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Dr T.DJERBOUA
Pharmacien maitre assistant en microbiologie
CHEF DE SERVICE DU LABORATOIRE CENTRAL DE BIOLOGIE MEDICALE
HOPITAL BELLOUA-CHU TIZI-OUZOU
Année universitaire : 2017-2018
Email : drtaoufik123@hotmail.fr
UNIVERSITE MOULOUD-MAAMERI DE TIZI-OUZOU
FACULTE DE MEDECINE
DEPARTEMENT DE MEDECINE
COURS DE 3ème ANNEE MEDECINE
MODULE DE MICROBIOLOGIE
I- INTRODUCTION / OBJECTIFS
II-INDICATIONS DU DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE
III-APPROCHES TECHNIQUES
IV- DEROULMENT DU DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE
V-EXEMPLES PRATIQUES : LA GRIPPE, LA RUBEOLE
ET LE VIH
VII-CONCLUSION
INTRODUCTION
INTRODUCTION
VIRUS = AGENTS INFECTIEUX ORIGINAUX =) TECHNIQUES DE
DIAGNOSTIC ORIGINALES
I ) INTRODUCTION
Le Développement de la virologie médicale en parallèle au développement de
la biologie moléculaire , des techniques de culture cellulaire et de microscopie
électronique
L’intérpretation nécessite une connaissance parfaite de la physiologie virale
OBJECTIFS
A LA FIN DU COURS L’ETUDIANT EST SENSE :
*CONNAITRE LES PRINCIPALES INDICATIONS DU DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE
*AVOIR UNE IDEE SUR LES APPROCHES REACTIONELLES UTILISES DANS LES
DIFFERENTES METHODES DE DIAGNOSTIC
*LES PRINCIPALES TECHNIQUES DISPONIBLES ACTUELLEMENT
*ETRE CAPABLE DE FAIRE LE LIEN : PATHOLOGIE-TECHNIQUE-PRELEVEMENT
*AVOIR UNE IDEE SUR LES BONNES PRATIQUES DE PRELEVMENT
*CONNAITRE LES AVANTAGES ET LES INCONVENIENTS DU DIAGNOSTIC
VIROLOGIQUE
III ) LES PRINCIPES !
1) INDICATIONS DU DIAGNOSTIC
VIROLOGIQUE
CIRCONSTANCES
ETIOLOGIE
VIRALE DU
SYNDROME
CLINIQUE
TRAITEMENT
ET SUIVI DES
PATIENTS
SURVEILLANCE
IMMUNITAIRE ET
ENQUETES
EPIDEMIOLOGIQUE
2) LES TECHNIQUES
LES APPROCHES
DIAGNOSTIC
DIRECT
Mise en evidence du virus
ou de ses composantes
DIAGNOSTIC
INDIRECT
Mise en évidence de la
réaction de l’hote contre
le virus , cellulaire ou
humorale
LES 3 ETAPES
PRELEVEMENTS , FICHE DE RENSEIGNEMENT , CONDITIONNEMENT , TRANSPORT
ANALYSE PROPREMENT DITE
INTERPRETATION , VALIDATION ,
RENDU DES RESULTATS
 DIAGNOSTIC INDIRECTE : sang +++ , prélèvements précoce et tardif
 DIAGNOSTIC DIRECTE : plus complexes
 Site infectieux accessible : prélèvement a son niveau (peau , muqueuse , LCR …
 Le prélèvement doit être fait très tôt durant l’infection (les viroses sont le plus
souvent aigues)
 Traiter les virus fragiles avec soin !
 Les modalités de prélèvement sont souvent fixés par le laboratoire executant
l’analyse
 FICHE DE RENSEIGNEMENT DUEMENT REMPLIE ( nom, prénom , sexe , age ,
provenant , signes cliniques , chronologie des événements , état
physiopathologiques concomitants , diagnostic présomptif , traitement en cours,,,)
 PRELEVEMENTS POUR DIAGNOSTIC DIRECT +++
 RESPECT DES CONDITIONS RECOMMANDES PAR LE LABORATOIRE ( rapidite ,
température ambiante ou conservation a basse temperature)
A,1) RECHERCHE DE VIRUS INFECTIEUX PAR CULTURE CELLULAIRE OU INOCULATION A
L’ANIMAL:
 Inoculation du virus contenu dans le prélèvement a un tissus en culture ou a un animal =)
reproduire le cycle viral =) amplification du virus infectieux
 Absence de système cellulaire polyvalent
 La réplication virale peut ce traduire par un modification de l’aspect de la culture cellulaire
(délais variable) =) EFFET CYTOPATHIQUE observable au microscope photonique
 La coloration permet de mettre en évidence des inclusions nucléaires (ADN) ou cytoplasmiques
(ARN)
 Techniques de référence pour plusieurs virus , longue , Fastidieuse , couteuse , NON
APPLICABLE A TOUT LES VIRUS , TRIBUTAIRE DE LA QUALITE DU PRELEVEMENT , permet de
prouver que le virus est vivant et éventuellement de tester sa sensibilité aux antiviraux
MAIS !!!!
MAIS !!!!
A,2) RECHERCHE DE ANTIGENES VIRAUX
 Détection des composantes du virus dans directement dans les prélèvement
 Interaction antigène – anticorps
 Applicable aux prélèvement solides (étales en frottis) ou aux antigènes solubles
 Détection par plusieurs méthodes : Enzymatique , Fluorescence , Chromatographie-coloration
…
 PEUT ETRE QUANTITATIF ( ex : CMV)
 TECHNQUE SIMPLE , RAPIDE , APPLICABLE THEORIQUEMENT A TOUT LES VIRUS
A,3) DETECTION DES ACIDES NUCLEIQUES :
 Basé sur la complémentarité des deux brins d’acide nucléique ,
 La détéction se fait soit sans amplification préalable (hybridation in situ ) ou après amplification
( PCR-DETECTION)
 QUANTITATIVE ET QUALITATIVE
 TECHNQUE SIMPLE , RAPIDE , TEND A DEVENIR LA REFERENCE POUR PLUSIEURS VIRUS
,APPLICABLE THEORIQUEMENT A TOUT LES VIRUS
 En constante évolution : PCR multiplex, en temps réel , PCR-séquençage …
PCR en temps reel
A,4) MICROSCOPE ELECTRONIQUE :
 Détection de la morphologie caractérique de certains virus (Rotavirus , Herpesvirus , Poxvirus,,,)
 Indications électives pour les prélèvements de selles (gastro-entérites virales ) et de viroses
cutanés
 Non utilisé en routine
Consiste a rechercher les anticorps élaborés par l’hote en réponse a une infection virale.
La sérologie ne peut être appliquée immédiatement , elle nécessite un certain temps pour la maturation de la
réaction immunitaire et pour que les anticorps deviennent détectables .
Les anticorps recherchés sont d’isotype IgM, IgG et parfois IgA
Les techniques de sérodiagnostic peuvent être purement qualitative : réponse + ou -
ou Semi quantitaves ex : Titrage d’anticorps en post vaccination HBV
L’intérêt du sérodiagnostic est discutable selon le cas en raison de sa complexité et des nombreuses
interférences, il est parfois très difficile a interpréter. Pour cela ne peut se substituer au diagnostic direct dans
le cas ou il est praticable.
Il est possible de controler la maturation des IgG = anciennetée de l’infection = TEST D’AVIDITE
Les techniques appliqués impliquent a leurs tour la réaction antigène-anticorps et la révélation peut se faire
de plusieurs manières :
 PLUSIEURS TECHNIQUES DISPONIBLES :
 ENZYME LINKED IMMUNE SORBENT ASSAY : repose sur la liaison de l’antigène virale entre
deux anticorps , le second est marqué par une enzyme (plusieurs variantes)
 Agglutination et hémagglutination : L’antigène viral préalablement fixé sur un support particulaire
(Latex , Hématies ) est agglutiné si présence d’anticorps (typage HIV-1/ HIV-2)
 La séroneutralisation : le virus sera neutralisé (ne produit pas d’ECP) en cas de présence d’anticorps
neutralisants dans le sérum du malade et après inoculation a des cultures cellulaires (Poliomyélite)
 L’Immuno-empreinte : typage du pool d’anticorps présents dans le sérum d’un malade (HIV)
CINETIQUE D’EVOLUTION DES
ANTICORPS : EXEMPLE DE LA RUBEOLE
DIAGNOSTIC
INDIRECT
DIAGNOSTIC DIRECT
 La culture prouve le pouvoir infectieux
(virus vivant)
 Détection très rapide du virus (PCR
,antigènes)
 Très sensibles et très spécifiques (PCR)
 Interprétation relativement aisée
 Adaptée a priori a tout les virus
impliqués en pathologie
 Permet le suivi des patients
 Simple , peu couteuse , de
routine
 Adapté a une grande variété
de virus
 Sensibilité et spécificité
satisfaisante
DIAGNOSTIC
INDIRECT
DIAGNOSTIC DIRECT
 Techniques couteuses
 Longues et fastidieuses (Culture)
 Tributaires de la qualité du prélèvement
(Culture)
 Risque de contamination ou de faux
positifs (PCR)
 Diagnostic souvent
rétrospectif
 Interprétation délicate
 Possibles faux positifs
(réactions croisées) ou de
faux négatifs
(immunodépression)
INTERPRETATION , VALIDATION ET
RENDU DES RESULTATS
VI) ETAPES POST-ANALYTIQUES
LES FIEVRES ERUPTIVES VIRALES
LA RUBEOLE
EXEMPLE PRATIQUE 1 :
LES FIEVRES ERUPTIVES VIRALES
LA RUBEOLE
EXEMPLE PRATIQUE 1 :
IgG
- +
CONFRONTER AUX DONNES CLINIQUES ET A
L’AGE DE LA GROSSESSE, EN CAS DE RISQUE
UNE DETERMINATION DES IgM PEUT ETRE
INDIQUEE
A SURVEILLER MENSUELLEMENT
PAR DETERMINATION DES IgG
JUSQU’A ACCOUCHEMENT
L’INFECTION PAR LE VIRUS DE
L’IMMUNODEFICIENCE HUMAINE
EXEMPLE PRATIQUE 3
INDICATIONS :
*diagnostic de l’infection chez l’enfant né de mère séropositive
* présence d’une symptomatologie clinique évocatrice
*Dépistage volontaire, systématique ou chez les populations à risque
*suivi des patients infectés traités ou non.
*validation biologique du don de sang et d’organes
L’INFECTION PAR LE VIRUS DE
L’IMMUNODEFICIENCE HUMAINE
EXEMPLE PRATIQUE 3
MARQUEURS RECHERCHES ET TECHNIQUES
AV : il s’agit de l’antigène capsidique P24 du HIV-1 par ELISA
LES ANTICORPS : anti gp120 et anti gp 41 du HIV-1 par ELISA ainsi que les anticorps anti HIV-
2 par ELISA, le typage du pool d’anticorps se fait par Immunoempreinte ou Western blot
(HIV-1) / Immunoblot (HIV-1/2).
LE GENOME VIRAL : il s’agit de l’ARN viral (suivi des patients : la charge virale, non
indiqués pour le diagnostic) ou de l’ADN proviral (infection materno-fœtale)
VALEURS DES TESTS : les tests cités ci-dessus sont répartis en
deux catégories :
1) les tests de dépistage : ELISA ou tests rapides
2) tests de confirmation : Western-blot ou Immunoblot
A RETENIR !!
Le diagnostic virologique n’est pas de routine
la qualité du prélèvement et la fiche de
renseignement sont capitaux pour la bonne
execution et l’interpretation correcte des
résultats
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plus utilisés
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Les hepatites virales
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DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE D'UNE INFECTION

  • 1. Dr T.DJERBOUA Pharmacien maitre assistant en microbiologie CHEF DE SERVICE DU LABORATOIRE CENTRAL DE BIOLOGIE MEDICALE HOPITAL BELLOUA-CHU TIZI-OUZOU Année universitaire : 2017-2018 Email : drtaoufik123@hotmail.fr UNIVERSITE MOULOUD-MAAMERI DE TIZI-OUZOU FACULTE DE MEDECINE DEPARTEMENT DE MEDECINE COURS DE 3ème ANNEE MEDECINE MODULE DE MICROBIOLOGIE
  • 2. I- INTRODUCTION / OBJECTIFS II-INDICATIONS DU DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE III-APPROCHES TECHNIQUES IV- DEROULMENT DU DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE V-EXEMPLES PRATIQUES : LA GRIPPE, LA RUBEOLE ET LE VIH VII-CONCLUSION
  • 3. INTRODUCTION INTRODUCTION VIRUS = AGENTS INFECTIEUX ORIGINAUX =) TECHNIQUES DE DIAGNOSTIC ORIGINALES I ) INTRODUCTION Le Développement de la virologie médicale en parallèle au développement de la biologie moléculaire , des techniques de culture cellulaire et de microscopie électronique L’intérpretation nécessite une connaissance parfaite de la physiologie virale
  • 4. OBJECTIFS A LA FIN DU COURS L’ETUDIANT EST SENSE : *CONNAITRE LES PRINCIPALES INDICATIONS DU DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE *AVOIR UNE IDEE SUR LES APPROCHES REACTIONELLES UTILISES DANS LES DIFFERENTES METHODES DE DIAGNOSTIC *LES PRINCIPALES TECHNIQUES DISPONIBLES ACTUELLEMENT *ETRE CAPABLE DE FAIRE LE LIEN : PATHOLOGIE-TECHNIQUE-PRELEVEMENT *AVOIR UNE IDEE SUR LES BONNES PRATIQUES DE PRELEVMENT *CONNAITRE LES AVANTAGES ET LES INCONVENIENTS DU DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE
  • 5. III ) LES PRINCIPES !
  • 6. 1) INDICATIONS DU DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE CIRCONSTANCES ETIOLOGIE VIRALE DU SYNDROME CLINIQUE TRAITEMENT ET SUIVI DES PATIENTS SURVEILLANCE IMMUNITAIRE ET ENQUETES EPIDEMIOLOGIQUE
  • 7. 2) LES TECHNIQUES LES APPROCHES DIAGNOSTIC DIRECT Mise en evidence du virus ou de ses composantes DIAGNOSTIC INDIRECT Mise en évidence de la réaction de l’hote contre le virus , cellulaire ou humorale
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  • 9. LES 3 ETAPES PRELEVEMENTS , FICHE DE RENSEIGNEMENT , CONDITIONNEMENT , TRANSPORT ANALYSE PROPREMENT DITE INTERPRETATION , VALIDATION , RENDU DES RESULTATS
  • 10.  DIAGNOSTIC INDIRECTE : sang +++ , prélèvements précoce et tardif  DIAGNOSTIC DIRECTE : plus complexes  Site infectieux accessible : prélèvement a son niveau (peau , muqueuse , LCR …  Le prélèvement doit être fait très tôt durant l’infection (les viroses sont le plus souvent aigues)  Traiter les virus fragiles avec soin !  Les modalités de prélèvement sont souvent fixés par le laboratoire executant l’analyse
  • 11.  FICHE DE RENSEIGNEMENT DUEMENT REMPLIE ( nom, prénom , sexe , age , provenant , signes cliniques , chronologie des événements , état physiopathologiques concomitants , diagnostic présomptif , traitement en cours,,,)  PRELEVEMENTS POUR DIAGNOSTIC DIRECT +++  RESPECT DES CONDITIONS RECOMMANDES PAR LE LABORATOIRE ( rapidite , température ambiante ou conservation a basse temperature)
  • 12. A,1) RECHERCHE DE VIRUS INFECTIEUX PAR CULTURE CELLULAIRE OU INOCULATION A L’ANIMAL:  Inoculation du virus contenu dans le prélèvement a un tissus en culture ou a un animal =) reproduire le cycle viral =) amplification du virus infectieux  Absence de système cellulaire polyvalent  La réplication virale peut ce traduire par un modification de l’aspect de la culture cellulaire (délais variable) =) EFFET CYTOPATHIQUE observable au microscope photonique  La coloration permet de mettre en évidence des inclusions nucléaires (ADN) ou cytoplasmiques (ARN)  Techniques de référence pour plusieurs virus , longue , Fastidieuse , couteuse , NON APPLICABLE A TOUT LES VIRUS , TRIBUTAIRE DE LA QUALITE DU PRELEVEMENT , permet de prouver que le virus est vivant et éventuellement de tester sa sensibilité aux antiviraux
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  • 20. A,2) RECHERCHE DE ANTIGENES VIRAUX  Détection des composantes du virus dans directement dans les prélèvement  Interaction antigène – anticorps  Applicable aux prélèvement solides (étales en frottis) ou aux antigènes solubles  Détection par plusieurs méthodes : Enzymatique , Fluorescence , Chromatographie-coloration …  PEUT ETRE QUANTITATIF ( ex : CMV)  TECHNQUE SIMPLE , RAPIDE , APPLICABLE THEORIQUEMENT A TOUT LES VIRUS
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  • 22. A,3) DETECTION DES ACIDES NUCLEIQUES :  Basé sur la complémentarité des deux brins d’acide nucléique ,  La détéction se fait soit sans amplification préalable (hybridation in situ ) ou après amplification ( PCR-DETECTION)  QUANTITATIVE ET QUALITATIVE  TECHNQUE SIMPLE , RAPIDE , TEND A DEVENIR LA REFERENCE POUR PLUSIEURS VIRUS ,APPLICABLE THEORIQUEMENT A TOUT LES VIRUS  En constante évolution : PCR multiplex, en temps réel , PCR-séquençage …
  • 23. PCR en temps reel
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  • 25. A,4) MICROSCOPE ELECTRONIQUE :  Détection de la morphologie caractérique de certains virus (Rotavirus , Herpesvirus , Poxvirus,,,)  Indications électives pour les prélèvements de selles (gastro-entérites virales ) et de viroses cutanés  Non utilisé en routine
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  • 34. Consiste a rechercher les anticorps élaborés par l’hote en réponse a une infection virale. La sérologie ne peut être appliquée immédiatement , elle nécessite un certain temps pour la maturation de la réaction immunitaire et pour que les anticorps deviennent détectables . Les anticorps recherchés sont d’isotype IgM, IgG et parfois IgA Les techniques de sérodiagnostic peuvent être purement qualitative : réponse + ou - ou Semi quantitaves ex : Titrage d’anticorps en post vaccination HBV L’intérêt du sérodiagnostic est discutable selon le cas en raison de sa complexité et des nombreuses interférences, il est parfois très difficile a interpréter. Pour cela ne peut se substituer au diagnostic direct dans le cas ou il est praticable. Il est possible de controler la maturation des IgG = anciennetée de l’infection = TEST D’AVIDITE
  • 35. Les techniques appliqués impliquent a leurs tour la réaction antigène-anticorps et la révélation peut se faire de plusieurs manières :  PLUSIEURS TECHNIQUES DISPONIBLES :  ENZYME LINKED IMMUNE SORBENT ASSAY : repose sur la liaison de l’antigène virale entre deux anticorps , le second est marqué par une enzyme (plusieurs variantes)  Agglutination et hémagglutination : L’antigène viral préalablement fixé sur un support particulaire (Latex , Hématies ) est agglutiné si présence d’anticorps (typage HIV-1/ HIV-2)  La séroneutralisation : le virus sera neutralisé (ne produit pas d’ECP) en cas de présence d’anticorps neutralisants dans le sérum du malade et après inoculation a des cultures cellulaires (Poliomyélite)  L’Immuno-empreinte : typage du pool d’anticorps présents dans le sérum d’un malade (HIV)
  • 36. CINETIQUE D’EVOLUTION DES ANTICORPS : EXEMPLE DE LA RUBEOLE
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  • 45. DIAGNOSTIC INDIRECT DIAGNOSTIC DIRECT  La culture prouve le pouvoir infectieux (virus vivant)  Détection très rapide du virus (PCR ,antigènes)  Très sensibles et très spécifiques (PCR)  Interprétation relativement aisée  Adaptée a priori a tout les virus impliqués en pathologie  Permet le suivi des patients  Simple , peu couteuse , de routine  Adapté a une grande variété de virus  Sensibilité et spécificité satisfaisante
  • 46. DIAGNOSTIC INDIRECT DIAGNOSTIC DIRECT  Techniques couteuses  Longues et fastidieuses (Culture)  Tributaires de la qualité du prélèvement (Culture)  Risque de contamination ou de faux positifs (PCR)  Diagnostic souvent rétrospectif  Interprétation délicate  Possibles faux positifs (réactions croisées) ou de faux négatifs (immunodépression)
  • 47. INTERPRETATION , VALIDATION ET RENDU DES RESULTATS VI) ETAPES POST-ANALYTIQUES
  • 48. LES FIEVRES ERUPTIVES VIRALES LA RUBEOLE EXEMPLE PRATIQUE 1 :
  • 49. LES FIEVRES ERUPTIVES VIRALES LA RUBEOLE EXEMPLE PRATIQUE 1 : IgG - + CONFRONTER AUX DONNES CLINIQUES ET A L’AGE DE LA GROSSESSE, EN CAS DE RISQUE UNE DETERMINATION DES IgM PEUT ETRE INDIQUEE A SURVEILLER MENSUELLEMENT PAR DETERMINATION DES IgG JUSQU’A ACCOUCHEMENT
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  • 51. L’INFECTION PAR LE VIRUS DE L’IMMUNODEFICIENCE HUMAINE EXEMPLE PRATIQUE 3 INDICATIONS : *diagnostic de l’infection chez l’enfant né de mère séropositive * présence d’une symptomatologie clinique évocatrice *Dépistage volontaire, systématique ou chez les populations à risque *suivi des patients infectés traités ou non. *validation biologique du don de sang et d’organes
  • 52. L’INFECTION PAR LE VIRUS DE L’IMMUNODEFICIENCE HUMAINE EXEMPLE PRATIQUE 3 MARQUEURS RECHERCHES ET TECHNIQUES AV : il s’agit de l’antigène capsidique P24 du HIV-1 par ELISA LES ANTICORPS : anti gp120 et anti gp 41 du HIV-1 par ELISA ainsi que les anticorps anti HIV- 2 par ELISA, le typage du pool d’anticorps se fait par Immunoempreinte ou Western blot (HIV-1) / Immunoblot (HIV-1/2). LE GENOME VIRAL : il s’agit de l’ARN viral (suivi des patients : la charge virale, non indiqués pour le diagnostic) ou de l’ADN proviral (infection materno-fœtale) VALEURS DES TESTS : les tests cités ci-dessus sont répartis en deux catégories : 1) les tests de dépistage : ELISA ou tests rapides 2) tests de confirmation : Western-blot ou Immunoblot
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  • 56. A RETENIR !! Le diagnostic virologique n’est pas de routine la qualité du prélèvement et la fiche de renseignement sont capitaux pour la bonne execution et l’interpretation correcte des résultats les techniques de sérologie sont de loin les plus utilisés la collaboration biologiste – clinicien +++