Microbiologie

1. Université farhat abbes.
Faculté science de la nature et de la vie.
Département de biologie et physiologie animale.
Spécialité de Parasitologie médicale et vétérinaire(Master 1).
la culture cellulaire

2. Plan :
1-Définition
2-Types de cellules
3- Les types de culture cellulaire
4- Les conditions de culture
5- Origine et obtention des cellules
6-La culture des cellules
7- Les milieux de culture
8- Les matériels
9- Les contaminants
10- Conservation des cellules
11-Les avantages et les inconvénients
12- L’utilisation des cellules en culture

3. Culture cellulaire
1-Définition:
• En biologie, la culture cellulaire désigne
un ensemble de techniques utilisées pour
faire croître des cellules hors de leur
organisme (ex-vivo) ou de leur milieu
d'origine, dans un but d'expérimentation
scientifique ou de fécondation in vitro.

4. 2-Types de cellules
Les cellules cultivées sont généralement décrites
d'après leur morphologie (forme et apparence) ou
leurs caractéristiques fonctionnelles. Il existe
trois morphologies de base:
1. type épithélial: ces
cellules sont attachées à
un substrat et
apparaissent plates et de
forme polygonale.

5. 2-Types de cellules
2. type lymphoblaste: ces cellules ne se fixent pas
normalement à un substrat mais restent en
suspension avec une forme sphérique.
3. type fibroblaste: ces
cellules sont attachées à
un substrat et
apparaissent allongées et
bipolaires.

6. 3-Les types de culture cellulaire
1
•Culture primaire
2
•Culture secondaire
3
•Lignée cellulaire

7.  La culture primaire
• Les cellules des tissus sont dispersées par
hydrolyse enzymatique des protéine
constituant la matrice extracellulaire. La
multiplication des cellules s’arrête quand
un élément du milieu nutritif est épuisé.
Quand elles sont cultivées sur support,
leur croissance s’arrête par inhibition de
contact. (c.à.d. quand elles forment un
tapis confluent de monocouche cellulaire.)

8.  La culture secondaire
• Ce sont les cellules de la culture primaire
qui sont utilisées pour ensemencer
d’autres cultures et ainsi de suite : ce
sont donc les cultures secondaires. Ces
cellules ainsi obtenues conservent les
caractéristiques du tissu d’origine mais
leur nombre de divisions est limité comme
dans l’organisme.

9.  Culture secondaire
repiquage
Origine de
cellule
Culture primaire
Culture
secondaire

10.  Les lignées cellulaires
• ( durée de vie indéfinie ) : les cellule
qui ont subi des modification
génétique qui permettent leur
croissance indéfini , elles proviennent
de tumeurs spontanées ou de cellule
transformées par immortalisation.

11. 4-Les conditions de culture :
• • Oxygène : Les cellules animales sont aérobies
strictes, l’apport d’oxygène est donc
indispensable.
• • Température : Les cellules doivent être placées
à la température qui correspond à celle de
l’organisme (généralement à 37°C).
• • pH : Les cellules doivent être placées au pH qui
correspond à celle de l’organisme dont elles sont
issues.
• • Osmolarité : Afin de prévenir l’augmentation
de l’osmolarité du milieu due à l’évaporation,
l’atmosphère de l’incubateur doit être saturée en
vapeur d’eau (humidité à 84-85%).

12. 5-Origine et obtention des cellules
On distingue 2 types de cellules dans
l'organisme :
les cellules circulantes ou libres, telles que les
cellules sanguines,
les cellules des tissus solides.

13. 5-Origine et obtention des cellules
Les premières sont récupérées
facilement par centrifugation
différentielle, alors que les secondes
peuvent être récupérées selon 2
procédés :
-migration cellulaires à partir d'explant
-dissociation du tissu avec libération des
cellules

14. 6-La culture des cellules
• Il existe deux types de cultures
des cellules:
• La culture en suspension.
• La
culture
adhérentes.
de
cellules

15. Culture en suspension
(lymphocytes, moelle osseuse, certains
types de tumeurs comme les tumeurs à
petites cellules rondes…) : les cellules
flottent dans le milieu et prolifèrent en
suspension.

16. La culture de cellules adhérentes
Culture sur support:
adhésion des cellules sur la paroi au fond
du flacon ou de la boîte de culture.

17. Milieu de culture
–







Exigences cellulaire minimales
-eau
-ion minéraux (osmolarité)
-source de carbone et d’énergie (glucose)
-source d’azote acide aminés
Source d’acide gras
pH constant 7.4
Solution tampon (PBS)

18. Milieu de culture
Complément variable selon les milieux
– Acide aminés
– Vitamines et cofacteurs
– Base azotées ribose et désoxyribose
Mélange d’antibiotiques à 1%
– pénicilline G
– Streptomycine
– antifongique

19. Milieu de culture
Glutamine à 1%
Sérum de veau fœtale (SVF)
– EGF (facteur de croissance épidermidique)
– FGF (facteur de croissance fibroblastique)
– Facteur d’adhésion
– Inhibiteur à antitrypsine

20. les matériels

21. Les locaux (PSM)

22. La culture cellulaire nécessite des conditions de
stérilité
absolues,
toute
contamination
microbienne entraîne la lyse des cellules. De plus
lorsque l'on fait de la production, le produit
obtenu doit être stérile. C'est pourquoi on
manipule dans des sales réservées à cet effet, On
utilise de hottes à flux laminaires équipées de
système de filtration d'air (PSM) et permet
d'obtenir une zone de manipulation stérile.

23. Le support

24. • On utilise des supports pour les cellules
adhérentes :
• Boîte stériles en polystyrène : elles ne
présentent pas de toxicité pour les
cellules et permettent d'observer
parfaitement les cellules en microscopie
optique. On peut aussi utiliser des lames
de verre ou des microplaques. Figure5

25. Figure 5 : boites de culture des cellules
adhérentes.

26. • Les cellules non adhérentes sont
cultivées dans les mêmes conditions
mais se développent en suspension.
Figure 6

27. Figure 6 : les flacons de culture des
cellules en suspension.

28. Les étuves d’incubation
Les cellules sont cultivées dans des
étuves thermostatées (37°C pour les
cellules de mammifères), avec 5% de
CO2 sous forme gazeuse. Ces étuves
doivent
être
décontaminées
régulièrement.

29. Les contaminants
 Contaminants biologiques
• Bactéries, levures, virus mycoplasmes
 Contaminants chimiques
• Endotoxines qualité de plastique
 Contaminants croisé
• Autres cellules

30. La stérilisation

31. La conservation des cellules

32. 1. Congélation
en présence
• Agents cryo-protecteurs
DMSO (diméthylsulfoxyde)
• Glycérol
Le DMSO protège les
membranes
lysosomiales et
empêche le relargage
des protéines

33. 1. décongélation
rapide à 37°C suivie d'un lavage et d'un
contrôle de viabilité

34.  Contrôle de viabilité
• Dénombrement en présence d’un
colorant
pour
estimation
de
viabilité cellulaire.
• Bleu de Funk ou (Trypan) exclus
dans des cellules vivantes et
pénétrant dans des cellules mortes
sous le microscope inversé.

35. Les avantages et les inconvénients

36. Les avantages
- la plus part des tissus animaux et
végétaux sont constitué de différent type
de cellules, alors que des cellules de type
spécifique avec des propriétés homogène
peuvent être cultivé.
-les conditions expérimentales, peuvent
être nettement mieux contrôlées en
culture que dans un organisme intacts.

37. Les avantages
-dans de nombreux cas, une cellule
unique peut rapidement se développer
en une colonie constituée de nombreuses
cellules identiques, un processus appelé
clonage cellulaire. Cette technique
simple, permet d’isolé facilement des
clones distincts de cellules.

38. les inconvénients
-Un des principaux inconvénients des
cellules en culture est le fait qu’elles
ne sont pas dans leur environnement
normal et que, par conséquent, leurs
activités ne sont pas régulées par les
autres cellules comme dans le cas d’un
organisme intact.

39. les inconvénients
-L’environnement immédiat des cellules en
culture radicalement de leur
environnement « normal », par
conséquent, leurs propriétés peuvent être
affectées de plusieurs façons.

40. L’utilisation des cellules en culture
L’étude des mécanismes de la
physiologie cellulaire : contrôle de cycle
cellulaire, métabolisme, régulation de
l’expression du gènes, études des
mouvements et des jonctions cellulaires.
La culture cellulaire permet d’étudier la
cellule eucaryote et ses relations avec
son environnement.

41. -En médecine humaine, la culture cellulaire
est utilisée pour la réalisation de greffes
et d’autogreffes (cellules souches
sanguines), le dépistage des maladies
génétiques (caryotype), la thérapie
génique.

42. L’industrie pharmaceutique est une grande
utilisatrice de ces culture : étude
pharmacologique et toxicologique de
nouvelles molécules médicamenteuses,
production des substances a usage
thérapeutique (hormones de croissance,
insuline, interférons et cytokines,
anticorps monoclonaux) et production de
vaccins.