L'électrophorèse est une technique de séparation et d'analyse des molécules chargées par l'action d'un champ électrique, principalement utilisée en biochimie pour la séparation des acides nucléiques et des protéines. Les étapes incluent la préparation du gel d'agarose, le dépôt de l'ADN, et la révélation des fragments, avec différentes méthodes permettant d'analyser la taille des fragments d'ADN. Cette technique est essentielle dans des applications telles que la cartographie du génome, l'analyse de l'ADN et la détection de maladies génétiques.

1. La république Algérienne Démocratique et Politique
Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique
Université Mohamed khider-Biskra
Faculté des Sciences exacte et des Sciences de la nature et de la vie
Département de science de la nature et de la vie
Groupe: 01
Chargé de module:
Mr Athamena .A
2011/2012

3. Plan de travail
introduction
Conclusion
Définition
applications
But et principe
Type
d’électrophorèse
Matériels et gels
utilisé

4. Introduction
L’électrophorèse est la principale des techniques utilisées en
biologie pour la séparation et la caractérisation des molécules.
Elle a quelques applications en chimie, mais principalement
utilisée en biochimie ou biologie moléculaire pour la séparation des
protéines ou celle des acides nucléiques.
Alors comment réaliser l’électrophorèse des acides
nucléiques ?

5. Définition
Technique de séparation
et d’analyse des
particules chargé grâce à
la migration différentielle
sous l’action d’un champ
électrique .

6. BUT

7. Principe
l'électrophorèse est basée sur le principe du
mouvement d’ions sous l’effet d’un champ
électrique.
La vitesse de migration des acides
nucléiques sera en fonction de :
les petits fragments
Taille
(PM ) Migrent rapidement [ ]du gel [ ]du gel
support
vitesse de
migration

8. Les fragments des acides nucléiques peuvent être séparer
selon leur conformation tridimensionnelle
Forme II circulaire
relachée (un brin
coupé)
Forme I circulaire
Forme III linéaire super enroulée
(deux brins cassés) fermée

9. Les acides nucléiques sont des macromolécules poly
anioniques chargés négativement à pH 8. Sous un champ
électrique, ils vont migrer vers l’anode (pôle +).

10. Mobilité élèctrophorétique différente

11. Les matériels

12. Tampon d'électrophorèse
(tampon TBE). est une solution
contenant du Tris [tris (hydroxyméthyl)
aminométhane]
Du borate ,de EDTA (Ethyléne diamine
tétra acétate )ajustée à PH 8.3
Tampon de charge : bleu de
bromophénol - xylène cyanol - glycérol -
tampon TBE.

13. LES GELS UTILISÉS
• Pour les
fragments d’ADN
de taille (0,5-20kb) Gel d’agarose
• Pour les fragments
Gel de de moins de 1000
polyacrylamide paires de base

14. gel de polyacrylamides
Il existe deux types de gel de polyacrylamide :
Les gels non dénaturants
•Séparer des fragments d’ADN double brin
•Ne peuvent pas déterminer précisément la taille
d’un fragment
Les gels dénaturants (DGGE)
•Séparer des fragments d’ADN simple brin

15. L’électrophorèse d’ADN est constituée de cinq étapes
importantes :
3)
Migration
2) Dépôt de
l’ADN dans 4)
les puits du Coloration
gel
1) Préparation
des gels 5)
d’agarose observation

16. Électrophorèse sur gel d’agarose
Préparation du gel
Réalisation du gel d’agarose par dissolution à chaud de
poudre d’agarose dans un tampon TBE à pH 8.2
et refroidissement jusqu’à une température voisine de
50 C.

17. après avoir obturé les
Préparation du moule pour
couler le gel : deux extrémités du moule
avec un scotch fort, placer
le moule sur une surface
bien horizontale et
disposer dans les
encoches prévues à cet
effet le peigne nécessaire
à la réalisation des puits
dans le gel.

18. Coulage du gel :
verser lentement le gel dans la cuve sans dépasser le niveau
supérieur des dents du peigne.

19. Laisser refroidir 30
mn environ avant
d’enlever délicatement le
peigne. Les puits sont
alors prêts pour recevoir
les dépôts d’ADN et le
scotch fermant la cuve
peut-être enlevé.

20. Mise en place du gel dans la cuve :
les puits sont placés
du côté de la cathode et
la cuve est remplie de
tampon TBE jusqu’au
niveau supérieur du gel.

21. Préparation de l’ADN
Décongélation : l’ADN est fourni congelé. Il faut prendre
certaines précautions pour que les fragments ne se réassocient
pas lors de la décongélation : pour cela on lui fait subir un choc
thermique à 65 c avant de le refroidir brutalement.

22. Dilution et densification
de l’ADN par une solution
de charge permettant que
le dépôt s’enfonce bien
au fond de chaque puits.
Cette solution est colorée
par du bleu de
bromophénol et elle
permettra de suivre
l’avancement de
l’électrophorèse.

23. On dépose directement
le dépôt de l’ADN dans les
puits et la migration se fait
dans le gel.
On branche la cuve a la
prise de courant pendant
une heure environ.

24. Quand le front de migration
atteint l’extrémité du gel, on
coupe le courant.

25. Révélation des fragments :
pendant la migration, il
faut préparer la solution
pour révéler les
fragments d’ADN : il
s’agit d’un colorant bleu
dans une solution
tampon dont on ajuste le
pH à pH= 5.2

26. Elimination de la coloration Après migration
de fond du gel par de l'eau coloration par du bleu de
distillée méthylène

27. Placer le gel sur un rétroprojecteur
pour une observation par la classe
entière.

29. Détermination de la taille
d'un fragment d'ADN:
Gel d'électrophorèse sur
agarose sur lequel on voit :
 les marqueurs (ou
échelle, "ladder") de
longueur (en paires de base)
de fragments d'ADN
 un fragment d'ADN
inconnu

31. Les avantages de l'électrophorèse en gel
d'agarose
préparation aisée, rapide, et peu coûteuse des gels d'agarose
pas de dénaturation des échantillons
l'agarose plus ferme et moins toxique que le gel de
polyacrylamide
les échantillons peuvent être récupérés en vue d'analyses
supplémentaires

32. Électrophorèse en champ pulsé
On change périodiquement l’orientation du
champ par rapport au gel ,lors du changement
de l’orientation du champ électrique l’acide
nucléique change le sens de son orientation .

33. Les différents types d’électrophorèse en
champ pulsé
Deux champs non homogènes orthogonaux sont
L’OFGE appliqués alternativement
(Orthogonal Field Les migrations sont plus linéaires que dans la
Alternating Gel technique originale
Electrophoresis) Séparer des fragments dont la taille peut atteindre
9Mb
champ homogène. Le FIGE(Field
Le sens du champ électrique étant simplement Inversion Gel
inversé périodiquement. Electrophoresis)
champ homogène et l’angles de
Le CHEF(Contour réorientation était fixé à 120°
clamped Les Migrations sont linéaires
Homogeous Eletric Séparer des fragements dont la taille peut
Field ) atteindre 12 Méga bases. .

34. OFAGE FIGE CHEF
A- B+
B-
A- A- B-
B+ A+ B+ A+
A+ B-
α = 90° α = 180° α = 120°
Orthogonal Field Alternation Field Invertion Gel Contour-Clamped
Gel Electrophoresis Electrophoresis Homogeneous Electric Field
Figure 1: Les différents types
d’électrophorèse en champ pulsé

35.  Électrophorèse capillaire
Tube capillaire de faible diamètre (50microns)remplie d’un gel
remplie d’un gel séparateur.
Le capillaire est introduit dans le tube contenant l’échantillon.
Sous l’influence d’une haute tension.
pénétration et migration
d’acides nucléiques dans le
capillaire .
Figure2:instrumentation d’électrophorèse
capillaire

36. Avantages
Le système ne Il n’est pas
consomme nécessaire de faire
qu’une quantité de dépôt
infime
d’échantillon

37. Les applications de l’électrophorèse
Estimation du poids moléculaire de fragments d'ADN
après une digestion par des enzymes de restriction
Analyse d'ADN ou d'ARN après une amplification par
PCR
Séparation de fragments d’ADN digérés avant Southern
blot ou d'ARN dans le cas de Northern Blot.

38. Conclusion
L’électrophorèse humain a joué un rôle important dans la
cartographie du génome .l’ électrophorèse est la séparation de
particules causées par un courant électrique.
Le processus sépare les composants de l'ADN pour
déterminer la présence de certains responsables génétiques et
même la présence de troubles et de maladies