Le document présente la méthode de coloration de Gram, développée en 1884, qui permet de distinguer les bactéries à Gram positif (violettes) des bactéries à Gram négatif (roses) en fonction de la composition de leur paroi cellulaire. Le protocole décrit les étapes de réalisation d'un frottis, de la coloration, et de l'observation au microscope. Les résultats peuvent varier en fonction de l'âge des cultures bactériennes.

1. COLORATION DE GRAM &
OBSERVATION AU
MICROSCOPE
Boughammoura Aïda

2. COLORATION DE GRAM
1. REALISATION D'UN FROTTIS
2. COLORATION DE GRAM
3. OBSERVATION AU MICROSCOPE

3. REALISATION D'UN FROTTIS
- nettoyer une lame de verre à l'éthanol / acétone
- déposer sur une lame propre une goutte de suspension
bactérienne
- réaliser le frottis à partir du centre de la lame en
décrivant un mouvement circulaire
- sécher le frottis en passant la lame à la flamme du bec
bunsen (2 à 3 fois)
- fixer la préparation en flambant la lame avec l'éthanol /
acétone
- sécher la lame à la flamme

4. COLORATION DE GRAM
- Coloration développée en 1884 par un médecin danois
Christian Gram
- méthode de coloration la plus largement utilisée en
bactériologie
- mise en évidence de différences de nature de la paroi
bactérienne (bactéries à Gram négatif ont un peptidoglycane
plus fin que celles à Gram positif)
- se déroule en 3 temps :
1. coloration au violet de gentiane et fixation de la coloration
par le lugol
2. traitement à l'éthanol (dissolvant le violet de gentiane
décolorant les bactéries à Gram négatif)
3. contre-coloration à la fushine ou safranine (colorant en rose
les bactéries précédemment décolorées)

5. COMPOSITION DE LA PAROI BACTERIENNE
Gram + Gram-
Peptidoglycane épais Peptidoglycane fin
90% de la paroi 10% de la paroi
L'éthanol traverse uniquement la paroi des bactéries à Gram
négatif (dissolution des lipides de la membrane externe) et
décolore le cytoplasme !

6. COLORATION DE GRAM :
PROTOCOLE
- verser quelques gouttes de violet de gentiane sur le
frottis
- attendre 1 minute
- éliminer l'excès de violet de gentiane puis avec un peu
d'eau sans insister
- plonger la lame 1 minute dans le lugol
- rincer abondamment à l'eau
- rincer à l'éthanol / acétone des 2 côtés de la lame
- rincer abondamment à l'eau
- plonger la lame 1 minute dans la fushnine ou safranine
- rincer abondamment à l'eau
- sécher la lame à la flamme

7. COLORATION DE GRAM :
RESULTATS
- les bactéries à Gram positif apparaissent violettes
- les bactéries à Gram négatif apparaissent roses
- les vieilles cultures bactériennes peuvent donner des
résultats de Gram variables en raison de la dégradation de
la paroi cellulaire

8. OBSERVATION AU MICROSCOPE
- grossissement x100 à immersion dans l'huile de paraffine
- ouverture maximale du diaphragme