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NOTIONS DE PRATIQUE AU
LABORATOIRE DE
MICROBIOLOGIE MEDICALE
REPONSABLE DU MODULE :Dr T.DJERBOUA – CHARGEE DES TP : Mme BRAHIMI
CO-ENCADREURS : Melle BACHIRI, Melle HAOUCHINE,
Année universitaire : 2017-2018
UNIVERSITE MOULOU-MAAMERI DE TIZI-OUZOU
FACULTE DE MEDECINE
DEPARTEMENT DE MEDECINE
MODULE DE MICROBIOLOGIE
TRAVAUX PRATIQUE DE 3ème ANNEE MEDECINE
PLAN1) Introduction
2) La sécurité au laboratoire de microbiologie
3) La microscopie
*Les microscopes
*matériel de microscopie optique
*L’examen microscopique :
-l’examen a l’état frais
-l’examen après coloration
4) La culture et l’identification bactérienne
*Présentations des milieux de culture et du matériel de culture bactérienne
*les incubateurs
* principes et techniques d’identification bactérienne
-Les méthodes phénotypiques
- Les méthodes génotypiques
5) Les tests de sensibilité aux antibiotiques : l’antibiogramme
*méthode de diffusion en milieu gélosé
* Détermination de la concentration minimale inhibitrice
* Tests complémentaires de sensibilité aux antibiotiques
OBJECTIFS PEDAGOGIQUES
A l'issu du cours, l'étudiant sera capable de :
• Executer un examen microscopique a l’état frais et confectionner un frottis bactériologique
• Reconnaitre les formes cellulaires bactérienne et apprécier leurs affinité morpho-tinctoriale
• Nommer et décrire le matériel utilisé en routine au laboratoire de microbiologie
• Nommer et définir l’intéret des milieux de culture utilisés au laboratoire de microbiologie
• Connaitre les principales techniques de tests de sensibilité aux antibiotiques (TSA)
• Comprendre les condition fondamentales d’execution des TSA , les critères de choix des antibiotiques a tester et
des approches de détection de la résistance aux antibiotiques
I. LA MICROSCOPIE
DEFINITION: il s’agit de l’observation d’un échantillon sous microscope a la recherche d’éléments
invisibles a l’œil nu.
La microscopie dite aussi EXAMEN DIRECT , constitue la première étape du diagnostic microbiologique
d’une infection ,
En routine, la microscopie se fait a l’aide du microscope optique.
Selon la technique utilisée nous distinguons deux cas :
• L’examen a l’état frais : par observation directe de l’échantillon tel quel sans modification physique ou
chimique
• L’examen après coloration : procédure qui permet a l’aide d’une combinaison de facteurs chimiques
(colorants) et parfois physiques (chaleur) d’obtenir une coloration des différents constituants bactériens
I. LA MICROSCOPIE
1) LES MICROSCOPES
En fonction de la taille des éléments observés , nous distinguons deux types de microscopes :
*le microscope optique (MO) ou photonique : la taille des éléments et de l’ordre du micromètre (0,1 mm a
2.10-4 mm ou 0,2 µm), le grossissement limite est de X1000 voire X2000 pour les plus puissants
*le microscope électronique (ME): permet d’atteindre des résolutions 100 fois plus petites que celles du MO
. Elle va de 0,6 nm (0,0006 µm a 0,00006 nm pour les plus puissants) l’objet est ainsi grossi jusqu'à 5
millions de fois sa taille,
*dit aussi microscope photonique, il est l’outil d’observation le plus utilisé
au laboratoire de microbiologie.
*il est composé de :
1,1.1) UNE TETE (1) : qui porte l’oculaire par le quelle l’observateur
observe l’échantillon, l’espace observé est appelé « champ microscopique »
La plupart des microscopes utilisés sont binoculaires
L’occulaire est doté d’un grossissement x10
1.2.2) UNE POTENCE: qui porte
1,2,2,1) une tourelle: elle est le support des OBJECTIFS qui sont le
support principal du grossissement , un microscope d’usage courant possède
4
objectifs dont le grossissement est respectivement de X4, X10,X40 et X100
NB : la résultante du grossissement oculaire X objectif donne le
grossissement global du microscope qui va ainsi de X40 a X1000
1,2,2,2) les vis micrométrique et micrométrique: qui permettent
respectivement un réglage grossier et fin de l’image par des mouvement de
1
2
3
I. LA MICROSCOPIE
1,LES MICROSCOPES
1.1) LE MICROSCOPE OPTIQUE (MO)
1.2) UNE POTENCE: (suite)
1,2,2.3) la platine: elle est le support sur lequel est mis l’échantillon (lame
porte-objet, hématimètre, boite de pétri…) l’objet est fixé grâce a des valet
ou a une surplatine guide objet.
La platine porte aussi un diaphragme et un condensateur (contrôle de la
luminosité)
Selon les microscopes la platine peut être dotée d’un mécanisme de
déplacement avant-arrière et gauche droite et d’une échelle micrométrique en
plus d’un vernier
,1.3) UN PIED:
Qui porte la source de lumière et son
régulateur d’intensité ainsi que le
bouton d’allumage
IL EXISTE DES VARIANTS DU MICROSCOPE OPTIQUE
CLASSIQUE , LES PLUS IMPORTANTS EN MICROBIOLOGIE
SONT
 LE MICROSCOPE A FLUORESCENCE:
la source est une lampe a UV.
L’échantillon est préparé de telle façon a
émettre une fluorescence visible. Cout
élevé, necessité d’équipement
supplémentaire
 LE MICROSCOPE A FOND NOIR LE
MICROSCOPE A CONTRAST DE PHASE:
Utilisent des approches d’optique pour augmenter le
contraste de l’image, permettant ainsi de aire
apparaitre des éléments transparents en MO
classique, leurs usage est limité est spécialisé,
n’est pas utilisé en pratique de routine du laboratoire de
microbiologie, il est réservé a des centres spécialisés pour l ’étude
de l’ultrastructure bactérienne et virale.
Sont principe est similaire au MO, sauf que la lumière est
remplacée par un faisceau d’élèctrons et les lentilles en verre sont
remplacés par un champ magnétique faisant office de (Lentilles
magnétiques). Les images sont observés après recueil des images
par un détecteur suivi de l’interpretation/corrections informatiques
des donnés.
La préparation des échantillons est totalement différente de ceux de
la MO
Les images obtenues sont en noir et blanc en fonction de la densité
aux électrons de la partie observée (plus les électrons sont absorbés
ou réfléchis plus l’objet est sombre) définissant ainsi sa
composition et son épaisseur
I. LA MICROSCOPIE
1,LES MICROSCOPES
1.2.LE MICROSCOPE ELECTRONIQUE (ME)
Selon le principe de fonctionnement , nous distinguons deux types de
microscopes électroniques utilisés en biologie:
1,2.1) Le microscope électronique a transmission (TEM) : le faisceau élargi
a la taille de l’échantillon par des lentilles magnétiques passe par l’echantillon
en donnant une seule image
1,2.2) Le microscope électronique a balayage (SEM): un faisceau
fin balaye l’ensemble de l’echantillon point par point,
En raison de leurs principes de fonctionnement , la SEM fournit des
images de 3D (parfois en couleur) et est adaptée a l’étude des surfaces
alors que la TEM fournit des images en 2D et est adaptée a l’étude
d’un échantillon en profondeur
Hormis le microscope lui-même, réaliser un examen microscopique necessite un certain nombre de besoin
I. LA MICROSCOPIE
2) LE MATERIEL DE MICROSCOPIE
L’ECHANTILLO
N
SUPPORT ET
OUTILS DE
DEPOT
D’ECHANTILLO
N
LES
COLORANTS
-Produit pathologique liquide ou
solide
-culture bactérienne liquide ou sur
milieu gélosé
-échantillon environnemental
etc…
-Anse de platine
-Pipettes Pasteur
-poire pour l’aspiration
-Pinces a épiler ou a dissection
-Lame porte objet
-lamelles
-hématimètre
-Boite de Pétri
LA PRORETE DE L’ENVIRONNEMENT DE TRAVAIL EST ASSUREE PAR LA PRATIQUE AU
VOISINAGE DE LA FLAMME DU BEC BUNSEN
Un ou plusieurs selon la coloration
désirée
L’ECHANTILLO
N
SUPPORT ET
OUTILS DE
DEPOT
D’ECHANTILLO
N
3.1) L’ETAT FRAIS: il s’agit de l’observation directe d’un échantillon sans aucun traitement physique/chimique particulier
Ceci permet de voir les éléments présents dans l’echantillons dans leurs morphologie d’origine. Il permet entre autre
l’observation de la MOBILITE BACTERIENNE et la NUMERATION (comptage) des éléments observés comme les leucocytes
L’observation se fait au grossissement x400 le plus souvent
MODE OPERATOIRE:
-a l’aide de la pipette pasteur montée d’une poire ou a l’anse de platine, mettre quelques gouttes de l’échantillon
-recouvrir délicatement d’une lamelle en évitant l’introduction de bulles d’air
-effectuer un LUTAGE (sceller les cotés de la lamelle a l’aide de paraffine de bougie) , cette opération permet d’empecher les
mouvements liquidiens et de stabiliser les cellules.
-Observer au grossissement X400
NB: *l’état frais entre lame et lamelle permet une estimation semi-quantitative des éléments observés (rares, nombreux, très
nombreux…) qui est imprécise.
• l’étimation quantitative est possible en faisant usage d’un hématimètre, il s’agit d’une lame de Quartz gravée de puits
microscopiques de volume connu. En comptage des cellules dans un volume connu permet le calcule et l’expression en
N cellule/mm3 OU N cellule/ml etc…
I. LA MICROSCOPIE
3) LES TYPES D’EAMENS MICROSCOPIQUES: ASPECTS PRATIQUES
MODE OPERATOIRE
DEPOT ENTRE LAME ET LAMELLE DEPOT DANS UN HEMATIMETRE
OBSERVATION AU MICROSCOPE OPTIQUE STANDARD
LEUCOCYTES OBSERVES ENTRE LAME ET LAMELLE
BACTERIES OBSERVES ENTRE LAME ET LAMELLE LEUCOCYTES ET BACTERIES DANS UN HEMATIMETRE
3.2) L’EXAMEN APRES COLORATION: il s’agit de l’observation des différents éléments de l’échantillon après coloration de
leurs éléments constitutifs permettant une meilleure visualisation du contenu de l’échantillons. Il existe de très nombreuses
colorations, cependant il est rare de trouver une qui soit universelle, c’est pour cela que nous faisons recours a plusieurs
colorations pour le même échantillon, de manière sommaire on peut distinguer
I. LA MICROSCOPIE
3) LES TYPES D’EAMENS MICROSCOPIQUES: ASPECTS PRATIQUES
 LES COLORATIONS SIMPLES: se
fait avec un seul colorant et en un seul
temps ex coloration au Bleu de
méthylène
Dans ce cas, les noyaux cellulaires et les
corps bactériens selon colorés en bleu.
C’est une technique simple et rapide mais
d’intérèt limité car n’apporte aucune
information sur la nature de la bactérie
MODE OPERATOIRE:
-a l’aide de la pipette pasteur, d’une anse de
platine ou d’un écouvillon, confectionner
un frottis bactériologique en étalant
l’échantillon en ELLIPSE DE 2 cm DE
LONG /1CM DE LARGE
ETALEMENT A
L’AIDE DE L’ANSE
DE PLATINE
TECHNIQUE DE
CONFECTION DU
FROTTIS
BACTERIOLOGIQUE
MODE OPERATOIRE (SUITE) :
-fixer le frottis en le plongeant en écrasant rapidement la flamme du Bec Bunsen 3 fois et ce pour éviter le décollement du frottis
lors de la coloration et que les éléments bougeant sous microscope.
-Inonder la lame de Bleu de méthylène filtré et attendre qulaques minutes (3-5 min)
-Rincer délicatement la lame jusqu’à ce que l’eau qui coule de la lame ne soit plus teintée en bleu (fin fil d’eau de robinet ou en
agitant délicatement dans un becher =) economie d’eau+++)
-sécher a l’air libre ou a l’aide de papier buvard toujours en manipulant délicatement pour ne pas décoller le frottis
-Mettre quelques gouttes d’huile a immersion et observer a l’objectif x100
I. LA MICROSCOPIE
3) LES TYPES D’EAMENS MICROSCOPIQUES: ASPECTS PRATIQUES
EXEMPLES D’OBSERVATION
PUS URETRAL X100 : notez les formes coccoides a l’intérieur du
polynucléaire , caractèristiques de Neisseria gonorrhoeae
ECOUVILLONAGE VAGINAL X100:
Nous observons deux cellules épithéliales est
des bacilles (flore de Doderline)
2) LES COLORATIONS DIFFERENCIELLES: elles se font en plusieurs temps et utilisent plusieurs colorants, le principe est
basé sur l’affinité qu’a le colorant vis-à-vis d’un élément cellulaire. Ainsi , selon sa compostions , une cellule peut avoir plusieurs
couleurs.
L’exemple type en Bactériologie est la coloration de Gram , cette coloration est le pivot du diagnostic microbiologique, cette
coloration permet d’apprécier l’affinité morpho-tinctoriale de la bactérie = sa forme et sa structure
MODE OPERATOIRE:
-Préparer un frottis bactériologique puis le fixer
-1ère coloration : inonder la lame de Cristal Violet
(Violet de Gentiane) et laisser agir 01 minute
-Mordançage : chasser le violet de Gentiane par le
Lugol et laisser agir 30 secondes
-Rinçage : par de l’eau de robinet, délicatement
-Décoloration: avec de l’Alcool éthylique absolu
(pur), laisser agir 05- a 10 secondes
-Rinçage : par de l’eau de robinet, délicatement
-Contre-coloration : inonder la lame de Fuchsine
basique, laisser agir 01 minute
-Rinçage : par de l’eau de robinet, délicatement
-séchage a l’étuve ou au papier absorbant
-ajouter de l’huile a immersion et observation au
microscope Objectif x100
REACTIFS DE LA COLORATION DE
GRAM
De GAUCHE A DROITE :
LUGOL, ALCOOL ETHYLIQUE, CRYSTAL
VIOLET,ALCOOL ETHYLIQUE, FUCHSINE BACIQUE
LECTURE:
-Les bactéries qui sont insensibles a la décoloration (témoin de leurs peptidoglycane épais qui retient le cristal violet) apparaissent
en violet , ce sont les GRAM POSITIF
-Les bactéries décolorés ne sont colorés que par la fuchsine, elles apparaissent en ROSE, ce sont les GRAM NEGATIF.
BACILLES A GRAM+ : Corynebacterium diphteriae et Bacillus anthracis
BACILLES A GRAM- : Pseudomonas aeruginosa et Escherichia coliCocci a Gram -: Neisseria spp et VelIlonella Spp
Cocci a Gram +: Staphylococcus aureus et Streptococcus pyogenes
3) LES COLORATIONS SPECIALES: ce sont des colorations qui ne sont utilisés dans le but de mettre en évidence des éléments
biens particuliers, il en existe de nombreux exemples en bactériologie certaines sont très complexes d’où leurs intérêt limité
Exemple 1 : Coloration May-Grunwald-Giemsa (MGG)
OBJECTIF: permet une meuilleure visualisation et reconaissance des leucocytes, les bactéries peuvent etre vues mais toutes ont
le meme teint (violet) a ne pas confondre avec des GRAM+ !
MODE OPERATOIRE:
-Confectionner un frottis bactériologique SANS LE FIXER
-FIXATION +1ERE OLORATION: inonder la lame avec une quantité connue de MAY-GRUNWALD, y ajouter immédiatement
la meme quantité d’eau . Ex : mettre 4 millilitres sur la lame puis ajouter 4 millilitres d’eau. LAISSER AGIR 2 minutes
-Rincer délicatement a l’eau de robinet
-Inonder la lame au GIEMSA diluée au 20ème, laisser Agir 20 minutes
-rincer , sécher et observer a l’objectif X100
LECTURE: la morphologie et la couleur cellulaire, des noyaux et des inclusions sont visibles et permettent l’identification des
cellules. Les bactéries sont parfois visibles et ont un teint monotone foncé.
Coloration MGG x100: les leucocytes sont colorés en fonction de leurs
constituants cellulaires permettant leurs reconnaissance
Coloration MGG x100: aspect monotone des bactéries, ici nous observons des
cocci sans autre information sur leurs nature
3) LES COLORATIONS SPECIALES: ce sont des colorations qui ne sont utilisés dans le but de mettre en évidence des éléments biens particuliers,
il en existe de nombreux exemples en bactériologie certaines sont très complexes d’où leurs intérêt limité
Exemple 2 : COLORATION ZIEHL-NEELSEN
OBJECTIF: mise en évidence des MYCOBACTERIES notamment Mycobacterium tuberculosis
PRINCIPE : les mycobactéries ont une paroi très épaisse et riche en acides gras a longue chaine. Ceci leurs confère la propriétée de garder leurs
coloration même face a un traitement agressif de décoloration par l’alcool et l’acide sulfurique. En meme temps , toute les autres bactéries perdent
totalement leurs couleur. Cette propriété est appelée « l’acido-alcoolo résistance » et les Mycobactéries sont dits Bacilles acido-alcolo-résistants
« BAAR »
MODE OPERATOIRE:
-Confectionner un frottis bactériologique et le fixer
1ère coloration : inonder la lame de FUCHSINE
PHENIQUEE
-a l’aide d’un coton imbibe d’alcool monté sur une tige
métallique, chauffer la fuchsine en faisant passer la torche
en bas de la lame et ce , jusqu’à émission de vapeur
-laisser agir 3 minutes
-répéter l’opération précédente 2 fois
-rincer a l’eau de robinet
DECOLORATION :
-inonder la lame d’acide sulfurique 20% et laisser agit 02
minutes puis rincer
-inonder la lame d’alcool ethylique absolue et laisser agir
03 minutes puis rincer
CONTRE COLORATION
-inonder la lame de Bleu de méthylène et laisser agir 01
minute puis rincer, sécher et observer a l’objectif X100
Au fil des decolorations seul les
BAAR Gardent la fuchsine phéniquee
LECTURE: Les BAAR apparaissent en rose sur fond bleu.
ZIEHL-NEELSEN X100 : le bacille tuberculeux est coloré en rose sur fond
bleu, les noyaux cellulaires apparaissent en bleu, les bactéries sont peu ou pas
colorés par le bleu de méthylène.
NB : l’examen microscopique est la clé de voute du diagnostic de la
tuberculose pulmonaire
UN MICROSCOPE BINOCULAIRE S’OBSERVE
AVEC LES DEUX YEUX !
I. LA MICROSCOPIE
4) RÉALISER LA MISE AU POINT
Quelque soit la forme du microscope , les oculaires
sont réglables (voir image) selon l’écart des yeux de
l’observateur =) chaque observateur doit régler
l’écart des oculaires !
La manière la plus simple d’obtenir une image
unique est de procéder ainsi:
1) Ecarter au maximum les oculaires
2) Mettre les mains sur les oculaires et rapprocher
les yeux des oculaires de sorte les deux champs
microscopiques
3) Rapprocher progressivement les oculaires
jusqu’à ce que les deux images n’en forme plus
qu’une !
I. LA MICROSCOPIE
RÉALISER LA MISE AU POINT
LE REGLAGE DE L’IMAGE DEPEND DE
L’OBJECTIF CHOISI !
La manière la plus simple d’obtenir une image en
fonction de l’objectif choisi1) Repérage de l’image microscopique :
*pour le grossissement X400 (objectif x40),en utilisant la vice micrométrique, faire descendre l’objectif jusqu’à une distance de 1
ou 2 millimètres de la lame
*pour le grossissement X1000 (objectif X100) : l’objectif doit être collé a la lame, le contacte entre les deux est réalisé en mettant
une grosse goutte d’huile a immersion sur la lame avant de la mettre dans le microscope
2) Corriger l’image grâce a la vice micrométrique, en la roulant délicatement dans un sens, si l’image deviens plus floue, faire
rouler la vice dans l’autre sens
EN BACTERIOLOGIE ,les objectifs utilises sont x40
pour les cellules humaines et autres eucaryotes
microscopiques et x100 pour les cellules bactériennes
Le réglage se fait grâce a :
• La vice Micrométrique : qui permet des mouvements
grossiers (grands) =) le repérage de l’image
• La vice micrométrique : qui assure des mouvements
fins =) correction de l’image
CULTURE ET IDENTIFICATION
BACTERIENNE
l’étude des bactéries par culture in vitro fait appelle a :
1) Des supports nutritifs appelés : milieux de culture
2) Divers instruments assurant l’environnement adéquat a la croissance bactérienne : les incubateurs
1) Les milieux de culture : il en existe une inifinie variété de milieux de cultures qui peuvent être classés en
1,1) SELON LA CONSISTANCE : milieux liquides en tube , milieux solides sur boite de Pétri
1,2) SELON LEURS INTERET :
1,2,1) les milieux d’isolement : se sont les milieux qui permettent d’avoir une culture visible sous forme de colonies , se sont des milieux solides.
1,2,2) les milieux d’enrichissement: se sont des milieux qui sont conçus de sorte a donner une culture bactérienne abondante. Se sont des milieux
liquides très enrichis en nutriments et en facteurs de croissance mais ne permettent pas de voir des colonies bactériennes.
1,3) SELON LA RICHESSE EN NUTRIMENTS: on distingue les milieux de base (ne contiennent les nutriments de base ) et les milieux enrichis
(contiennent des facteurs de croissance apportés par l’ajout de sang de d’un mélange de vitamines par exemple)
1,4) SELON L’OBJECTIF D’UTILISATION:
1,4,1) les milieux non selectifs : liquides ou solides permettent la croissance de plusieurs bactéries a la fois
1,4,2) les milieux selectifs : se sont des milieux additionnés d’un ou plusieurs agents qui inhibent la croissance de certaines bactéries et favorisent
la croissance d’autres bactéries permettant de les sélectionner
1,4,3: les milieux d’identification : se sont des milieux permettant d’étudier le métobolisme bactérien , indispensable a leurs identification
NB : il existe d’autres milieux : tests de sensibilité aux antibiotiques, milieux de transport, milieux de
conservation….
LA CULTURE BACTERIENNE
QUELQUES DEFINITIONS :
1) ENSEMMENCEMENT: action de mettre des
bactéries sur un milieu de culture stérile, les bactéries
proviennent d’un prélèvement pathologique, de
l’environnement …
2) REPIQUAGE : action d’ensemmencer un d’isolement
a partir d’un milieu d’enrichissement
3) ISOLEMENT : il consiste a prélever une colonie
bactérienne précise et de l’ensemmencer sur un
milieu solide pour avoir une culture bactérienne pure
LA CULTURE BACTERIENNE
ANSE DE PLATINE
Pipette pasteur
Râteau
Ecouvillons
LA CULTURE BACTERIENNE
1) IDENTIFICATION ET DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE: en complément de la morphologie, l’étude des besoins nutritifs, des
conditions de croissance et du métabolisme bactérien permet souvent de les identifier. ‘est ainsi que des « galeries biochimiques
d’identification » ont été mises au point
L’identification bactérienne peut se faire actuellement par biologie moléculaire et par spectrométrie de masse
LA CULTURE BACTERIENNE
LES TESTS DE SENSIBILITE AUX
ANTIBIOTIQUES
L ’ANTIBIOGRAMME
PRE-REQUIS
Le milieux
L’ensemmencement
L’incubation
Les antibiotiques a tester
L’ANTIBIOGRAMME
DEFINITIONS
• Les tests de sensibilité aux antibiotiques sont un ensemble de tests de laboratoire visant a
apprécier l’activité d’un antibiotique donné , d’une groupe d’antibiotiques et / ou d’associations
d’antibiotiques sur une ou plusieurs bactéries isolés d’un prélèvement pathologique le plus
souvent.
• L’exécution de ces tests obéit a des règles nationales et internationales bien codifiés et normalisés
• Ces tests sont de deux ordres :
• 1) des tests qualitatifs (diffusion en milieu gélosé)
• 2) des tests quantitatifs (détermination de la CMI et de la CMB)
DIFFUSION EN MILIEU GELOSE
st la plus simple. Elle consiste à ensemencer en
surface d'un milieu solide par inondation de la
souche à tester. Puis à déposer des disques de papier
buvard comprenant un antibiotique à une certaine
concentration.
Après solubilisation de l'antibiotique par l'humidité
du milieu gélosé, il s'établit un gradient de
concentration qui varie avec le temps.
La boite ainsi préparée est mise à incuber pendant
une nuit à 37°C. Il est possible de voir la croissance
bactérienne (au milieu de la boite) ainsi que des
zones d'inhibition de la croissance circulaires, à
proximité de chaque disque.
Plus la zone d'inhibition est grande, plus grande est
la sensibilité de la souche bactérienne testée vis-à-vis
de l'antibiotique étudié. Chaque zone peut être
mesurée selon divers moyens: règle, compas, pied à
coulisse.....
DETERMINATION DE LA CMI / CMB
Elle consiste a déterminer la concentration exacte
qui inhibe toute croissance bactérienne visible
C’est une technique donc le principe est simple maux
qui est plus laborieuse que la diffusion en milieu
gélosé (moins fréquemment pratiqué)
Elle peut être effectuée en milieu liquide (dilutions
en milieu liquide ou sur milieu solide (dilutions en
milieu solide ou ENCORE PAR TECHNIQUE E-test)
La concentration minimale bactéricide est définie
comme la concentration de l’antibiotique qui tue
99,99% des bactéries (0,01% de survivants) . Elle est
déterminé a partir de la CMI par culture des tubes
ou la culture bactérienne a été inhibée suivi d »un
comptage des bactérie survivantes
DETERMINATION DE LA CMI / CMB
Elle consiste a déterminer la concentration exacte
qui inhibe toute croissance bactérienne visible
C’est une technique donc le principe est simple maux
qui est plus laborieuse que la diffusion en milieu
gélosé (moins fréquemment pratiqué)
Elle peut être effectuée en milieu liquide (dilutions
en milieu liquide ou sur milieu solide (dilutions en
milieu solide ou ENCORE PAR TECHNIQUE E-test)
La concentration minimale bactéricide est définie
comme la concentration de l’antibiotique qui tue
99,99% des bactéries (0,01% de survivants) . Elle est
déterminé a partir de la CMI par culture des tubes
ou la culture bactérienne a été inhibée suivi d »un
comptage des bactérie survivantes
DETERMINATION DE LA CMI / CMB
Elle consiste a déterminer la concentration exacte qui
inhibe toute croissance bactérienne visible
C’est une technique donc le principe est simple maux
qui est plus laborieuse que la diffusion en milieu gélosé
(moins fréquemment pratiqué)
Elle peut être effectuée en milieu liquide (dilutions en
milieu liquide ou sur milieu solide (dilutions en milieu
solide ou ENCORE PAR TECHNIQUE E-test)
La concentration minimale bactéricide est définie
comme la concentration de l’antibiotique qui tue 99,99%
des bactéries (0,01% de survivants) . Elle est déterminé
a partir de la CMI par culture des tubes ou la culture
bactérienne a été inhibée suivi d »un comptage des
bactérie survivantes
NB : les antibiotiques dont la CMB est beacoup plus
supérieure que la CMI (X4) sont bactériostatiques ceux
dont la CMI est proche de la CMB sont bactéricides

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  • 1. NOTIONS DE PRATIQUE AU LABORATOIRE DE MICROBIOLOGIE MEDICALE REPONSABLE DU MODULE :Dr T.DJERBOUA – CHARGEE DES TP : Mme BRAHIMI CO-ENCADREURS : Melle BACHIRI, Melle HAOUCHINE, Année universitaire : 2017-2018 UNIVERSITE MOULOU-MAAMERI DE TIZI-OUZOU FACULTE DE MEDECINE DEPARTEMENT DE MEDECINE MODULE DE MICROBIOLOGIE TRAVAUX PRATIQUE DE 3ème ANNEE MEDECINE
  • 2. PLAN1) Introduction 2) La sécurité au laboratoire de microbiologie 3) La microscopie *Les microscopes *matériel de microscopie optique *L’examen microscopique : -l’examen a l’état frais -l’examen après coloration 4) La culture et l’identification bactérienne *Présentations des milieux de culture et du matériel de culture bactérienne *les incubateurs * principes et techniques d’identification bactérienne -Les méthodes phénotypiques - Les méthodes génotypiques 5) Les tests de sensibilité aux antibiotiques : l’antibiogramme *méthode de diffusion en milieu gélosé * Détermination de la concentration minimale inhibitrice * Tests complémentaires de sensibilité aux antibiotiques
  • 3. OBJECTIFS PEDAGOGIQUES A l'issu du cours, l'étudiant sera capable de : • Executer un examen microscopique a l’état frais et confectionner un frottis bactériologique • Reconnaitre les formes cellulaires bactérienne et apprécier leurs affinité morpho-tinctoriale • Nommer et décrire le matériel utilisé en routine au laboratoire de microbiologie • Nommer et définir l’intéret des milieux de culture utilisés au laboratoire de microbiologie • Connaitre les principales techniques de tests de sensibilité aux antibiotiques (TSA) • Comprendre les condition fondamentales d’execution des TSA , les critères de choix des antibiotiques a tester et des approches de détection de la résistance aux antibiotiques
  • 4. I. LA MICROSCOPIE DEFINITION: il s’agit de l’observation d’un échantillon sous microscope a la recherche d’éléments invisibles a l’œil nu. La microscopie dite aussi EXAMEN DIRECT , constitue la première étape du diagnostic microbiologique d’une infection , En routine, la microscopie se fait a l’aide du microscope optique. Selon la technique utilisée nous distinguons deux cas : • L’examen a l’état frais : par observation directe de l’échantillon tel quel sans modification physique ou chimique • L’examen après coloration : procédure qui permet a l’aide d’une combinaison de facteurs chimiques (colorants) et parfois physiques (chaleur) d’obtenir une coloration des différents constituants bactériens
  • 5. I. LA MICROSCOPIE 1) LES MICROSCOPES En fonction de la taille des éléments observés , nous distinguons deux types de microscopes : *le microscope optique (MO) ou photonique : la taille des éléments et de l’ordre du micromètre (0,1 mm a 2.10-4 mm ou 0,2 µm), le grossissement limite est de X1000 voire X2000 pour les plus puissants *le microscope électronique (ME): permet d’atteindre des résolutions 100 fois plus petites que celles du MO . Elle va de 0,6 nm (0,0006 µm a 0,00006 nm pour les plus puissants) l’objet est ainsi grossi jusqu'à 5 millions de fois sa taille,
  • 6. *dit aussi microscope photonique, il est l’outil d’observation le plus utilisé au laboratoire de microbiologie. *il est composé de : 1,1.1) UNE TETE (1) : qui porte l’oculaire par le quelle l’observateur observe l’échantillon, l’espace observé est appelé « champ microscopique » La plupart des microscopes utilisés sont binoculaires L’occulaire est doté d’un grossissement x10 1.2.2) UNE POTENCE: qui porte 1,2,2,1) une tourelle: elle est le support des OBJECTIFS qui sont le support principal du grossissement , un microscope d’usage courant possède 4 objectifs dont le grossissement est respectivement de X4, X10,X40 et X100 NB : la résultante du grossissement oculaire X objectif donne le grossissement global du microscope qui va ainsi de X40 a X1000 1,2,2,2) les vis micrométrique et micrométrique: qui permettent respectivement un réglage grossier et fin de l’image par des mouvement de 1 2 3 I. LA MICROSCOPIE 1,LES MICROSCOPES 1.1) LE MICROSCOPE OPTIQUE (MO)
  • 7. 1.2) UNE POTENCE: (suite) 1,2,2.3) la platine: elle est le support sur lequel est mis l’échantillon (lame porte-objet, hématimètre, boite de pétri…) l’objet est fixé grâce a des valet ou a une surplatine guide objet. La platine porte aussi un diaphragme et un condensateur (contrôle de la luminosité) Selon les microscopes la platine peut être dotée d’un mécanisme de déplacement avant-arrière et gauche droite et d’une échelle micrométrique en plus d’un vernier ,1.3) UN PIED: Qui porte la source de lumière et son régulateur d’intensité ainsi que le bouton d’allumage
  • 8. IL EXISTE DES VARIANTS DU MICROSCOPE OPTIQUE CLASSIQUE , LES PLUS IMPORTANTS EN MICROBIOLOGIE SONT  LE MICROSCOPE A FLUORESCENCE: la source est une lampe a UV. L’échantillon est préparé de telle façon a émettre une fluorescence visible. Cout élevé, necessité d’équipement supplémentaire  LE MICROSCOPE A FOND NOIR LE MICROSCOPE A CONTRAST DE PHASE: Utilisent des approches d’optique pour augmenter le contraste de l’image, permettant ainsi de aire apparaitre des éléments transparents en MO classique, leurs usage est limité est spécialisé,
  • 9. n’est pas utilisé en pratique de routine du laboratoire de microbiologie, il est réservé a des centres spécialisés pour l ’étude de l’ultrastructure bactérienne et virale. Sont principe est similaire au MO, sauf que la lumière est remplacée par un faisceau d’élèctrons et les lentilles en verre sont remplacés par un champ magnétique faisant office de (Lentilles magnétiques). Les images sont observés après recueil des images par un détecteur suivi de l’interpretation/corrections informatiques des donnés. La préparation des échantillons est totalement différente de ceux de la MO Les images obtenues sont en noir et blanc en fonction de la densité aux électrons de la partie observée (plus les électrons sont absorbés ou réfléchis plus l’objet est sombre) définissant ainsi sa composition et son épaisseur I. LA MICROSCOPIE 1,LES MICROSCOPES 1.2.LE MICROSCOPE ELECTRONIQUE (ME)
  • 10. Selon le principe de fonctionnement , nous distinguons deux types de microscopes électroniques utilisés en biologie: 1,2.1) Le microscope électronique a transmission (TEM) : le faisceau élargi a la taille de l’échantillon par des lentilles magnétiques passe par l’echantillon en donnant une seule image 1,2.2) Le microscope électronique a balayage (SEM): un faisceau fin balaye l’ensemble de l’echantillon point par point, En raison de leurs principes de fonctionnement , la SEM fournit des images de 3D (parfois en couleur) et est adaptée a l’étude des surfaces alors que la TEM fournit des images en 2D et est adaptée a l’étude d’un échantillon en profondeur
  • 11.
  • 12.
  • 13. Hormis le microscope lui-même, réaliser un examen microscopique necessite un certain nombre de besoin I. LA MICROSCOPIE 2) LE MATERIEL DE MICROSCOPIE L’ECHANTILLO N SUPPORT ET OUTILS DE DEPOT D’ECHANTILLO N LES COLORANTS -Produit pathologique liquide ou solide -culture bactérienne liquide ou sur milieu gélosé -échantillon environnemental etc… -Anse de platine -Pipettes Pasteur -poire pour l’aspiration -Pinces a épiler ou a dissection -Lame porte objet -lamelles -hématimètre -Boite de Pétri LA PRORETE DE L’ENVIRONNEMENT DE TRAVAIL EST ASSUREE PAR LA PRATIQUE AU VOISINAGE DE LA FLAMME DU BEC BUNSEN Un ou plusieurs selon la coloration désirée
  • 15. 3.1) L’ETAT FRAIS: il s’agit de l’observation directe d’un échantillon sans aucun traitement physique/chimique particulier Ceci permet de voir les éléments présents dans l’echantillons dans leurs morphologie d’origine. Il permet entre autre l’observation de la MOBILITE BACTERIENNE et la NUMERATION (comptage) des éléments observés comme les leucocytes L’observation se fait au grossissement x400 le plus souvent MODE OPERATOIRE: -a l’aide de la pipette pasteur montée d’une poire ou a l’anse de platine, mettre quelques gouttes de l’échantillon -recouvrir délicatement d’une lamelle en évitant l’introduction de bulles d’air -effectuer un LUTAGE (sceller les cotés de la lamelle a l’aide de paraffine de bougie) , cette opération permet d’empecher les mouvements liquidiens et de stabiliser les cellules. -Observer au grossissement X400 NB: *l’état frais entre lame et lamelle permet une estimation semi-quantitative des éléments observés (rares, nombreux, très nombreux…) qui est imprécise. • l’étimation quantitative est possible en faisant usage d’un hématimètre, il s’agit d’une lame de Quartz gravée de puits microscopiques de volume connu. En comptage des cellules dans un volume connu permet le calcule et l’expression en N cellule/mm3 OU N cellule/ml etc… I. LA MICROSCOPIE 3) LES TYPES D’EAMENS MICROSCOPIQUES: ASPECTS PRATIQUES
  • 16. MODE OPERATOIRE DEPOT ENTRE LAME ET LAMELLE DEPOT DANS UN HEMATIMETRE
  • 17. OBSERVATION AU MICROSCOPE OPTIQUE STANDARD LEUCOCYTES OBSERVES ENTRE LAME ET LAMELLE BACTERIES OBSERVES ENTRE LAME ET LAMELLE LEUCOCYTES ET BACTERIES DANS UN HEMATIMETRE
  • 18. 3.2) L’EXAMEN APRES COLORATION: il s’agit de l’observation des différents éléments de l’échantillon après coloration de leurs éléments constitutifs permettant une meilleure visualisation du contenu de l’échantillons. Il existe de très nombreuses colorations, cependant il est rare de trouver une qui soit universelle, c’est pour cela que nous faisons recours a plusieurs colorations pour le même échantillon, de manière sommaire on peut distinguer I. LA MICROSCOPIE 3) LES TYPES D’EAMENS MICROSCOPIQUES: ASPECTS PRATIQUES  LES COLORATIONS SIMPLES: se fait avec un seul colorant et en un seul temps ex coloration au Bleu de méthylène Dans ce cas, les noyaux cellulaires et les corps bactériens selon colorés en bleu. C’est une technique simple et rapide mais d’intérèt limité car n’apporte aucune information sur la nature de la bactérie MODE OPERATOIRE: -a l’aide de la pipette pasteur, d’une anse de platine ou d’un écouvillon, confectionner un frottis bactériologique en étalant l’échantillon en ELLIPSE DE 2 cm DE LONG /1CM DE LARGE ETALEMENT A L’AIDE DE L’ANSE DE PLATINE TECHNIQUE DE CONFECTION DU FROTTIS BACTERIOLOGIQUE
  • 19. MODE OPERATOIRE (SUITE) : -fixer le frottis en le plongeant en écrasant rapidement la flamme du Bec Bunsen 3 fois et ce pour éviter le décollement du frottis lors de la coloration et que les éléments bougeant sous microscope. -Inonder la lame de Bleu de méthylène filtré et attendre qulaques minutes (3-5 min) -Rincer délicatement la lame jusqu’à ce que l’eau qui coule de la lame ne soit plus teintée en bleu (fin fil d’eau de robinet ou en agitant délicatement dans un becher =) economie d’eau+++) -sécher a l’air libre ou a l’aide de papier buvard toujours en manipulant délicatement pour ne pas décoller le frottis -Mettre quelques gouttes d’huile a immersion et observer a l’objectif x100 I. LA MICROSCOPIE 3) LES TYPES D’EAMENS MICROSCOPIQUES: ASPECTS PRATIQUES
  • 20. EXEMPLES D’OBSERVATION PUS URETRAL X100 : notez les formes coccoides a l’intérieur du polynucléaire , caractèristiques de Neisseria gonorrhoeae ECOUVILLONAGE VAGINAL X100: Nous observons deux cellules épithéliales est des bacilles (flore de Doderline)
  • 21. 2) LES COLORATIONS DIFFERENCIELLES: elles se font en plusieurs temps et utilisent plusieurs colorants, le principe est basé sur l’affinité qu’a le colorant vis-à-vis d’un élément cellulaire. Ainsi , selon sa compostions , une cellule peut avoir plusieurs couleurs. L’exemple type en Bactériologie est la coloration de Gram , cette coloration est le pivot du diagnostic microbiologique, cette coloration permet d’apprécier l’affinité morpho-tinctoriale de la bactérie = sa forme et sa structure MODE OPERATOIRE: -Préparer un frottis bactériologique puis le fixer -1ère coloration : inonder la lame de Cristal Violet (Violet de Gentiane) et laisser agir 01 minute -Mordançage : chasser le violet de Gentiane par le Lugol et laisser agir 30 secondes -Rinçage : par de l’eau de robinet, délicatement -Décoloration: avec de l’Alcool éthylique absolu (pur), laisser agir 05- a 10 secondes -Rinçage : par de l’eau de robinet, délicatement -Contre-coloration : inonder la lame de Fuchsine basique, laisser agir 01 minute -Rinçage : par de l’eau de robinet, délicatement -séchage a l’étuve ou au papier absorbant -ajouter de l’huile a immersion et observation au microscope Objectif x100 REACTIFS DE LA COLORATION DE GRAM De GAUCHE A DROITE : LUGOL, ALCOOL ETHYLIQUE, CRYSTAL VIOLET,ALCOOL ETHYLIQUE, FUCHSINE BACIQUE
  • 22. LECTURE: -Les bactéries qui sont insensibles a la décoloration (témoin de leurs peptidoglycane épais qui retient le cristal violet) apparaissent en violet , ce sont les GRAM POSITIF -Les bactéries décolorés ne sont colorés que par la fuchsine, elles apparaissent en ROSE, ce sont les GRAM NEGATIF. BACILLES A GRAM+ : Corynebacterium diphteriae et Bacillus anthracis BACILLES A GRAM- : Pseudomonas aeruginosa et Escherichia coliCocci a Gram -: Neisseria spp et VelIlonella Spp Cocci a Gram +: Staphylococcus aureus et Streptococcus pyogenes
  • 23. 3) LES COLORATIONS SPECIALES: ce sont des colorations qui ne sont utilisés dans le but de mettre en évidence des éléments biens particuliers, il en existe de nombreux exemples en bactériologie certaines sont très complexes d’où leurs intérêt limité Exemple 1 : Coloration May-Grunwald-Giemsa (MGG) OBJECTIF: permet une meuilleure visualisation et reconaissance des leucocytes, les bactéries peuvent etre vues mais toutes ont le meme teint (violet) a ne pas confondre avec des GRAM+ ! MODE OPERATOIRE: -Confectionner un frottis bactériologique SANS LE FIXER -FIXATION +1ERE OLORATION: inonder la lame avec une quantité connue de MAY-GRUNWALD, y ajouter immédiatement la meme quantité d’eau . Ex : mettre 4 millilitres sur la lame puis ajouter 4 millilitres d’eau. LAISSER AGIR 2 minutes -Rincer délicatement a l’eau de robinet -Inonder la lame au GIEMSA diluée au 20ème, laisser Agir 20 minutes -rincer , sécher et observer a l’objectif X100
  • 24. LECTURE: la morphologie et la couleur cellulaire, des noyaux et des inclusions sont visibles et permettent l’identification des cellules. Les bactéries sont parfois visibles et ont un teint monotone foncé. Coloration MGG x100: les leucocytes sont colorés en fonction de leurs constituants cellulaires permettant leurs reconnaissance Coloration MGG x100: aspect monotone des bactéries, ici nous observons des cocci sans autre information sur leurs nature
  • 25. 3) LES COLORATIONS SPECIALES: ce sont des colorations qui ne sont utilisés dans le but de mettre en évidence des éléments biens particuliers, il en existe de nombreux exemples en bactériologie certaines sont très complexes d’où leurs intérêt limité Exemple 2 : COLORATION ZIEHL-NEELSEN OBJECTIF: mise en évidence des MYCOBACTERIES notamment Mycobacterium tuberculosis PRINCIPE : les mycobactéries ont une paroi très épaisse et riche en acides gras a longue chaine. Ceci leurs confère la propriétée de garder leurs coloration même face a un traitement agressif de décoloration par l’alcool et l’acide sulfurique. En meme temps , toute les autres bactéries perdent totalement leurs couleur. Cette propriété est appelée « l’acido-alcoolo résistance » et les Mycobactéries sont dits Bacilles acido-alcolo-résistants « BAAR » MODE OPERATOIRE: -Confectionner un frottis bactériologique et le fixer 1ère coloration : inonder la lame de FUCHSINE PHENIQUEE -a l’aide d’un coton imbibe d’alcool monté sur une tige métallique, chauffer la fuchsine en faisant passer la torche en bas de la lame et ce , jusqu’à émission de vapeur -laisser agir 3 minutes -répéter l’opération précédente 2 fois -rincer a l’eau de robinet DECOLORATION : -inonder la lame d’acide sulfurique 20% et laisser agit 02 minutes puis rincer -inonder la lame d’alcool ethylique absolue et laisser agir 03 minutes puis rincer CONTRE COLORATION -inonder la lame de Bleu de méthylène et laisser agir 01 minute puis rincer, sécher et observer a l’objectif X100 Au fil des decolorations seul les BAAR Gardent la fuchsine phéniquee
  • 26. LECTURE: Les BAAR apparaissent en rose sur fond bleu. ZIEHL-NEELSEN X100 : le bacille tuberculeux est coloré en rose sur fond bleu, les noyaux cellulaires apparaissent en bleu, les bactéries sont peu ou pas colorés par le bleu de méthylène. NB : l’examen microscopique est la clé de voute du diagnostic de la tuberculose pulmonaire
  • 27. UN MICROSCOPE BINOCULAIRE S’OBSERVE AVEC LES DEUX YEUX ! I. LA MICROSCOPIE 4) RÉALISER LA MISE AU POINT Quelque soit la forme du microscope , les oculaires sont réglables (voir image) selon l’écart des yeux de l’observateur =) chaque observateur doit régler l’écart des oculaires ! La manière la plus simple d’obtenir une image unique est de procéder ainsi: 1) Ecarter au maximum les oculaires 2) Mettre les mains sur les oculaires et rapprocher les yeux des oculaires de sorte les deux champs microscopiques 3) Rapprocher progressivement les oculaires jusqu’à ce que les deux images n’en forme plus qu’une !
  • 28. I. LA MICROSCOPIE RÉALISER LA MISE AU POINT LE REGLAGE DE L’IMAGE DEPEND DE L’OBJECTIF CHOISI ! La manière la plus simple d’obtenir une image en fonction de l’objectif choisi1) Repérage de l’image microscopique : *pour le grossissement X400 (objectif x40),en utilisant la vice micrométrique, faire descendre l’objectif jusqu’à une distance de 1 ou 2 millimètres de la lame *pour le grossissement X1000 (objectif X100) : l’objectif doit être collé a la lame, le contacte entre les deux est réalisé en mettant une grosse goutte d’huile a immersion sur la lame avant de la mettre dans le microscope 2) Corriger l’image grâce a la vice micrométrique, en la roulant délicatement dans un sens, si l’image deviens plus floue, faire rouler la vice dans l’autre sens EN BACTERIOLOGIE ,les objectifs utilises sont x40 pour les cellules humaines et autres eucaryotes microscopiques et x100 pour les cellules bactériennes Le réglage se fait grâce a : • La vice Micrométrique : qui permet des mouvements grossiers (grands) =) le repérage de l’image • La vice micrométrique : qui assure des mouvements fins =) correction de l’image
  • 30. l’étude des bactéries par culture in vitro fait appelle a : 1) Des supports nutritifs appelés : milieux de culture 2) Divers instruments assurant l’environnement adéquat a la croissance bactérienne : les incubateurs 1) Les milieux de culture : il en existe une inifinie variété de milieux de cultures qui peuvent être classés en 1,1) SELON LA CONSISTANCE : milieux liquides en tube , milieux solides sur boite de Pétri 1,2) SELON LEURS INTERET : 1,2,1) les milieux d’isolement : se sont les milieux qui permettent d’avoir une culture visible sous forme de colonies , se sont des milieux solides. 1,2,2) les milieux d’enrichissement: se sont des milieux qui sont conçus de sorte a donner une culture bactérienne abondante. Se sont des milieux liquides très enrichis en nutriments et en facteurs de croissance mais ne permettent pas de voir des colonies bactériennes. 1,3) SELON LA RICHESSE EN NUTRIMENTS: on distingue les milieux de base (ne contiennent les nutriments de base ) et les milieux enrichis (contiennent des facteurs de croissance apportés par l’ajout de sang de d’un mélange de vitamines par exemple) 1,4) SELON L’OBJECTIF D’UTILISATION: 1,4,1) les milieux non selectifs : liquides ou solides permettent la croissance de plusieurs bactéries a la fois 1,4,2) les milieux selectifs : se sont des milieux additionnés d’un ou plusieurs agents qui inhibent la croissance de certaines bactéries et favorisent la croissance d’autres bactéries permettant de les sélectionner 1,4,3: les milieux d’identification : se sont des milieux permettant d’étudier le métobolisme bactérien , indispensable a leurs identification NB : il existe d’autres milieux : tests de sensibilité aux antibiotiques, milieux de transport, milieux de conservation…. LA CULTURE BACTERIENNE
  • 31. QUELQUES DEFINITIONS : 1) ENSEMMENCEMENT: action de mettre des bactéries sur un milieu de culture stérile, les bactéries proviennent d’un prélèvement pathologique, de l’environnement … 2) REPIQUAGE : action d’ensemmencer un d’isolement a partir d’un milieu d’enrichissement 3) ISOLEMENT : il consiste a prélever une colonie bactérienne précise et de l’ensemmencer sur un milieu solide pour avoir une culture bactérienne pure LA CULTURE BACTERIENNE
  • 32. ANSE DE PLATINE Pipette pasteur Râteau Ecouvillons
  • 33.
  • 35.
  • 36.
  • 37.
  • 38. 1) IDENTIFICATION ET DIAGNOSTIC BACTERIOLOGIQUE: en complément de la morphologie, l’étude des besoins nutritifs, des conditions de croissance et du métabolisme bactérien permet souvent de les identifier. ‘est ainsi que des « galeries biochimiques d’identification » ont été mises au point L’identification bactérienne peut se faire actuellement par biologie moléculaire et par spectrométrie de masse LA CULTURE BACTERIENNE
  • 39. LES TESTS DE SENSIBILITE AUX ANTIBIOTIQUES L ’ANTIBIOGRAMME
  • 41. DEFINITIONS • Les tests de sensibilité aux antibiotiques sont un ensemble de tests de laboratoire visant a apprécier l’activité d’un antibiotique donné , d’une groupe d’antibiotiques et / ou d’associations d’antibiotiques sur une ou plusieurs bactéries isolés d’un prélèvement pathologique le plus souvent. • L’exécution de ces tests obéit a des règles nationales et internationales bien codifiés et normalisés • Ces tests sont de deux ordres : • 1) des tests qualitatifs (diffusion en milieu gélosé) • 2) des tests quantitatifs (détermination de la CMI et de la CMB)
  • 42. DIFFUSION EN MILIEU GELOSE st la plus simple. Elle consiste à ensemencer en surface d'un milieu solide par inondation de la souche à tester. Puis à déposer des disques de papier buvard comprenant un antibiotique à une certaine concentration. Après solubilisation de l'antibiotique par l'humidité du milieu gélosé, il s'établit un gradient de concentration qui varie avec le temps. La boite ainsi préparée est mise à incuber pendant une nuit à 37°C. Il est possible de voir la croissance bactérienne (au milieu de la boite) ainsi que des zones d'inhibition de la croissance circulaires, à proximité de chaque disque. Plus la zone d'inhibition est grande, plus grande est la sensibilité de la souche bactérienne testée vis-à-vis de l'antibiotique étudié. Chaque zone peut être mesurée selon divers moyens: règle, compas, pied à coulisse.....
  • 43. DETERMINATION DE LA CMI / CMB Elle consiste a déterminer la concentration exacte qui inhibe toute croissance bactérienne visible C’est une technique donc le principe est simple maux qui est plus laborieuse que la diffusion en milieu gélosé (moins fréquemment pratiqué) Elle peut être effectuée en milieu liquide (dilutions en milieu liquide ou sur milieu solide (dilutions en milieu solide ou ENCORE PAR TECHNIQUE E-test) La concentration minimale bactéricide est définie comme la concentration de l’antibiotique qui tue 99,99% des bactéries (0,01% de survivants) . Elle est déterminé a partir de la CMI par culture des tubes ou la culture bactérienne a été inhibée suivi d »un comptage des bactérie survivantes
  • 44. DETERMINATION DE LA CMI / CMB Elle consiste a déterminer la concentration exacte qui inhibe toute croissance bactérienne visible C’est une technique donc le principe est simple maux qui est plus laborieuse que la diffusion en milieu gélosé (moins fréquemment pratiqué) Elle peut être effectuée en milieu liquide (dilutions en milieu liquide ou sur milieu solide (dilutions en milieu solide ou ENCORE PAR TECHNIQUE E-test) La concentration minimale bactéricide est définie comme la concentration de l’antibiotique qui tue 99,99% des bactéries (0,01% de survivants) . Elle est déterminé a partir de la CMI par culture des tubes ou la culture bactérienne a été inhibée suivi d »un comptage des bactérie survivantes
  • 45. DETERMINATION DE LA CMI / CMB Elle consiste a déterminer la concentration exacte qui inhibe toute croissance bactérienne visible C’est une technique donc le principe est simple maux qui est plus laborieuse que la diffusion en milieu gélosé (moins fréquemment pratiqué) Elle peut être effectuée en milieu liquide (dilutions en milieu liquide ou sur milieu solide (dilutions en milieu solide ou ENCORE PAR TECHNIQUE E-test) La concentration minimale bactéricide est définie comme la concentration de l’antibiotique qui tue 99,99% des bactéries (0,01% de survivants) . Elle est déterminé a partir de la CMI par culture des tubes ou la culture bactérienne a été inhibée suivi d »un comptage des bactérie survivantes NB : les antibiotiques dont la CMB est beacoup plus supérieure que la CMI (X4) sont bactériostatiques ceux dont la CMI est proche de la CMB sont bactéricides