primer 3: présélection de trois
couples d’amorces pour chaque
polymorphisme.
 Logiciel Netprimer: choix du couple
d’amorce le plus stable: faible possibilité de
formation de dimères et de structures
secondaires.

16. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Design des couples d’amorces
Gène SNP Taille Tm (°C)
USP03 rs17765311 132 pb 58.8
APEH rs2131109 133 pb 60.0
USP40 rs1247224 112 pb 56.8
Les trois couples conçus répondent au mieux aux exigences de l’analyse HRM: Tm
comprise entre 55°C et 60°C, taille de l’amplicon comprise entre 100 et 150pb,
pourcentage important en GC supérieur a 50%, très faible possibilité
d’autohybridation.

17. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Montée standard en T° 0,2°/s
Dénaturation
Courbe de fusion
High Resolution Melt
Analyse des courbes de
fusion
Courbes d’amplification
Contrôles positifs
Attribution des
génotypes

18. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Résultats

19. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
50 pb
100 pb
MT 1 2 3 4 5 6 ND
97 pb97 pb97 pb + 106pb
132 pb
Identification du polymorphisme rs17765311A/C (USP03)
Profil de migration des produits digérés
106 pb 106 pb106 pb
A/A A/A A/A
Amplification par
PCR classique
Digestion
enzymatique
(Alu1)
Profil de migration la séquence amplifiée du
gène USP03
132 pb
M 1 2 3 4 T(-)
200 pb
100 pb
C/C C/CA/C
Détection des contrôles positifs

20. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
QPCR-HRM
Coubes d’amplification de la séquence cible du gène USP03
Amplification
Identification du polymorphisme rs17765311A/C (USP03)
Courbes de fusion normalisées de la séquence
amplifiée du gène USP03
A/A
A/C C/C
Courbes de différences de la séquence amplifiée
du gène USP03
A/C
A/A
C/C
Analyse HRM

21. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Gène polymorphisme Génotype/ Allèle N % HW
USP03
Génotype
0.51
A/A 48 41.73
A/C 55 47.82
C/C 12 10.43
Allèle
A 151 65.6
C 79 34.4
Distribution allélique et génotypique du polymorphisme rs17765311A/C
chez la population générale tunisienne
Identification du polymorphisme rs17765311A/C (USP03)

22. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
100 pb
200 pb
Profil de migration de la séquence cible du gène APH
MT 1 2 3 4 5 T(-)
133 pb
Identification du polymorphisme rs2131109 A/G (APH)
rs2131109
Chromatogramme de la séquence cible d’un échantillon à
génotype A/G
Amplification par
PCR classique
Séquençage des
produits PCR
Détection des contrôles positifs par séquençage

23. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Identification du polymorphisme rs2131109 A/G (APH)
QPCR-HRM
Coubes d’amplification de la séquence cible du gène APH
Courbes de fusion normalisées de la séquence
amplifiée du gène APH
A/A
A/G G/G
Courbes de différences de la séquence
amplifiée du gène APH
G/G
A/A
A/G
Amplification
Analyse HRM

24. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Gène polymorphisme Génotype/Allèle N % HW
APH rs2131109 A/G
Génotype
0.89
A/A 46 40
A/G 54 47
G/G 15 13
Allèle
A 146 63.5
G 84 36.5
Distribution allélique et génotypique du polymorphisme rs17765311A/G
chez la population générale tunisienne
Identification du polymorphisme rs2131109 A/G (APH)

25. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Identification du polymorphisme rs12472244 A/G (USP40)
Chromatogramme de la séquence cible d’un échantillon à
génotype A/A
rs12472244
200 pb
100 pb
MT 1 2 3 4 5 T(-)
Profil de migration de la séquence cible du gène
USP40
112 pb
Amplification par
PCR classique
Séquençage des
produits PCR
Détection des contrôles positifs

26. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Identification du polymorphisme rs12472244 A/G (USP40)
Coubes d’amplification de la séquence cible du gène USP03
QPCR-HRM
Analyse HRM
Courbes de fusion normalisées de la séquence
amplifiée du gène USP40
G/G
A/A
A/G
Courbes de différences de la séquence
amplifiée du gène USP40
A/A
G/G
A/G
Amplification

27. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Gène polymorphisme Génotype/Allèle N % HW
USP40 rs1247244A/G
Génotype
0,14
A/A 44 38.26
A/G 48 41.74
G/G 23 20
Allèle
A 136 59
G 94 41
Distribution allélique et génotypique du polymorphisme rs17765311A/C chez
la population générale tunisienne
Identification du polymorphisme rs17765311A/C (USP40)

28. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
rs12472244
Chromatogramme révélant une deuxième mutation au niveau de la
séquence amplifiée du gène USP40
Détection d’une mutation supplémentaire
A/T
Lors de l’identification de contrôles positifs du polymorphisme du gène USP40
(rs12472244), un SNP supplémentaire a été détecté dans l’un échantillon.
L’analyse HRM a révélé une courbe différente des trois génotypes qui forme
un cluster séparément.
Cluster isolé
Coubes de différences
Identification du polymorphisme rs12472244 A/G (USP40)

29. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Discussion

30. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Ce travail est le premier a avoir identifié ces SNPs par
qPCR-HRM.
Cette approche se distingue des autres techniques de
génotypage par sa simplicité, son efficacité et son
cout réduit.

31. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
L’échantillon présentant un SNP secondaire
(détecté par séquençage) a généré une courbe
différente de celle des trois génotypes et a formé un
cluster séparément lors de l’analyse HRM .
Possibilité d’appliquer la technique
pour la recherche des mutations
Technique très sensible

32. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
…Limite
Les formes homozygotes (C/C, G/G et A/A, T/T) Difficiles à
distinguer compte tenu de la faible différence de Tm
Niveau d’amplification
SNP de classe III (C/G) et IV (A/T)
Trois échantillons n’ont pu être discriminés par HRM due à leur
faible niveau d’amplification. L’analyse HRM est limitée par un
niveau d’amplification faible.

33. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
Conclusions et perspectives

34. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
 La mise en place d’une technique de génotypage efficace
et rapide: la qPCR-HRM.
 Détermination pour la première fois de la distribution
génotypiques et alléliques des trois polymorphismes étudiés
dans la population générale tunisienne.
 Intérêt de la technique qPCR-HRM dans la découverte de
nouveaux polymorphismes.

35. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
En perspectives,
 Etude cas témoins pour analyser l’association des trois
polymorphismes génétiques à la rectocolite
hémorragique en Tunisie.
 Mise au point de qPCR-HRM triplexe pour l’amplification
et le génotypage des trois SNPs étudiés simultanément.

36. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016
• Ce travail s’inscrit dans le cadre d’un projet
collaboratif interne (PCI06): <<Etude des facteurs
de risques génétiques et microbiologiques
associés à la rectocolite hémorragique en
Tunisie 2014-2016>>.
• PIA Dr. CHELBI Hanen

37. Colloque Jeunes Chercheurs
de l’Institut Pasteur de Tunis
8-9 Décembre 2016