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Journée Découverte de Pilotraite
Atelier biofilms : formation, constitution,
facteurs d’influence,
résultats PiloTraite
Le 12 mai 2022 à Derval (44)
Cécile Laithier1 et Alice Hubert1, Hélène Tormo2 et Gwenaëlle Jard2
1 2
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Introduction sur les biofilms
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Constitution des biofilms de
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Espèce Caractéristiques microbiologiques
Bovins
• Des différences de méthodes selon les études mais globalement,
les groupes microbiens indésirables et les groupes microbiens
d’intérêt ont des niveaux similaires.
Ovins
Caprins
Communauté microbienne mobilisable de la machine à traire
en élevage bovin
• Communauté microbienne avec des niveaux faibles;
• Les groupes microbiens indésirables et les groupes microbiens
d’intérêt ont des niveaux similaires.
Niveaux des groupes microbiens mobilisables dans le circuit de la machine à traire
5
FlorAcQ 2011-2014
Communauté microbienne mobilisable de la
machine à taire en élevage ovin
• La machine à traire est un réservoir de groupes microbiens pouvant
potentiellement ensemencer le lait.
• Les niveaux des groupes microbiens d’intérêt technologique (bactéries
lactiques) et indésirables (bactéries à Gram-) sont similaires.
Dispersion des niveaux des groupes microbiens dans l’eau après passage dans le circuit machine à traire (ufc/mL d’eau). (N=24 échantillons, 6
exploitations des Pyrénées Atlantiques).
FlorAcQ 2011-2014
1
10
100
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10000
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FMAR Bactéries
d'affinage
Bactéries
lactiques
Levures Moisissures Bactéries à Gram
négatif
Niveaux
UFC/mL
d'eau
de
rinçage
6
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2,5 2,4 2,4
2
1 0,9
0,6 0,5 0,4
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
log
UFC/ml
Les laits UHT-MAT en élevages caprins (12 fermes, 4 passages – étude
2013)
Lait d’une traite Lait UHT-MAT
MAT : réservoir majeur de flores
acidifiantes mais également de
Pseudomonas spp
Similitudes et différences avec les profils lait d’une traite :
SCN reste majoritaire mais même niveau que
Pseudomonas spp, entérocoques, levures
Coliformes, moisissures et SCP à niveau inférieur
P. fluorescens et BL. Hétéro faiblement dénombrés
Bonne aptitude acidifiante
4,2
3,1
2,5 2,2
1,6
0,9 0,9
0,8
0,3
0,2
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
log
UFC/ml
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
24 30 36 42 48
pH
LT LBOL LUHT
Les facteurs
d’influence sur les
biofilms
Facteurs d’influence
Espèce Principaux facteurs de variation (étudiés surtout en caprins)
Bovins • Conception installation de traite : privilégier installations
petites et simples (raccords, joints … : niches de flores
indésirables)
• Nature des matériaux : attention parties « plastique » dans
lactoducs, en particulier d’évacuation, moins de flores sur
silicone/caoutchouc
• Entretien et renouvellement du matériel : respect des
recommandations et surveiller points à risque (joints…)
• Nettoyage du matériel avec TACT et séchage +qualité de
l’eau, raisonner l’alternance en fonction de la dureté de
l’eau (systématique : peut favoriser les flores d’altération)
• La désinfection (en plus de l’alcalin chloré) :
appauvrissement en flores et source d’irrégularité du
pouvoir d’ensemencement de la MAT→ à raisonner au cas
par cas selon la situation sanitaire
Ovins
Caprins
Zoom sur CMaflaura
Deux machines à traire totalement
indépendantes à la ferme caprine du
Pradel
Procédures testées :
- Procédure simplifiée : rinçage le soir
- Produits alternatifs (lessive de
soude/vinaigre)
- Alcalins non chlorés
- Désinfection des manchons trayeurs
pendant la traite
Avec MAT conçue simplement,
entretenue du Pradel sans défaut de
nettoyage, pas de problème majeur de
microflores et sur fromageabilité
Défaut de température (55-38°C) : Effet
négatif sur la transformation fromagère
(acidification), probablement du fait du
développement observé de microflores
indésirables (Pseudomonas spp)
Pilotraite complémentaire : travaux en conditions contrôlées
L’implantation de
biofilms dans une
nouvelle machine
à traire
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biofilms dans la
machine à traire
pilote
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caractériser
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complexes dans Pilotraite
Définition de procédures de
nettoyage/désinfection
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prélèvement des biofilms
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d’implantation
Démarche
Caractérisation du biofilm résident
Implantation d’un biofilm complexe
à partir de laits
Implantation d’un biofilm complexe
à partir d’un tronçon de lactoduc
Après nettoyage/désinfection
1/ Nettoyage/désinfection
2/ Circulation d’un biofilm complexe obtenu par
passage de lait UHT dans la MAT d’une autre ferme
1/ Nettoyage/désinfection
2/ Circulation d’un biofilm complexe issu d’un
tronçon de lactoduc
1
2
3
Procédure retenue :
Méthode d’implantation
NED
Prélèvement de
la microflore
mobilisable dans
la MAT
Prélèvement du
biofilm implanté par :
1/ écouvillonnage des
coupons
2/ méthode lait UHT
Prélèvement substrat
départ
Circulation pendant 2h
Rinçage du pilote
Attente 4h (lait
réfrigéré)
Circulation pendant 2h
Rinçage du pilote
Modalité 2 jours
uniquement :
Circulation pendant 2h
Rinçage du pilote
Attente 4h (lait
réfrigéré)
Circulation pendant 2h
Rinçage du pilote
Prélèvement substrat fin
J 1 J 2 J 3 J 4
2 modalités testées :
1 jour d’implantation donc 2 circulations
2 jours d’implantation donc 4 circulations
Tronçon de lactoduc
en provenance
de la ferme du Pradel
Installation du tronçon
sur le pilote
Porte-coupons
Procédure retenue :
Méthode d’implantation
NED
Mise en place
tronçon sur le
pilote
Prélèvement du
biofilm implanté par :
1/ écouvillonnage des
coupons
2/ méthode lait UHT
Prélèvement sur
tronçon
Circulation pendant 2h
Rinçage du pilote
Attente 4h (lait
réfrigéré)
Circulation pendant 2h
Rinçage du pilote
Circulation pendant 2h
Rinçage du pilote
Attente 4h (lait
réfrigéré)
Circulation pendant 2h
Rinçage du pilote
Prélèvement substrat fin
J 1 J 2 J 3 J 4
Retrait du tronçon de la MAT à la ferme du Pradel à J-2 (avant traite du matin)
Transport en réfrigéré
Evolution de la flore microbienne pendant
l’installation du biofilm
Biofilm résident
Biofilm complexe – lait - 2 jours
Biofilm complexe – lait - 1 jour
Biofilm complexe - section du tuyau de MAT
Légende:
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
Trial 1 T2.1.1 T2.2.1 Trial 2 T3.1 T2.2.2 T2.2.3 T2.1.2 T2.1.3 Trial 3
FMAR
in
log
CFU/ml
Evolution de la flore totale mésophile aérobie
dans le lait UHT après circulation dans le
pilote (n=1)
Pas de procédure d’implantation
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
Trial 1 T2.1.1 T2.2.1 Trial 2 T3.1 T2.2.2 T2.2.3 T2.1.2 T2.1.3 Trial 3
Relative
abundance
Evolution de l’abondance relative des groupes
microbiens dans le lait UHT après circulation
dans le pilote (n=1)
Gram negative bacteria Yeasts and molds
Mesophilic lactic bacteria Ripening bacteria
▪ Microflores pathogènes non détectées
▪ Niveaux de Pseudomonas spp souvent
équivalents à ceux des Gram négative
Colonisation des coupons
✓ L’installation en biofilm dépend de la procédure (1 jour/2 jours) et de la position des
coupons
✓Les bactéries d’altération s’installent bien sur les coupons
✓Meilleure implantation après 2 jours, notamment d’écosystèmes plus complexes
1 2 3 4 5 6
12 11 10 8 7
9
Position des coupons sur le porte-coupon
Conclusions et perspectives
✓ Biofilm résident :
- Microflores d’affinage et d’altération: représentatif des machines à traire du terrain
- Biofilm résident modifié avec l’apport important de certaines microflores
✓ Groupes microbiens : stable durant l’expérimentation, mais des analyses plus approfondies sont
nécessaires (metabarcoding en cours de traitement)
✓ Procédures d’implantation plus longues favorisent le développement des biofilms dans le pilote
✓ Focus sur les coupons: colonisation plus élevée par les bactéries d’altération et 2 jours
d’implantation favorisent la croissance de biofilms complexes
✓ Développement avec succès de l’installation pilote et de protocoles pour étudier l’impact de
procédures de nettoyage/désinfection sur les biofilms de la machine à traire
✓ Biofilm résident: nécessaire d’être contrôlé avant chaque expérimentation

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Journée Pilotraite atelier biofilms

  • 1. Funded by : Journée Découverte de Pilotraite Atelier biofilms : formation, constitution, facteurs d’influence, résultats PiloTraite Le 12 mai 2022 à Derval (44) Cécile Laithier1 et Alice Hubert1, Hélène Tormo2 et Gwenaëlle Jard2 1 2
  • 2. Les biofilms de la machine à traire
  • 3. Introduction sur les biofilms https://idele.fr/detail-article/la-qualite- microbiologique-du-lait Travail réalisé dans le cadre d’un projet étudiant EI-Purpan https://view.genial.ly/5fbb84dd84a2a1619873086d
  • 4. Constitution des biofilms de la MAT Espèce Caractéristiques microbiologiques Bovins • Des différences de méthodes selon les études mais globalement, les groupes microbiens indésirables et les groupes microbiens d’intérêt ont des niveaux similaires. Ovins Caprins
  • 5. Communauté microbienne mobilisable de la machine à traire en élevage bovin • Communauté microbienne avec des niveaux faibles; • Les groupes microbiens indésirables et les groupes microbiens d’intérêt ont des niveaux similaires. Niveaux des groupes microbiens mobilisables dans le circuit de la machine à traire 5 FlorAcQ 2011-2014
  • 6. Communauté microbienne mobilisable de la machine à taire en élevage ovin • La machine à traire est un réservoir de groupes microbiens pouvant potentiellement ensemencer le lait. • Les niveaux des groupes microbiens d’intérêt technologique (bactéries lactiques) et indésirables (bactéries à Gram-) sont similaires. Dispersion des niveaux des groupes microbiens dans l’eau après passage dans le circuit machine à traire (ufc/mL d’eau). (N=24 échantillons, 6 exploitations des Pyrénées Atlantiques). FlorAcQ 2011-2014 1 10 100 1000 10000 100000 FMAR Bactéries d'affinage Bactéries lactiques Levures Moisissures Bactéries à Gram négatif Niveaux UFC/mL d'eau de rinçage 6
  • 7. 4,4 2,5 2,4 2,4 2 1 0,9 0,6 0,5 0,4 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 log UFC/ml Les laits UHT-MAT en élevages caprins (12 fermes, 4 passages – étude 2013) Lait d’une traite Lait UHT-MAT MAT : réservoir majeur de flores acidifiantes mais également de Pseudomonas spp Similitudes et différences avec les profils lait d’une traite : SCN reste majoritaire mais même niveau que Pseudomonas spp, entérocoques, levures Coliformes, moisissures et SCP à niveau inférieur P. fluorescens et BL. Hétéro faiblement dénombrés Bonne aptitude acidifiante 4,2 3,1 2,5 2,2 1,6 0,9 0,9 0,8 0,3 0,2 0,0 0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 log UFC/ml 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 24 30 36 42 48 pH LT LBOL LUHT
  • 9. Facteurs d’influence Espèce Principaux facteurs de variation (étudiés surtout en caprins) Bovins • Conception installation de traite : privilégier installations petites et simples (raccords, joints … : niches de flores indésirables) • Nature des matériaux : attention parties « plastique » dans lactoducs, en particulier d’évacuation, moins de flores sur silicone/caoutchouc • Entretien et renouvellement du matériel : respect des recommandations et surveiller points à risque (joints…) • Nettoyage du matériel avec TACT et séchage +qualité de l’eau, raisonner l’alternance en fonction de la dureté de l’eau (systématique : peut favoriser les flores d’altération) • La désinfection (en plus de l’alcalin chloré) : appauvrissement en flores et source d’irrégularité du pouvoir d’ensemencement de la MAT→ à raisonner au cas par cas selon la situation sanitaire Ovins Caprins
  • 10. Zoom sur CMaflaura Deux machines à traire totalement indépendantes à la ferme caprine du Pradel Procédures testées : - Procédure simplifiée : rinçage le soir - Produits alternatifs (lessive de soude/vinaigre) - Alcalins non chlorés - Désinfection des manchons trayeurs pendant la traite Avec MAT conçue simplement, entretenue du Pradel sans défaut de nettoyage, pas de problème majeur de microflores et sur fromageabilité Défaut de température (55-38°C) : Effet négatif sur la transformation fromagère (acidification), probablement du fait du développement observé de microflores indésirables (Pseudomonas spp) Pilotraite complémentaire : travaux en conditions contrôlées
  • 11. L’implantation de biofilms dans une nouvelle machine à traire Projet CMAFLAURA
  • 12. Installation de biofilms dans une nouvelle MAT sous 2 protocoles de nettoyage
  • 13. L’implantation de biofilms dans la machine à traire pilote
  • 14. Conditions d’utilisation du pilote pour étudier les biofilms Eliminer les biofilms avant chaque expérimentation Prélever les biofilms pour les caractériser Implanter les biofims complexes dans Pilotraite Définition de procédures de nettoyage/désinfection Définition de méthodes de prélèvement des biofilms Définition des procédures d’implantation
  • 15. Démarche Caractérisation du biofilm résident Implantation d’un biofilm complexe à partir de laits Implantation d’un biofilm complexe à partir d’un tronçon de lactoduc Après nettoyage/désinfection 1/ Nettoyage/désinfection 2/ Circulation d’un biofilm complexe obtenu par passage de lait UHT dans la MAT d’une autre ferme 1/ Nettoyage/désinfection 2/ Circulation d’un biofilm complexe issu d’un tronçon de lactoduc 1 2 3
  • 16. Procédure retenue : Méthode d’implantation NED Prélèvement de la microflore mobilisable dans la MAT Prélèvement du biofilm implanté par : 1/ écouvillonnage des coupons 2/ méthode lait UHT Prélèvement substrat départ Circulation pendant 2h Rinçage du pilote Attente 4h (lait réfrigéré) Circulation pendant 2h Rinçage du pilote Modalité 2 jours uniquement : Circulation pendant 2h Rinçage du pilote Attente 4h (lait réfrigéré) Circulation pendant 2h Rinçage du pilote Prélèvement substrat fin J 1 J 2 J 3 J 4 2 modalités testées : 1 jour d’implantation donc 2 circulations 2 jours d’implantation donc 4 circulations
  • 17. Tronçon de lactoduc en provenance de la ferme du Pradel Installation du tronçon sur le pilote Porte-coupons
  • 18. Procédure retenue : Méthode d’implantation NED Mise en place tronçon sur le pilote Prélèvement du biofilm implanté par : 1/ écouvillonnage des coupons 2/ méthode lait UHT Prélèvement sur tronçon Circulation pendant 2h Rinçage du pilote Attente 4h (lait réfrigéré) Circulation pendant 2h Rinçage du pilote Circulation pendant 2h Rinçage du pilote Attente 4h (lait réfrigéré) Circulation pendant 2h Rinçage du pilote Prélèvement substrat fin J 1 J 2 J 3 J 4 Retrait du tronçon de la MAT à la ferme du Pradel à J-2 (avant traite du matin) Transport en réfrigéré
  • 19. Evolution de la flore microbienne pendant l’installation du biofilm Biofilm résident Biofilm complexe – lait - 2 jours Biofilm complexe – lait - 1 jour Biofilm complexe - section du tuyau de MAT Légende: 0,0 1,0 2,0 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 Trial 1 T2.1.1 T2.2.1 Trial 2 T3.1 T2.2.2 T2.2.3 T2.1.2 T2.1.3 Trial 3 FMAR in log CFU/ml Evolution de la flore totale mésophile aérobie dans le lait UHT après circulation dans le pilote (n=1) Pas de procédure d’implantation 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Trial 1 T2.1.1 T2.2.1 Trial 2 T3.1 T2.2.2 T2.2.3 T2.1.2 T2.1.3 Trial 3 Relative abundance Evolution de l’abondance relative des groupes microbiens dans le lait UHT après circulation dans le pilote (n=1) Gram negative bacteria Yeasts and molds Mesophilic lactic bacteria Ripening bacteria ▪ Microflores pathogènes non détectées ▪ Niveaux de Pseudomonas spp souvent équivalents à ceux des Gram négative
  • 20. Colonisation des coupons ✓ L’installation en biofilm dépend de la procédure (1 jour/2 jours) et de la position des coupons ✓Les bactéries d’altération s’installent bien sur les coupons ✓Meilleure implantation après 2 jours, notamment d’écosystèmes plus complexes 1 2 3 4 5 6 12 11 10 8 7 9 Position des coupons sur le porte-coupon
  • 21. Conclusions et perspectives ✓ Biofilm résident : - Microflores d’affinage et d’altération: représentatif des machines à traire du terrain - Biofilm résident modifié avec l’apport important de certaines microflores ✓ Groupes microbiens : stable durant l’expérimentation, mais des analyses plus approfondies sont nécessaires (metabarcoding en cours de traitement) ✓ Procédures d’implantation plus longues favorisent le développement des biofilms dans le pilote ✓ Focus sur les coupons: colonisation plus élevée par les bactéries d’altération et 2 jours d’implantation favorisent la croissance de biofilms complexes ✓ Développement avec succès de l’installation pilote et de protocoles pour étudier l’impact de procédures de nettoyage/désinfection sur les biofilms de la machine à traire ✓ Biofilm résident: nécessaire d’être contrôlé avant chaque expérimentation