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Bactériologie médicale
 Les bactéries sont répandues dans l’environnement: terre, eau des
rivières, de boisson, mer, milieux extrêmes.
 L’homme est colonisé par environ 1014 bactéries alors que le
nombre de cellules du corps n’est que de 1013
 La bactériologie médicale n’intéresse qu’un petit nombre
de ces bactéries (quelques centaines)



 celles qui sont les agents de maladies
infectieuses
Catherine Branger, MCU-PH
Service de Microbiologie, Hôpital Louis Mourier, Colombes, catherine.branger@lmr.aphp.fr
Faculté de Médecine site Bichat, Paris 7
Structure de la bactérie
et éléments utiles à l’identification 
 Capsule : polysaccharides
- Empêche la phagocytose
- Peut être à l’état soluble dans les
liquides de l’organisme
élément facultatif
 Paroi : enveloppe rigide responsable de
la forme des cellules
- Assure la protection
- Rôle dans l’antigénicité
 Membrane cytoplasmique:
- Perméases : rôle dans les échanges
- Enzymes respiratoires
- Rôle métabolique majeur
 Cytoplasme
 Appareil nucléaire (chromosome et
plasmides)_
 Ribosomes (ARN et protéines)
 Pili sexuel: rôle dans la conjugaison
 fimbriae: impliqués dans les
phénomènes d’adhésion
 Flagelles: assurent la mobilité,
- antigéniques
- éléments facultatifs
Phénomène de sporulation
Spore :
- forme de survie de certaines bactéries
(Clostridium, Bacillus) dans des
conditions extérieures défavorables
- Résistent à une pénurie de nourriture,
élévation de pH, t°, dessiccation,
désinfectants, etc.
- Reprise de la forme végétative en
milieux favorable
 Utile à l’identification bactérienne
Physiologie – croissance
 La bactérie se multiplie par fission binaire et donne deux cellules filles
identiques
 Temps de division varie de 20 min à plusieurs jours
ex: Escherichia coli: 20 mn, Mycobactéries 20h
Sur milieu gélosé, par divisions
successives, après 20 générations (soit
106 bactéries), les bactéries donnent
naissance à une population formant une
colonie, c’est-à-dire un amas visible à
l’œil nu
Mode de croissance: exponentiel
1- phase de latence : temps nécessaire à
la bactérie pour synthétiser les enzymes
adaptées au substrat
2 - phase exponentielle : les bactéries
se reproduisent
3 - phase stationnaire : taux de
croissance nul. Les bactéries qui se
multiplient compensent celles qui
meurent
4 - phase de déclin : accumulation
métabolites toxiques, lyse cellulaire
Besoins nutritifs
 Éléments nécessaires à la croissance :
- Éléments qui constituent leur structure cellulaire: carbone, H, O, azote et
besoin en soufre
- besoins inorganiques : phosphore
- autres éléments : sodium, potassium, calcium, etc.
 Les bactéries se nourrissent de matières organiques:
sucres, amidon, cellulose, protéines, matières grasses etc.
 Les bactéries fabriquent des enzymes qui permettent la dégradation des
macromolécules et leur transformation en molécules plus simples
 connaissance de l’activité
enzymatique utilisée pour
l’identification
Conditions de croissance (1)_
 Effet de l’oxygène: très important pour l’isolement des bactéries en pathologie
infectieuse
- bactéries aérobies: ne se développent qu’en présence d’O2, pression partielle
voisine de ppO2 de l’air (1)
- bactéries micro-aérophiles: se développent mieux ou exclusivement lorsque
la ppO2 est inférieure à celle de l’air (2)
- bactéries anaérobies: l’oxygène leur est toxique. Elles se développe en milieu
très réducteur (ex: tube digestif de l’homme et des animaux) (3)
- bactéries aéro-anaérobies : se développent en présence ou absence d’oxygène
(4)
2 4
2
1
3
4
3
2
Conditions de croissance (2)_



 Effet de la température
Classées selon leur température optimale de croissance :
- mésophiles : température proche de celle du corps humain (37°C)
(ex. : E. coli)_
- thermophile : entre 45°C et 70°C
- hyperthermophiles :  80°C
- psychrophiles : proche de 0°C
- psychrotrophes : proche de 0°C avec optimum de croissance proche
des bactéries mésophiles (ex. : Pseudomonas)_



 Effet du pH
- bactéries neutrophiles : se développent pour les pH compris entre 5,5
et 8,5, optimum voisin de 7
 la plupart des bactéries d’intérêt médical
- bactéries alcalophiles : préfèrent les pH alcalins, cas de Pseudomonas
et Vibrio
Bactéries saprophytes
Bactéries de l’environnement qui se retrouve comme flore de
passage sur la peau et les muqueuses.
 bactéries des végétaux comestibles, terre, eau.
 Présence transitoire sans danger.
 Bactéries commensales: Flore résidente du corps humain
- protège la peau et les muqueuses
- Effet de barrière vis-à-vis des bactéries pathogènes
- Différentes selon la niche écologique
 l’homme est bénéficiaire
 flore intestinale: importante
- flore dominante: anaérobies 109 à 1011 bac/g de selles
- flore sous dominante: entérobactéries (surtout E. coli) et autres
(entérocoques) 102 à 106 bac/g
 flore oro-naso-pharyngèe: abondante, variées, flore polymorphe
anaérobie et aérobie



 flore vaginale: en majorité lactobacilles qui gardent un pH acide bas
défavorable aux autres bactéries



 flore cutanée: composée surtout de staphylocoques commensaux,
empêche aussi l’implantation de bactéries pathogènes
 Bactéries pathogènes strictes







 Facteur de pathogénicité lié à la bactérie:
- Provoque une infection identifiée et
physiopathologiquement spécifique
- Peut se développer chez l’homme sain



 Exemples:
- Mycobacterium tuberculosis : tuberculose
- Yersinia pestis : peste
- Bacillus anthracis : anthrax
- Salmonella typhi : typhoïde
 Pathogènes opportunistes







 Provoque une infection quand il y a :
- défaillance de l’hôte
- un terrain favorable
- une déficience des défenses antibactériennes.



 Exemples:
- effraction de la peau: abcès, furoncle
- infection virale qui provoque la lyse des cellules des voies
respiratoires supérieures et favorise le passage des bactéries:
surinfections bronchiques (pneumocoque)_
- défaut d’épuration des bactéries du méat urinaire: cystites
à E. coli (hôte commensale du tube digestif)_
Bactériologie médicale s’intéresse aux:
- pathogènes stricts
- pathogènes opportunistes
Ensemble de moyens permettant de mettre en évidence
l’agent infectieux
 Diagnostic direct : mise en évidence de la bactérie elle-même
 Diagnostic indirect : mise en évidence de la réponse de
l’organisme vis-à-vis de l’agent infectieux par la présence
d’anticorps spécifiques
Diagnostic d’une infection bactérienne
 Moyens diagnostiques :
- visualiser par examen microscopique
- isoler sur des milieux de culture
- identifier l’agent pathogène
La procédure peut être insuffisante :
- agent a disparu à la suite d’un traitement antibiotique
- bactérie non cultivable ou de culture lente ou nécessitant
des milieux spéciaux
 Autres moyens :
- recherche d’antigènes solubles (ex: polysaccharides de la capsule)
- méthodes moléculaires: PCR, sonde d’hybridation, séquençage
Diagnostic direct
Le résultat des examens bactériologiques dépend des conditions de
prélèvements.
 Faire le prélèvement au moment opportun en fonction du contexte
clinique :
- précocement
- avant toute antibiothérapie
 Transport rapide :
- certaines bactéries ne résistent pas au froid, à la dessiccation, à la
présence d’oxygène
- Si les prélèvements sont contaminés par une flore commensale, les
bactéries peuvent se multiplier et fausser l’interprétation du résultat
(ex: urines pour le diagnostic d’infection urinaire)._
 Utiliser du matériel stérile à usage unique et respecter les règles
d’asepsie élémentaires lors des prélèvements.
Prélèvements (1)
Prélèvements (2)_
 Sites de prélèvements
Ils varient selon le siège de l’infection et le germe
- Méningite : ponction lombaire (LCR), sang (hémoculture)_
- Diarrhée : selles (coproculture)_
- Infection urinaire : urines (uriculture)_
- Fièvre au long court : sang (hémoculture)_
- Pneumonie : expectoration, prélèvements bronchiques, sang
- Plaie chirurgicale : pus
1) Examen macroscopique



 Décrit le prélèvement
Toute infection bactérienne s’accompagne
de signes biologiques liés à
l’inflammation avec la présence
éventuelle de leucocytes, notamment de
polynucléaires.
Ces éléments peuvent entraîner une
modification visuelle du prélèvement.
selles
claires
troubles
J0
2) Examen microscopique
 Recherche d’éléments cellulaires de type
polynucléaires :
évaluation de la réaction inflammatoire qui
peut signer une infection bactérienne.
J0
 Recherche visuelle de bactéries.
2a – Numération quantitative des cellules (leucocytes et
hématies)
exprimée en nombre d’éléments/mm3
- pour les liquides de ponction ( L.C.R., ascite, pleurale,
articulaire)
- urines
nécessaire à l’interprétation diagnostique
Etat frais polynucléaires
Ex: urines
Nombre de leucocytes  104 /ml (ou 10/mm3)_
pas de réaction inflammatoire, leucocyturie physiologique
 pas de suspicion d’infection
 Ex: liquide céphalo-rachidien
A l'état normal, le LCR est limpide, eau de roche 
 hématies :  1/mm3
 éléments nucléés : enfant et l'adulte  5/mm3
: nouveau-né  30/mm3
2b - Examen microscopique après coloration
Coloration à partir d’un étalement (frottis) sur lame de verre :
- visualisation et différenciation morphologique des
éléments nucléaires (MGG)
- visualisation et différenciation morphologique des
bactéries après coloration de Gram
 Coloration de May-Grunewald-Giemsa (MGG)_
Coloration principalement à visée cytologique pour individualiser les
polynucléaires, les lymphocytes, les macrophages…
- Sert à évaluer la réaction inflammatoire pour tout liquide de
ponction (L.C.R., ascite, pleurale, articulaire…)
- Les bactéries peuvent aussi être observées ou spécialement
recherchées
Pneumocoque dans LCR,
méningite
Borellia burgdorferi, frottis sanguin
Prélèvement: liquide cephalo-rachidien
Exemple 1
Examen direct :
- numération (cellule de Malassez) : 1000 leucocytes
- frottis coloré par MGG : 90% de polynucléaires neutrophiles
10% de lymphocytes
Conclusion : réaction purulente à polynucléaires, orientation en faveur d’une
méningite bactérienne
Exemple 2
Examen direct :
- numération à la cellule de Malassez : 400 leucocytes
- frottis coloré par le MGG : 30% de polynucléaires neutrophiles
70% de lymphocytes
Conclusion : réaction lymphocytaire, orientation en faveur d’une méningite
virale
Porines
Lipoprotéines
hydrophobes
Membrane
externe
Membrane
cytoplasmique
Espace
périplasmique
GRAM négatif
peptidoglycane
GRAM positif
Capsule
polysaccharidique
Coloration différentielle dépend de
la structure de la paroi et est basée
sur la perméabilité de la paroi des
bactéries à l’alcool
Coloration de Gram : permet de
distinguer 2 grands groupes de
bactéries :
G Paroi perméable à l’alcool
- bactéries dites à Gram –
(roses) qui ne retiennent pas le
colorant
G Paroi imperméable à l’alcool
- bactéries dites à Gram +
(violettes) qui retiennent le
colorant
Coloration de Gram
Coloration de Gram (1
(1)
)
 Coloration de Gram
La coloration de Gram ne permet pas une identification mais une
orientation
- présence ou absence de bactéries
- forme : cocci, bacilles, coccobacilles, fusiformes, incurvée,
etc…
- groupement : amas (Staphylocoques), chaînettes (Streptocoques),
diplocoques (Pneumocoques, Neisseria)
- coloration : Gram + ou Gram -
 Coloration de Gram: première réponse diagnostique en moins de
1 heure qui_ oriente l’identification et l’antibiothérapie probabiliste
Bacteriodes, Fusobacterium
Bacilles
Veillonella
Coques
Gram -
Clostridium (tetani, perfringens
etc…)_
Bacilles
Peptostreptococcus
Coques
Gram +
Bactéries
anaérobies
Entérobactéries (E. Coli,
Salmonella, etc…),
Pseudomonas, Vibrio,
Campylobacter, Brucella
Bacilles
Neisseria (méningocoque)_
Coques
Gram -
Corynebacterium, Listeria,
Bacillus
Bacilles
Staphylocoques, Streptocoques,
Entérocoques
Coques
Gram +
Bactéries
aérobies
Examens directs
Fusobacterium, pus
Pneumocoque, capsule, crachat
E. coli et polynucléaires, urines Méningite à pneumocoque
Bacteries intra
polynucleaire
Staphylococcus , abcès cutané Streptococcus, hémoculture
Gonocoque, pus uretral Vibrio cholerae
Campylobacter, selles
 Autres colorations (1)_
Coloration spécifique des Mycobactéries : Zielh Neelsen
- paroi des mycobactéries : riche en lipides, difficilement colorable par
les colorants usuels
- paroi colorable par la fushine qui retient le colorant malgré une
action combinée d’acide et d’alcool
Ë d’où le nom de « Bacille Acido-Alcoolo-Résistant : BAAR
- ne permet pas de préciser si mycobactérie de la tuberculose ou
mycobactérie atypique
 Autres colorations (2)
Fluorescence :
- coloration des Mycobactéries à l ’auramine
- coloration par des anticorps marqués par un conjugué fluorescent
 Bactéries difficilement colorables par le Gram ou d’autres
colorations : (Legionella, Coxiella burneti, Chlamydia)_
Mycobactéries colorées
à l’auramine
Legionella pneumophila
tréponéme
Aline BRA
No dossier: 084140125
ECBU Milieu de jet
Aspect des urines: Trouble
Cellules epithéliales Rares
Hématies 103/ml
Leucocytes 105 /ml
Cylindres urinaires Absence
Cristaux urinaires Absence
Examen direct après coloration de Gram:
Rares bacilles à Gram négatif
J0 Exemple de résultat
3) Mise en culture
3a - milieux_ de culture
Produits pathologiques ensemencés sur milieux qui doivent satisfaire les
besoins énergétiques et nutritifs des bactéries
 Milieux solides : milieux gélosés le plus souvent
- simples
- enrichis (sang, vitamines etc…) pour bactéries exigeantes :
méningocoque, streptocoque
- sélectifs (antiseptique, antibiotique, pH acide ou alcalin) pour
isoler des bactéries pathogènes au sein d’une flore bactérienne
polymorphe.
Milieux sélectifs
S. aureus entérobactéries
J0
 Milieux liquides :
Exemple : culture du sang
hémoculture
3b - Culture: ensemencement
 Ensemencement en stries en quadrants
cas des pus:
pour isoler les bactéries les unes des autres
(ensemencement par épuisement)
Les bactéries se multiplient et donnent en 18
heures à 5 jours ou plus (3 semaines pour
les mycobactéries) une colonie visible à
l’œil nu (environs 106 bactéries)_
Ex: examen cytobactériologique d’une expectoration
(contient de nombreuses bactéries de la flore
oropharyngée)_
- Dépôt de 100 _l d’une dilution à 10-5 du
prélèvement sur milieu de culture, incubation
- numeration des colonies au bout de 24h
- Seuil significatif d’une bactérie potentiellement
pathogène: 107 UFC/ml
Ex: Ensemencement d’une urine: 10 _l
Interprétation : infection urinaire si  105 UFC/ml
et présence de cytologie (leucocytes)_
 Ensemencement au rateau après dilution du prélèvement si
nécessaire pour isoler les bactéries les unes des autres et pour les
dénombrer
INTERPRETATION
Infection urinaire
≥ 105
≥ 104
Pas d'infection
 105
 104
Bactéries/
mL
Leucocyturie/
mL
Interprétation infection urinaire
3c – Culture incubation
 Atmosphère
- culture aérobie: ambiante
- culture anaérobie: jarre sans oxygène
- Microaerophile: étuve avec 5% de CO2
 Température : 37°C
 Obscurité
 Délai d’incubation : variable selon les prélèvements et
les bactéries recherchées
Protocoles usuels : 48h à 5j
Protocole mycobactéries : 3 mois
1) Observation des milieux de culture
 Appréciation de la quantité de colonies :
- Semi quantitative (rare, nombreux, très nombreux)_
- Quantitative (ex.: 104, 105…/ml)_
 Observation des colonies isolées et orientation de l’identification
- aspect des colonies : taille
- aspect muqueux ou sec, pigmentation
- hémolyse autour de la colonie
- odeur particulière
- caractères culturaux : pousse en anaérobie ou en aérobie
J1
J1
Observation des milieux de culture
Serratia marscecens Proteus mirabilis
Peptococcus niger
2) Identification
Les bactéries possèdent un équipement
enzymatique que l’on utilise pour les identifier :
tests biochimiques
 Tests d’orientation rapide ex :
catalase : catalyse l’hydrolyse de l’H2O2 en H2
et O2 .
1 goutte de H2O2 + 1 colonie = apparition de
bulles
coagulase pour identification des
Staphylocoques :
plasma de lapin + 1 colonie = coagulum
J1
 Recherche de caractères biochimiques : utilisation de milieux de
cultures dont la composition permet de mettre en évidence une activité
enzymatique (en 4 à 48h)_
- Activité enzymatique ex: _-alactosidase (OMPG) lysine
décarboxylase (LDC), uréase (UR)…
- Activité fermentaire : révélée avec un milieu type contenant un
sucre, un indicateur coloré de changement de pH : la fermentation du sucre
entraîne une diminution de pH et un changement de couleur du milieu
Activité enzymatique Activité fermentaire
Me N. Y. ROSINE, (F) 16/08/1956 51 ans : 5
Me N. Y. ROSINE, (F) 16/08/1956 51 ans : 5é
ém MED-S
m MED-S
No dossier 0801M17150
No dossier 0801M17150
_____________________________________________________
_____________________________________________________
MICROBIOLOGIE
MICROBIOLOGIE
17/01/08
17/01/08
Nature : ECBU (Milieu de jet)
Nature : ECBU (Milieu de jet)
Cytologie
Cytologie
Aspect des urines: H
Aspect des urines: Hé
ématique
matique
Cellules
Cellules Rares
Rares
H
Hé
ématies
maties 10
106
6 /ml
/ml
Leucocytes
Leucocytes 104 /ml
Cylindres urinaires Absence
Cylindres urinaires Absence
Cristaux urinaires Absence
Cristaux urinaires Absence
examen direct apr
examen direct aprè
ès coloration de Gram:
s coloration de Gram:
Rares bacilles
Rares bacilles à
à Gram n
Gram né
égatif
gatif
Rares Levures
Rares Levures
Culture:
Culture:
105 UFC/ml bacilles
bacilles à
à Gram n
Gram né
égatif type Ent
gatif type Enté
érobact
robacté
érie
rie
Escherichia coli
Escherichia coli
Antibiogramme
Antibiogramme en cours
en cours
J1
3) Recherches complémentaires
Mise en évidence de constituants antigéniques situés sur la paroi bactériennes
par des réactions d’agglutination sur lame à l’aide d’immunsérum
typage de la capsule
Ex. :typage du méningocoque (Nesseria meningitidis)_
responsable de méningites et méningococcémies
J1
sérogroupes
- B : le plus fréquent en France (75% des souches isolées de
méningites)_
- A, C : Afrique, Asie, mais de plus en plus souvent rencontré en
France,
- X, Y, W135, ... : rare
Vaccin: pour les groupes A, C, Y, W135 seulement, pas de vaccin pour
le groupe B.
méningites et méningococcémies à méningocoque:
- Chimioprophylaxie (rifampicine) et vaccination si elle est
possible des sujets contacts.
- maladie à déclaration obligatoire
Intérêt du typage des méningocoques:
épidémiologique et prophylactique
Structure antigénique des entérobactéries
Antigènes O : Ag de paroi toujours présents
Antigènes H : Ag flagellaires
Antigène K : Ag de capsule ou d’enveloppe (plus rare)_
Localisation des antigènes H, O et K dans une entérobactérie
 L’étude des antigènes permet d’établir la fiche d’identité
antigénique de certains germes dont les Salmonelles
Exemple: formule antigénique de serovars de Salmonella
enterica sous-espèce enterica
-
-
-
1, 5
d
gm
gp
I, v
+
9, 12
1, 9, 12
1, 9, 12
1, 9, 12
Typhi
Enteritidis
Dublin
Panama
D
1,2
eh
6, 8
Newport
C2
1, 5
1, 5
c
c
+
6, 7
6, 7
Paratyphi C
Cholerae suis
C1
1, 2
1, w
1, 2
-
b
b
i
gm
1, 4, 5, 12
4, 12
1, 4, 5, 12
4, 12
Paratyphi B
Wien
Thyphimurium
Essen
B
-
a
1, 2 12
Paratyphi A
A
Phase 2
Phase 1
Vi
Antigènes O
Sérotypes
Groupes
Antigènes H
Importance du sérotypage des salmonelles:
clinique et épidémiologique
 sérovars typhi et para typhi A, B et C
- Fièvre typhoïde: bactériémie à point de départ lymphatique
- Maladie à déclaration obligatoire
 Autres sérovars
- Salmonelloses non typhoïdiques ou salmonelloses digestives,
infections essentiellement à l’origine de toxi-infections alimentaires.
-maladies à déclaration obligatoire quand au moins 2 cas sont
groupés.
3) Antibiogramme
La bactérie est testée à partir d’une
colonie vis-à -
vis d’un panel
d’antibiotiques pour déterminer sa
sensibilité
Réponse en 4h à 18h en fonction de la
technique
J1
J2
Résultats identification et antibiogramme
RO, MICHELINE, (F) 04/11/1924 83 ans : 4ém MED-S 04/01/08
No:
No: 0801M04013
0801M04013
ECBU sur Sonde
H
Hé
ématies
maties 10*4 /ml
Leucocytes
Leucocytes 10*6 /ml
Examen direct apr
Examen direct aprè
ès
s coloration
coloration de Gram:
de Gram: Nombreux bacilles à Gram négatif
Culture:
Culture: 10*6UFC/ml bacilles à Gram négatif type Entérobactérie
Identification:
Identification: Escherichia coli
Antibiogramme:
Antibiogramme:
Amoxicilline
Amoxicilline Résistant
Amoxi + Ac. Clavulanique
Amoxi + Ac. Clavulanique Intermédiaire
C
Cé
éfalotine
falotine Résistant
Cefotaxime
Cefotaxime Sensible
Amikacine
Amikacine Sensible
Gentamicine
Gentamicine Sensible
Trimethoprime + Sulfamide
Trimethoprime + Sulfamide Résistant
Furanes
Furanes Sensible
Ac Nalidixique
Ac Nalidixique Résistant
Ofloxacine
Ofloxacine Résistant
Ciprofloxacine
Ciprofloxacine Résistant
J2
Autres moyens de diagnostic direct (1)_
 Recherche d’antigènes solubles
bactériens
 Exo-antigènes polysaccharidiques originaires de la
paroi ou de la capsule, libérés dans le milieu
biologique
 recherchés dans le L.C.R., le sérum, les urines
 utilisé:
- pour un diagnostic précoce
- en cas d’infection décapité par un traitement
antibiotique
Exemple 1
Méningites : dans le L.C.R.
recherche d’antigène soluble des
méningocoques (B, A, C, Y, W135),
pneumocoques, Haemophilus influenzae b,
streptocoque B, E. coli K1. mise en évidence par
agglutination de particules de
latex sensibilisés
Habitat des Légionelles
 Les Legionelles sont des bactéries pathogènes opportunistes, présentes dans les
écosystèmes naturels ou artificiels d'eau douce.
 L'isolement est surtout fréquent dans les circuits d'eau chaude (robinets, ballons,
pommeaux de douche à 40 - 45°C), dans certaines eaux thermales.
Pneumopathie à Legionella pneumophila (maladie des légionnaires)
 Affection respiratoire aigüe et fébrile ( létalité 10 à 20 % voir + chez les
immunodéprimés). Aspect clinique et radiologique pas toujours caractéristique.
 Deux complications majeures possibles :
- Insuffisance respiratoire irréversible
- Insuffisance rénale aiguë
Représenterait 5 à 15% des pneumopathies communautaires nécessitant une
hospitalisation
 Nécessite un traitement spécifique
Exemple 2 : Pneumopathie à Legionella pneumophila de
sérogroupe L1
Exemple 2: Détection d’Ag solubles pour le diagnostic de
pneumopathie à Legionella pneumophila de sérogroupe L1
 Réalisée sur les urines par test
immunochromographique
(Ac de lapin anti legionella pneumophila de sérogroupes 1
adsorbés sur membrane de nitrocellulose)_
- Fait en parallèle à la culture, à l’examen direct et à la
sérologie (recherche d ’Ac chez le patient).
 Avantages :
- précocité : 80% de patients atteints ont des antigènes
solubles dans les urines dès l’apparition des signes
cliniques
- simplicité
- rapidité
- bonne valeur prédictive
 Inconvénients :
- ne détecte que le sérogroupe L1
Autres moyens de diagnostic direct (3)
 Méthodes moléculaires :
Méthode pour identifier une bactérie dans un produit
pathologique ou à partir d’une culture
Principe simple :
 amplification d’une séquence génomique avec des
amorces spécifiques (PCR)
 Révélation du produit d’amplification
- par électrophorèse sur gel
- hybridation spécifique
- séquençage et comparaison avec les
séquences déposées dans les banques de données
Intérêt :
- Gain de sensibilité
- Détection d’agents non cultivable sur milieux usuels
(ex. : Chlamydia détection à partir des prélèvements
génitaux)_
- Gain de temps important pour l’identification de certaines
espèces bactériennes (ex. : identification des mycobactéries)_
- Gain de spécificité pour l’identification de germes inhabituels à
partir de culture
Révélation du produit de PCR par
électrophorèse sur gel
Autres moyens de diagnostic direct (7)
(7)_
_
Révélation du produit amplifié par hybridation
avec une sonde spécifique déposée sur un support
de type nitrate de cellulose puis révélé.
Identification de
Mycobacterium xenopi
Autres moyens de diagnostic direct(8)_
Identification de bactèrie non identifiables (ou difficilement identifiables)
par les méthodes traditionnelles
- Amplification de gènes codant pour l’ARN 16s ou 23s avec des amorces consensus
- Séquençage du produit d’amplification
- Analyse de la séquence en comparant aux séquences des banques de données
- Soit la séquence correspond à celle d’une bactérie déjà identifiée
- Soit la séquence est proche de celle d’une espèce

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  • 1. Bactériologie médicale Les bactéries sont répandues dans l’environnement: terre, eau des rivières, de boisson, mer, milieux extrêmes. L’homme est colonisé par environ 1014 bactéries alors que le nombre de cellules du corps n’est que de 1013 La bactériologie médicale n’intéresse qu’un petit nombre de ces bactéries (quelques centaines) celles qui sont les agents de maladies infectieuses Catherine Branger, MCU-PH Service de Microbiologie, Hôpital Louis Mourier, Colombes, catherine.branger@lmr.aphp.fr Faculté de Médecine site Bichat, Paris 7 Structure de la bactérie et éléments utiles à l’identification Capsule : polysaccharides - Empêche la phagocytose - Peut être à l’état soluble dans les liquides de l’organisme élément facultatif Paroi : enveloppe rigide responsable de la forme des cellules - Assure la protection - Rôle dans l’antigénicité Membrane cytoplasmique: - Perméases : rôle dans les échanges - Enzymes respiratoires - Rôle métabolique majeur Cytoplasme Appareil nucléaire (chromosome et plasmides)_ Ribosomes (ARN et protéines) Pili sexuel: rôle dans la conjugaison fimbriae: impliqués dans les phénomènes d’adhésion Flagelles: assurent la mobilité, - antigéniques - éléments facultatifs Phénomène de sporulation Spore : - forme de survie de certaines bactéries (Clostridium, Bacillus) dans des conditions extérieures défavorables - Résistent à une pénurie de nourriture, élévation de pH, t°, dessiccation, désinfectants, etc. - Reprise de la forme végétative en milieux favorable Utile à l’identification bactérienne Physiologie – croissance La bactérie se multiplie par fission binaire et donne deux cellules filles identiques Temps de division varie de 20 min à plusieurs jours ex: Escherichia coli: 20 mn, Mycobactéries 20h Sur milieu gélosé, par divisions successives, après 20 générations (soit 106 bactéries), les bactéries donnent naissance à une population formant une colonie, c’est-à-dire un amas visible à l’œil nu
  • 2. Mode de croissance: exponentiel 1- phase de latence : temps nécessaire à la bactérie pour synthétiser les enzymes adaptées au substrat 2 - phase exponentielle : les bactéries se reproduisent 3 - phase stationnaire : taux de croissance nul. Les bactéries qui se multiplient compensent celles qui meurent 4 - phase de déclin : accumulation métabolites toxiques, lyse cellulaire Besoins nutritifs Éléments nécessaires à la croissance : - Éléments qui constituent leur structure cellulaire: carbone, H, O, azote et besoin en soufre - besoins inorganiques : phosphore - autres éléments : sodium, potassium, calcium, etc. Les bactéries se nourrissent de matières organiques: sucres, amidon, cellulose, protéines, matières grasses etc. Les bactéries fabriquent des enzymes qui permettent la dégradation des macromolécules et leur transformation en molécules plus simples connaissance de l’activité enzymatique utilisée pour l’identification Conditions de croissance (1)_ Effet de l’oxygène: très important pour l’isolement des bactéries en pathologie infectieuse - bactéries aérobies: ne se développent qu’en présence d’O2, pression partielle voisine de ppO2 de l’air (1) - bactéries micro-aérophiles: se développent mieux ou exclusivement lorsque la ppO2 est inférieure à celle de l’air (2) - bactéries anaérobies: l’oxygène leur est toxique. Elles se développe en milieu très réducteur (ex: tube digestif de l’homme et des animaux) (3) - bactéries aéro-anaérobies : se développent en présence ou absence d’oxygène (4) 2 4 2 1 3 4 3 2 Conditions de croissance (2)_ Effet de la température Classées selon leur température optimale de croissance : - mésophiles : température proche de celle du corps humain (37°C) (ex. : E. coli)_ - thermophile : entre 45°C et 70°C - hyperthermophiles : 80°C - psychrophiles : proche de 0°C - psychrotrophes : proche de 0°C avec optimum de croissance proche des bactéries mésophiles (ex. : Pseudomonas)_ Effet du pH - bactéries neutrophiles : se développent pour les pH compris entre 5,5 et 8,5, optimum voisin de 7 la plupart des bactéries d’intérêt médical - bactéries alcalophiles : préfèrent les pH alcalins, cas de Pseudomonas et Vibrio
  • 3. Bactéries saprophytes Bactéries de l’environnement qui se retrouve comme flore de passage sur la peau et les muqueuses. bactéries des végétaux comestibles, terre, eau. Présence transitoire sans danger. Bactéries commensales: Flore résidente du corps humain - protège la peau et les muqueuses - Effet de barrière vis-à-vis des bactéries pathogènes - Différentes selon la niche écologique l’homme est bénéficiaire flore intestinale: importante - flore dominante: anaérobies 109 à 1011 bac/g de selles - flore sous dominante: entérobactéries (surtout E. coli) et autres (entérocoques) 102 à 106 bac/g flore oro-naso-pharyngèe: abondante, variées, flore polymorphe anaérobie et aérobie flore vaginale: en majorité lactobacilles qui gardent un pH acide bas défavorable aux autres bactéries flore cutanée: composée surtout de staphylocoques commensaux, empêche aussi l’implantation de bactéries pathogènes Bactéries pathogènes strictes Facteur de pathogénicité lié à la bactérie: - Provoque une infection identifiée et physiopathologiquement spécifique - Peut se développer chez l’homme sain Exemples: - Mycobacterium tuberculosis : tuberculose - Yersinia pestis : peste - Bacillus anthracis : anthrax - Salmonella typhi : typhoïde Pathogènes opportunistes Provoque une infection quand il y a : - défaillance de l’hôte - un terrain favorable - une déficience des défenses antibactériennes. Exemples: - effraction de la peau: abcès, furoncle - infection virale qui provoque la lyse des cellules des voies respiratoires supérieures et favorise le passage des bactéries: surinfections bronchiques (pneumocoque)_ - défaut d’épuration des bactéries du méat urinaire: cystites à E. coli (hôte commensale du tube digestif)_
  • 4. Bactériologie médicale s’intéresse aux: - pathogènes stricts - pathogènes opportunistes Ensemble de moyens permettant de mettre en évidence l’agent infectieux Diagnostic direct : mise en évidence de la bactérie elle-même Diagnostic indirect : mise en évidence de la réponse de l’organisme vis-à-vis de l’agent infectieux par la présence d’anticorps spécifiques Diagnostic d’une infection bactérienne Moyens diagnostiques : - visualiser par examen microscopique - isoler sur des milieux de culture - identifier l’agent pathogène La procédure peut être insuffisante : - agent a disparu à la suite d’un traitement antibiotique - bactérie non cultivable ou de culture lente ou nécessitant des milieux spéciaux Autres moyens : - recherche d’antigènes solubles (ex: polysaccharides de la capsule) - méthodes moléculaires: PCR, sonde d’hybridation, séquençage Diagnostic direct Le résultat des examens bactériologiques dépend des conditions de prélèvements. Faire le prélèvement au moment opportun en fonction du contexte clinique : - précocement - avant toute antibiothérapie Transport rapide : - certaines bactéries ne résistent pas au froid, à la dessiccation, à la présence d’oxygène - Si les prélèvements sont contaminés par une flore commensale, les bactéries peuvent se multiplier et fausser l’interprétation du résultat (ex: urines pour le diagnostic d’infection urinaire)._ Utiliser du matériel stérile à usage unique et respecter les règles d’asepsie élémentaires lors des prélèvements. Prélèvements (1)
  • 5. Prélèvements (2)_ Sites de prélèvements Ils varient selon le siège de l’infection et le germe - Méningite : ponction lombaire (LCR), sang (hémoculture)_ - Diarrhée : selles (coproculture)_ - Infection urinaire : urines (uriculture)_ - Fièvre au long court : sang (hémoculture)_ - Pneumonie : expectoration, prélèvements bronchiques, sang - Plaie chirurgicale : pus 1) Examen macroscopique Décrit le prélèvement Toute infection bactérienne s’accompagne de signes biologiques liés à l’inflammation avec la présence éventuelle de leucocytes, notamment de polynucléaires. Ces éléments peuvent entraîner une modification visuelle du prélèvement. selles claires troubles J0 2) Examen microscopique Recherche d’éléments cellulaires de type polynucléaires : évaluation de la réaction inflammatoire qui peut signer une infection bactérienne. J0 Recherche visuelle de bactéries. 2a – Numération quantitative des cellules (leucocytes et hématies) exprimée en nombre d’éléments/mm3 - pour les liquides de ponction ( L.C.R., ascite, pleurale, articulaire) - urines nécessaire à l’interprétation diagnostique Etat frais polynucléaires
  • 6. Ex: urines Nombre de leucocytes 104 /ml (ou 10/mm3)_ pas de réaction inflammatoire, leucocyturie physiologique pas de suspicion d’infection Ex: liquide céphalo-rachidien A l'état normal, le LCR est limpide, eau de roche hématies : 1/mm3 éléments nucléés : enfant et l'adulte 5/mm3 : nouveau-né 30/mm3 2b - Examen microscopique après coloration Coloration à partir d’un étalement (frottis) sur lame de verre : - visualisation et différenciation morphologique des éléments nucléaires (MGG) - visualisation et différenciation morphologique des bactéries après coloration de Gram Coloration de May-Grunewald-Giemsa (MGG)_ Coloration principalement à visée cytologique pour individualiser les polynucléaires, les lymphocytes, les macrophages… - Sert à évaluer la réaction inflammatoire pour tout liquide de ponction (L.C.R., ascite, pleurale, articulaire…) - Les bactéries peuvent aussi être observées ou spécialement recherchées Pneumocoque dans LCR, méningite Borellia burgdorferi, frottis sanguin Prélèvement: liquide cephalo-rachidien Exemple 1 Examen direct : - numération (cellule de Malassez) : 1000 leucocytes - frottis coloré par MGG : 90% de polynucléaires neutrophiles 10% de lymphocytes Conclusion : réaction purulente à polynucléaires, orientation en faveur d’une méningite bactérienne Exemple 2 Examen direct : - numération à la cellule de Malassez : 400 leucocytes - frottis coloré par le MGG : 30% de polynucléaires neutrophiles 70% de lymphocytes Conclusion : réaction lymphocytaire, orientation en faveur d’une méningite virale
  • 7. Porines Lipoprotéines hydrophobes Membrane externe Membrane cytoplasmique Espace périplasmique GRAM négatif peptidoglycane GRAM positif Capsule polysaccharidique Coloration différentielle dépend de la structure de la paroi et est basée sur la perméabilité de la paroi des bactéries à l’alcool Coloration de Gram : permet de distinguer 2 grands groupes de bactéries : G Paroi perméable à l’alcool - bactéries dites à Gram – (roses) qui ne retiennent pas le colorant G Paroi imperméable à l’alcool - bactéries dites à Gram + (violettes) qui retiennent le colorant Coloration de Gram Coloration de Gram (1 (1) ) Coloration de Gram La coloration de Gram ne permet pas une identification mais une orientation - présence ou absence de bactéries - forme : cocci, bacilles, coccobacilles, fusiformes, incurvée, etc… - groupement : amas (Staphylocoques), chaînettes (Streptocoques), diplocoques (Pneumocoques, Neisseria) - coloration : Gram + ou Gram - Coloration de Gram: première réponse diagnostique en moins de 1 heure qui_ oriente l’identification et l’antibiothérapie probabiliste Bacteriodes, Fusobacterium Bacilles Veillonella Coques Gram - Clostridium (tetani, perfringens etc…)_ Bacilles Peptostreptococcus Coques Gram + Bactéries anaérobies Entérobactéries (E. Coli, Salmonella, etc…), Pseudomonas, Vibrio, Campylobacter, Brucella Bacilles Neisseria (méningocoque)_ Coques Gram - Corynebacterium, Listeria, Bacillus Bacilles Staphylocoques, Streptocoques, Entérocoques Coques Gram + Bactéries aérobies Examens directs Fusobacterium, pus Pneumocoque, capsule, crachat E. coli et polynucléaires, urines Méningite à pneumocoque Bacteries intra polynucleaire
  • 8. Staphylococcus , abcès cutané Streptococcus, hémoculture Gonocoque, pus uretral Vibrio cholerae Campylobacter, selles Autres colorations (1)_ Coloration spécifique des Mycobactéries : Zielh Neelsen - paroi des mycobactéries : riche en lipides, difficilement colorable par les colorants usuels - paroi colorable par la fushine qui retient le colorant malgré une action combinée d’acide et d’alcool Ë d’où le nom de « Bacille Acido-Alcoolo-Résistant : BAAR - ne permet pas de préciser si mycobactérie de la tuberculose ou mycobactérie atypique Autres colorations (2) Fluorescence : - coloration des Mycobactéries à l ’auramine - coloration par des anticorps marqués par un conjugué fluorescent Bactéries difficilement colorables par le Gram ou d’autres colorations : (Legionella, Coxiella burneti, Chlamydia)_ Mycobactéries colorées à l’auramine Legionella pneumophila tréponéme Aline BRA No dossier: 084140125 ECBU Milieu de jet Aspect des urines: Trouble Cellules epithéliales Rares Hématies 103/ml Leucocytes 105 /ml Cylindres urinaires Absence Cristaux urinaires Absence Examen direct après coloration de Gram: Rares bacilles à Gram négatif J0 Exemple de résultat
  • 9. 3) Mise en culture 3a - milieux_ de culture Produits pathologiques ensemencés sur milieux qui doivent satisfaire les besoins énergétiques et nutritifs des bactéries Milieux solides : milieux gélosés le plus souvent - simples - enrichis (sang, vitamines etc…) pour bactéries exigeantes : méningocoque, streptocoque - sélectifs (antiseptique, antibiotique, pH acide ou alcalin) pour isoler des bactéries pathogènes au sein d’une flore bactérienne polymorphe. Milieux sélectifs S. aureus entérobactéries J0 Milieux liquides : Exemple : culture du sang hémoculture 3b - Culture: ensemencement Ensemencement en stries en quadrants cas des pus: pour isoler les bactéries les unes des autres (ensemencement par épuisement) Les bactéries se multiplient et donnent en 18 heures à 5 jours ou plus (3 semaines pour les mycobactéries) une colonie visible à l’œil nu (environs 106 bactéries)_ Ex: examen cytobactériologique d’une expectoration (contient de nombreuses bactéries de la flore oropharyngée)_ - Dépôt de 100 _l d’une dilution à 10-5 du prélèvement sur milieu de culture, incubation - numeration des colonies au bout de 24h - Seuil significatif d’une bactérie potentiellement pathogène: 107 UFC/ml Ex: Ensemencement d’une urine: 10 _l Interprétation : infection urinaire si 105 UFC/ml et présence de cytologie (leucocytes)_ Ensemencement au rateau après dilution du prélèvement si nécessaire pour isoler les bactéries les unes des autres et pour les dénombrer
  • 10. INTERPRETATION Infection urinaire ≥ 105 ≥ 104 Pas d'infection 105 104 Bactéries/ mL Leucocyturie/ mL Interprétation infection urinaire 3c – Culture incubation Atmosphère - culture aérobie: ambiante - culture anaérobie: jarre sans oxygène - Microaerophile: étuve avec 5% de CO2 Température : 37°C Obscurité Délai d’incubation : variable selon les prélèvements et les bactéries recherchées Protocoles usuels : 48h à 5j Protocole mycobactéries : 3 mois 1) Observation des milieux de culture Appréciation de la quantité de colonies : - Semi quantitative (rare, nombreux, très nombreux)_ - Quantitative (ex.: 104, 105…/ml)_ Observation des colonies isolées et orientation de l’identification - aspect des colonies : taille - aspect muqueux ou sec, pigmentation - hémolyse autour de la colonie - odeur particulière - caractères culturaux : pousse en anaérobie ou en aérobie J1 J1 Observation des milieux de culture Serratia marscecens Proteus mirabilis Peptococcus niger
  • 11. 2) Identification Les bactéries possèdent un équipement enzymatique que l’on utilise pour les identifier : tests biochimiques Tests d’orientation rapide ex : catalase : catalyse l’hydrolyse de l’H2O2 en H2 et O2 . 1 goutte de H2O2 + 1 colonie = apparition de bulles coagulase pour identification des Staphylocoques : plasma de lapin + 1 colonie = coagulum J1 Recherche de caractères biochimiques : utilisation de milieux de cultures dont la composition permet de mettre en évidence une activité enzymatique (en 4 à 48h)_ - Activité enzymatique ex: _-alactosidase (OMPG) lysine décarboxylase (LDC), uréase (UR)… - Activité fermentaire : révélée avec un milieu type contenant un sucre, un indicateur coloré de changement de pH : la fermentation du sucre entraîne une diminution de pH et un changement de couleur du milieu Activité enzymatique Activité fermentaire Me N. Y. ROSINE, (F) 16/08/1956 51 ans : 5 Me N. Y. ROSINE, (F) 16/08/1956 51 ans : 5é ém MED-S m MED-S No dossier 0801M17150 No dossier 0801M17150 _____________________________________________________ _____________________________________________________ MICROBIOLOGIE MICROBIOLOGIE 17/01/08 17/01/08 Nature : ECBU (Milieu de jet) Nature : ECBU (Milieu de jet) Cytologie Cytologie Aspect des urines: H Aspect des urines: Hé ématique matique Cellules Cellules Rares Rares H Hé ématies maties 10 106 6 /ml /ml Leucocytes Leucocytes 104 /ml Cylindres urinaires Absence Cylindres urinaires Absence Cristaux urinaires Absence Cristaux urinaires Absence examen direct apr examen direct aprè ès coloration de Gram: s coloration de Gram: Rares bacilles Rares bacilles à à Gram n Gram né égatif gatif Rares Levures Rares Levures Culture: Culture: 105 UFC/ml bacilles bacilles à à Gram n Gram né égatif type Ent gatif type Enté érobact robacté érie rie Escherichia coli Escherichia coli Antibiogramme Antibiogramme en cours en cours J1 3) Recherches complémentaires Mise en évidence de constituants antigéniques situés sur la paroi bactériennes par des réactions d’agglutination sur lame à l’aide d’immunsérum typage de la capsule Ex. :typage du méningocoque (Nesseria meningitidis)_ responsable de méningites et méningococcémies J1
  • 12. sérogroupes - B : le plus fréquent en France (75% des souches isolées de méningites)_ - A, C : Afrique, Asie, mais de plus en plus souvent rencontré en France, - X, Y, W135, ... : rare Vaccin: pour les groupes A, C, Y, W135 seulement, pas de vaccin pour le groupe B. méningites et méningococcémies à méningocoque: - Chimioprophylaxie (rifampicine) et vaccination si elle est possible des sujets contacts. - maladie à déclaration obligatoire Intérêt du typage des méningocoques: épidémiologique et prophylactique Structure antigénique des entérobactéries Antigènes O : Ag de paroi toujours présents Antigènes H : Ag flagellaires Antigène K : Ag de capsule ou d’enveloppe (plus rare)_ Localisation des antigènes H, O et K dans une entérobactérie L’étude des antigènes permet d’établir la fiche d’identité antigénique de certains germes dont les Salmonelles Exemple: formule antigénique de serovars de Salmonella enterica sous-espèce enterica - - - 1, 5 d gm gp I, v + 9, 12 1, 9, 12 1, 9, 12 1, 9, 12 Typhi Enteritidis Dublin Panama D 1,2 eh 6, 8 Newport C2 1, 5 1, 5 c c + 6, 7 6, 7 Paratyphi C Cholerae suis C1 1, 2 1, w 1, 2 - b b i gm 1, 4, 5, 12 4, 12 1, 4, 5, 12 4, 12 Paratyphi B Wien Thyphimurium Essen B - a 1, 2 12 Paratyphi A A Phase 2 Phase 1 Vi Antigènes O Sérotypes Groupes Antigènes H Importance du sérotypage des salmonelles: clinique et épidémiologique sérovars typhi et para typhi A, B et C - Fièvre typhoïde: bactériémie à point de départ lymphatique - Maladie à déclaration obligatoire Autres sérovars - Salmonelloses non typhoïdiques ou salmonelloses digestives, infections essentiellement à l’origine de toxi-infections alimentaires. -maladies à déclaration obligatoire quand au moins 2 cas sont groupés.
  • 13. 3) Antibiogramme La bactérie est testée à partir d’une colonie vis-à - vis d’un panel d’antibiotiques pour déterminer sa sensibilité Réponse en 4h à 18h en fonction de la technique J1 J2 Résultats identification et antibiogramme RO, MICHELINE, (F) 04/11/1924 83 ans : 4ém MED-S 04/01/08 No: No: 0801M04013 0801M04013 ECBU sur Sonde H Hé ématies maties 10*4 /ml Leucocytes Leucocytes 10*6 /ml Examen direct apr Examen direct aprè ès s coloration coloration de Gram: de Gram: Nombreux bacilles à Gram négatif Culture: Culture: 10*6UFC/ml bacilles à Gram négatif type Entérobactérie Identification: Identification: Escherichia coli Antibiogramme: Antibiogramme: Amoxicilline Amoxicilline Résistant Amoxi + Ac. Clavulanique Amoxi + Ac. Clavulanique Intermédiaire C Cé éfalotine falotine Résistant Cefotaxime Cefotaxime Sensible Amikacine Amikacine Sensible Gentamicine Gentamicine Sensible Trimethoprime + Sulfamide Trimethoprime + Sulfamide Résistant Furanes Furanes Sensible Ac Nalidixique Ac Nalidixique Résistant Ofloxacine Ofloxacine Résistant Ciprofloxacine Ciprofloxacine Résistant J2 Autres moyens de diagnostic direct (1)_ Recherche d’antigènes solubles bactériens Exo-antigènes polysaccharidiques originaires de la paroi ou de la capsule, libérés dans le milieu biologique recherchés dans le L.C.R., le sérum, les urines utilisé: - pour un diagnostic précoce - en cas d’infection décapité par un traitement antibiotique Exemple 1 Méningites : dans le L.C.R. recherche d’antigène soluble des méningocoques (B, A, C, Y, W135), pneumocoques, Haemophilus influenzae b, streptocoque B, E. coli K1. mise en évidence par agglutination de particules de latex sensibilisés Habitat des Légionelles Les Legionelles sont des bactéries pathogènes opportunistes, présentes dans les écosystèmes naturels ou artificiels d'eau douce. L'isolement est surtout fréquent dans les circuits d'eau chaude (robinets, ballons, pommeaux de douche à 40 - 45°C), dans certaines eaux thermales. Pneumopathie à Legionella pneumophila (maladie des légionnaires) Affection respiratoire aigüe et fébrile ( létalité 10 à 20 % voir + chez les immunodéprimés). Aspect clinique et radiologique pas toujours caractéristique. Deux complications majeures possibles : - Insuffisance respiratoire irréversible - Insuffisance rénale aiguë Représenterait 5 à 15% des pneumopathies communautaires nécessitant une hospitalisation Nécessite un traitement spécifique Exemple 2 : Pneumopathie à Legionella pneumophila de sérogroupe L1
  • 14. Exemple 2: Détection d’Ag solubles pour le diagnostic de pneumopathie à Legionella pneumophila de sérogroupe L1 Réalisée sur les urines par test immunochromographique (Ac de lapin anti legionella pneumophila de sérogroupes 1 adsorbés sur membrane de nitrocellulose)_ - Fait en parallèle à la culture, à l’examen direct et à la sérologie (recherche d ’Ac chez le patient). Avantages : - précocité : 80% de patients atteints ont des antigènes solubles dans les urines dès l’apparition des signes cliniques - simplicité - rapidité - bonne valeur prédictive Inconvénients : - ne détecte que le sérogroupe L1 Autres moyens de diagnostic direct (3) Méthodes moléculaires : Méthode pour identifier une bactérie dans un produit pathologique ou à partir d’une culture Principe simple : amplification d’une séquence génomique avec des amorces spécifiques (PCR) Révélation du produit d’amplification - par électrophorèse sur gel - hybridation spécifique - séquençage et comparaison avec les séquences déposées dans les banques de données Intérêt : - Gain de sensibilité - Détection d’agents non cultivable sur milieux usuels (ex. : Chlamydia détection à partir des prélèvements génitaux)_ - Gain de temps important pour l’identification de certaines espèces bactériennes (ex. : identification des mycobactéries)_ - Gain de spécificité pour l’identification de germes inhabituels à partir de culture Révélation du produit de PCR par électrophorèse sur gel
  • 15. Autres moyens de diagnostic direct (7) (7)_ _ Révélation du produit amplifié par hybridation avec une sonde spécifique déposée sur un support de type nitrate de cellulose puis révélé. Identification de Mycobacterium xenopi Autres moyens de diagnostic direct(8)_ Identification de bactèrie non identifiables (ou difficilement identifiables) par les méthodes traditionnelles - Amplification de gènes codant pour l’ARN 16s ou 23s avec des amorces consensus - Séquençage du produit d’amplification - Analyse de la séquence en comparant aux séquences des banques de données - Soit la séquence correspond à celle d’une bactérie déjà identifiée - Soit la séquence est proche de celle d’une espèce