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                                 2011/2012
éLéctrophorèse d'adn
Plan de travail


                    introduction


  Conclusion
                                            Définition




applications
                                      But et principe


       Type
 d’électrophorèse
                        Matériels et gels
                            utilisé
Introduction
   L’électrophorèse est la principale des techniques utilisées en
biologie pour la séparation et la caractérisation des molécules.


   Elle a quelques applications en chimie, mais principalement
utilisée en biochimie ou biologie moléculaire pour la séparation des
protéines ou celle des acides nucléiques.


   Alors comment réaliser l’électrophorèse des acides
nucléiques ?
Définition


Technique de séparation
     et d’analyse des
particules chargé grâce à
la migration différentielle
sous l’action d’un champ
        électrique .
BUT
Principe
         l'électrophorèse est basée sur le principe du
         mouvement d’ions sous l’effet d’un champ
         électrique.

         La vitesse de migration des acides
         nucléiques sera en fonction de :




         les petits fragments
Taille
(PM )    Migrent rapidement              [ ]du gel       [ ]du gel
                                         support
                                                         vitesse de
                                                     migration
Les fragments des acides nucléiques peuvent être séparer
 selon leur conformation tridimensionnelle

                          Forme II circulaire
                          relachée (un brin
                               coupé)




                                                Forme I circulaire
 Forme III linéaire                             super enroulée
(deux brins cassés)                             fermée
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anioniques chargés négativement à pH 8. Sous un champ
     électrique, ils vont migrer vers l’anode (pôle   +).
Mobilité élèctrophorétique différente
Les matériels
Tampon d'électrophorèse




(tampon TBE). est une solution
contenant du Tris [tris (hydroxyméthyl)
aminométhane]
Du borate ,de EDTA (Ethyléne diamine
tétra acétate )ajustée à PH 8.3

Tampon de charge : bleu de
bromophénol - xylène cyanol - glycérol -
tampon TBE.
LES GELS UTILISÉS

• Pour les
  fragments d’ADN
  de taille (0,5-20kb)         Gel d’agarose




                         • Pour les fragments
    Gel de                 de moins de 1000
polyacrylamide             paires de base
gel de polyacrylamides

   Il existe deux types de gel de polyacrylamide :


           Les gels non dénaturants

•Séparer des fragments d’ADN double brin
•Ne peuvent pas déterminer précisément la taille
d’un fragment



       Les gels dénaturants (DGGE)


•Séparer des fragments d’ADN simple brin
L’électrophorèse d’ADN est constituée de cinq étapes
importantes :


                           3)
                        Migration

         2) Dépôt de
         l’ADN dans                     4)
         les puits du               Coloration
              gel



1) Préparation
   des gels                                     5)
  d’agarose                                  observation
Électrophorèse sur gel d’agarose


               Préparation du gel
Réalisation du gel d’agarose par dissolution à chaud de
poudre d’agarose dans un tampon TBE à pH 8.2




et refroidissement jusqu’à une température voisine de
50 C.
après avoir obturé les
Préparation du moule pour
couler le gel :             deux extrémités du moule
                            avec un scotch fort, placer
                            le moule sur une surface
                            bien horizontale et
                            disposer dans les
                            encoches prévues à cet
                            effet le peigne nécessaire
                            à la réalisation des puits
                            dans le gel.
Coulage du gel :


    verser lentement le gel dans la cuve sans dépasser le niveau
supérieur des dents du peigne.
Laisser refroidir 30
mn environ avant
d’enlever délicatement le
peigne. Les puits sont
alors prêts pour recevoir
les dépôts d’ADN et le
scotch fermant la cuve
peut-être enlevé.
Mise en place du gel dans la cuve :




                                      les puits sont placés
                                 du côté de la cathode et
                                 la cuve est remplie de
                                 tampon TBE jusqu’au
                                 niveau supérieur du gel.
Préparation de l’ADN




   Décongélation : l’ADN est fourni congelé. Il faut prendre
certaines précautions pour que les fragments ne se réassocient
pas lors de la décongélation : pour cela on lui fait subir un choc
thermique à 65 c avant de le refroidir brutalement.
Dilution et densification
de l’ADN par une solution
de charge permettant que
le dépôt s’enfonce bien
au fond de chaque puits.
Cette solution est colorée
par du bleu de
bromophénol et elle
permettra de suivre
l’avancement de
l’électrophorèse.
On dépose directement
le dépôt de l’ADN dans les
puits et la migration se fait
dans le gel.




                                On branche la cuve a la
                                prise de courant pendant
                                une heure environ.
Quand le front de migration
atteint l’extrémité du gel, on
coupe le courant.
Révélation des fragments :
 pendant la migration, il
faut préparer la solution
pour révéler les
fragments d’ADN : il
s’agit d’un colorant bleu
dans une solution
tampon dont on ajuste le
pH à pH= 5.2
Elimination de la coloration          Après migration
de fond du gel par de l'eau    coloration par du bleu de
distillée                      méthylène
Placer le gel sur un rétroprojecteur
pour une observation par la classe
entière.
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d'un fragment d'ADN:


    Gel d'électrophorèse sur
agarose sur lequel on voit :

   les marqueurs (ou
échelle, "ladder") de
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de fragments d'ADN

   un fragment d'ADN
inconnu
éLéctrophorèse d'adn
Les avantages de l'électrophorèse en gel
    d'agarose

préparation aisée, rapide, et peu coûteuse des gels d'agarose
pas de dénaturation des échantillons
l'agarose plus ferme et moins toxique que le gel                de
polyacrylamide

les   échantillons peuvent être récupérés en vue d'analyses
supplémentaires
Électrophorèse en champ pulsé




On change périodiquement l’orientation du
champ par rapport au gel ,lors du changement
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nucléique change le sens de son orientation .
Les différents types d’électrophorèse en
                             champ pulsé


                        Deux champs non homogènes orthogonaux sont
      L’OFGE            appliqués alternativement
 (Orthogonal Field      Les migrations sont plus linéaires que dans la
  Alternating Gel       technique originale
  Electrophoresis)      Séparer des fragments dont la taille peut atteindre
                        9Mb



champ homogène.                                       Le FIGE(Field
Le sens du champ électrique étant simplement          Inversion Gel
inversé périodiquement.                               Electrophoresis)



                           champ homogène et l’angles de
  Le CHEF(Contour          réorientation était fixé à 120°
      clamped              Les Migrations sont linéaires
  Homogeous Eletric        Séparer des fragements dont la taille peut
       Field )             atteindre 12 Méga bases. .
OFAGE                            FIGE                       CHEF
                                       A-     B+
                       B-
A-                                                          A-                     B-




B+                      A+                                  B+                   A+
                                       A+     B-

         α = 90°                      α = 180°                     α = 120°
Orthogonal Field Alternation       Field Invertion Gel        Contour-Clamped
    Gel Electrophoresis             Electrophoresis        Homogeneous Electric Field




                          Figure 1: Les différents types
                        d’électrophorèse en champ pulsé
   Électrophorèse capillaire

 Tube capillaire de faible diamètre (50microns)remplie d’un gel
 remplie d’un gel séparateur.
 Le capillaire est introduit dans le tube contenant l’échantillon.

 Sous l’influence d’une haute tension.




pénétration et migration
d’acides nucléiques dans le
capillaire .


                              Figure2:instrumentation d’électrophorèse
                              capillaire
Avantages




Le système ne                  Il n’est pas
consomme                      nécessaire de faire
qu’une quantité               de dépôt
infime
d’échantillon
Les applications de l’électrophorèse

Estimation du poids moléculaire de fragments d'ADN
après une digestion par des enzymes de restriction

Analyse d'ADN ou d'ARN après une amplification par
PCR

Séparation de fragments d’ADN digérés avant Southern
blot ou d'ARN dans le cas de Northern Blot.
Conclusion

L’électrophorèse humain a joué un rôle important dans la
cartographie du génome .l’ électrophorèse est la séparation de
particules causées par un courant électrique.
  Le processus sépare les composants de l'ADN pour
déterminer la présence de certains responsables génétiques et
même la présence de troubles et de maladies
éLéctrophorèse d'adn

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éLéctrophorèse d'adn

  • 1. La république Algérienne Démocratique et Politique Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université Mohamed khider-Biskra Faculté des Sciences exacte et des Sciences de la nature et de la vie Département de science de la nature et de la vie Groupe: 01 Chargé de module: Mr Athamena .A 2011/2012
  • 3. Plan de travail introduction Conclusion Définition applications But et principe Type d’électrophorèse Matériels et gels utilisé
  • 4. Introduction L’électrophorèse est la principale des techniques utilisées en biologie pour la séparation et la caractérisation des molécules. Elle a quelques applications en chimie, mais principalement utilisée en biochimie ou biologie moléculaire pour la séparation des protéines ou celle des acides nucléiques. Alors comment réaliser l’électrophorèse des acides nucléiques ?
  • 5. Définition Technique de séparation et d’analyse des particules chargé grâce à la migration différentielle sous l’action d’un champ électrique .
  • 6. BUT
  • 7. Principe l'électrophorèse est basée sur le principe du mouvement d’ions sous l’effet d’un champ électrique. La vitesse de migration des acides nucléiques sera en fonction de : les petits fragments Taille (PM ) Migrent rapidement [ ]du gel [ ]du gel support vitesse de migration
  • 8. Les fragments des acides nucléiques peuvent être séparer selon leur conformation tridimensionnelle Forme II circulaire relachée (un brin coupé) Forme I circulaire Forme III linéaire super enroulée (deux brins cassés) fermée
  • 9. Les acides nucléiques sont des macromolécules poly anioniques chargés négativement à pH 8. Sous un champ électrique, ils vont migrer vers l’anode (pôle +).
  • 12. Tampon d'électrophorèse (tampon TBE). est une solution contenant du Tris [tris (hydroxyméthyl) aminométhane] Du borate ,de EDTA (Ethyléne diamine tétra acétate )ajustée à PH 8.3 Tampon de charge : bleu de bromophénol - xylène cyanol - glycérol - tampon TBE.
  • 13. LES GELS UTILISÉS • Pour les fragments d’ADN de taille (0,5-20kb) Gel d’agarose • Pour les fragments Gel de de moins de 1000 polyacrylamide paires de base
  • 14. gel de polyacrylamides Il existe deux types de gel de polyacrylamide : Les gels non dénaturants •Séparer des fragments d’ADN double brin •Ne peuvent pas déterminer précisément la taille d’un fragment Les gels dénaturants (DGGE) •Séparer des fragments d’ADN simple brin
  • 15. L’électrophorèse d’ADN est constituée de cinq étapes importantes : 3) Migration 2) Dépôt de l’ADN dans 4) les puits du Coloration gel 1) Préparation des gels 5) d’agarose observation
  • 16. Électrophorèse sur gel d’agarose Préparation du gel Réalisation du gel d’agarose par dissolution à chaud de poudre d’agarose dans un tampon TBE à pH 8.2 et refroidissement jusqu’à une température voisine de 50 C.
  • 17. après avoir obturé les Préparation du moule pour couler le gel : deux extrémités du moule avec un scotch fort, placer le moule sur une surface bien horizontale et disposer dans les encoches prévues à cet effet le peigne nécessaire à la réalisation des puits dans le gel.
  • 18. Coulage du gel : verser lentement le gel dans la cuve sans dépasser le niveau supérieur des dents du peigne.
  • 19. Laisser refroidir 30 mn environ avant d’enlever délicatement le peigne. Les puits sont alors prêts pour recevoir les dépôts d’ADN et le scotch fermant la cuve peut-être enlevé.
  • 20. Mise en place du gel dans la cuve : les puits sont placés du côté de la cathode et la cuve est remplie de tampon TBE jusqu’au niveau supérieur du gel.
  • 21. Préparation de l’ADN Décongélation : l’ADN est fourni congelé. Il faut prendre certaines précautions pour que les fragments ne se réassocient pas lors de la décongélation : pour cela on lui fait subir un choc thermique à 65 c avant de le refroidir brutalement.
  • 22. Dilution et densification de l’ADN par une solution de charge permettant que le dépôt s’enfonce bien au fond de chaque puits. Cette solution est colorée par du bleu de bromophénol et elle permettra de suivre l’avancement de l’électrophorèse.
  • 23. On dépose directement le dépôt de l’ADN dans les puits et la migration se fait dans le gel. On branche la cuve a la prise de courant pendant une heure environ.
  • 24. Quand le front de migration atteint l’extrémité du gel, on coupe le courant.
  • 25. Révélation des fragments : pendant la migration, il faut préparer la solution pour révéler les fragments d’ADN : il s’agit d’un colorant bleu dans une solution tampon dont on ajuste le pH à pH= 5.2
  • 26. Elimination de la coloration Après migration de fond du gel par de l'eau coloration par du bleu de distillée méthylène
  • 27. Placer le gel sur un rétroprojecteur pour une observation par la classe entière.
  • 29. Détermination de la taille d'un fragment d'ADN: Gel d'électrophorèse sur agarose sur lequel on voit :  les marqueurs (ou échelle, "ladder") de longueur (en paires de base) de fragments d'ADN  un fragment d'ADN inconnu
  • 31. Les avantages de l'électrophorèse en gel d'agarose préparation aisée, rapide, et peu coûteuse des gels d'agarose pas de dénaturation des échantillons l'agarose plus ferme et moins toxique que le gel de polyacrylamide les échantillons peuvent être récupérés en vue d'analyses supplémentaires
  • 32. Électrophorèse en champ pulsé On change périodiquement l’orientation du champ par rapport au gel ,lors du changement de l’orientation du champ électrique l’acide nucléique change le sens de son orientation .
  • 33. Les différents types d’électrophorèse en champ pulsé Deux champs non homogènes orthogonaux sont L’OFGE appliqués alternativement (Orthogonal Field Les migrations sont plus linéaires que dans la Alternating Gel technique originale Electrophoresis) Séparer des fragments dont la taille peut atteindre 9Mb champ homogène. Le FIGE(Field Le sens du champ électrique étant simplement Inversion Gel inversé périodiquement. Electrophoresis) champ homogène et l’angles de Le CHEF(Contour réorientation était fixé à 120° clamped Les Migrations sont linéaires Homogeous Eletric Séparer des fragements dont la taille peut Field ) atteindre 12 Méga bases. .
  • 34. OFAGE FIGE CHEF A- B+ B- A- A- B- B+ A+ B+ A+ A+ B- α = 90° α = 180° α = 120° Orthogonal Field Alternation Field Invertion Gel Contour-Clamped Gel Electrophoresis Electrophoresis Homogeneous Electric Field Figure 1: Les différents types d’électrophorèse en champ pulsé
  • 35. Électrophorèse capillaire Tube capillaire de faible diamètre (50microns)remplie d’un gel remplie d’un gel séparateur. Le capillaire est introduit dans le tube contenant l’échantillon. Sous l’influence d’une haute tension. pénétration et migration d’acides nucléiques dans le capillaire . Figure2:instrumentation d’électrophorèse capillaire
  • 36. Avantages Le système ne Il n’est pas consomme nécessaire de faire qu’une quantité de dépôt infime d’échantillon
  • 37. Les applications de l’électrophorèse Estimation du poids moléculaire de fragments d'ADN après une digestion par des enzymes de restriction Analyse d'ADN ou d'ARN après une amplification par PCR Séparation de fragments d’ADN digérés avant Southern blot ou d'ARN dans le cas de Northern Blot.
  • 38. Conclusion L’électrophorèse humain a joué un rôle important dans la cartographie du génome .l’ électrophorèse est la séparation de particules causées par un courant électrique. Le processus sépare les composants de l'ADN pour déterminer la présence de certains responsables génétiques et même la présence de troubles et de maladies