La métabolomique est l'analyse des petites molécules et des voies métaboliques au sein des cellules et des organismes, utilisant des techniques comme la chromatographie et la spectrométrie de masse. Les applications incluent le profilage métabolique en réponse à des pathologies, ainsi que l'imagerie in situ pour identifier des molécules dans des tissus. Le développement de bases de données et l'optimisation des méthodes d'analyse, telles que le MALDI imaging, sont essentiels pour améliorer la sensibilité et la précision dans le domaine.

1. Métabolomique : Concept et perspectives
Dimitri Heintz
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2. Activité
• Plateforme Métabolomique
• Petites molécules bioactives
• Chromatographie
• Spectrométrie de masse
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3. Plan
• Définitions
• Les outils de la métabolomique
• L’identification des métabolites et Le problème des banques
de données
• Applications
• L’imagerie métabolique par spectrométrie de masse
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4. Définitions
• Métabolome: ensemble des constituants de faible masse
moléculaires d’une cellule ou d’un organisme.
Apparu à la fin des années 1990
• Métabolomique: analyse de l’ensemble des constituants de
faible masse moléculaires d’une cellule ou d’un organisme.
• Fluxomique: analyse de l’ensemble des flux métaboliques au
sein d’une cellule ou d’un organisme
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5. Définition de la métabolomique
•
La métabolomique: l’analyse de l’ensemble des molécules de petite masse moléculaire
(une limite arbitraire est fixée à 1000 ou 3 000 uma) d’un système biologique.
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6. Les différentes approches métabolomiques
On peut distinguer deux grands niveaux d’analyses
complémentaires :
• Les analyses dites ciblées
• Les analyses dites globales
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7. Le profilage métabolique
Il s’agit ici d’analyser tous les composés appartenant à une voie métabolique
ou à une famille chimique donnée.
Ce type d’approche a pour but une meilleure compréhension de la fonction
ou de la régulation d’une voie métabolique et/ou de ses liens avec les
autres voies métaboliques.
Elle cherche ainsi à comparer des profils ou des empreintes de métabolites
qui sont modifiés en réponse à une pathologie ou à une exposition à un
toxique, mais l’identification et la quantification absolue des métabolites
modifiés ne sont pas recherchées
cherche à donner une signification biologique aux variations observées.
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8. L’analyse ciblée
Elle a pour objet de mesurer quantitativement et spécifiquement un ou un
nombre réduit de Métabolite
Les analyses effectuées dans ce cadre sont quantitatives, précises et sensibles
et s’apparentent à des dosages en milieu biologique classique.
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9. Les étapes majeures
Préparation des échantillons
• Extraction protocol
• Derivatizations
l’analyse des échantillons
• Suitable analytical methods, LOD
• Reproducible analytical protocol,
• Data collections and storage
Analyse des données
• Data deconvolution software
• Software development
• Bioinformatique
• Identification of up/down regulated compounds
• Major bottleneck
• Databases, for new compounds “de novo”
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10. The cycle of the metabolomics workflow.
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11. Métabolites et métabolome
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12. Métabolomique en clinique
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13. Métabolomique clinique
• > 95 % des essais cliniques, diagnostic, sont des petites molécules
• 89% des médicaments sont des petites molécules
• 50% des médicaments sont des dérivés de métabolites
• 30% des maladies sont des maladies du métabolisme
• Métabolites sont des entités fonctionnelles, des cofacteurs et jouent des
rôles dans la signalisation de > 1000 protéines chez l’homme
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14. Les outils de la métabolomique
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15. Acquisition des empreintes métaboliques
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16. Déroulement d’une analyse métabolomique
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17. Le problème en métabolomique c’est l’absence de banques
données de petites moléculues
Gène ID, abondance
des transcrits
Protéine ID,
concentration
Métabolite ID,
concentration
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18. Principales bases de données métabolomique
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19. The human Metabolome project
• http://www.hmdb.ca/
• Genome Canada Project lancé en janvier 2005 7.5 Millions de $
• Objectifs: recenser et quantifier les différents métabolites des tissus et
biofuides
• (urine, plasma, LCR)
• Déterminer Les empreintes métaboliques pour: chaque
patient/maladie/sexe/age/
• Développement d’outils et de technologies et de protocoles for l’analyse
quantitative en métabolomique
• Création d’une banque de métabolites
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20. 03/09/2013
20

21. 7000
03/09/2013
21

22. Human metabolome
41519 métabolites en septembre 2013
3100
1600
28000
1800
7000
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23. Plusieurs variables & plusieurs métabolites
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24. Pourquoi une base de données
En spectrométrie de masse l’ionisation est variable d’un
instrument à un autre donc pas possible d’avoir une seule
banque unique
Exception: la GC-MS
mais pas très sensible /à la LC-MS/MS
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25. 03/09/2013
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26. 03/09/2013
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27. Plan
• Définition: imagerie in situ par spectrométrie de masse
• Principe
• Préparation de l’échantillon, la coupe histologique (étape clés)
• Applications:
– Surface de tissus animaux / humain
– Surface de tissus végétaux
– Autres surfaces (biologique ou non, boues, plastique…)
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28. Les Métabolomes
Chaque type cellulaire a son Métabolome
Histologie de l'appareil respiratoire: portion de poumon
Bronches (BR), artère pulmonaire (A), bronciole (br)
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29. La Problématique de la Métabolomique sur les tissus
Histologie de l'appareil respiratoire
Métabolome B
Métabolome A
Métabolomes C
Métabolome D, E…
Metabolomique « classique »
Extraction/ broyage/biopsie…
Plusieurs Métabolomes sont mélangés
Difficile de trouver un marquer spécifique dans ces conditions
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30. L’imagerie in situ par spectrométrie de masse
• Technologie émergente
• possibilité d’identifier des molécules sur des échantillons solides
• Permet d’analyser directement des molécules à la surface des tissus sans
marquage
• Les molécules:
 Métabolites
 Médicaments
 Protéines
 Peptides
 Lipides
 tRNA
 RNAs
• Permet de déterminer la distribution spatiale et temporelle de molécules
dans des tissus
• Résolution spatiale max (5µm )
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31. Imagerie in situ par spectrométrie de masse
Nombre de publications /an
120
100
80
Plantes
60
40
humain
20
Souris/rat
0
2000
2000
2005
2010
2012
Article pionnier: Caprioli RM et al Anal. Chem (1997)
Ancêtre: Hillenkamp F el al Appl. Phys. A: Mater. Sci. Process (1975)
Stoeckli, M., Chaurand, P., Hallahan, D. E., and Caprioli, R. M. (2001) Imaging mass spectrometry: a new technology for the
analysis of protein expression in mammalian tissues. Nat. Med. 7, 493–496
Chaurand, P., Schwartz, S. A., and Caprioli, R. M. (2002) Imaging mass spectrometry: a new tool to investigate the spatial
organization of peptides and proteins in mammalian tissue sections. Curr. Opin. Chem. Biol.6, 676–681
Fournier, I., Day, R., and Salzet, M. (2003) Direct analysis of neuropeptides by in situ MALDI-TOF mass spectrometry in the rat
brain. Neuro Endocrinol.Lett. 24, 9–14
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32. imagerie in situ par spectrométrie de masse
•
Identification-spatiotemporelle de molécules dans des tissus biologiques
Image moléculaire
•
•
•
•
•
•
Identification de plusieurs molécules dans une même analyse
Identification de molécules dans un organisme entier ou dans un organe
Couplage possible avec la microscopie classique
Compatible avec les techniques histologiques (oui en Protéomique)
Compatible avec les méthodes Protéomiques & Métabolomiques
Obtention d’images moléculaires > 100 Mbytes / Gbytes/échantillon
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33. Il existe différentes méthodologies
d’imagerie in situ par spectrométrie de masse
•
–
–
–
MALDI (Matrix Assisted Laser Desorption Ionization)
SIMS (secondary ion mass spectrometry)
DESI (Desorption electrospray Ionization)
Mobilité ionique (à suivre)
1
2
3
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34. MALDI: technique d’ionisation très sensible
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35. Sensibilité de l’imagerie par spectrométrie de masse
IM-FTICR
MALDI Imaging
IM-MS/MS ?
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36. Préparation de l’échantillon(étape clés)
• la coupe histologique
• Le dépôt de la matrice
Les molécules s’ionisent
1
preparation
4
Congélation / inclusion…
2
3
Air brush pistol
MALDI matrix preparation
(SA, DHB or HCCA)
Cryo-microtome
Cryosections (8-12µm)
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Matrix coated section (8-12µm)
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37. L’ionisation en MALDI Imaging
• Il y aura transformation des molécules en ions
• on va mesurer la masse exacte des ions pour identifier finement les molécules
• Le choix de la matrice est un point clés
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38. Préparation de l’échantillon(étape clés)
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39. Comment obtenir une image moléculaire par MALDI imaging?
Image moléculaire
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40. Comment obtenir une image moléculaire
• Préparation d‘une coupe d‘un tissus recouvert de matrice déposée
sur une plaque MALDI
• On tire sur la coupe avec un lazer UV (source MALDI)
• On obtient des spectres MALDI MS ou MS/MS
• Conversion des spectres en pixels
200 µm pixels
2500
5000
7500
10000
12500
SJBM 1412 201315000
17500
20000
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41. SJBM 1412 2013
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42. On peut identifier différentes molécules dans différentes régions du cerveau
optical image
4963 Da
4938 Da
5433 Da
5764 Da
6230 Da
6551 Da
6713 Da
7542 Da
7843 Da
14092 Da
18358 Da
Image resolution 80µm
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43. On peut analyser simultanément plusieurs molécules ou alors faire une
recherche à l’aveugle (profiling)
optical image
18385 Da 6230 Da 7843 Da
4938 Da 6651 Da 6713 Da
4963 Da 5764 Da 10607 Da
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44. Imagerie MALDI: Etudes pharmacocinétiques
Etude de la distribution spatiale et temporelle d’un médicament dans le rein d’un rat
à 30 min et à 2h
m/z = 313.1485
T = 30 min
T= 2h
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45. Plusieurs molécules sont co-localisées dans une zone particulière:
distribution région – spécifique des molécules
1mm
m/z = 5470 Da
m/z = 6177 Da
m/z = 18746 Da
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46. Importance de la resolution en métabolomique
Il faut pouvoir identifier un métabolite avec la plus grande précision
(0.0112 Da différence)
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47. Projet collaboratif autour du
développement du MALDI imaging
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48. Préparation de l’échantillon
•
•
•
•
Besoin de l’expertise en histologie
Faire une coupe d’un tissu n’est pas toujours facile
Microtome/cryomicrotome, fixations, inclusions….
Les constructeurs et les plateformes n’ont souvent pas cette expertise
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49. Les matrices
•
•
•
•
En métabolomique le problème est que la matrice est un métabolite
En métabolomique il n’y a pas de matrice universelle
Choix de la matrice est fonction de la molécule à analyser
Développement majeure des prochaines années
– Lavage des tissus (enlever les sels)
– délipidation (baisser la suppression d’ions)
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50. Etude pharmacocinétique par MALDI Imaging
Distribution spatio-temporelle d’un médicament chez la souris
Famotidine
médicament utilisé dans le traitement des ulcères (estomac ou du duodénum). Il réduit
la production d’acide et de pepsine ainsi que le volume de la sécrétion gastrique
Administration de Famotidine à une souris
3 minutes
La sourie est sacrifiée
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51. Etude pharmacocinétique par MALDI Imaging
Distribution spatio-temporelle par MALDI Imaging de la Famotidine
Questions:
- ou se trouve la Famotidine , dans quel(s) tissus au bout de 3 minutes ?
- à quelle concentration ?
- quels sont les produits du catabolisme de la Famotidine (conjugués…) ?
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52. Distribution spatio-temporelle par MALDI Imaging de la Famotidine chez la
souris
Famotidine
MW= 337.449 g/mol
Les molécules s’ionisent
[ M+H+]
La coupe est recouverte de
matrice DHB
Résolution spatiale
basse: 200µm
Accumulation de la Famotidine dans les reins
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53. Distribution spatio-temporelle par MALDI Imaging de la Famotidine chez la
souris
Accumulation de produits du catabolisme de la Famotidine dans les reins
[ M+H+]
+/Na
338.05> 259.06
Famotidine
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+/OH
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54. Identification de bio-marqueurs du cancer du foie
Modèle: souris/ xénogreffe de cellules / cancer colorectal humain
Injection par la veine porte de cellules
HCT116
(GFP-tagged human colon cancer cells)
2 semaines
Propagation du
cancer dans le foie
Souris âgée de
13 semaines
Animal est sacrifié 2 semaines après
injection
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55. Identification de bio-marqueurs du cancer du foie
Identification des zones cancéreuses par microscopie à fluorescence ou par
microscope optique
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56. Identification de bio-marqueurs du cancer du foie par MALDI Imaging
Dosage du gluthation dans le foie (GSH)
10µm
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Échantillon: foie de souris
Résolution spatiale: 10µm
Matrice: 9-AA(aminoacridine)
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57. Dosage du glutation dans le foie (GSH) par MALDI Imaging
Augmentation de GSH dans
les tissus cancéreux
P: parenchyme
M:Metastase
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58. Conclusion
La métabolomique par spectrométrie de masse et imagerie in situ
•
•
•
•
•
•
Technologie émergente
possibilité d’identifier des molécules directement sur des échantillons solides
Sans marquage
Résolution tissulaire (5µm)
MALDI Imaging est la technique la plus avancée
Sensibilité par encore très élevée
 Combinaison de différentes expertises
• spectrométrie de masse
• Métabolomique
• Imagerie & microscopie
• Histologie
• Bioinformatique
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59. Conclusion sur l’imagerie in situ par spectrométrie de masse
• l’acquisition des données & le traitement des données
facteur limitant reste le temps d’analyse
lui-même est tributaire de:
- la fréquence de répétition des tirs
- la rapidité de déplacement de la cible
- temps d’acquisition de l’éléctronique
Ex: à 1Hz l’acquisition durera une journée
à 100Hz l’acquisition durera quelques heures
+ la durée d’analyse est importante: + l’échantillon sera dégradé + il y aura
évaporation de la matrice sous vide
• La seule technique qui permet d’identifier finement plusieurs molécules
sans marquage sur des tissus
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60. Merci
dimitri.heintz@ibmp-cnrs.unistra.fr
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