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virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 1
Objectifs
Pourquoi faire le diagnostic virologique ?
Quels sont les méthodes de diagnostic?
Quels sont les traitements?
POURQUOI FAIRE LE DIAGNOSTIC
VIROLOGIQUE?
virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 4
- Dépistage des virus: don de sang, d’organes et de tissus
- Suivi biologique des infections: VIH, VHB, VHC
- Prise de mesures prophylactiques et contrôle des
épidémies ex. grippe, Rotavirus et VRS en pédiatrie
- Faire des études épidémiologiques (prévalence, réservoir
du virus, transmission)
- Prouver l’origine virale d’une infection
- Prise de décisions thérapeutiques (développer des
antiviraux)
QUELLES SONT LES MÉTHODES
DE DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE ?
virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 6
virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 7
Choix du prélèvement: selon la clinique
Recherche d’une porte d’entrée, sites de multiplication ou
d’excrétion des virus
Le prélèvement doit être réalisé le plus tôt possible après le
début des signes cliniques
(multiplication du virus pendant la phase d’incubation)
Acheminement du prélèvement au laboratoire dans un
milieu de transport, le plus rapidement possible
Transmission des renseignements cliniques avec le
prélèvement
virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 8
Diagnostic de Primo-infection
Apparition des anticorps entre 2 sérums d’un patient
1 sérum précoce (négatif) et 1 sérum tardif (positif)
Définir le statut immunitaire vis-à-vis d’un virus
1 seul sérum
Savoir si un patient à déjà rencontré un
virus précis (Ac positif) ou non (Ac négatif)
virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 9
virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 10
virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 12
Culture de virus : technique de référence
Virus ne peut se multiplier que dans des cellules vivantes
-Animal: culture du Coxsakievirus A
-Œuf de poule embryonné: virus de la grippe
- cellules en culture in vitro
Transport rapide du prélèvement au laboratoire,
dans un milieu de transport, pour conserver le pouvoir
infectieux du virus
Lignées primaires: lignée directement issue
Sang, biopsie de peau ou d’organe
Inconvénients: Matériel en faible quantité
Mélange de différents types cellulaires
Ces cellules ne peuvent être maintenues en culture que
pendant quelques générations.
Avantage: proche de la réalité
Les cellules "immortalisées"
Lymphocytes B et Fibroblastes: infection par EBV
et Virus SV40, respectivement.
Fibroblaste primaire : 10-12 générations
Fibroblaste humain immortalisé : 30-40 générations
Inconvénients: Seuls deux types cellulaires sont
disponibles sous cette forme
On introduit des gènes à effet prolifératif et anti-
apoptotique, modifiant donc ces activités cellulaires
Les cellules tumorales
Disponibles: cancers de tous les types cellulaires
Division rapide, conservation des cultures
pendant très longtemps
Inconvénients: mutations
virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 16
virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 17
Milieu de culture
 eau
 ions minéraux , pH autour de 7,2%
 source de carbone et d’énergie (glucose, pyruvate par
exemple)
 de facteurs de croissance:
-Les acides aminés essentiels
- les vitamines
- des acides gras comme l’acide arachidonique
 des gaz:
-Le dioxygène les cellules étant aérobies
- Le dioxyde de carbone 5%, 37°C
virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 18
Cellules dissociées déposées
sur une surface solide
Les cellules en culture sont :
Hors interaction avec les autres types
cellulaires
Dans un milieu dont les facteurs de
croissance ne sont pas forcément les bons
Hors de leur contexte matriciel
En monocouche au lieu d’un contexte 3D
virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 20
Détection d’un ECP (effet cytopathique) au microscope
Temps d’apparition de l’ECP:
-24h pour un EBV (Epstein Barr virus)
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Détection précoce par des anticorps monoclonaux à 24-48h de culture
Par ELISA
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virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 21
- Monocouche de cellules humaines sensibles
(détection d’un effet cytotoxique. Ex. Herpes
-Tapis bactériens (plages de lyse causées par les
virus bactériophages)
-Tissus ex vivo (ex. morceaux d’amygdales
contenant des lymphocytes pour étude du VIH
- œufs embryonnés pour culture du virus
influenzae
virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 22
Autres méthodes PCR
PCR: Polymerase Chain Reaction
virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 23
virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 24
Diagnostic direct: détection du génome
virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 25
PCR quantitative: détection du génome
Charge virale nb de copies de génome viral par ml de plasma
QUELLES SONT LES PRINCIPALES
APPLICATIONS
DU DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE ?
virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 27
- HSV dans LCR (liquide cépalorachidien):
Méningo-encéphalite (urgence)
- CMV: PCR quantitative en cas de dons
d’organes (greffés de rein)
- VIH: PCR qualitative: dépistage du VIH chez
le nouveau-né
- PCR quantitative: quantifier la charge virale
pour le suivi thérapeutique
- VHC: Sérologie + PCR
virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 28
Structure détectée Méthode Applications
Virus complet Culture virale HSV, VZV, Entérovirus,
adénovirus
Protéines virales
(antigènes)
Diagnostic « direct » Rotavirus, adénovirus,
VRS, virus de la grippe,
HSV, CMV, VZV
Acides nucléiques
viraux
Biologie moléculaire HIV, HCV, HBV, V.
respiratoires
V. opportunistes,
V. neurotropes
HSV: Herpes s Smplex virus, VZV: virus de la Varicelle et du Zona, VRS: Virus respiratoire
Syncitiale, CMV: Cytomegalovirus,
virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 29
Chaque année, 90% au moins de la population
souffre d'une maladie virale
Au moins 60% des maladies infectieuses sont
imputables aux virus
Le nombre d'agents antiviraux est relativement
peu élevé
Les antibiotiques sont inefficaces contre les virus
Les récents produits ciblent l’infection à VIH
Ils visent toutes les phases du cycle viral
-Utiliser des doses optimales
oAssocier plusieurs antiviraux (ex. VIH),
pour augmenter l’efficacité du traitement,
diminuer la toxicité des médicaments et
prévenir l’émergence de mutants
résistants
- Mettre en route le traitement le plus
rapidement possible
virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 32
Les antiviraux doivent bloquer la réplication du
virus sans atteindre le Métabolisme cellulaire
Les antiviraux ont un effet virostatique (et pas
virucide)
Ils agissent sur des virus en cours de réplication
Ils n’ont pas d’action sur les virus en phase de latence
Ils agissent sur quelques virus: virus des hépatites,
VIH, herpesvirus
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l’origine de l’émergence de mutants résistants
virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 33
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La réplication virale
virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 35
BCG: Bacille de Calmette et Guerrin (vaccin contre la tuberculose), HBV: vaccin contre le
Virus de l’hépatite B, DTC: vaccin contre la Diphtérie, Tétanos et Coqueluche, PO: vaccin contre
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3cours les méthodes de diagnostic des pathologies virales

  • 1. virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 1
  • 2. Objectifs Pourquoi faire le diagnostic virologique ? Quels sont les méthodes de diagnostic? Quels sont les traitements?
  • 3. POURQUOI FAIRE LE DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE?
  • 4. virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 4 - Dépistage des virus: don de sang, d’organes et de tissus - Suivi biologique des infections: VIH, VHB, VHC - Prise de mesures prophylactiques et contrôle des épidémies ex. grippe, Rotavirus et VRS en pédiatrie - Faire des études épidémiologiques (prévalence, réservoir du virus, transmission) - Prouver l’origine virale d’une infection - Prise de décisions thérapeutiques (développer des antiviraux)
  • 5. QUELLES SONT LES MÉTHODES DE DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE ?
  • 6. virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 6
  • 7. virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 7 Choix du prélèvement: selon la clinique Recherche d’une porte d’entrée, sites de multiplication ou d’excrétion des virus Le prélèvement doit être réalisé le plus tôt possible après le début des signes cliniques (multiplication du virus pendant la phase d’incubation) Acheminement du prélèvement au laboratoire dans un milieu de transport, le plus rapidement possible Transmission des renseignements cliniques avec le prélèvement
  • 8. virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 8 Diagnostic de Primo-infection Apparition des anticorps entre 2 sérums d’un patient 1 sérum précoce (négatif) et 1 sérum tardif (positif) Définir le statut immunitaire vis-à-vis d’un virus 1 seul sérum Savoir si un patient à déjà rencontré un virus précis (Ac positif) ou non (Ac négatif)
  • 9. virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 9
  • 10. virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 10
  • 11.
  • 12. virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 12 Culture de virus : technique de référence Virus ne peut se multiplier que dans des cellules vivantes -Animal: culture du Coxsakievirus A -Œuf de poule embryonné: virus de la grippe - cellules en culture in vitro Transport rapide du prélèvement au laboratoire, dans un milieu de transport, pour conserver le pouvoir infectieux du virus
  • 13. Lignées primaires: lignée directement issue Sang, biopsie de peau ou d’organe Inconvénients: Matériel en faible quantité Mélange de différents types cellulaires Ces cellules ne peuvent être maintenues en culture que pendant quelques générations. Avantage: proche de la réalité
  • 14. Les cellules "immortalisées" Lymphocytes B et Fibroblastes: infection par EBV et Virus SV40, respectivement. Fibroblaste primaire : 10-12 générations Fibroblaste humain immortalisé : 30-40 générations Inconvénients: Seuls deux types cellulaires sont disponibles sous cette forme On introduit des gènes à effet prolifératif et anti- apoptotique, modifiant donc ces activités cellulaires
  • 15. Les cellules tumorales Disponibles: cancers de tous les types cellulaires Division rapide, conservation des cultures pendant très longtemps Inconvénients: mutations
  • 16. virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 16
  • 17. virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 17 Milieu de culture  eau  ions minéraux , pH autour de 7,2%  source de carbone et d’énergie (glucose, pyruvate par exemple)  de facteurs de croissance: -Les acides aminés essentiels - les vitamines - des acides gras comme l’acide arachidonique  des gaz: -Le dioxygène les cellules étant aérobies - Le dioxyde de carbone 5%, 37°C
  • 18. virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 18 Cellules dissociées déposées sur une surface solide
  • 19. Les cellules en culture sont : Hors interaction avec les autres types cellulaires Dans un milieu dont les facteurs de croissance ne sont pas forcément les bons Hors de leur contexte matriciel En monocouche au lieu d’un contexte 3D
  • 20. virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 20 Détection d’un ECP (effet cytopathique) au microscope Temps d’apparition de l’ECP: -24h pour un EBV (Epstein Barr virus) - 2-3 jours pour un HSV -4-5 jours pour un VZV -10-15 jours pour un CMV Détection précoce par des anticorps monoclonaux à 24-48h de culture Par ELISA Par IF
  • 21. virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 21 - Monocouche de cellules humaines sensibles (détection d’un effet cytotoxique. Ex. Herpes -Tapis bactériens (plages de lyse causées par les virus bactériophages) -Tissus ex vivo (ex. morceaux d’amygdales contenant des lymphocytes pour étude du VIH - œufs embryonnés pour culture du virus influenzae
  • 22. virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 22 Autres méthodes PCR PCR: Polymerase Chain Reaction
  • 23. virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 23
  • 24. virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 24 Diagnostic direct: détection du génome
  • 25. virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 25 PCR quantitative: détection du génome Charge virale nb de copies de génome viral par ml de plasma
  • 26. QUELLES SONT LES PRINCIPALES APPLICATIONS DU DIAGNOSTIC VIROLOGIQUE ?
  • 27. virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 27 - HSV dans LCR (liquide cépalorachidien): Méningo-encéphalite (urgence) - CMV: PCR quantitative en cas de dons d’organes (greffés de rein) - VIH: PCR qualitative: dépistage du VIH chez le nouveau-né - PCR quantitative: quantifier la charge virale pour le suivi thérapeutique - VHC: Sérologie + PCR
  • 28. virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 28 Structure détectée Méthode Applications Virus complet Culture virale HSV, VZV, Entérovirus, adénovirus Protéines virales (antigènes) Diagnostic « direct » Rotavirus, adénovirus, VRS, virus de la grippe, HSV, CMV, VZV Acides nucléiques viraux Biologie moléculaire HIV, HCV, HBV, V. respiratoires V. opportunistes, V. neurotropes HSV: Herpes s Smplex virus, VZV: virus de la Varicelle et du Zona, VRS: Virus respiratoire Syncitiale, CMV: Cytomegalovirus,
  • 29. virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 29
  • 30. Chaque année, 90% au moins de la population souffre d'une maladie virale Au moins 60% des maladies infectieuses sont imputables aux virus Le nombre d'agents antiviraux est relativement peu élevé Les antibiotiques sont inefficaces contre les virus Les récents produits ciblent l’infection à VIH Ils visent toutes les phases du cycle viral
  • 31. -Utiliser des doses optimales oAssocier plusieurs antiviraux (ex. VIH), pour augmenter l’efficacité du traitement, diminuer la toxicité des médicaments et prévenir l’émergence de mutants résistants - Mettre en route le traitement le plus rapidement possible
  • 32. virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 32 Les antiviraux doivent bloquer la réplication du virus sans atteindre le Métabolisme cellulaire Les antiviraux ont un effet virostatique (et pas virucide) Ils agissent sur des virus en cours de réplication Ils n’ont pas d’action sur les virus en phase de latence Ils agissent sur quelques virus: virus des hépatites, VIH, herpesvirus La variabilité génétique des virus est un problème à l’origine de l’émergence de mutants résistants
  • 33. virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 33 Virus: cibles des antiviraux aux différentes étapes de La réplication virale
  • 34.
  • 35. virus généralités: Pr. Latifa Berrezouga 35
  • 36. BCG: Bacille de Calmette et Guerrin (vaccin contre la tuberculose), HBV: vaccin contre le Virus de l’hépatite B, DTC: vaccin contre la Diphtérie, Tétanos et Coqueluche, PO: vaccin contre la poliomyélite
  • 37. QU’EST-CE QUE VOUS CONSIDÉREZ COMME CONNAISSANCE GÉNÉRALE ?